特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法
2023-12-01 01:46:31
特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法
【專利摘要】本發明涉及一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法，屬於生命醫學科學領域。本方法採用生物信息學分析，找出血吸蟲基因組中某miRNA靶基因群，而後利用Solexa分析蟲體在該miRNA高或低表達時期蟲體差異表達基因群，並與該miRNA靶基因群取交集，得到候選關鍵基因群，而後結合KEGG分析找出其中重要基因，初步確定關鍵靶基因群；然後利用該miRNA類似物(mimic)體外實驗，進一步篩選出關鍵靶基因，再結合螢光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該基因的靶向關係。本方法的建立有助於鑑別特定時期miRNA的關鍵靶基因，有助於迅速揭示miRNA的調控作用，為miRNA功能研究提供了理想途徑。同時也對其它物種相近研究方法的建立提供有價值的參考。
【專利說明】特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生命醫學科學領域，尤其是涉及一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵 靶基因的分析與鑑定方法。
【背景技術】
[0002] 在生物體中，miRNA往往有無數靶基因，而且一個基因往往具有多種miRNA的結合 位點。加之，在蟲體發育不同時期miRNA對不同靶基因的調控有輕重緩急之別。因此，目前 使用的生物信息學和體外實驗結合的miRNA鑑定方法，難以準確確定某個發育時期miRNA 調控的關鍵靶基因，而該靶基因的確定將對認識該miRNA功能至關重要。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種特定發育階段 血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法。該方法可有效避免非靶基因和次要靶基因對 miRNA主要功能研究的幹擾，有助於快速、深入理解miRNA在蟲體發育中的關鍵調控作用。 本方法不僅有助於鑑別miRNA關鍵的靶基因，而且有助於迅速揭示miRNA在蟲體發育調控 中的作用，為miRNA功能研究提供了理想途徑。另外，本方法對其它物種相近研究可提供重 要參考。
[0004] 本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
[0005] -種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法，包括以下步驟：
[0006] (1)分析特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA表達：
[0007] 通過Solexa分析，比較日本血吸蟲不同發育時期miRNA表達特點，從中確定特定 發育階段血吸蟲的特徵性miRNA ;
[0008] (2)特定發育階段血吸蟲的基因表達譜分析：
[0009] 通過Solexa分析並比較特定發育階段血吸蟲的基因表達譜，從中找到高表達的 基因和低表達的基因，即差異表達基因群；
[0010] (3)特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA關鍵基因的分析：
[0011] 通過生物信息學預測該miRNA在本物種內所有靶基因，並與特定發育階段差異表 達的基因群取交集，獲得兩群中共有基因，分析其中參與關鍵代謝通路的基因，將之定為特 定發育階段血吸蟲特徵性miRNA的"候選關鍵靶基因"，簡稱關鍵基因；
[0012] ⑷確定關鍵基因中的革巴基因：
[0013] 利用該miRNA類似物進行體外實驗，以篩選出關鍵基因中的靶基因；
[0014] 利用生物信息學分析關鍵基因3' UTR區的miRNA結合位點；
[0015] 結合Luciferase螢光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該基因3' UTR區調控 關係。
[0016] 步驟（3)所述的特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA關鍵基因的分析包括以下步 驟：
[0017] (a)利用生物信息學分析，在血吸蟲全基因組中預測出步驟（2)得到差異表達基 因，將該基因群與步驟（3)中預測靶基因群取交集，得交集基因群；
[0018] (b)基於差異表達基因譜，通過生物信息進行pathway分析，將蟲體發育中處於關 鍵代謝通路中的基因群與步驟（a)所得交集基因群取二次交集，初步確定該交集基因群中 參與關鍵代謝過程的基因為關鍵基因。
[0019] 步驟⑷中，用miRNA類似物進行體外實驗，以篩選出關鍵基因中的真正靶基因， 具體包括以下步驟：
[0020] (a)血吸蟲尾蚴感染小鼠到特定發育階段後用無菌預冷生理鹽水從小鼠主動脈灌 注,衝出血吸蟲,並用含抗生素的無菌生理鹽水衝洗2次；
[0021] (b)用注射器針頭挑取血吸蟲蟲體，轉移到16孔板；每孔雌雄蟲10對，至少4孔； 一孔一組，分A、B、C和D四組；
[0022] (c)在RPMI-1640培養基，37°C，5% CO2培養；每組補加下列成分：A組：50D of inhibitor N.C. ;B 組 50D of miRNA 類似物，C 組：50D of miRNA inhibitor;〕組：50D of Negative control ；
[0023] (d)每天換液，並補充相應成分，連續5天；
[0024] (e)挑取雌蟲,轉入無菌平皿上的三個ddH20水泡中依次浸泡,水泡每次更新,然後 再轉移到含有IOOOul Trizol試劑的EPP管中，-80°C保存備用，或者直接勻漿取RNA ;
[0025] (f)利用Real time PCR方法檢測各組蟲中關鍵基因表達特徵，按如下原則：B基 因表達下調，C組基因表達上調，提示該基因為miRNA潛在靶基因，反之不是。
[0026] 步驟（4)中，利用生物信息學分析上述選擇的關鍵基因及其3' UTR區的miRNA結 合位點，具體通過以下步驟進行：
[0027] 1)確定miRNA與靶基因接合區域：
[0028] 通過聚類分析，比較多物種相同miRNA的序列保守區；
[0029] 2)分析關鍵基因及其上下遊miRNA接合區域：
[0030] 通過將miRNA保守區段與關鍵基因比較，若找到結合區，則可進一步判定為潛在 靶基因，並做進一步Luciferase螢光素酶報告系統的分析。
[0031] 步驟（4)中，結合Luciferase突光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該基因 3' UTR區調控關係，具體通過以下步驟進行：
[0032] I) LUC-靶基因3' UTR報告質粒構建；
[0033] 將選定關鍵基因，3' UTR區序列導入目的基因：
[0034] 2)目的miRNA過表達質粒構建：
[0035] 基於目的miRNA成熟序列設計引物，引物含交換配對鹼基、酶切位點，並含有目的 基因 5'端部分序列用於PCR釣取目的基因；
[0036] 通過該引物擴增血吸蟲基因組，獲得目的miRNA基因序列，並將該序列導入載體 GV268,元件順序為 CMV-MCS-SV40-Neomycin ;
[0037] 3)質粒轉染後Iuciferase檢測：
[0038] 使用 293T 細胞和"Dual-Glo? Luciferase Assay System(E2920，promega) "試劑 盒進行Iuciferase表達檢測。
[0039] 關鍵靶基因鑑定方法的建立，將有利於從真正發揮作用的靶基因功能來認識 miRNA的功能，從而避免了單純從生物信息學得到的預測靶基因中的假陽性引起的誤導，和 單純Iuciferase鑑定得到的次要靶基因的幹擾。
[0040] 與現有技術相比，本發明方法的建立，可避免鑑定miRNA靶基因過程中出現的假 陽性結果和次要靶基因對miRNA在蟲體發育特定階段的特定功能認識的幹擾，而有助於找 到關鍵靶基因。本方法擬採用生物信息學分析初步確定血吸蟲基因組中在研miRNA靶基因 範圍，而後利用Solexa分析該miRNA高或低表達時期蟲體基因表達譜特點，從中確定潛在 的關鍵靶基因群。然後利用該miRNA類似物（mimic)體外實驗，以篩選出該miRNA靶基因， 並結合突光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該祀基因關係。本方法的建立不僅有助於 鑑別特定時期miRNA的特定靶基因，而且有助於迅速揭示miRNA在蟲體發育調控中的準確 作用，為miRNA功能研究提供了理想途徑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041] 圖1為日本血吸蟲不同發育時期差異miRNA表達的特徵性miRNA譜；
[0042] 圖 2 為 ATP synthase 基因在 bantam mimic 和 bantam inhibitor 作用下的基因 表達情況；
[0043] 圖3為不同物種Bantam序列比較以及主要結合序列分析；
[0044] 圖 4 為 ATP synthase 基因 3' UTR 區的 bantam 結合區；
[0045] 圖5為LUC-靶基因3' UTR報告質粒；
[0046] 圖6為目的miRNA (如Bantam)過表達質粒；
[0047] 圖7為Iuciferase檢測結果。
【具體實施方式】
[0048] 下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0049] 實施例
[0050] -種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法，包括以下步驟：
[0051] 第一步：分析特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA表達：
[0052] 通過Solexa分析，比較日本血吸蟲不同發育時期miRNA表達特點，從中確定特定 發育階段血吸蟲的特徵性miRNA ;本實施例中，分別檢測日本血吸蟲尾蚴單性和雙性感染 小鼠18天和23天後，蟲體miRNA表達譜。分析不同時期差異表達的特徵性miRNA。如圖 1。從圖1可見蟲體不同發育時期miRNA表達譜不同，提示各期有各期特點。如在感染18天 時，單性（sl8)或雙性（dl8)感染的雌蟲中miRNA-lc、miRNA-lb和miRNA-la表達升高；在 雙性感染23天雌蟲（d23)中，bantam表達明顯升高；在單性感染23天雌蟲（s23)，miR-l、 miR-71、miR-750和miR-7表達升高，提示不同發育階段蟲體都有特徵表達miRNA。但是，某 個時期特徵性表達的miRNA功能的分析，則依賴於對其關鍵靶基因的鑑定。
[0053] 第二步：特定發育階段血吸蟲的基因表達譜分析（本實施例中比較d23和s23基 因表達譜）：
[0054] 通過Solexa分析並比較d23和s23基因表達譜，從中找到d23中高表達的基因和 低表達的基因群。在d23中bantam表達商，提不其祀基因表達會降低。但是，由於蟲體內 基因表達是多個miRNA調控的結果，所以，bantam關鍵靶基因在蟲體中不一定表現出下調， 但至少出現差異表達。（華大基因公司協助完成基因表達譜分析）。
[0055] 第三部：特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA關鍵基因的分析（d23的Bantam為 例說明）
[0056] (a)利用生物信息學分析（華大基因公司協助完成靶基因分析），在血吸蟲全基因 組中預測出所有bantam靶基因，將該靶基因群與d23差異表達基因群取交集，得交集基因 群；
[0057] (b)基於差異表達基因譜，通過生物信息進行pathway分析，將蟲體發育中處於關 鍵代謝通路，如能量代謝通路、信號通路等中的基因群與步驟（a)所得交集基因群取二次 交集，初步確定該交集基因群中參與關鍵代謝過程（能量代謝、信號傳導通路等重要生命 過程）的基因為關鍵基因。
[0058] 第四步：鑑別關鍵基因中的靶基因（d23的Bantam為例說明）：從第三步中篩選得 到的基因都是對蟲體發育關鍵的基因，但是，由於生物信息學預測到的靶基因群存在假陽 性，因此，以下分析將著重從中鑑別出真正靶基因。
[0059] (1)利用該miRNA類似物進行體外實驗，以篩選出關鍵基因中的靶基因；
[0060] (a)40條尾蚴感染小鼠，23天後用無菌預冷生理鹽水從小鼠主動脈灌注，衝出血 吸蟲，並用含抗生素（青黴素 l〇〇U/ml ;鏈黴素0. lmg/ml)的無菌生理鹽水中洗2次；
[0061] (b)用注射器針頭挑取蟲體，轉移到16孔板；每孔雌雄蟲10對，至少4孔；一孔一 組，分A、B、C和D四組；
[0062] (c)在RPMI-1640培養基，37°C，5% CO2培養；每組補加下列成分：A組：50D of inhibitor Ν· C.(序列如 SEQ ID NO :1 所示，即 5' CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3'）；B 組 50D of bantam mimic (正義序列如 SEQ ID NO :2 所示，5' UGAGAUCGCGAUUAAAGCUGGU3'，反義 序列如 SEQ ID NO :3 所示；anti-sense :5, CAGCUUUAAUCGCGAUCUCAUU3,），C 組：50D of bantam inhibitor (序列如 SEQ ID NO :4 所示，5'ACCAGCUUUAAUCGCGAUCUCA3'）；D 組：50D of Negative control (正義序列如 SEQ ID NO :5 所示，5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3'，反義 序列如 SEQ ID NO :6 所示，5' ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'）；
[0063] (d)每天換液，並補充相應成分，連續5天；
[0064] (e)挑取雌蟲,轉入無菌平皿上的三個ddH20水泡中依次浸泡,水泡每次更新,然後 再轉移到含有IOOOul Trizol試劑的EPP管中，-80°C保存備用，或者直接勻漿取RNA ;(方 法見Trizol使用說明書）
[0065] (f)利用Real time PCR方法檢測各組蟲中關鍵基因表達特徵，按如下原則：B基 因表達下調，C組基因表達上調，提示該基因為miRNA潛在靶基因，反之不是。從初步鑑定 到的靶基因群中，基於其在蟲體中關鍵代謝通路的分布，選擇一個或多個進行第二階段生 物信息學分析，並進行螢光素酶報告系統的檢測。在能量代謝通路中發揮關鍵作用的ATP synthase在bantam mimic組基因表達下調，而在bantam inhibitor組基因表達上調，如圖 2。由於該基因表達受bantam豐度影響，因此，與ATP synthase基因表達特徵相似的基因 可做進一步分析。不受bantam豐度影響的基因被淘汰。
[0066] (2)利用生物信息學分析上述選擇的靶基因及其3' UTR區的miRNA結合位點，具 體通過以下步驟進行：
[0067] 1)確定miRNA與靶基因接合區域
[0068] 通過聚類分析，比較多物種相同miRNA的序列保守區，見圖3 ;
[0069] 2)分析關鍵基因及其上下遊miRNA接合區域：
[0070] 通過將Bantam保守區段與關鍵基因比較，若找到結合區，則可進一步判定為潛在 靶基因，並做進一步Luciferase螢光素酶報告系統的分析。如在血吸蟲的能量代謝中發揮 作用的ATP synthase被檢測出附合上述標準，如圖4。則做進一步分析。
[0071] (3)結合Luciferase突光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該祀基因關係，具 體通過以下步驟進行（上海吉凱基因化學技術有限公司協助完成）：
[0072] I) LUC-靶基因3' UTR報告質粒構建；
[0073] 將選定關鍵基因，如ATP synthase基因，3' UTR區序列導入載體GV272,元件順序 為 SV40-Luc-MCS，克隆位點為 Xbal/Xbal。見圖 5。ATP synthase 基因序列如 SEQ ID NO: 7所示。
[0074] ATP synthase 基因序列 5' 端 tctaga 為 XbaI 酶切位點，3' 端 tctaga 為 XbaI 酶 切位點，其餘部分為編碼區。
[0075] 2)目的miRNA (如Bantam)過表達質粒構建：
[0076] 基於Bantam成熟序列設計引物，引物含交換配對鹼基、酶切位點，並含有目的基 因5'端部分序列用於PCR釣取目的基因；
[0077] 引物：
[0078]
【權利要求】
1. 一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方法，其特徵在於，包括 以下步驟： (1) 分析特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA表達： 通過Solexa分析，比較日本血吸蟲不同發育時期miRNA表達特點，從中確定特定發育 階段血吸蟲的特徵性miRNA ; (2) 特定發育階段血吸蟲的基因表達譜分析： 通過Solexa分析並比較特定發育階段血吸蟲的基因表達譜，從中找到高表達的基因 和低表達的基因，即差異表達基因群； (3) 特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA關鍵基因的分析： 通過生物信息學預測該miRNA在本物種內所有靶基因，並與特定發育階段差異表達的 基因群取交集，獲得兩群中共有基因，分析其中參與關鍵代謝通路的基因，將之定為特定發 育階段血吸蟲特徵性miRNA的"候選關鍵靶基因"，簡稱關鍵基因； (4) 確定關鍵基因中的祀基因： 利用該miRNA類似物進行體外實驗，以篩選出關鍵基因中的靶基因； 利用生物信息學分析關鍵基因3' UTR區的miRNA結合位點； 結合Luciferase螢光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該基因3'UTR區調控關係。
2. 根據權利要求1所述的一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方 法，其特徵在於，步驟（3)所述的特定發育階段血吸蟲的特徵性miRNA關鍵靶基因的分析包 括以下步驟： (a) 利用生物信息學分析，在血吸蟲全基因組中預測出步驟（2)得到差異表達基因，將 該基因群與步驟（3)中預測靶基因群取交集，得交集基因群； (b) 基於差異表達基因譜，通過生物信息進行pathway分析，將蟲體發育中處於關鍵代 謝通路中的基因群與步驟（a)所得交集基因群取二次交集，初步確定該交集基因群中參與 關鍵代謝過程的基因為關鍵基因。
3. 根據權利要求1所述的一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方 法，其特徵在於，步驟（4)中，用miRNA類似物進行體外實驗，以篩選出關鍵基因中的真正靶 基因，具體包括以下步驟： (a) 血吸蟲尾蚴感染小鼠到特定發育階段後用無菌預冷生理鹽水從小鼠主動脈灌注， 衝出血吸蟲,並用含抗生素的無菌生理鹽水衝洗2次； (b) 用注射器針頭挑取血吸蟲蟲體，轉移到16孔板；每孔雌雄蟲10對，至少4孔；一孔 一組，分A、B、C和D四組； (c) 在RPMI-1640培養基，37 °C，5 % C02培養；每組補加下列成分：A組：50D of inhibitor N.C. ;B 組 50D of miRNA 類似物，C 組：5 OD ofmiRNA inhibitor ;D 組：50D of Negative control ； (d) 每天換液，並補充相應成分，連續5天； (e) 挑取雌蟲，轉入無菌平皿上的三個ddH20水泡中依次浸泡，水泡每次更新，然後再轉 移到含有lOOOul Trizol試劑的EPP管中，-80°C保存備用，或者直接勻漿取RNA ; (f) 利用Real time PCR方法檢測各組蟲中關鍵基因表達特徵，按如下原則：B基因表 達下調，C組基因表達上調，提示該基因為miRNA潛在靶基因，反之不是。
4. 根據權利要求1所述的一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定 方法，其特徵在於，步驟（4)中，利用生物信息學分析上述選擇的關鍵基因及其3'UTR區的 miRNA結合位點，具體通過以下步驟進行： 1) 確定miRNA與靶基因接合區域： 通過聚類分析，比較多物種相同miRNA的序列保守區； 2) 分析關鍵基因及其上下遊miRNA接合區域： 通過將miRNA保守區段與關鍵基因比較，若找到結合區，則可進一步判定為潛在靶基 因，並做進一步Luciferase螢光素酶報告系統的分析。
5. 根據權利要求1所述的一種特定發育階段血吸蟲miRNA關鍵靶基因的分析與鑑定方 法，其特徵在於，步驟（4)中，結合Luciferase突光素酶報告系統進一步確認該miRNA與該 基因3' UTR區調控關係，具體通過以下步驟進行： 1. LUC-靶基因3' UTR報告質粒構建； 將選定關鍵基因，3' UTR區序列導入目的基因： 2) 目的miRNA過表達質粒構建： 基於目的miRNA成熟序列設計引物，引物含交換配對鹼基、酶切位點，並含有目的基因 5'端部分序列用於PCR釣取目的基因； 通過該引物擴增血吸蟲基因組，獲得目的miRNA基因序列，並將該序列導入載體 GV268,元件順序為 CMV-MCS-SV40-Neomycin ; 3) 質粒轉染後luciferase檢測： 使用 293T 細胞和"Dual_Glo?Luciferase Assay System (E2920，promega)"試劑盒進 行luciferase表達檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404139SQ201410620559
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月6日 優先權日:2014年11月6日
【發明者】孫軍, 王素文 申請人:同濟大學