分離、鑑定和/或分析全血樣品中的白細胞種群的方法和試劑系統的製作方法
2023-11-02 04:46:17 2
專利名稱：分離、鑑定和/或分析全血樣品中的白細胞種群的方法和試劑系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速進行全血中的紅細胞部分的溶血作用的新溶解劑系統，藉助此種系統可將白細胞部分以其天然狀態或接近天然狀態的形式分離出來。然後可將該白細胞部分在多種不同的環境中進行進一步研究或分析。本發明的溶解劑實際上由一種水溶性化合物組成，此種水溶性化合物在水介質中至少部分離解，從而釋放出質子和平衡離子。在將相應濃度的此種化合物加入全血樣品中時，其離解的程度可有效地將血樣酸化(PH值約在2.6至4.0範圍內)，並同時將血樣的重量克分子滲透壓濃度保持在低於大約100毫滲克分子。本溶解劑系統的優選用途之一是預處理全血樣品，來進行紅細胞部分的快速和實際上是完全的溶血作用。此種預處理還導致微妙地改變白細胞部分，從而，使白細胞部分進一步分離為至少五種獨特的亞種群，因此，本試劑系統適用於配製用聚焦流式分析系統，例如VCS全血分析儀和EpicsModelC和PROFILE流式細胞光度計(均由美國佛羅裡達州海厄利亞conlter電子儀器有限公司出售)，進行分析的全血樣品。
在研究和分析複合生物流體(即全血)的組分之前，通常需要將其分離成為其各種組分，這也往往是在此種研究和分析中所採用的許多確認的分析方案和/或測試儀器的必要的技術要求。在血樣中的流體部分的此種研究或分析是最使人關注的場合，可將細胞部分從血樣中分離出去，而不必考慮細胞膜的生存或細胞膜的完整性。相反，在血樣中的細胞部分的此種研究或分析是最使研究人員或臨床醫生關注的場合時，將全血樣品分離成為各種細胞組分，就需要相應地調節血樣的處理/加工技術。將全血樣品分離成為其各種細胞組分的常規方法是用離心的方法。雖然此種方法是有效的，但是需要花很大的勞動、效率相當低而且需要用人工來控制血樣中的細胞部分。
在試圖用化學藥劑來進行血樣中的細胞部分的此種分離時，由於種種原因，結果始終是不能令人完全滿意的。更準確地說，細胞種群在活體內或體外的生活強度和生存性，均取決於保持一種與保存實際細胞結構和細胞中的化學平衡一致的準確生理環境。細胞膜的滲透性和運送特性可控制細胞中的化學平衡。生理環境的改變又可以誘發細胞膜的應答或改變。細胞膜應答在性質上是「防禦性的」;也就是說，細胞膜的生理應答是適合於保持細胞中的化學平衡，因此是延續和不間斷細胞的生存性。
現在已充分認識到，細胞只能在一定的限度範圍內耐受此種理想生理環境的改變;而且，還認識到如果超過此種限度，細胞就會遭到永久性的損傷。在本技術領域中還進一步認識到，此種生理環境的改變(即，稀釋介質的毒性-即使是用蒸餾水)可影響細胞的溶血作用。
已經廣泛地研究了全血中的各種細胞種群對其生理環境的改變的耐受程度並利用了大量的文獻資料來證明。改變全血中的細胞部分的生理環境的各個方面的效果是微妙的和引人注目的，而且可以通過飲食代謝物和/或異物來實現。這些研究工作包括Dacosta等人在Transfusion雜誌，13，305(1973年)中所發表的檢測細胞製劑對不同藥物的反應;Kobayoashi.T等人在JournalofBioChemistry，93，675(1983年)中所發表的檢測細胞製劑對欲食不平衡的反應;和Rother.T等人在Z.ImmunologieForschungsgemeinschaft，155，118(1978年)中和Schettini.F等人在ActaPaediat.scand.，60，17(1971年)中所發表的檢測細胞製劑對改變PH值的反應。
在上述每一篇文章中，藥物、食物代謝物或改變PH值均顯著地將血液的生理環境改變到可使紅白細胞發生溶血作用的程度。
更準確地說，上述Rother等人的文章，報導了可通過應用在有EDTA存在的情況下可溶解未致敏的紅血細胞的鹽酸來酸化(PH值為6.4)從而使血清活化。這篇文章將上述這種酸化作用的效果與用腠島素使血清活化後所觀察到的「偏差溶解」活性進行了比較。SChettini和他的同事們進行了一項獨立的、與Rother等人的研究沒有聯繫的研究工作，他們得出結論認為，嬰兒和年紀較小的兒童的紅細胞對酸的溶血作用比年紀較大的兒童更敏感。
到目前為止，還沒有一種化學處理能快速地和有效地將全血樣品分離為活的細胞部分。在應用全血樣品的一種或幾件化學處理的時候(就像在配製或預處理全血來進行的白細胞的分離時)，此種化學處理的焦點是根據分離/分析(ⅰ)在此種化學處理後所剩下來的細胞碎片(即核);(ⅱ)由這些化學處理所固定的細胞;或(ⅲ)這些細胞的比較苛刻的改變(這些改變終於導致細胞的最後的分離)來改變血樣而使其細胞組分互相分離。但是，全血樣品的這些比較苛刻的和分裂性的化學處理已成功地應用於與比較複雜的測試儀器相結合的情況下。更準確地說，改變細胞種群在體外的生理環境，已有利地用來測定某些細胞參數和用來測定個別種群的數量。在鑑定全血的細胞的個別的細胞亞種群中，每一種個別的細胞種群對其生理環境的改變的獨特的反應是具有特殊的優點的。以前已將血液的白細胞分類為二種主要的部分淋巴樣部分和髓樣部分。淋巴樣部分包括淋巴細胞(B和T細胞)。髓樣部分包括單核白細胞和粒性白細胞(嗜中性白細胞、嗜鹼性白細胞和嗜酸性白細胞)。改變全血的細胞種群的生理環境的一種可接受的技術是通過在血樣品中加入一種所謂的「溶解劑」。某些溶解劑和溶解劑系統的發展已使臨床醫生具有有效地將全血中的白細胞種群與紅細胞種群分離的能力。在血樣中的細胞種群的相對濃度和這些細胞中的某些分類的粗形態外觀在臨床上是具有重要意義的。
因此，進一步分離白細胞種群的能力，對研究和處理各種疾病，提供了一種非常寶貴的診斷手段。還進一步認識到，可鑑定白細胞亞種群的數目越大，對任何一種此類亞種群的鑑定就越準確和越可靠。
在最近的專利文獻中，發表了許多公開各種可提高進行白細胞分離的自動測試儀器的能力的試劑系統和技術的參考資料。下列參考資料是本技術領域中的有代表性的有關專利文獻美國專利第3，874，852號;第4，286，963號;第4，346，018號;第4，485，175;第4，520，274號;第4，529，740號和美國專利申請序列第615，961號(相當於1985年12月19日公布的國際申請PCT/US85/00954號)和第615，966號(相當於1985年12月19日公布的國際專利申請PCT/US85/00868號)，本發明詳細地參考了所有上述文獻。
美國專利第3，874，852號(Hamill)敘述了在測定全血的白細胞和血紅蛋白中所應用的試劑系統和方法。此種試劑系統包括一種季胺鹽和氰離子實際上是無亞鐵氰化物的水溶液。此種試劑系統對於全血中的紅血細胞和血小板細胞的基質溶解和將游離血紅蛋白轉化為色原都是有效的。有人報導了此種系統可具有診斷準確性地用於測定白細胞和血紅蛋白。但是，應用此系統所提供的白細胞種群的分布，僅限於總的細胞的計數，而不能進一步將此種細胞部分分離為其分離的亞種群。
美國專利第4，286，963號(Ledis等人)敘述了將全血中的紅血細胞進行快速分離的溶解稀釋劑和方法。此種稀釋劑提高了進行白細胞種群的淋巴樣亞種群和髓樣亞種群的分類鑑定的自動測試儀器的能力。Ledis所敘述的溶解稀釋劑是由至少一種季胺鹽和一種芳基取代的短鏈烷醇在緩衝水介質(PH值為3.5至5.0)中的混合物所組成。但是，此種Ledis專利的溶解稀釋劑，僅限於其所具有的將白細胞種群分離為二種主要的亞種群的能力;也就是，分離為淋巴樣部分和髓樣部分的能力。
美國專利第4，346，018號(Carter等人)敘述了一種多用途血液稀釋劑和應用此種稀釋劑與一種弱溶解劑相結合的方法來進行血紅蛋白測定和將淋巴細胞種群分離為淋巴樣亞種群和髓樣亞種群。此種稀釋劑包括N-(2-乙醯氨荃)亞氨基二乙酸、(ADA)，與其它組合一起作為一種血液穩定劑。該溶解劑包括至少一種季按鹽的水溶液。但是，此種Carter專利的稀釋劑/溶解劑僅限於其所具有的將白細胞種群分離為二種主要的亞種群的能力;也就是，分離為淋巴樣部分和髓樣部分的能力。此外，已經發現ADA有助於穩定紅血細胞種群和血小板種群的大小分布、細胞形狀，而最主要的是，將紅血細胞種群和血小板種群的高度的細胞分散體穩定到超過以前用其他化合物所穩定的程度。
美國專利第4，485，175號(Ledis等人)敘述了一種試劑系統和應用自動細胞計數設備將白細胞種群分離定為三種亞種群的方法。此試劑系統包括一種血液稀釋劑和一種溶解劑。在將此種溶解劑(包括一種季胺鹽的水溶液)，在適度的濃度條件和比較低的速度下，加入稀釋血樣中時，可對各種白細胞亞種群造成意想不到的體積改變。此種可使Ledis等人達到白細胞種群的分離度的發現，是以觀察到粒性白細胞亞種群對溶解劑的比較高的靈敏度為基礎的。控制淋巴細胞種群與溶解劑接觸的速度，可較好地保留粒性白細胞亞種群。但是，此種Ledis等人專利的試劑系統，僅限於其所具有的將白細胞種群分離為三種亞種群的能力;也就是，分離為淋巴白細胞亞種群、單核白細胞亞種群和粒性白細胞亞種群的能力。雖然所有上述溶解劑和試劑系統均促進分離血樣的白細胞部分(在較大或較小的程度上)，但是每一種溶解劑和試劑系統均具有一種共同的缺陷;也就是說，不能在沒有不利地改變進行此種處理的細胞的化學平衡的情況下，來分離血樣的白細胞部分。在誘發此種化學平衡的改變時，對細胞種群的影響就可以從比較小的改變(即，膨脹)一至到溶解。對白細胞種群的生理環境的顯著改變，還會改變白細胞表面標記的免疫化學應答。因此，用此種慣用的溶解劑系統處理白細胞種群，與這些白細胞種群的進一步免疫化學研究是根本不相容的。因此，到目前為止，根據上述每一種細胞種群的各自的表面標記的免疫化學應答的差異，此種局限性，妨礙了單獨應用溶解劑或與其他儀器配合使用，來進一步改進各種疾病狀態的診斷過程。
因此，本發明的目的是補救現有技術中的上述以及有關的缺陷。
更準確地說，本發明的主要目的是對複合生物流體樣品，例如全血，提供一種化學處理或預處理，此種化學處理促進後續分離、鑑定和/或分析在該流體樣品中存在的一種或幾種細胞種群。
本發明的另一個目的是，對全血樣品提供一種化學處理或預處理，此種化學處理促進血樣的分離並從而促進以其天然狀態或接近天然狀態形式存在的的白細胞部分的物理、生理和/免疫化學性質為基礎的白細胞部分的分離、鑑定和/或分析。
本發明的另一個目的是，提供一種全血樣品的化學處理或預處理，此種處理方法是選擇性地只適用於血樣中的一種細胞成分。
本發明的另一個目的是，提供一種試劑系統，此種試劑系統可快速速地和有效地將全血樣品分離為實際上是完整的白細胞部分和溶解的紅細胞部分。
本發明的再一個目的是，提供一種溶解劑系統，可用來分離鑑定全血中的白細胞亞種群。
本發明的再一個目的是，提供一種包括一種溶解劑和一種伴抑制劑的新溶解系統，可用來分離鑑定全血中的白細胞亞種群。
本發明的再一個目的是，提供一種新溶解劑系統，此溶解劑系統可通過(a)測定此種白細胞亞種群的物理和/或光學性質，和/或(b)觀察此種白細胞亞種群與專門吸附每一種白細胞亞種群上的一種或幾種表面標記的免疫劑(即，抗血清)的免疫化學應答或互相作用，有效地用來分離鑑定全血中的白細胞亞種群。
本發明的進一步目的是，提供一種方法，此種方法可通過(a)測定白細胞亞種群的物理和/或光學性質，(b)此種白細胞亞種群對專門吸附每一種所述白細胞亞種群上的一種或幾種表面標記的抗血清的免疫化學應答，來進行白細胞亞種群的分離鑑定。
上述和有關目的，可通過提供一種可選擇性地與一種複合生物流體樣品的各種細胞組分互相作用的化學試劑系統來實現。此種試劑系統，可在其各種預期的應用環境中，提供至少一種試劑組分來選擇性地將複合生物流體樣品的一種或幾種細胞成分，有效地改變到可進行所研究的細胞成分的後續分離、鑑定和/或分析所必須的程度。此種試劑系統，通過提供一種單獨的用來抑制或阻滯細胞改變劑對血樣中的細胞種群的作用的試劑，還進一步預期具有調整血樣中的細胞成分的化學處理的能力。
本發明的原理和概念已成功地在進行白血細胞的分類分析之前用於處理全血樣品。本發明的化學試劑系統的基本組分，包括一種「溶解劑」和一種稱為「抑制劑」的溶解劑的伴劑。抑制劑的主要功能是阻滯溶解劑的活性和血樣在用溶解劑處理後恢復血樣的離子平衡。
因此，本發明的溶解劑系統和方法，具有以上概述的目的，即全血樣的紅血細胞種群的選擇性溶血作用，並同時促進以顯示所研究的白細胞亞種群的特徵的一種或幾種物理、生理和/或免疫化學特性為基礎的一種或幾種白細胞亞種群的後續分離、鑑定和/或分析。本發明的溶解劑實際上是由一種水溶性化合物組成的，此種水溶性化合物在水介質中至少部分離解，從而釋放出質子和平衡離子。在將相應濃度的此種化合物加入全血樣品中時，此種化合物的離解程度可有效地將血樣酸化(PH值在大約2.6至4.0的範圍內)，並同時將血樣的重量克分子滲透壓濃度保持在低於大約100毫滲克分子。已經發現至少有三類化合物適合作為實施本發現的目的溶解劑。這幾類化合物包括低分子量的羧酸、磺酸和活性苯酚。
適合作為本發明的溶解劑的羧酸，可用下列通式表示R-COOH式中R是H、一種1至3個碳原子的脂肪烴基;一種羰基取代的1至3個碳原子的脂肪烴基;一種羥基取代的1至3個碳原子的脂肪烴基;或一種1至3個碳原子的脂肪烴基和多羰基和/或羥基取代基。
在上述通式範圍內的有代表性的羧酸，包括甲酸、甲基-羧酸(乙酸)、2-羥基-乙基-2-羧酸(乳酸);1，2-乙基-1二羧酸(琥珀酸);和2-羥基-1，2，3-丙基-三羧酸(檸檬酸);及其混合物。
適合作為本發明的溶解劑的磺酸，可用下列通式表示R-SO3H式中R是羥基、一種1至3個碳原子的脂肪烴基或芳基。
在上述通式範圍內的有代表性的磺酸，包括硫酸;甲磺酸;乙磺酸;苯磺酸;對甲苯磺酸;硝基苯磺酸及其混合物。
適合作為本發明的溶解劑的活性苯酚，可用下列通式表示
式中R是一種吸電子基團，例如囟基、氰基、硝基或任何上述吸電子取代基的組合基團;和n是1-3。
在上述通式範圍內的有代表性的活性苯酚，包括對硝基苯酚;間硝苯酚;鄰硝基苯酚;2，4-二硝基苯酚;對氯苯酚;對氰基苯酚;和1-氯-2，4-二硝基苯酚;及其混合物。
以上是可用做符合本發明的目的的溶解劑的有代表性的幾類物質。可以理解，在血樣中比較弱的酸將以未離解的化合物和離解狀態的化合物這二種形式存在。當然，強酸在血樣中實際上是完全離解的。某些未離解的酸和由離解的酸離解出來的平衡離子均可明顯地影響白細胞部分的分離度，而具體影響的程度則取決於它們在血樣中的相對濃度和所研究的細胞被分析物對酸和/或其平衡離子的生理識別(如果有的話)。例如，磷酸，即使在適當的PH值下，通常是不能令人滿意地將白細胞分離為5種亞種群。一般是假設平衡離子(磷酸根離子)的相容性是不合乎要求的，因此，要將白細胞種群分離顯然是很困難的。
在本發明的概念的此種優選是實施方案中，新溶解劑系統包括一種水溶液，此溶液中含有一種分離有效量的選自甲酸、乙酸及其混合物的溶解劑。在這些混合物中，甲酸最好是構成主要的功能組分而乙酸則僅以少量的形式存在。在本公開中所應用的「分離有效量」一詞的含義是，表示溶解劑的濃度不僅對溶解紅血細胞是有效的，而且還可以進行白細胞部分的微妙改變，來促進此種白細胞部分的後續分離、鑑定和/或分析;其中還包括提高進行白細胞種群的至少5種亞種種群的分類分析和鑑定的測試儀器的能力。甲酸在溶解劑中的優選濃度範圍是在大約0.10至0.15%(體積/體積)的範圍內。已經測出滿足上述規範的此種優選溶解劑的濃度為每毫升全血需要大約0.009至0.020毫升的甲酸。此種，溶解劑可實現白細胞部分的此種微妙的改變，並同時保持白細胞種群的5種細胞亞種群中的每一種亞種群的表面標記的免疫化學應答。如上所述，在用該溶解劑進行全血樣品的此種處理的主要目的是，此種試劑有效地實現了紅血細胞部分的基質溶解作用，並同時將白細胞部分保持在其實際上是天然的狀態。
在本發明的一種優選實施方案中，試劑系統除含有溶解劑外，還含有皂苷。「皂苷」一詞是指商品級皂樹皂苷粉。將皂苷加入試劑系統是隨意的，通常只是在臨床醫生不是用光學照相或免疫化學技術來監測某些白細胞亞種群參數時才加入。在溶解劑系統中加入適量的皂苷是有效的，因為它具有降低紅細胞碎片的大小的能力，從而防止了它們在通過測量電不透明度和/或應用Coulter在美國專利第2，656，508號和3，502，974號(本文均詳細地參了這些文獻)中所敘述的方法，測量Coulter體積來測定某些白細胞參數時所發生的幹擾。已經測出對於降低紅細胞碎片的大小是有效的優選皂苷濃度範圍為每毫升全血需要大約.006至0.012克。簡單地說，該技術涉及應用射頻電流(RF)和直流(DC)電場激勵來測定細胞的體積。通過應用低頻或直流(DC)和射頻(RF)電流激勵，產生一種檢測粒子的電場，於是從一個單獨的粒子(即白細胞)通過電場時得到二種或幾種互相關聯的輸出信號。從此種輸出信號所得出的數值叫做「相對不透明度」(relativeOpacity)，此種相對不透明度對於每一種白細胞的亞種群是獨有的。在溶解劑中加入皂苷，可將紅血細胞碎片的大小降低到它們不會干擾或它們本身不會導致顯示一種白細胞種群特徵的輸出信號發生偏差的程度。
在細胞分類是以光散射測量為基礎的情況下(應用Fulwyler在美國專利第3，989，381號和/或Auer等人在美國專利第4，038，556號中所敘述的技術一本文均詳細地參考了這些文獻)，紅細胞碎片不會干擾或不利地影響白細胞種群的各種亞種群的光度分類。因此，在白細胞種群的亞種群分類是以光度分析為基礎的情況下，就不需要在溶解劑系統中加入皂苷。
對於本發明的分類方法來說，血液樣品與溶解劑系統接觸的時間的長短是具有關鍵性意義的。正如在下文公開的實例中所說明的，此種接觸時間不應超過10秒鐘，而最好是只需要大約6秒鐘或少於6秒鐘。這二種接觸時間都是指在室溫的條件下(約18至28℃)。在每一種情況中，都是通過簡單地在血樣中加入適當濃度的鹽類來抑制溶解劑的作用，使細胞回到其天然的生理環境。抑制劑有效地阻滯溶解劑對白細胞種群的進一步活性，而不需要再加入固定劑。在白細胞部分的後續分析需要阻滯溶解劑的活性的情況下，溶解劑的抑制劑實際上是溶解劑系統的一種補體。此種抑制劑通過將pH值(大約6.00至7.25)和重量克分子滲透在濃度(大約300至330毫滲光分子)控制在一個相當狹窄的範圍內，來穩定白細胞種群。還可以配製抑制劑來匹配選用於聚焦流式孔分析系統的「鞘」流體的導電性。當根據Coulter等人在美國專利第3，502，974號(上述所列參考文獻)中所敘述的技術(RF電流與DC電場結合進行激勵)進行分析時，調節抑制劑的組成和體積，來提供5種主要白細胞亞種群的最佳分離。按上述方法處理的血樣中的白細胞部分，可通過應用能夠進行多參數粒子(細胞)測定的血液分析器;和通過與專門吸附那些在每一種白細胞亞種群的細胞上的一種或幾種表面標記的抗血清(即，抗體、結合蛋白等)的免疫化學作用，容易地分離為至少5種亞種群。
圖1、2和3是表示實例2的血樣的白細胞分類分析的散點圖;每一張圖中的，X軸都是互不相同的。
圖4是表示實例1的血樣的白細胞分類分析的散點圖。
圖5是表示實例5的血樣的白細胞分類分析的散點圖。
圖6是表示實例6的血樣的白細胞分類分析的散點圖。
本發明的溶解劑系統，包括一種含有令人意想不到的低濃度的溶解劑(最好是低於1.0%(體積))的水溶液。本發明的溶解劑系統的溶解劑，通常可描述為一種水溶性的在水介質中至少部分離解的酸性化合物。如上所述，對於在本發明所預期的各種環境的中使用的此種可溶於水的酸性化合物來說，有許多相互聯繫的因素是很重要的。這些因素，包括PH、重量克分子滲透壓濃度和平衡離子的相容性。為了使紅血細胞種群進行合乎要求的溶解，必須將血樣酸化。但是，在此種血樣的PH值不在大約2.6至4.0的優選範圍為的情況下，將白細胞部分分離為獨特的亞種群的能力就明顯地受到損害。
在溶解的血樣的重量克分子滲透壓濃度不能保持在低於100毫滲克分子的情況下，此種有效地將白細胞種群分離為其各種亞群的能力，也受到阻礙。因此，在不能將溶解的血樣的PH值或重量克分子滲透壓濃度保持在所述的參數範圍內的情況下，有效地將白細胞種群分離為各種亞種群的能力顯然受到損害。
在其些情況下，已經證明離解了的酸性化合物的平衡離子，可導致白細胞部分的分離受到影響的程度。例如，磷酸，即使在可產生適當的PH值和重量克分子滲透壓濃度的濃度下，也不能有效地將此種白細胞部分分離為其各種亞種群。一般是假設此種酸(磷酸)的平衡離子以某種未知的方式與白細胞部分相互作用或者是不能與白細胞部分相互作用，從而不能提供由其他水溶性的酸性化合物所提供的分離的程度。
可能還會有其他的是溶解劑所固有的對血樣的作用的因素和機理，這些因素和機理導致了本發明的令人意想不到的和出乎意料的結果。到目前為止，只確定了以上列舉的三種因素，也不打算暗示本發明的有效性只取決於上述已確定的因素。
本發明的溶解劑最好是一種甲酸、乙酸或甲酸與乙酸的混合物水溶液，其中甲酸是主要的功能組分。簡單地將溶解劑加入去離子水中即可配製此種水溶液。加入此種稀釋劑的溶解劑的量足以配製溶解劑濃度約為0.05%至0.5%(體積/體積)的溶液。在本發明的優選實施方案中，溶解劑的濃度約為0.1至0.25%(體積/體積)。
在該溶解劑包括一種含有甲酸和乙酸的混合物的情況下，乙酸最好是只能以部分取代有決定性意義的量的甲酸的形式存在，因此，其濃度只在大約0.05至0.10%(體積/體積)。
溶解劑系統，除了溶解劑外，還可以隨意地含有非常少量的皂苷(最好是至少大約0.05至0.2%(重量)。目前已充分認識到，作為一種溶解劑，皂苷的有效性是高度取決於濃度的。如果皂苷的濃度低，通常是不起作用的。如果將皂苷用作一種溶解劑時，其濃度必須至少為2%(重量)才能實際上完成紅血細胞的基質溶解作用。但是，遺憾的是，在皂苷以溶解有效量存在的情況下，它還能導致白細胞的溶解。因此，應用皂苷作為一種溶解劑，在白血細胞種群中的任何誘導的改變，及其用自動測試儀器進行的後續分類，都必須以它們各自的核的任何一種可覺察的和明顯的特性為基礎。但是，在臨床醫生遇到所謂的「形骸細胞」(完整的紅細胞膜)幹擾以物理和/或電性質的差異為基礎的分類鑑定的情況下，在本發明的溶解劑系統中最好是有皂苷存在。如上所述，如果在用純光度儀器和/或通過免疫化學分析進行分類化鑑定的情況下，不需要將皂苷加入溶解劑系統中。
溶解劑系統中還可以含有其他的常規添加劑，其含量只要未達到與溶解劑系統的主要功能組分(即抗微生物保存劑，例如鈉萬畝定)不相容的程度。
本發明的溶解劑系統可通過簡單地將其用人工加入或自動加入的方法來與全血樣品混合，令溶解劑和血樣進行短時間的互相作用，然後加入合適的抑制劑來實際上阻滯溶解劑的作用。因此，當將在此種環境中有效的抑制劑加入血樣和溶解劑中所含的水混合物中時，必須能夠立即阻滯溶解劑的溶解活性。抑制劑的準確配方是可以改變的，而具體的配方則取決於聚焦流式孔分析系統中所使用的溶解劑系統和鞘流體的組成。抑制劑通常是一種含有可溶性鹽的水溶液，這些可溶性鹽能夠有效地實際上阻滯和/或實際上抑制溶解劑的溶解活性並恢復血樣的離子平衡。此種恢復離子平衡的作用，可延長存活細胞的存活力並可應用儀器來進行後續分析，此種儀器要求血樣具有導電性(含有電解質)，例如應用Coulter Counter 全血分析器。
適用於與本發明的溶解劑組合物配合使用的抑制劑，通常可含有下列4種成份的至少二種成分的任何組合物氯化鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉;此外，還含有作為保存劑的疊氮化物。在本發明的上下文中，抑制劑對溶解劑作用的有效性，是由它能快速降低選用於溶解劑系統中的羧酸和不揮發性無機酸的溶解活性的能力來確定的。如上所述，用於白細胞亞種群的分離的方法和儀器，還能夠對抑制劑的準確的配方提出某些技術要求(即導電性、PH值等)。更準確地說，當此種分離分析在聚焦流式孔分析系統中進行時，抑制劑的組成和體積對於將5種白細胞亞種群互相進行最佳的分離是具有關鏈性意義的。在此種類型的分析系統中，還必須調節抑制劑的離子平衡，來獲得溶解的血樣與鞘流體的令人滿意的導電性匹配。在優選的抑制劑配方中，主要的離子及其在溶解劑的一抑制的血樣中的相對比值，應該實際上與主要的離子及其在鞘流體中相對比值是相同的。抑制劑的功能組分的相對濃度(此種抑制劑將與本發明的溶解劑系統配合使用)，將在大約1至3%(重量/體積)的氯化鈉、大約0.25至0.8%(重量/體積)的碳酸鈉或碳酸氫鈉以及大約2至4%(重量/體積)的硫酸鈉的範圍內。最佳的抑制劑的成分的準確相對量通常是由經驗來確定的;此種調節的目的是使溶解的血樣的PH值達到大約6.0至7.5的範圍內，而穩定的溶解血樣的最後重量克分子滲透壓濃度則達到大約300至330毫滲克分子的範圍內。以前在聚焦流式孔系統中已經觀察到，通過將最後血樣的重量克分子滲透壓濃度調節到大約310毫滲克分子，可達到白細胞亞種群的最佳群生。用一種鹼性抑制劑來實際上完全中和溶解的血樣的酸度，對於聚焦流式孔分析系統是具有關鍵性意義的。血樣的組分(即血纖維蛋白和血小板)對PH是很敏感的，而且在酸性條件下可形成聚集體，此種聚集體可能干擾分離分析(即噪聲)或實際上阻塞聚焦流式孔系統的孔。
既不預期也不想要抑制劑也必然能阻止或抑制皂苷(如果存在時)。其理由是十分簡單的，因為皂苷在預期的濃度時(大約0.2%(重量))，是一種比較無效的溶解劑。如果在將皂苷加入血樣中時，抑制劑也能阻止皂苷的活性的話，那麼血樣的適當澄清(破壞完整的紅血細胞膜)就不會發生。因此，預料在抑制了溶解劑的活性後，皂苷的活性可延續大約5至15秒鐘。在某些情況下，可適當地提供一種只適用於皂苷的抑制劑;但是，在目前預期的濃度(低於0.1%)下，還沒有可達到或促進本發明的皂苷抑制劑。當然，抑制劑的適合程度是根據關於血樣(所研究的被分折物)中的細胞對溶解劑的靈敏度和在進行分析之前溶解劑與這些細胞被分析物接觸的時間來確定的。如上所述，抑制劑阻滯了溶解活性，但是它不能完全消除其對血樣中的白細胞部分的影響。因此，如果在加入抑制劑和分析血樣之間經過一段相當長的時間的話，那麼，最好是將白細胞部分固定，來保留所研究的細胞被分析物的特徵大小和形狀。
在本發明的優選方案中，溶解劑與血樣有效接觸的時間(從溶解劑與血樣混合的時間到加入抑制劑的時間)，必須少於10秒，而最好是6秒或少於6秒。假設溶解劑與血樣的活性接觸是在室溫(大約18至28℃)下進行的，則其活性接觸時間間隔，為上面所規定的時間。當然，如果溫度超過此水平時，活性接觸的時間就會稍微縮短和縮得更短;如果溫度低於此水平時，則活性接觸的時間就會稍微加長。為了成功地實施本發明的分離方法，具有關鍵性意義和必不可少的是小心地和準確地控制溶解劑與犧牲的細胞種群(紅血細胞)和所需要的細胞部分(白細胞種群)的相互作用的動力學。目前還不準確地知道溶解劑與二種細胞部分之間的反應的機理，而只是顯示出此種相互作用的結果。因此，推測在分離分析中是怎樣達要這些改進的，是不屬於本文的討範圍的，因此，本文並不試圖對此種機理進行解釋或隨後對此種機理提求權利要求。
限制這二種細胞部分與溶解劑的接觸，可有效地和有效率地進行紅細胞種群的基質溶解作用，而由抑制劑誘導的白細胞種群的外加的微秒改變，可使它們能夠進行有效的分離。這二種情況實際上是同時發生的，並同時使分離的白細胞部分保持其天然的免疫化學反應性。
如上所述，溶解劑與血液的接觸時間，足以使犧牲的細胞部分產生選擇性的破壞性應答，而又同時使白細胞部分產生分離應答;此種改變令人意想不到的可使白細胞種群的至少5種細胞亞種群之間進行實際的分離。此種溶解劑，極不同於慣用的溶解劑(即皂苷、季胺鹽)，它不會有害地改變白細胞亞種群中的每一個細胞的表面標記的天然免疫化學應答。對於本發明的此種溶解劑來說，此種質量是獨特的。
可將已經與上述溶解劑系統接觸的血樣，用進行分離鑑定的儀器來進行分離鑑定。此種分離可應用採用美國專利第3，549，994號(本文詳細地參考了此文獻)、第3，502，974號和第3，989，381號中所敘述的設備來進行。可將上述參考專利中所敘述的發明的特點，具體結合到工業用的儀器中去。簡單地說，首先應用自動移液設備，將血樣與溶解劑系統混合，來處理血樣。溶解劑對犧牲細胞種群(紅血細胞)的溶解作用必須同時是快速的和有效的。然後用同樣的移液設備將抑制劑加入，來實際上阻滯溶解劑對存活的細胞部分(白細胞)的活性。然後將含有白細胞部分的血樣進行每一種個別的細胞亞種群的計數，和/或用此種方式收集的數據來繪製直方圖和/或散點圖。
本技術領域中的工作人員都知道，在進行Coulter體積測量中所包括的原理叫做「Coulter原理」簡單地說，採用coulter原理的儀器的操作，包括測定由於個別細胞通過設計用來測量由於細胞的存在所導致的電壓降的傳感器時所引致的阻抗的變化。採用此原理的儀器包括二個流體容器或室，在每一個容器或室中裝有導電性電解質溶液。將至少二個有相反電性的電極插入該電解質溶液中，其中每一個流體隔室中分別插入一個電極。將其中有血細胞懸浮的電解質溶液樣品，通過在二個流體隔室之間的狹窄的通道或銳孔。不過此種狹窄的通道可以具有各種不同的形狀，在每一套儀器中，此種通道規定出一個傳感區，在此傳感區中由於有或無粒子的存在而導致通道中發生可探測出的電性的變化。例如，當導電性比較差的血細胞通過此通道時，取代了其體積與細胞體積相等的電解質溶液，於是由於增加了通道的阻抗而使電壓下降。由電壓下降所造成的電阻的脈動式起伏可用來進行粒子計數和粒子體積測定。在美國專利第2，656，508號中較詳細地敘述了Coulter原理。此種傳感和鑑定特定細胞種群的技術，可以通過將coulter原理的測量方法與在傳感區中用射頻激勵細胞的方法相結合來提高。簡單地說，此種射頻提高作用是根據一個粒子通過血液學分析器的傳感區時，可導致傳感區中的射頻(RF)能量的相移的原理來工作的。此種相移可與細胞種群的物理和組成特性相關聯。在美國專利第3，502，974號中較細地敘述了此種細胞的RF分類技術。白細胞分類還可以利用美國專利第3，380，584號(本發明已詳細地參考此文獻)中所敘述的流式細胞光度術的光學測量原理來進行。
本發明的溶解劑系統，可有效地誘導白細胞部分的微妙改變，來提高用自動細胞計數設備進行白細胞種群的5種獨特的亞種群的分類，例如見美國專利第4，412，004號(Ornstein等人，本發明已詳細地參考此文獻)。如上所述，這些5種獨特的亞種群淋巴白細胞亞種群、單核白細胞亞種群和三種粒性的細胞亞種群包括(嗜酸性細胞、嗜鹼性細胞和嗜中性細胞)。白細胞種群中的這些每一種亞種群都具有獨特的表面標記。在某些疾病狀態下，在一種或幾種這些亞種群上的表面標記，可提供一種獨特的免疫化學應答，因而有可能在疾病發展的初期就將其診斷出來或確診。檢出在白細胞種群的這些一種或幾種亞種群上的這些獨特的表面標記，當然是取決於有效地將這些具有特徵疾病狀態表面標記的細胞實際上與未受疾病影響的細胞分離開來;以及在被分析的血樣中的受疾病影響的細胞的相對濃度。
本發明所預期的起始溶解條件，可延續存活的和要將其互相分離開來的細胞種群的存活力。對於其中的大部分細胞來說，預期至少72小時的細胞存活力，將適合於某些類型的免疫化學分析。在本分類方法的某些應用中，將一種或幾種這些亞種群在體外保持幾小時或甚至可能幾天，可能是必需的和適當的。為了達到此種延長的穩定性，將白細胞種群與含有溶解劑/抑制劑混合物的流體部分實際上分離開，隨後再將這些細胞懸浮在一種生理介質中是切實可行的。
下列實例用來說明本發明的溶解劑系統的獨特優點。在配製和評價此種溶解劑系統對所採用的設備和技術是標準化的或者是上文中所敘述的。除非另行規定，否則在下列實例中所用的份數和百分數均用重量表示。
實施例1用試劑級化學物質配製本發明的溶解劑系統。首先將1.3毫升的90%甲酸與998毫升去離子水混合，配製0.12%(體積/體積)的甲酸溶液。將50微升全血樣品(K3EDTA)與800微升的0.12%甲酸溶液一起在室溫下(大約20℃)旋動5秒鐘，使其緩緩混合。加入400微升的含有0.55%碳酸氫鈉、3.0%氯化鈉和0.01%疊氮化鈉的抑制劑溶液，大約5秒鐘後，甲酸的溶解作用即受到抑制。在加入抑制劑後的大約5至10秒鐘內，血樣即受到抑制並隨即可以用流式細胞光度技術來進行分類分析。用於此種分類分析的設備裝有測定光散射的氦/氖雷射器和矽二極體探測器。應用光學參數分析法來觀察白細胞種群和它們的各個參數，即測量消光(零角散射)，和任何一種幾種角度範圍內的光散射。圖4說明用上述方法繪製的血樣的散點圖。在此散點圖上，可鑑定出和用數量表示出白細胞種群的5種獨特的亞種群。
實施例2重複實例1的步驟，但是將0.05%(重量/體積)皂苷粉加入含有0.12%甲酸的水溶液中。然後將全血樣品(50微升)與600微升溶解劑)混合。加入265微升的含有0.60%碳酸鈉和3.00%氯化鈉的水溶液，6秒鐘後，溶解劑即被抑制。
在溶解組合物中加入皂苷，可有效地消除根據Coulter體積測定時的紅細胞碎片的幹擾。皂苷的有效性高度取決於溫度。要實際上完全消除紅細胞碎片的幹擾，在完成溶解血樣中的紅細胞部分後，還需要再延長10秒鐘(在大約18至28℃室溫下)。在將血樣保持在低溫(低於18℃)的情況下，需要稍長的時間來通過皂苷有效地消除紅細胞碎片的幹擾。
在加入抑制劑後大約10至20秒鐘內，即可將血樣進行分類分析。按實例1中所述的步驟將血樣進行光學照相測定。還應用一種ISOTON 鞘流體和DC電場和RF電流測定細胞體積，來對血樣中的白細胞種群進行觀察，圖1說明最後所得到的散點圖。在同時得到的圖2所表示的光散射對DC的散點圖上，可鑑定出和用數量表示出白細胞種群的4種獨特的亞種群。而白細胞的第5種亞種群(嗜鹼性細胞)則是通過一種柵控二次散點圖(gated secondary scattergram)來分離。此種嗜鹼性細胞種群描述在圖3表示的散點圖中。
實例3重複實例2的步驟，應用相同的甲酸/皂苷試劑組合物。用含有3.13%(重量/體積)硫酸鈉(無水)、1.45%(重量/體積)氯化鈉和0.60%(重量/體積)碳酸鈉(無水)的抑制劑來抑制甲酸的溶解活性。按實例2中所敘述的方法，用電光技術來分析血樣，散點圖的結果類似於圖1、2和3的結果。但是，鞘流體改為ISOTON Ⅲ稀釋劑。
實例4重複實例3的步驟，但是應用一種濃的溶解的一投制的血樣來較快速地獲得數據。溶解劑包括0.15%(體積/體積)甲酸和含有0.10%(重量/體積)皂苷粉。用含有2.67%(重量/體積)硫酸鈉(無水)、1.24%(重量/體積)氯化鈉和0.56%(重量/體積)碳酸鈉(無水)的抑制劑來抑制甲酸的溶解活性。
實例5重複實例1的步驟，但是用0.01%(體積/體積)乙酸代替溶解系統中的甲酸。在加入2.0%氯化鈉溶液中含有0.25%碳酸氫鈉的抑制劑後大約5秒鐘，該試劑的活性即受到抑制。在加入抑制劑後的大約5至10秒鐘內，血樣即受到適當地抑制並隨即可以用流式細胞光度技術來進行分類分析。在此分析中所用的設備和分析技術實際上與實例1中所用的設備和分析技術相同。圖5中的散點圖說明對此血樣所進行的分類分析。
實例6重複實例5的步驟，但是，在加入抑制劑前，將血樣與溶解劑接觸的時間由5秒鐘延長至7秒鐘。還將碳酸氯鈉在2.0%氯化鈉溶液中的濃度由0.25%增加到0.375%來稍稍改變抑制劑。圖6中的散點圖說明白細胞種群的此種分類分析的結果。
實例7重複實例1的步驟，但是應用免疫化學技術來分離和鑑定的細胞種群的各種亞種群。在溶解劑的作用剛抑制後，將血樣用一種等滲緩衝液來稀釋並用一系列磁粉來順序地進行打漿，每一種磁粉已用一種不同的只專門吸附一種白細胞種群的抗血清進行了預處理。應用上述詳細參考的文獻中所敘述的常規磁粉分離技術，可將所吸附的細胞順序地從血樣中分離出來。然後將分離出來來磁粉再進行顯示一種或幾種疾病狀態的表面標記的篩分。
實例8重複進行實例7的步驟，但是將細胞與磁粉分離，然後根據Nature第256卷第495-497頁(1975年)中Kahler和Milstein提出的步驟，將該細胞用一種不死的細胞株培養。將按此方式生產的無性繁殖系進行篩分，來生產專門吸附所研究的表面標記的抗血清。
實例9重複實例5的步驟，但是用0.10%(體積/體積)檸檬酸代替溶解劑系統中的乙酸。用檸檬酸代替乙酸後所獲得的結果與實例5所獲得的結果是相當不多的。
實例10重複實例5的步驟，但是用0.1%(體積/體積)琥珀酸代替溶解劑)系統中的乙酸。用琥珀酸代替乙酸後所獲得的結果與實例5所獲得的結果是相差不多的。
實例11重複實例5的步驟，但是用0.1%(體積/體積)乳酸代替溶解劑)系統中的乙酸。用乳酸代替乙酸後所獲得的結果與實例5所獲得的結果是相差不多的。
實例12重複實例5的步驟，但是用0.5%(體積/體積)硫酸代替溶解劑系統中的乙酸。用硫酸代替乙酸後所獲得的結果與實例5所獲得的結果是相差不多的。
以上內容詳盡的說明書和實例，是用來說明本發明的溶解劑、溶解劑系統和方法的某些優選實施方案。本發明人無意將他們的發明的上述這些特殊實施方案解釋為是對其發明的範圍和寬度的說明，而只是簡單地用來支持其所提出的權利要求書。
權利要求
1.一種與全血中的一種或幾種細胞組分進行選擇性溶解作用的溶解劑系統，所述系統包括一種水溶液，其中含有一種稀釋劑和一種分離有效量的實際上是由一種水溶性化合物組成的溶解劑，此種水溶性化合物在水介質中至少部分離解，從而產生游離質子和平衡離子，在將分離有效量的所述化合物加入全血樣品中，可(i)將血樣的PH值由其生理水平降至大約2.6至4.0的範圍內，並同時將血樣的重量克分子滲透壓濃度保持在至少低於大約100毫滲克分子，(ii)進行紅血細胞部分的快速的和實際上是完全的溶血作用，和(iii)進行白細胞部分的微妙改變，來提高進行白細胞種群的至少5種亞種群的分類分析和鑑定的儀器的能力，並在進行所述微妙改變的同時，將白細胞亞種群保持在其實際上是天然的生理狀態和/或免疫化學狀態。
2.一種進行的血細胞分類分析的試驗試劑(test kit)，其中包括(a)一種溶解劑系統，其中含有一種稀釋劑和一種分離有效量的實際上是由一種水溶性化合物組成的溶解劑，此種水溶性化合物在水介質中至少部分離解，從而產生游離質子和平衡離子，在將分離有效量的所述化合物加入全血樣品中時，可(ⅰ)將血樣的PH值由生理水平降至大約2.6至4.0的範圍內，並同時將血樣的重量克分子滲透壓濃度保持在至少低於大約100毫滲克分子分子，(ⅱ)進行紅血細胞部分的快速的和實際上是完全的溶血作用，和(ⅲ)進行白細胞部分的微妙改變，來提高進行白細胞種群的至少5種亞種群的分類分析和鑑定的儀器的能力，並在進行所述微妙改變的同時，將白細胞亞種群保持在其實際上是天然的生理狀態和/或免疫化學狀態。(b)一種實際上是由一種鹼性鹽水溶液組成的抑制劑，在將其加入血樣中時，此種鹼性鹽水溶液可有效地快速阻滯溶解劑的溶解活性，並同時將溶解的血樣穩定在PH值約為6至7.5的範圍內而重量克分子滲透濃度則穩定在約為300毫滲克分子的範圍內。
3.在一種含有可使全血樣品中的紅細胞部分進行選擇性溶血作用的溶解劑的試劑系統中，可使血樣中的白細胞部分進行物理分離和/或分析，其改變措施包括一種鹼性鹽水溶液，在將其加入血樣中時，此種鹼性鹽水溶液可有效地快速阻滯溶解劑的溶解活性，並同時將溶解的血樣穩定在PH值約為6至7.5的範圍內而重量克分子滲透壓濃度則穩定在300至330毫滲克分子的範圍內。
4.一種使全血樣品中的紅細胞種群進行選擇性溶血作用，並同時促進血樣中的一種或幾種白細胞亞種群的後續分離、鑑定和/或分析的方法，所述的分離、鑑定和/或分析是以白細胞種群的一種或幾種物理、生理和/或免疫化學特性為基礎的，這些特性顯示所研究的亞種群的特徵，所述方法包括(a)提供一種水溶性溶解劑系統，其中含有一種稀釋劑和一種分離有效量的實際上是由一種水溶性化合物組成的溶解劑，此種水溶性溶解劑在水介質中至少部分離解，從而產生游離質子和平衡離子，在將分離有效量的所述化合物加入全血樣品中時，可(ⅰ)將血樣的PH值由其生理水平降至大約2.6至4.0的範圍內，並同時將血樣的重量克分子滲透壓濃度保持在至少低於大約100毫滲克分子，(ⅱ)進行紅血細胞部分的快速的和實際上是完全的溶血作用，和(ⅲ)進行白細胞部分的微妙改變，來提高進行白細胞種群的至少5種亞種群的分類分析和鑑定的儀器的能力，並在進行所述微妙改變的同時，將白細胞亞種群保持在實際上是天然的生理狀態和/或免疫化學狀態;(b)將全血樣品與分離有效量的溶解劑系統接觸;(c)使溶解劑和血樣在18至28℃的溫度範圍內進行一段不超過10秒鐘的作用時間;和(d)加入一種抑制劑，阻滯溶解劑對血樣中的白細胞部分的作用，所述抑制劑的濃度足以實際上立即阻滯溶解劑的溶解活性並恢復白細胞種群在血樣中的生理環境。
全文摘要
本發明的溶解劑包括一種水溶性化合物，此種化合物在水溶液中可至少部分離解並釋放出一個質子和一個平衡離子，從而將該血樣酸化至PH值約為2.6至4.0。本試劑系統的優點和獨特性是意想不到的速度(在室溫下通常低於10秒)和使白細胞種群(特別是粒性白細胞種群)進一步分離的能力。在基質溶解後，加入一種抑制劑來阻滯溶解劑系統的活性，從而抑制對白細胞種群的任何進一步的引人注目的改變。
文檔編號G01N33/50GK1030481SQ8810167
公開日1989年1月18日 申請日期1988年3月11日 優先權日1987年3月13日
發明者史蒂芬·拉·萊德斯, 哈羅德·裡·克魯斯, 蒂莫西·傑·費希爾, 特德·塞納 申請人:庫爾特電子公司