高致病性豬藍耳病病毒重組質粒和遺傳工程疫苗的製作方法

2023-11-02 04:05:57

專利名稱：：高致病性豬藍耳病病毒重組質粒和遺傳工程疫苗的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物工程領域，具體地說，涉及一種病毒的重組質粒和遺傳工程疫苗，更具體地說，涉及一種高致病性豬藍耳病病毒重組質粒和遺傳工程疫苗。
背景技術：
：豬繁殖與呼吸症候群(PorcineR印roductiveandRespiratorySyndrome,PRRS),又稱藍耳病，是一種由豬繁殖與呼吸障礙症候群病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病。PRRSV基因組為大小約15kb、不分節段的單股正鏈RNA。由於RNA病毒易於發生遺傳及抗原突變，近年來在世界各地出現了致病力增強的PRRSV變異株，另外，因為PRRSV靶細胞為免疫系統重要成員之一的肺泡巨噬細胞，感染豬大多呈現免疫抑制而致繼發感染和混合感染。為了更深入的了解PRRSV的生物學特性和不斷變化的現狀，最有效的方法之一就是利用反向遺傳作業系統對其基因組結構和生物學特性進行相應的研究，從而獲取其結構與基因的直接證據。早在1998年Meulenberg就成功構建起歐洲株LV(LelystadVirus)的重組質粒，而後世界各國的科學家也紛紛構建起不同病毒株的重組質粒，而且試驗證據也在不斷證明，拯救出來的病毒一般都具有與野毒株相類似的生物學特性，但是這些野毒株和構建的重組質粒大多屬於經典PRRSV株，感染率和致死率均不高，不能有效區分強毒株與弱毒株對動物體致病力的差異。2006年5月以來，中國爆發了高致病性PRRSV引發的所謂"豬高熱症候群"，該病以傳播迅猛、高致死率為特徵，死亡率竟然高達80%-100%。尤其令人吃驚的是，高致病性PRRSV與典型株不同，表現於不僅僅感染仔豬死亡率可達100%，而且77日齡成年感染豬死亡率也高達57%。因此，很有必要構建出高致病性病毒重組質粒株，以便於對高致病性的PRRSV的生物學特性進行研究，同時，開發新型高效的藍耳病疫苗也成為當務之急。但是，由於PRRSV基因組很長，是大小約15kb、不分節段的單鏈正股RNA，編碼至少9個開放閱讀框(ORF)，而且這些閱讀框兩兩之間具有重疊區域，因此閱讀框中的一個鹼基的變化就有可能會影響整個基因組的結構從而導致整個全長質粒不具備感染性；此外，因為RNA病毒自身的特點，其基因組並不穩定，因此，利用傳統的方法，很難從cDNA直接獲得全長重組質粒，從而成為開發新型高效的藍耳病疫苗的工作的瓶頸。PRRSV結構蛋白構成外觀圓形有囊膜的病毒顆粒，其中，0RF5、0RF6和0RF7所編碼的產物為病毒蛋白必需蛋白，而其他糖蛋白GP2、GP3、GP4等在病毒顆粒組裝乃至激發機體內免疫過程中的作用還存在爭議。GP5被認為是病毒的細胞結合蛋白，同時也是刺激機體產生中和抗體的主要蛋白，核衣殼蛋白N是免疫原性最強的蛋白，因此，針對這些在病毒感染過程中與激發機體免疫極其相關的這些蛋白，開發豬繁殖與呼吸症候群疫苗成為可能。另一方面，不同病毒株間遺傳及抗原差異很大，如何提高疫苗毒株的交叉保護性以及研製針對目前優勢流行株的高效疫苗是亟待解決的問題。利用反向遺傳操作技術可以構建不同毒株間的嵌合病毒，使其具備多種病毒的免疫學特性；另外，這種嵌合疫苗是在基因水平上按照理想設計改造病原體，即將兩種或多種相似的病原體的基因組或片段用基因工程的方法以不同形式連接或置換，從而可以得到減毒活疫苗。因此，利用嵌合疫苗開發新型高效的豬繁殖與呼吸症候群疫苗具有可行性。
發明內容本發明的目的在於，提供一種高致病性豬藍耳病病毒重組質粒的構建方法。本發明還有一個目的在於，提供一種高致病性藍耳病的遺傳工程活疫苗。本發明還有一個目的在於，提供一種高致病性藍耳病的遺傳工程活疫苗的構建方法。本發明的從病毒cDNA獲得高致病性藍耳病病毒的重組質粒的方法，為根據藍耳病病毒相對保守區的序列設計多對引物對，利用高致病性豬藍耳病病毒cDNA為模板，分段擴增藍耳病病毒基因序列，然後將擴增出的序列依次連接到合適的載體，從而獲得了一種高致病性藍耳病病毒重組質粒。本發明的高致病性藍耳病的遺傳工程活疫苗，是編碼結構蛋白的序列和3'UTR基因被所述重組質粒的相應的編碼結構蛋白的序列以及3'UTR基因所替代的弱毒疫苗株。本發明的高致病性藍耳病的遺傳工程活疫苗的構建方法包括以下步驟首先擴增出重組質粒的結構蛋白基因；然後將擴增出的結構蛋白基因和弱毒疫苗株進行酶切，最後將酶切後的結構蛋白基因和弱毒疫苗株進行連接，並轉化T0P10，然後通過篩選獲得遺傳工程活疫苗，從而提供了相應的構建方法。使用本發明的重組質粒構建方法，可以將基於發病豬場獲得的血清中分離出來的病毒構建成全長感染性cDNA質粒pJX143，該病毒及其拯救出來的病毒具有和野生親本毒相似的生物學特性和動物宿主的感染力和致死率。而且後續的試驗證實，該重組質粒確實是引起這次"豬無名高熱"的主要致病病原。同時，基於上述重組質粒，構建的一株疫苗株pSX12對豬體具有較好安全性，免疫後可有效誘導產生機體免疫，並提供豬體免疫保護作用，對"豬高致病性藍耳病"的免疫保護率高達100%，安全有效。圖1是不同PRRS-F/PRRS-R引物對擴增PRRSV全基因組序列PCR產物電泳檢測結果，其中，泳道l為由引物SF1392和SR6589獲得的長度約為5kb的PCR片段，泳道2為由引物SF4344和SR9033獲得的長度約為5kb的PCR片段，泳道3為由引物SF7682和SR13334獲得的長度約為5.5kb的PCR片段，泳道4為引物STL和SR2573獲得的長度約為2.5kb的PCR片段，泳道5為由引物SF11422和Qst獲得的長度約為2.5kb的PCR片段。圖2是PRRSV基因組全長cDNA質粒構建策略示意圖。圖3是全基因組質粒構建示意圖。圖4是用重組質粒轉染細胞後出現的細胞病變結果。圖5是拯救病毒的N蛋白免疫螢光照片，其中，A是被拯救病毒vJX143的N蛋白免疫螢光照片；B是被拯救病毒vJX143-M的N蛋白免疫螢光照片；C為陰性對照。圖6是對照弱毒株、拯救病毒株與野毒株病毒滴度比較結果。圖7是拯救病毒株、野毒株和陰性對照對豬的體溫影響的結果。圖8是嵌合質粒構建示意圖。圖9是嵌合病毒構建過程中結構蛋白擴增的電泳結果。圖10是Smal酶切嵌合質粒pSX12、p5NX12和p56N12的電泳結果，其中，泳道1是Smal酶切的pSX12，泳道2是Smal酶切的p5NX12，泳道3是Smal酶切的p56N12，泳道4是Smal酶切的陽性對照pAPRRS。圖11是試驗及對照組豬在PRRSVSX12株病毒接種及PRRSVJX143株病毒攻毒後每天體溫變化。圖12是在vSX12株病毒接種後第0，3，5，7，10，14，21，28天抗體變化圖。具體實施例方式在本發明中，所述豬藍耳病病毒或豬繁殖與呼吸症候群病毒株指的是，豬繁殖與呼吸症候群病毒vJX143株。在本發明中，所述重組質粒指的是，利用反向遺傳操作技術，由上述野毒株獲得的cDNA質粒pJX143。在本發明中，所述嵌合病毒指的是，利用基因嵌合技術獲得的全長重組質粒pSX12、p5NX12和p56N12。在本發明中，所述的反向遺傳操作指的是相對於經典遺傳學而言的，是在獲得高致病性藍耳病基因組全部序列(JX143)的基礎上，通過對病毒基因進行必要的加工和修飾，如定點突變、基因插入/缺失、基因置換等，再按組成順序構建全長病毒基因組，讓其裝配出具有生物活性的病毒粒子，研究高致病性藍耳病基因組的結構與功能，以及這些修飾可能對病毒的表型、性狀有何種影響等方面的內容。在本發明中，所述北美株和歐洲株代表株指的分別是，北美株經典毒株VR2332(Genbankaccession抑Q217415)和歐洲株經典毒株LV(Genbankaccession棚96262)。在本發明中，所述弱病毒株pAPRRS指的是，參考文獻孫志，王金勇，張建武，秦愛健，袁世山，豬繁殖與呼吸障礙症候群病毒3'UTR的反向遺傳操作.微生物學報[J]，2007，47(5):774-778.的方法，利用系列傳代獲得的一株弱毒株的感染性克隆。以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限定本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件進行。在本發明的實施例中，使用的病毒和細胞Marc-145細胞(美國細胞保藏中心ATCC，保存號為CRL-2378.1);高致病性的PRRSV病毒vJX143株(中國普通微生物保藏管理中心保存號為CGMCCNo.1964)，利用其感染正常豬仔710天後取血清待用。在本發明的實施例中，使用的質粒與菌株:pBlueScript1ISK(+)載體購自Invitrogen公司，pBS-T載體、T0P10感受態細胞購自TIANGENE公司。在本發明的實施例中，使用的其他試劑QIAampViralRNAMiniKit購自QIAGENE公司，DNA膠回收試劑盒和QuantReverseTranscriptase購自TIANGENE公司，rTaqDNA聚合酶，dNTP和限制性內切酶購自TaKaRa公司，質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，DMRIE-C轉染試劑購自Invitrogen公司，Opti-MEM購自Invitrogen公司。在本發明的實施例中，Marc-145單層細胞採用以下方法製備Marc-145細胞在含有6%FBS的DMEM培養基的六孔板中貼壁長滿單層後，棄培養基，PBS洗兩遍後加入維持液(2%FBS的DMEM)培養基，37°C5%0)2培養箱中培養。在本發明的實施例中，細胞回歸試驗過程如下利用試驗豬體內各組織臟器的病料研磨勻漿上清感染單層Marc-145細胞，然後進行傳代，以觀察是否可以出現細胞病變，如出現，則證明豬體內各組織臟器中含有具有生物活性的病毒粒子。實施例l、高致病性藍耳病病毒重組質粒的構建根據GenBank登錄號為EF488048的高致病性藍耳病病毒基因JX143的鹼基序列，設計出5對引物，分別作為PCR擴增的引物；然後將從使用PRRSV病毒vJX143株感染的豬仔的血清中提取高致病性病毒RNA，反轉錄合成為野毒株cDNA，以其作為PCR的模板，進行PCR擴增，獲得野毒株cDNA的5條特異性片段l-5，並將第5條特異性片段進行突變，獲得特異性片段5';然後將特異性片段l一5或特異性片段l一4+5'依次插入到pBlueScriptIISK(+)載體中，構建獲得重組質粒pJX143和pJX143-M，過程如圖3所示，然後分別通過細胞實驗和動物體實驗，驗證了獲得的重組質粒具有高致病性，具體過程如下1.1、引物設計根據GenBank登錄號為EF488048的JX143鹼基序列，設計在PRRSV基因組中的相對保守區引物，分別命名為STL，SF1392,SR2573,SF4344,SR6589,SF7682，SR9033，SF11422，SR13334和Qst，其中，STL和SR2573，SF1392和SR6589,SF4344和SR9033,SF7682和SR13334，SF11422和Qst分別構成相應的引物對，其序列分別如下所示-ACATGCATGCTAATACGACTCACTATAGGTATGACGTATAGGTGTTGGC-3'-GCCGCGCTTTGCCCGTTCGT-3'-CTGCCCAGGCCATCATGTCCGAAGTC-3'-GCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTT-3'-ACCGAGGCTGTAAAAGGCAAGTGACC-3'-CTTTCCGTTGAGCAGGCCCTTGGTATGA-3'-GGCGGCAAACCAGCGGACAA-3'-TTTATAAGGCCACTGCCACC-3'STL:5，SF1392:5，SR2573:5,SF4344:5，SR6589:5，SF7682:5，SR9033:5，SF11422:5，SR13334:5，Qst:5，1.2、高致病性病毒重組質粒的構建1.2.1、血清樣品中病毒RNA的提取使用vJX143株感染仔豬，然後取發病豬的血清樣品140u1，參照QIAampViralRNAMiniKit中病毒細胞培養上清的方法，提取病毒的RNA。1.2.2、高致病性病毒cDNA的合成取上述獲得的病毒RNA12.5"1，加入dNTP(2.5mM)4u1，lOXBuffer2ul，Qst反轉錄弓l物(10mM)0.5yl，QuantReverseTranscriptase(購自Invitrogen公司)1wl,混合均勻後置37t:水浴1小時，獲得高致病性病毒cDNA。1.2.3、高致病性病毒cDNA片段的PCR擴增以上述合成的cDNA為模板，每次以一對實施例1.1中相應的上下遊引物對作為引物，分別進行PCR擴增，其反應體系如下cDNA模板lul，上下遊引物對(10uM)各lul,lOXBuffer2ul，2.5mMdNTP2ul，rTaqDNA聚合酶5units,加水至20u1。PCR反應完成後，將獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖l所示，根據圖l的結果，分別獲得了大小為2.5Kb、2.5Kb、5.1Kb、5.3Kb、5.2Kb的目的條帶。然後參照說明書，使用膠回收試劑盒回收目的片段，獲得5條特異性片段，然後對上述5條特異性片段測序，其序列分別如SEQIDNO:1-5所示。1.2.4、特異性片斷的克隆將上步獲得的各特異性片斷，參照pBS-TMiniKit(TIANGEN公司)中片段連接的方法，分別克隆到pBS-T載體中，通過藍白斑篩選及其瓊脂糖凝膠電泳，獲得重組質粒，分別命名為pBS-INKpBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5。獲得的5個重組質粒經測序驗證，克隆進去的5條特異性片段正確。1.2.5、病毒全長cDNA重組質粒的構建利用生物醫學軟體DNASTAR(http:〃enfu11.com/china/Profession/{E37D28C4-9991-4AA1-B76A-016A046CD62D}.htm)，對pBS-INl、pBS-IN2、pBS_IN3、pBS-IN4、pBS-IN5中目的片段的重疊區域進行分析後，選取合適的酶切位點(分別為SphI、Mfel、AflII、Agel、AscI和NotI)進行酶切，如圖2所示，使用Sphl和Mfel雙酶切pBS-IN1，Mfel和AflII雙酶切pBS-IN2，AflII和Agel雙酶切pBS-IN3，Agel和Ascl雙酶切pBS-IN4，Ascl和Notl雙酶切pBS-IN5，然後將上述酶切後的片段按照pBS-INlpBS-IN5的順序依次插入到經相同酶切的pBlueScriptIISK(+)載體中，構建成為全長重組質粒。獲得的全長重組質粒用BamHI鑑定，出現了預期大小的片斷，然後將該片段測序，結果顯示序列如SEQIDNO:6所示，表明重組質粒構建成功。同時，還將pBS-IN5上的特異性片段(即SEQIDN0:5)上對應全長的第14680位的鹼基A突變為G，獲得pBS-IN5-M片段，然後採用上述相同的方法，將pBS-IN5-M替代pBS-IN5片段插入到pBlueScriptIISK(+)載體中，構建了重組質粒pBLJX-5-M。1.3、病毒RNA的製備1.3.1、質粒的NotI線性化於37°C，用NotI分別對質粒pBLJX-5和pBLJX_5-M進行線性化酶切(反應體系為突變質粒30pL，2pL，ddH2013pL，10xNEBBuffer25pL)，酶切過夜。參考說明書的方法，用QIAquickPCRPurificationKit純化酶切產物，分別獲得純化的線性化質粒。1.3.2、體外轉錄參考說明書的方法，使用T7mMESSAGEHighYieldCa卯edRNATranscriptionKit(購自Ambion公司)體外轉錄純化後的線性化質粒，並採用RNA電泳鑑定，根據鑑定結果，獲得了vJX143和VJX143-MRNA。1.4、高致病性藍耳病病毒重組質粒的檢測1.4.1、RNA的轉染接種Marc-145細胞(羅猴腎細胞系，購自美國ATCC)於六孔板中培養，待細胞密度為80-90%時，向每孔中分別加入2ii1vJX143和vJX143-MRNA和2u1DMRIE-C轉染i式劑，在lml的Opti-MEM中振蕩混勻，然後根據轉染試劑說明書的方法，轉染Marc-145細胞，並且逐日觀察細胞病變。待出現如圖4所示的細胞病變(CPE)後，收取上清並傳代，上清收取及傳代過程具體如下Marc-145細胞在含有6%FBS的DMEM培養基的六孔板中貼壁長滿單層後，棄培養基，PBS洗兩遍，吸取轉染過後五天的上清液，將其與維持液(含2%FBS的DMEM)按照1:10的比例接種上清液200^1，置37'C繼續培養並採用上述方法繼續傳代，並收取第五代的病毒上清，然後按照QIAGEN公司RNA提取試劑盒中的操作方法提取上清病毒RNA，獲得病毒vJX143和vJX143-M。根據上述結果，獲得的重組質粒pJX143和pJX143-M具有感染性，能夠從單一的基因組序列成功轉變為具有活性的病毒粒子並具有相應的病毒感染性。1.4.2、間接免疫螢光檢測按照實施例1.4.1中的RNA轉染步驟，分別以純化後1000倍稀釋的病毒vJX143和vJX143-M，感染單層Marc-145細胞，然後於感染36h後棄去培養基，用冰甲醇固定lOmin，1XBSA室溫封閉30rain，PRRSV核衣殼蛋白的特異性單抗(1:800稀釋)室溫孵育2h，再加入FITC標記的羊抗鼠的二抗室溫孵育lh，PBS洗五遍後，在螢光顯微鏡下觀察，結果如圖5所示。根據圖5的結果pJX143和pJX143-M於轉染後第5天出現了明顯的CPE，以無限稀釋法傳代純化嵌合病毒vJX143和vJX143-M，並且以間接免疫螢光分別檢測感染嵌合病毒vJX143或vJX143-M36h後的Marc-145細胞，出現了特異性螢光。同時，利用RT-PCR技術檢測原代(P)和子代(P5)病毒，結果顯示，分子標記依然穩定存在。上述結果說明利用反向遺傳作業系統獲得了和野毒具有相似生長特性的全長重組質粒，而且同時說明在0RF5下遊插入的遺傳標記並不影響整個病毒的生長，是可行的。1.4.3、病毒細胞半數感染量(TCIDs。)測定參照Pizzi，M.，5"柳joZi/7《ra77'3"o"oft力e/"i/Yy/erce/te/7^-/7W./7t,0^er歷i/e^6/^eyeec/-M/e/7C力^e/re/s,鵬t力odHumBiol，1950.22(3):p151-90.中的方法，用96孔組織培養板方法進行感染性滴度的測定。將上述感染細胞後收取的病毒上清用維持液(2%FBS的DMEM)作10倍系列稀釋後，將l(T連續稀釋的病毒接種96孔細胞培養板上的MARC-145單層細胞，每稀釋度接種4L，每孔0.20ml，再設2孔對照(即用維持液代替病毒液)，置37"C5%的二氧化碳培養箱中培養，逐日觀察感染細胞，記錄出現細胞病變的孔數，當停止出現細胞病變後，停止觀察，並按Reed-Muench法計算TCID50，1.4.4、病毒多步生長曲線的繪製分別以低劑量(0.1MOI)病毒(野毒、vJX143和vJX143-M)感染MARC-145細胞，分別在感染後不同的時間段(6h、12h、24h、36h、48h、72h、84h、96h、108h、120h)收取細胞上清，並進行病毒滴度的測定，收取的每個時間點病毒用TCIDs。計算滴度，並根據不同時間點病毒的滴度，繪製病毒多步生長曲線，結果如圖6所示，根據該圖，在感染10h後病毒形成第一個複製高峰期，隨後在第50h出現第二個複製高峰期;野毒株vJX143與嵌合病毒vJX143及vJX143-M之間的差異不顯著。結果說明利用反向遺傳操作技術，獲得的全長重組質粒質粒拯救出來的病毒和野生毒株在病毒的複製，增值，各個時間的病毒滴度等及其平臺期，指數增長期，平臺期等生長曲線方面具有相似的生物活性。1.4.5、動物回歸試驗將12頭35日齡PRRSV血清陰性豬分成4組，每組三頭，以鼻腔接種分別接種野毒(A組)、嵌合病毒vJX143(B組)和vJX143-M(C組)及生理鹽水(D組)，每頭接種lml(TCID5I)lOVml)，同時肌肉注射lml，隔離詞喂，每天測量體溫並進行臨床症狀的觀察，結果如圖7所示。攻毒25天後，撲殺試驗豬，採取肺、腎臟、脾、腸、淋巴結及血清，利用RT-PCR及細胞回歸試驗檢測上述各組織器官中的病毒組分，實驗結果如下A組和B組試驗豬在攻毒5天後體溫升高，攻毒豬均見消痩,腹式呼吸，食欲不振，精神沉鬱,有部分豬發現水樣稀糞，並伴有咳嗽症狀，死亡豬尤其可見消瘦，腹式呼吸。A組豬分別在第13天和第16天死亡，B組豬分別在第14和15天死亡。對死亡豬剖檢可見肺部症狀明顯，淋巴結出血明顯，部分豬腎臟有出血點，少數豬伴有整個消化道廣泛性出血、水腫，腸內容物為紅色，含有大量氣泡和粘液。C組豬體溫、精神狀況均正常，剖檢未見上述變化。具體體溫變化如圖7所示。上述實驗結果，說明拯救出來的病毒與野毒具有相似的生物學特性，而且在動物試驗中也證實，這次豬高熱綜合症的病原確實是由vJX143為代表的病毒。在實施例1中，通過分子操作技術獲得了正在中國大面積爆發的"豬高熱症候群"的主要病原-高致病性PRRSV的全長序列，而且在此基礎之上成功構建了高致病性全長重組質粒pJX143，並證實拯救出來的病毒與原毒具有相類似的生物學特性，更重要的是在動物回歸試驗中，該重組質粒pJX143呈現出與親本毒相似的高致死率。此外，加入了遺傳標記MluI的全長質粒具有相似的特徵，而且在傳代之後依然能夠穩定存在，可以成為鑑定野毒與拯救病毒可靠的遺傳標記，從而證實該株PRRSV是引起"豬高熱症候群"的主要病原，而且也是中國這次大面積暴發的代表株；同時，根據反向遺傳作業系統構建的該重組質粒可以為後續試驗及其應用提供有效的操作平臺。實施例2、藍耳病嵌合病毒構建及檢測2.1、引物設計根據pJX143株的序列，設計引物SPEF，NDE5F，Qst，SRS0E6,SFS0E7，SF12670,SR14365,SF14413和SR15497,其序列及序列說明如表1所示表l、克隆以及測序所用引物tableseeoriginaldocumentpage122.2、結構蛋白嵌合質粒的構建以pJX143重組質粒的結構蛋白為對象，通過PCR擴增出pJX143的結構蛋白基因GP4-GP5-M-N和GP5-M-N，然後分別使用Spel/Xhol和Ndel/Xhol進行雙酶切，再與經過相應的內切酶切過的弱病毒株pAPRRS的大片段通過T4DNA連接酶連接，經測序鑑定後篩選出陽性克隆，獲得pSX12和p5NX12，構建策略如圖8所示，具體構建步驟如下2.2.1、擴增結構蛋白GP4—GP5—M—N基因以pJX143作為模板，弓l物SPEF和Qst分別作為上遊引物和下遊引物，PCR擴增結構蛋白GP4—GP5—M—N基因，具體如下PCR反應體系為:pJX143模板lu1，上下遊引物對(IOuM)各1ii1，10XpfuBuffer5iil，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50lU。PCR反應參數為95。C預變性2min，94。C變性45s，62。C退火45s，72。C延伸2min30s，共進行35個循環，然後72'C延伸10min。取PCR反應產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖9所示，根據檢測結果，獲得的目的片段大小為2.4kb。2.2.2、擴增結構蛋白GP5—M—N基因以pJX143作為模板，引物NDE5F和Qst分別作為上遊引物和下遊引物，PCR擴增結構蛋白GP5—M—N基因，具體如下PCR反應體系為'pJX143模板lul，上下遊引物對(IOuM)各lul，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2yl，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50iil。PCR反應參數為95。C預變性2min，94。C變性45s，52。C退火45s，72。C延伸2min，進行6個循環，再95。C預變性加in，94。C變性45s，62。C退火45s，72。C延伸2min，進行25個循環，再72'C延伸10min。取PCR反應產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖9所示，根據檢測結果，獲得的目的片段大小為1.6kb。2.2.3、擴增結構蛋白基因的酶切利用小量膠回收試劑盒分別純化實施例2.3.1和2.3.2中獲得的PCR產物，然後分別以SpeI/XhoI雙酶切GP4—GP5—M—N基因的PCR產物，以NdeI/XhoI雙酶切GP5—M一N基因PCR產物，將獲得的酶切產物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳後，使用膠回收試劑盒純化酶切產物，獲得大小分別為2.4kb的GP4—GP5—M—N基因片段和1.6kb的GP5—M—N基因片段。2.2.4、載體pAPRRS、p5NDE的雙酶切分別以SpeI/XhoI雙酶切pAPRRS，以NdeI/XhoI雙酶切p5NDE。再將酶切產物分別以1%瓊脂糖凝膠電泳，並用膠回收試劑盒純化，分別獲得大小分別為16kb的pAPRRS雙酶切片段和17kb的p5NDE雙酶切片段。2.2.5、嵌合質粒的連接和鑑定將回收的PCR雙酶切產物和相應的質粒雙酶切產物，以T4DNA連接酶連接，然後轉化T0P10，篩選大小合適的陽性質粒，測序鑑定。具體步驟如下將PCR產物和相應的載體片段以摩爾比3:1的比例，以T4DNA連接酶連接，轉化TOPIO，挑取獨立的菌落進行純培養，提取質粒DNA，1%凝膠電泳，挑取大小為18kb的質粒進行測序，結果分別如SEQIDNO:7和8所示。將GP4—GP5—M—N嵌合的全長質粒(即SEQIDNO:7對應的質粒)命名為pSX12,GP5一M—N嵌合的全長質粒(即SEQIDNO:8對應的質粒)命名為p5NX12。2.3、GP5—M的嵌合質粒質粒的構建及鑑定參考KarinLHeckmanetal.GenesplicingandmutagenesisbyPCR-drivenoverlapextension.NATUREPROTOCOLS.2007VOL.2NO.4,通過S0EPCR法，把p5NX12的N蛋白以及3'UTR基因置換成弱毒疫苗株全長重組質粒pAPRRS的相應部分，從而獲得GP5—M的嵌合質粒，具體步驟如下在M蛋白和N蛋白基因重疊區域設計S0EPCR內引物(即SRS0E6和SFS0E7)，外引物採用SPEF和Qst。以p5NX12為模板，SPEF和SRS0E6為上下遊引物，採用S0EPCR擴增，其中PCR反應體系為:p5NX12模板U1，上下遊引物對(10pM)各1"1，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50ul。PCR反應參數為:95°C預變性2min，94。C變性45s，62。C退火45s,72。C延伸2min，共進行35個循環，然後72'C延伸10min。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖9所示，然後用膠回收試劑盒回收，獲得大小為1.9kb目的片段。然後，以pAPRRS為模板，SFS0E7和Qst為上下遊引物，PCR擴增，其中PCR反應體系為:pAPRRS模板lii1，上下遊引物對(IOuM)各1"1，lOXpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50ul。PCR反應循環參數為95°C預變性2min，94。C變性45s，68。C退火延伸2min，共進行35個循環，然後72T:延伸10min。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖9所示，然後用膠回收試劑盒回收，獲得大小為0.5kb目的片段。最後，以上述兩個PCR產物為模板，SPEF和Qst為上下遊引物，PCR擴增，其中PCR反應體系為模板各lul，上下遊引物對(10nM)各lul，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul,PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50iU。PCR反應循環參數為95°C預變性2min，94。C變性45s，62。C退火45s，72'C延伸2min45s，共進行35個循環，然後72。C延伸10min。將獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖9所示，然後用膠回收試劑盒回收，獲得大小約為2.5kb目的片段。將回收穫得的PCR產物和pAPRRS經SpeI/XhoI雙酶切後連接，通過1%凝膠電泳篩選，將獲得的大小約為18kb的質粒，命名為p56N12並進行測序，結果如SEQIDN0:9所示，根據該結果，p56N12構建成功。pSX12，p5NX12，p56N12以SmaI酶切鑑定，結果如圖10所示，根據該結果，這三個嵌合質粒的Smal酶切圖譜與預期的一致，沒有發生結構缺失。根據上述實驗結果，通過反向遺傳操作，以pJX143株重組質粒pAPRRS質粒為基礎構建了把JX143株GP4—GP5—M—N基因置換入pAPRRS而得到三個嵌合質粒的pSX12、p5NX12和p56N12。經Smal酶切鑑定，與pAPRRS比較，無缺失；經測序分析顯示質粒SX12的序列為SEQIDNO:7，質粒5NX12的序列為SEQIDNO:8，質粒56N12的序列為SEQIDNO:9，根據該結果成功獲得了3個變異株結構蛋白嵌合的嵌合質粒。2.5、嵌合質粒的拯救2.5.1、嵌合質粒轉染細胞將MARC-145細胞傳代至六孔板上，使每孔細胞數達到2乂105個，當細胞密度達到60%80%左右時即可進行轉染。將pSX12，p5NX12，p56N12按Roche公司FUGeneHD轉染試劑的方法轉染MARC-145細胞，然後置37'C，5%002培養箱中培養，並觀察細胞病變，待細胞病變達80%時，收集細胞上清。2.5.2、轉染上清的傳代與RNA的提取MARC-145細胞在含有10%FBS的DMEM培養基的六孔板中貼壁長滿單層後，棄培養基，PBS洗兩遍，將細胞病變上清與維持液(2%FBS的DMEM)按照1:10的比例接種上清液200yL，置37。C繼續培養。傳代5次以後，待產生80%CPE後，吸取病毒上清，按照QIAgen公司ViralRNAminiKit說明書的方法，提取病毒RNA。2.5.3、RT-PCR鑑定將提取的3個嵌合病毒上清RNA模板，按AMV(購自Takara公司)和rTaq(購自Takara公司)說明書進行RT-PCR反應，獲得病毒cDNA序列，其中，cDNA第一鏈合成引物是Qst,PCR引物是SX12以SF12670、SR14365為上下遊引物、5NX12以SF14413、SR15497為上下遊引物、56N12分別以SF12670、SR14365和SF14413、SR15497為上下遊引物進行PCR擴增，並測序鑑定，根據測序結果，3個嵌合病毒構建成功。將嵌合病毒在MARC-145細胞上連續傳代5次後，取細胞上清用於抽提病毒基因組，並進行RT-PCR擴增重組質粒與弱毒重組質粒的嵌合交叉區域。經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統可見並測序，採用DNAstar軟體與親本重組質粒pAPRRS序列進行比對，結果顯示3個嵌合病毒變異株序列都能穩定存在。根據實施例2，本發明在高致病性藍耳病重組質粒和經典弱毒藍耳病重組質粒的基礎之上，將高致病藍耳病病毒的GP4—GP5—M—N，GP5—M，GP5—M-N基因分別替換到經典弱毒藍耳病重組質粒中，從而構建出3個嵌合質粒，經病毒拯救，獲得了活病毒，經RT-PCR鑑定，嵌合病毒能夠穩定的傳代而不發生缺失，因此，上述3個嵌合病毒，可作為新型藍耳病疫苗。從上述三個嵌合病毒中，任取一個進行動物實驗，以驗證其對藍耳病具有免疫作用，在本發明的實施例3中，使用的是pSX12。實施例3、藍耳病嵌合病毒免疫保護性試驗3.1試驗豬的選擇及分組選取29日齡健康仔豬10頭，經採集血清進行PRRSV抗體及抗原檢測，確定為PRRSV抗體陰性和抗原陰性，稱重後隨機將其分為2組，5頭/組，隔離飼養。3.2藍耳病嵌合病毒接種選取TCIDs。為IO"的PRRSVSX12株病毒的Marc-145細胞培養物，用滅菌PBS液做IOO倍稀釋後，頸部肌肉接種一組5頭試驗仔豬，104°TCID5。/ml，2ml/頭；另一組5頭豬頸部肌肉接種滅菌PBS液作為對照，2ml/頭。3.3藍耳病嵌合病毒免疫後的攻毒試驗組仔豬在PRRSVSX12株病毒接種後28天，接種PRRSVvJX143株病毒用滅菌PBS液做10倍稀釋的Marc-145細胞培養物，10"TCID5。/ml，頸部肌肉接種3ml/頭。對照組5頭豬也做同樣劑量和途徑的接種。3.4試驗豬的體溫測定試驗及對照組豬在PRRSVSX12株病毒接種後至用PRRSVvJX143株病毒攻毒14天後，每天進行體溫測定，測定結果如圖11所示。根據測定結果，試驗組在接種PRRSVSX12株病毒後未出現可觀察到的體溫反應;PRRSVvJX143株病毒攻毒後SX12株病毒接種組出現一過性體溫升高，而對照組則出現明顯的體溫升高，並且比SX12株病毒接種組的高體溫水平持續更長的時間。3.5試驗豬血清抗體的測定在PRRSVSX12株病毒接種後第0，3，5，7，10，14，21，28天對SX12株病毒接種組採集血清，並利用IDEXXPRRSV抗體檢測試劑盒(購自美國HerdChekIDEXX)進行抗體檢測，同時對未免疫組定期採集血清,並進行抗體檢測作為對照，結果如圖12所示，根據該結果，試驗組在接種PRRSVSX12株病毒後第10天抗體開始產生，14天達到陽性值(ELISAS/P》0.4)，攻毒後抗體繼續升高並達到峰值，到剖殺時(免疫後52天)，抗體一直維持在高水平(ELISAS/P》3)，說明PRRSVSX12株有良好的免疫原性，可刺激機體產生很強的免疫反應。在PRRSVvJX143株病毒接種後第0，2，4，6，8，10，14天對SX12株病毒接種組和未免疫攻毒組採集血清並利用IDEXXPRRSV抗體檢測試劑盒進行抗體檢測，結果如圖12所示，根據該結果，PRRSVvJX143株攻毒後，可有效刺激機體的免疫記憶細胞，使機體產生更高水平的抗體。3.6試驗豬攻毒後的症狀觀察試驗及對照組豬在PRRSVSX12株病毒接種後至用PRRSVvJX143株病毒攻毒後21天，每天進行症狀觀察。根據觀測結果，試驗組在接種PRRSVSX12株病毒後未出現可觀察到的症狀反應；PRRSVvJX143株病毒攻毒後SX12株病毒接種組5頭中有兩頭出現輕微的呼吸症狀和咳嗽，未出現典型的腹式呼吸；而對照組5頭豬則出現嚴重的呼吸症狀和咳嗽，呈現典型的腹式呼吸；並有一頭豬在攻毒後14天死亡。3.7試驗豬的各組織器官的病理學觀察在PRRSVvJX143株病毒攻毒後21天，剖殺試驗組和對照組的仔豬，其中對照組5頭豬均出現肺臟水腫，部分豬出現有壞死；其中2頭豬出現心、肺粘連和腹膜炎；全部豬腹股溝淋巴結和扁桃體淋巴結出現不同程度的出血；部分豬肝臟出現有黃白色的壞死灶；部分豬脾臟出現邊緣性梗死；腎臟很少見到出血點，部分豬腦有出血，但未見腸道等消化系統的病變。而試驗組仔豬，除2頭仔豬出現輕微的肺部水腫外，未見到其他組織器官眼觀病理變化。同時，觀察其肺部病變，根據HalburPG，PaulPS，FreyML，etal，ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.VetPathol，1995，32:648-660.的方法，對肺部的肺炎病變進行評估，結果如表2所示。表2、PRRSVSX12株肺臟的病理學評價tableseeoriginaldocumentpage18注表中數據為肺炎病變部位佔整個肺臟比例百分比的平均數士標準差；其中，"ND"指沒有評價，a為SX12株免疫攻毒後5頭豬的肺臟的病理學評價，b為未免疫組攻毒後14天死亡豬的肺臟的病理學評價，c為未免疫組攻毒後21天剖殺其餘4頭豬的肺臟的病理學評價。根據表2的評價結果，PRRSVSX12株免疫組肺部病變得分為12.00±8.37，遠低於未免疫對照組的肺部病變得分(55.00±12.91)，說明PRRSVSX12株對成活豬保護性也很高，肺部病變輕微，說明該毒株對強毒的攻擊有良好的保護作用。在實施例3中，對構建的藍耳病嵌合病毒SX12株對29日齡仔豬進行了免疫保護性試驗，其中SX12株病毒接種組在接種SX12後，未出現明顯的體溫反應和呼吸症狀，說明該PRRSVSX12對豬致病力很低，PRRSV抗體在SX12株免疫後10天開始上升，14天達到並超過陽性水平(ELISAS/P〉0.4)，說明該PRRSVSX12對豬有良好的免疫原性，能刺激機體產生很強的免疫反應。在攻毒PRRSVvJX143株後，SX12株病毒接種組出現一過性體溫升高，出現輕微的呼吸症狀，剖檢各組織臟器未出現明顯的病理變化；而未免疫攻毒組則持續更長時間的體溫升高，出現嚴重的呼吸症狀和咳嗽，呈現典型的腹式呼吸；剖檢可見典型的肺部病理變化，其他組織臟器部分可見典型的損傷，說明PRRSVSX12株免疫後可抗擊強毒PRRSVvJX143株的攻擊，具有明顯的保護作用。綜上所述，基於發病豬場獲得的血清中分離出來的病毒構建的全長感染性cDNA質粒pJX143及其拯救出來的病毒具有和野生親本毒相似的生物學特性和動物宿主的感染力和致死率。而且後續的試驗證實，該重組質粒確實是引起這次"豬無名高熱"的主要指病病原。基於上述重組質粒，構建了數株疫苗候選株(pSX12，p5NX12，p56N12)，其中的一株疫苗株pSX12對豬體具有較好安全性，免疫後可有效誘導產生機體免疫，並提供豬體免疫保護作用，對"豬高致病性藍耳病"的免疫保護率高達100%，安全有效。序列表〈110〉中國農業科學院上海獸醫研究所〈120〉高致病性豬藍耳病病毒重組質粒和遺傳工程疫苗〈130〉P5071073〈160〉9〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉2600DNA〈213〉藍耳病病毒〈400〉1atgacgtataggtgttggctctatgccacggcatttgtattgtcaggagctgtgaccatt60ggcacagcccaaaacttgctgcacgggaacaccctcctgtgacagccctcttcaggggga120ttaggggtctgtccctaacaccttgcttccggagttgcactgttttacggtctctccacc180cctttataccatgtctgggatacttgatcggtgcacgtgtacccccaatgctggggtgttt240gtggcggagggccaggtctactgcacacgatgtctcagtgcacggtctctccttcctctg300aatctccaagttcctgagcttggggtgttgggttttttttataggcccgaagagccactc360cggtggacgttgccacgtgctttccccactgtcgagtgctcccccgccggggcctgttgg420ttttctgcgatttttccgattgc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