The-GRPAKRGDV十肽,其製備,活性及應用的製作方法
2023-12-01 08:55:51
本發明涉及The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val十肽，涉及它的製備方法，涉及它治療缺血性中風的活性，抗血栓活性和溶血栓活性。因而本發明涉及它在製備治療缺血性中風，抗血栓和溶血栓藥物中的應用。本發明生物醫藥領域。
背景技術：
冠心病、腦卒中以及脈管炎等是非常常見的心腦血管疾病。隨著人們生活水平的不斷提高，心腦血管疾病的發病人數逐年遞增。心腦血管疾病危險因素流行，我國心腦血管疾病的患病率持續上升。據資料統計，每5個成年人中就有1個心血管病患者。血栓形成是心腦血管疾病的重要病因。缺血性腦卒中，具有很高的致死率和致殘率。溶栓治療是常見的重要的手段之一。現有溶栓藥物存在出血、再栓塞、再灌注損傷等問題，因此尋找新型的抗缺血性腦卒中新藥具有重要的應用價值。在3年的實驗研究中，發明人發現The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val十肽具有這樣的活性。根據這個發現，發明人提出了本發明。
技術實現要素：
本發明的第一個內容是提供The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val十肽。
本發明的第二個內容是提供The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的製備方法，該方法包括以下步驟：
(1)Boc-Asp(OBzl)與Val-OBzl偶聯得到Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(2)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(3)Boc-Gly與L-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶聯得到Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(4)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得L-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(5)Boc-Arg(NO2)與L-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶聯得到Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
(6)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(7)Boc-Ala與Lys(Z)-OBzl偶聯得到Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(8)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(9)Boc-Pro與L-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯得到Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(10)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(11)Boc-Arg(NO2)與L-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯得到L-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(12)Boc-Gly與L-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯得到Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(13)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl在4N氯化氫的乙酸乙酯溶液中得到L-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(14)Boc-The與L-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl偶聯得到Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(15)Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl在2N NaOH作用下得到Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)；
(16)Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)與L-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶聯得到Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(17)Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl在三氟乙酸/三氟甲磺酸(4∶1)溶液中得到The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val。
以上所使用的液相方法是本領域的常規並公開的技術。TFA是三氟乙酸，TFMSA是三氟甲磺酸，HCl/EtOAc是氯化氫的乙酸乙酯溶液。
本發明的第三個內容是評價The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val治療缺血性中風的活性。
本發明的第四個內容是評價The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的抗血栓活性。
本發明的第五個內容是評價The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的溶血栓活性。
附圖說明
圖1The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val的合成路線.i)HOBt，DCC，NMM，THF；ii)4N HCl/EtOAc；iii)2N NaOH，甲醇；iv)TFA，TFMSA。
具體實施方式
為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
實施例1製備Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl(1)
將2.08g(11mmol)Boc-Ala溶於20mL無水四氫呋喃(THF)，冰浴下加入1.35g(10mmol)1-羥基苯並三唑(HOBt)和用無水THF溶解的2.47g(12mmol)二環己基羰二亞胺(DCC)，攪拌0.5小時，得反應液A。30分鐘後，將4.07g(10mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl用15mL THF溶解，並用N-甲基嗎啉先調節pH至9，加入到反應液A中，室溫下攪拌12小時，TLC(展開劑CHCl3∶MeOH＝30∶1)顯示HCl·Lys(Z)-OBzl消失。過濾除去反應液中的二環己基脲(DCU)，反應液減壓濃縮至幹，殘留物用100mL乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液洗3次，5％硫酸氫鉀水溶液洗3次，飽和氯化鈉水溶液洗3次，分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉乾燥12h，過濾，濾液減壓濃縮得到的淡黃色色固體通過矽膠柱柱層析(CH2Cl2∶CH3OH＝90∶1)純化，得到4.0g(74％)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：542[M+H]+。
實施例2製備HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl(2)
將2.0g(3.7mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl溶於少量乾燥乙酸乙酯中，冰鹽浴下加入20mL 4N氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴下反應4小時，TLC(CHCl3∶MeOH，30∶1)顯示原料點消失，反應完全。反應液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解並減壓濃縮。該操作重複3次，除淨游離的氯化氫，殘留物再用無水乙醚磨洗3次，得到1.6g(90％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：442[M+H]+。
實施例3製備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(3)
採用實施例1的方法從731mg(3.4mmol)Boc-Pro和1.8g(3.3mmol)HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.7g(78％)標題化合物，為微黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：639[M+H]+。
實施例4製備HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(4)
採用實施例2的方法從1.7g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.4g(91％)標題化合物，為微黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：539[M+H]+。
實施例5製備Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(5)
採用實施例1的方法從798mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)和1.6g(2.4mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.5g(71％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：840[M+H]+。
實施例6製備HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(6)
採用實施例2的方法從1.5g(1.8mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.2g(86％)標題化合物，為白色粉末。ESI-MS(m/z)：740[M+H]+。
實施例7製備Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(7)
採用實施例1的方法從403mg(2.3mmol)Boc-Gly和1.4g(2.2mmol)HCl·Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.4g(68％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：897[M+H]+。
實施例8製備HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(8)
採用實施例2的方法從1.4g(1.5mmol)Boc-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.2g(95％)標題化合物，為白色固體。797[M+H]+。
實施例9製備Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl(9)
採用實施例1的方法從360mg(1.3mmol)Boc-The和300mg(1.44mmol)HCl·Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到1.0g(79％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：1054[M+H]+。
實施例10製備Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)(1O)
將1.0g(0.95mmol)Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶於5mL甲醇中，冰浴下加入2NNaOH水溶液使pH保持在12，反應6小時，TLC(展開劑二氯甲烷：甲醇＝10∶1)顯示原料點消失。用飽和硫酸氫鉀調pH至7，減壓除去甲醇，用飽和硫酸氫鉀調pH值至2，用乙酸乙酯(30mL×3)反覆萃取溶液3次，合併乙酸乙酯層，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至幹，得到0.58g(64％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：962[M-H]-。
實施例11製備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl(11)
採用實施例1的方法從3.25g(10mmol)Bcc-Asp(OBzl)和3.6g(9.5mmol)Tosh·Val-OBzl得到4.6g(95％)標題化合物，為黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：513[M+H]+。
實施例12製備HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl(12)
採用實施例2的方法從4.8g(9.4mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到4.0g(95％)標題化合物，為黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：413[M+H]+。
實施例13製備Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(13)
採用實施例1的方法從1.45g(8.3mmol)Boc-Gly和4.5g(8.2mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得到3.5g(61％)標題化合物，為黃色油狀物。ESI-MS(m/z)：570[M+H]+。
實施例14製備HCl·Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(14)
採用實施例2的方法從3.5g(6.1mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到3.0g(97％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：470[M+H]+。
實施例15製備Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(15)
採用實施例l的方法從1.45g(5.6mmol)Boc-Arg(NO2)和3.2g(5.5mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.5g(71％)標題化合物，為黃色固體。ESI-MS(m/z)：771[M+H]+。
實施例16製備HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(16)
採用實施例2的方法從2.5g(3.2mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到2.1g(91％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：671[M+H]+。
實施例17製備Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(17)
採用實施例1的方法從580mg(0.6mmol)Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)和353mg(0.5mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到200mg(25％)標題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/z)：1615[M+H]+。
實施例18製備The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(18)
將100mg(0.06mmol)Boc-The-Gly-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(17)加入茄瓶中，冰鹽浴下加入1mL TFA和0.25mL TFMSA，1小時後TLC(正丁醇∶水∶冰醋酸＝1∶1∶1)顯示原料點消失，停止反應，用無水乙醚反覆洗滌，減壓抽乾，然後用水溶解，用25％氨水調pH值至7，用Sephadex G10除鹽，C18柱純化，凍幹，得到20mg(29％)標題化合物，為白色粉末。Mp 198-201℃；[α]20D＝-18.18(c＝0.11，H2O).IR(KBr)：vR-CH3＝2962，2873，1450，1381；vR-CH2-R＝2930，1257；vCO-NH＝1680，3387；vNH2＝3400，600.ESI-MS(m/e)：1111[M+H]+1HNMR(800MHz，D2O)δ/ppm＝0.8617(d，J＝6.8Hz，3H)，0.8778(d，J＝6.8Hz，3H)，1.0391(t，J＝7.28Hz，3H)，1.3284(d，J＝7.2Hz，3H)，1.3773(m，2H)，1.5844(m，2H)，1.6289(m，2H)，1.6472(m，2H)，1.6968(m，2H)，1.7432(m，2H)，1.8021(m，2H)，1.8483(dq，J＝6.8Hz，J＝5.84Hz，1H)，1.9694(dddd，J＝6.65Hz，J＝7.28Hz，J＝6.65Hz，J＝16.8Hz，2H)，2.1198(dd，J＝7.2Hz，J＝14.24Hz，2H)，2.1621(ddt，J＝5.36Hz，J＝6.65Hz，J＝7.28Hz，1H)，2.3637(ddt，J＝7.92Hz，J＝16.96Hz，J＝7.52Hz，1H)，2.7638(dd，J＝7.92Hz，J＝16.96Hz，1H)，2.8615(dd，J＝7.92Hz，J＝16.96Hz，1H)，2.9395(t，J＝7.44Hz，2H)，3.1308(dd，J＝7.36Hz，J＝14.64Hz，2H)，3.1752(m，2H)，3.1665(m，2H)，3.5754(dt，J＝7.28Hz，J＝16.8Hz，1H)，3.7833((dt，J＝7.28Hz，J＝16.8Hz，1H)，3.9091(s，2H)，4.0263(d，J＝16.8Hz，1H)，3.9603(d，J＝16.8Hz，1H)，4.0545(t，J＝6.64Hz，1H)，4.1401(d，J＝5.84Hz，1H)，4.2188(q，J＝7.2Hz，1H)，4.2601(dd，J＝6.24Hz，1H)，4.2523(dd，J＝6.24Hz，lH)，4.3566(d，J＝6.56Hz，1H)，4.5869(dd，J＝5.36Hz，J＝7.28Hz，1H)。
實驗例l評價The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)的抗血栓活性
將SD雄性大鼠(180-220g)，隨機分組，每組15隻，靜悉飼養一天，停止餵養過夜。經灌胃給予The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10ml/kg)30min之後，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之後手術。分離大鼠的右頸動脈和左頸靜脈，將準確稱重的絲線置於旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側動脈並注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側動脈流經旁路插管進入左側靜脈，15min之後取出附有血栓的絲線稱量，計算血液循環前後絲線的重量，得到的血栓重以表示並代表抗血栓活性，作t檢驗。數據列入表1。結果表明口服100nmol/kgThe-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)能有效地抑制血栓形成。
表1 100nmol/kg The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)的抗栓活性
n＝10，阿司匹林劑量167μmol/kg，口服給藥，十肽給藥劑量為1O0nmol/kg；a)表示與生理鹽水比。
實驗結果表明：對濃度為100nmol/kg，十肽的血栓溼重為18.16±4.37mg，與生理鹽水相比有顯著性差異(28.56±4.12mg，p＜0.01)，十肽具有一定的抗栓活性，陽性對照的血栓溼重為12.97±2.48mg。
實驗例2評價The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)的溶血栓活性
SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進行麻醉。麻醉大鼠後將其仰臥位固定，分離其右頸總動脈，近心端處夾住動脈夾，將近心端及遠心端分別穿入手術線，遠心端的手術線結紮，遠心端插管，將動脈夾鬆開，取出約1mL動脈血，置於1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內注入0.1ml大鼠動脈血，隨後在管內迅速插入一支不鏽鋼材質的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不鏽鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，託柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min後，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。
旁路插管由三部分構成，中間段為長60.0mm，內徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用於插入大鼠頸動脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用於插入中段的聚乙烯膠管內)，3段管的內壁均需要矽烷化(1％的矽油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置於中段聚乙烯膠管內，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環的過程中不會漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。
分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術線，結紮遠心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述製備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時遠離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時注射器不要撤離聚乙烯管，用動脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血，結紮遠心端，在離動脈夾不遠處將右頸總動脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術縫線將動靜脈固定。
用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)，尿激酶的生理鹽水溶液(20000IU/kg)或The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)，刺入遠離血栓固定螺旋的近靜脈處，打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環，按靜脈-心臟-動脈的順序作用於螺旋的血栓上。血液循環1h之後，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計算每隻大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環前後血栓的重量差，以均值表示並代表溶血栓活性，作t檢驗。數據列入表2。結果表明100nmol/kg The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)能有效地溶解形成的血栓。
表2 100nmol/kg The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)溶血栓活性
n＝10，尿激酶劑量為20000IU/kg；十肽給藥劑量為1nmol/kg，靜脈給藥；a)與生理鹽水相比，p＜0.01，b)與尿激酶比，p＞0.05
實驗結果表明：對濃度為100nmol/kg的十肽的血栓減重為35.03±6.35mg，與生理鹽水比較有顯著性差異(27.40±3.20mg，p＜0.01)，與陽性對照尿激酶比較，p＞0.05無差異， 活性相當，陽性對照尿激酶的血栓減重為40.14±5.43mg。
實驗例3評價The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)對缺血性中風大鼠的治療作用
在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內側緣分離出右頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，結紮頸外動脈的遠心端，在頸外動脈剪一小口，鬆開頸總動脈近心端的動脈夾，取10μL血，之後再用無創動脈夾夾閉頸總動脈的近心端。將取得的10μL血放置在1mL EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固，然後轉移至-20℃冰箱中放置1小時，使血液凝塊結實。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為400mg/kg。取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水，用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細小血栓塊，製備細小血栓的懸液並轉移至1mL注射器內。鬆開頸總動脈近心端的動脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大鼠的大腦，然後結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處得動脈夾，恢復血流。等待甦醒。大鼠甦醒24小時後按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵、1分表示未損傷側前肢不能伸展、2分表示向未損傷側行走、3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走、4分表示意識障礙無自主行走、5分表示死亡。大鼠經尾靜脈每天注射1次The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)，劑量為100nmol/kg。連續注射6天，每天評分。結果列入表3。數據表明The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)連續治療6天除可使4隻腦缺血24小時的大鼠神經生物學評分為0分，使2隻腦缺血24小時的大鼠神經生物學評分為2分外，還可將5隻腦缺血24小時神經生物學評分為2分、3分的大鼠改善為1分，因為不像已經公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg，後5次維持劑量需要2μmol/kg，The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)6次劑量均為100nmol/kg。這樣一來，首次劑量和維持劑量分別降低了50倍和20倍。
表3 The-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-The-Arg-Gly-Asp-Val(十肽)連續治療6天對腦缺血24小時大鼠神經生物學評分的影響
n＝11。