一種海洋貝毒素單抗製備方法

2023-11-02 08:12:42

專利名稱：一種海洋貝毒素單抗製備方法
技術領域：
本發明涉及一種海洋貝毒素單抗製備方法，用於小分子食品汙染物單克隆抗體製備過程中雜交瘤細胞株的篩選，特別是針對海洋貝毒素中的腹瀉性貝毒素大田軟海綿酸單 克隆抗體製備。
背景技術：
近年來，全球氣候變暖、赤潮頻發，海洋貝毒素引發的海產品安全問題日益嚴重， 已成為公共衛生和進出口檢驗檢疫中值得關注的重大問題。導致食源性中毒的海洋貝毒素 多來源於某些藻類，通過食物鏈蓄積於貝、螺等海產品中，毒性放大，多數毒素性質非常穩 定，一般加工處理不能破壞，由誤食有毒海產品而引發中毒的事件時有發生，毒素對機體具 有致癌、致畸、致突變等毒性作用，且中毒後無特效藥救治。因此開展海洋貝毒素的快速檢 測方法，確保海產品食用安全具有重要的公共衛生意義。目前最常用、最成熟的方法是高效 液相或液質聯用技術。但此項技術所需儀器設備價格昂貴，樣品前處理過程困難，需要專業 的人員操作，不適於現場攜帶使用等缺點。人們正在積極探索研究海洋貝毒素的免疫學方 法，此法常以單克隆抗體(McAb)或多克隆抗體(PcAb)為探針，採用競爭方式，被公認為是 一種快速、靈敏、經濟、實用的檢測方法，已有多種海洋毒素全安檢測試劑盒商品化。免疫學 方法的建立最關鍵的步驟就是抗體的獲得。而單克隆抗體由於理化性狀高度均一，與抗原 結合的特異性強、容易大量獲得，因此在免疫學檢測中備受青眯。對於海洋貝毒素類食品汙 染物來說，其分子量小，結構簡單，不能刺激機體產生抗體，因此若想製備其單抗，必須將其 與大的載體蛋白偶聯，使其成為載體蛋白上的一個抗原表位，藉助載體效應激活T淋巴細 胞，進而使B細胞活化並分泌針對小分子的抗體。在常規單抗製備過程中，要採用免疫原進 行免疫，檢測原(與免疫原載體不同)進行檢測，需製備兩種偶聯物，麻煩又浪費；免疫脾細 胞與SP20細胞融合後要進行大量的篩選工作，多數融合的雜交瘤分泌的抗體均是針對載 體蛋白，針對小分子抗體的雜交瘤數量很少，常規利用檢測原進行篩選會消耗大量標準物 質；另外由於海洋生物毒素製備困難，價格昂貴，據調查腹瀉性貝毒大田軟海綿酸Img最高 時達兩萬多元人民幣，石房蛤毒素競高達十幾萬元。要想獲得這類物質的一株單抗順利的 話至少也需數十萬元，而標準品的消耗主要體現在雜交瘤細胞的篩選上，很多研究均因為 標準抗原用量大引起的資金問題限制了其免疫學方法的建立。

發明內容
本發明的目的在於提供一種海洋貝毒素單抗製備方法，解決昂貴小分子海洋貝毒 素在單克隆抗體製備過程中雜交瘤的篩選消耗大量標準抗原問題，其改進了常規小分子單 抗製備過程中兩種抗原的使用與抗體雜交瘤細胞的篩選方法，免疫抗原與檢測抗原只需一 種偶聯物，不但能夠節省大量的抗原標準物，而且獲得的抗體與抗原的結合活性好，用改進 後的方法製備的海洋貝毒素大田軟海綿酸的單抗，具體採用活潑酯法合成大田軟海綿酸與 載體蛋白的偶聯物作為免疫原兼檢測原，免疫BALB/c小鼠，常規細胞融合技術將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合，利用改進的方法對融合細胞所分泌的抗體進行篩選； 經過3次克隆，獲得1株可穩定分泌抗OA的雜交瘤細胞株，該株雜交瘤細胞分泌的抗體屬 於IgGl亞類，相對分子質量約為160kD，抗體滴度為2. 56 X 106，抗體親和力為9. OX IO8L/ mol，與軟骨藻酸、膝鉤藻毒素1/4、膝鉤藻毒素2/3、石房蛤毒素、微囊藻毒素、節球藻毒素、 河豚毒素等非腹瀉性貝毒沒有交叉反應，不但節約大量的標準抗原，而且獲得的抗體能夠 用於ELISA等免疫學方法的建立。本發明的技術方案是這樣實現的一種海洋貝毒素單抗製備方法，其特徵在於製備小分子貝毒素單抗用於動物免疫和雜交瘤篩選的抗原為同一偶聯物，並採用了正篩法 和負篩法相結合的篩選法進行小分子貝毒素單抗雜交瘤細胞的篩選，其步驟如下(1)、抗原的製備採用活潑酯法製備免疫原兼檢測原，操作方法如下lmg貝毒素大田軟海綿酸OA、 0. 155mg N-羥丁二醯亞胺、0. 285mg N，N雙環乙烷碳二亞胺於100 μ LN，N 二甲基甲醯胺N， N-DMF中混均，室溫孵育2h，以載體蛋白與小分子物質摩爾比為1 20 1 50的比例加 入載體蛋白，並試先用50 μ L 0. lmol/L NaHCO3溶解，室溫繼續孵育2h，未反應的物質通過 超濾離心去除，將偶聯抗原用一定體積的PBS緩衝液(pH 7.4)溶起，_20°C保存備用；(2)、動物免疫與效價測定採用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用100 μ g偶聯抗原 與等量福氏完全佐劑混勻分3次腹腔注射，間隔2d ；3周後再用100 μ g偶聯抗原與等量福 氏不完全佐劑混勻，腹腔分3次免疫。此後每2周用半量偶聯抗原重複腹腔加強免疫；用載 體競爭ELISA法測定血清效價，其具體ELISA程序如下偶聯抗原用0. 05mol/L pH9. 6的 碳酸鹽緩衝液稀釋至1 μ g/mL，每孔100 μ L包被96孔酶標板，4°C過夜；用PBST洗板3次， 每次3min ；加入載體蛋白(1 μ g/mL)與等量系列稀釋的血清共100 μ L，37°C反應40min ； 洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔100μ L，37°C，30min，洗板3次；加鄰苯 二胺(OPD)顯色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定 490nm處吸光度值，用陰性血清作對照；(3)、細胞融合與篩選效價達到4000倍以上，尾靜脈加強免疫1次，3d後取脾臟，採用PEG細胞融合技術 將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合，採取如下改進正篩負篩結合法對雜交瘤細 胞進行篩選①負篩選擇去除針對載體克隆對融合細胞先用載體進行篩選載體抗原用 0. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋至1 μ g/mL, 4°C過夜包被96孔酶標板，用PBST洗板 3次，每次3min ；加入細胞培養上清液100 μ L，37°C板反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，去除 大量針對載體的陽性孔，陰性克隆進入下一輪篩選；②正篩選擇針對OA的目標克隆用貝毒素偶聯抗原篩選針對小分子抗體的雜交 瘤細胞用偶聯抗原包被ELISA板過夜，洗滌後加入細胞培養上清100yL，37°C板內反應 40min ；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min，洗板3次； 加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值；用陰性和陽性血清作對照，選擇陽性克隆進入下一輪篩選；③競爭優選雜交瘤細胞經上述篩選得到的貝毒素陽性克隆再次用抗原競爭法篩 選具有抗原競爭活性的抗體用偶聯抗原(lyg/mL)包被ELISA板，洗滌後加入OA標準品 (20ng/mL)與細胞培養上清各50 μ L，37°C板內競爭反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，OD值 最小者為最具競爭活性的抗體，此細胞株繼續克隆直至全部為陽性，即為優選出的雜交瘤 細胞；所述的海洋貝毒素是腹瀉性貝毒素大田軟海綿酸，所述的免疫原兼檢測原為大田軟海綿酸與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)或人免疫球蛋白(hlgG)等經 活潑酯法製備的偶聯物；其大田軟海綿酸單克隆抗體屬於IgGl亞類，相對分子質量約為 160kD，抗體滴度為2. 56 X 106，抗體親和力為9. 0 X 108L/mol。所述的在單抗雜交瘤細胞篩選過程中採用了正篩負篩相結合的篩選法，即先用載 體蛋白對融合雜交瘤細胞進行篩選，去除大量針對載體蛋白呈陽性的雜交瘤細胞株；陰性 克隆繼續用免疫原兼檢測原與標準品競爭篩選針對目標毒素的雜交瘤。本發明的積極效果是減少了常規方法中免疫原與檢測原採用不同製備的麻煩與 浪費，尤其是在雜交瘤篩選過程中利用載體負篩法選擇去除大量陰性克隆，利用正篩及抗 原競爭篩選法選擇優異陽性克隆，篩選的雜交瘤細胞分泌的抗體具有較好的抗原競爭能 力，減少了大量標準抗原的消耗，具有製備簡單方便、抗原用量小，節約成本，抗體競爭活性 好等優點。
具體實施例方式下面結合腹瀉性貝毒素大田軟海綿酸單克隆抗體製備實施例對本發明做進一步 的描述實施例1 1. OA-BSA抗原的製備大田軟海綿酸0kadaicAcid，OA牛血清白蛋白Bovine Serum Albumi，BSA採用活潑酯法製備免疫原兼檢測原0A-BSA，操作方法如下lmg大田軟海綿酸 0A、0. 155mg N-羥丁二醯亞胺、0. 285mg N，N雙環乙烷碳二亞胺於100 μ L N，N 二甲基甲 醯胺(N，N-DMF)中混均，室溫孵育2h，加入4mg牛血清白蛋白BSA (溶於50 μ L 0. lmol/L NaHCO3)，室溫繼續孵育2h，未反應的物質通過超濾離心去除，將偶聯抗原用400 μ L的PBS緩 衝液(ρΗ 7.4)溶起，使其蛋白濃度為10mg/mL，-20°C保存備用。2.動物免疫與效價測定採用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100 μ gOA-BSA與 等量福氏完全佐劑混勻分3次腹腔注射，間隔2d ；3周後再用100 μ gOA-BSA與等量福氏不 完全佐劑混勻，腹腔分3次免疫。此後每2周用半量OA-BSA重複腹腔加強免疫；用BSA競 爭ELISA法測定血清效價，其具體ELISA程序如下0A_BSA用0. 05mol/L ρΗ 9. 6的碳酸 鹽緩衝液稀釋至1 μ g/mL，每孔100 μ L包被96孔酶標板，4°C過夜；用PBST洗板3次，每次3min ；加入BSA (1 μ g/mL)與等量系列稀釋的血清共100 μ L，37°C反應40min ；洗板3次；力口 入酶標羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯 色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光
度值，用陰性血清作對照。3.細胞融合與篩選效價達到4000倍以上，尾靜脈加強免疫1次，3d後取脾臟，採用PEG細胞融合技術將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合，採取如下改進正篩負篩結合法對雜交瘤細 胞進行篩選(1)負篩選擇去除針對載體克隆對融合細胞先用載體進行篩選載體抗原BSA用 0. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋至1 μ g/mL，4°C過夜包被96孔酶標板，用PBST洗 板3次，每次3min ；加入細胞培養上清液100 μ L，37。C反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，去除 大量針對載體的陽性孔，陰性克隆進入下一輪篩選；(2)正篩選擇針對OA的目標克隆用貝毒素偶聯抗原篩選針對小分子抗體的雜瘤 細胞用OA-BSAd μ g/mL)包被ELISA板過夜，洗滌後加入細胞培養上清100μ L，37°C板內 反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min，洗板3 次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔1001^，371，10-151^11;加入501^終止液，酶聯免疫 檢測儀測定490nm處吸光度值，用陰性和陽性血清作對照；選擇陽性克隆進入下一輪篩選；(3)競爭優選雜交瘤細胞經上述篩選得到的貝毒素陽性克隆再次用抗原競爭法 篩選具有抗原競爭活性的抗體用OA-BSAd μ g/mL)包被ELISA板，洗滌後加入OA標準品 (20ng/mL)與細胞培養上清各50 μ L，37°C板內競爭反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，OD值 最小者為最具競爭活性的抗體，此細胞株繼續克隆直至全部為陽性，即為優選出的雜交瘤 細胞；4.腹水製備與抗體特性研究將高壓滅菌的石蠟油注射到10周齡的雌性BALB/c小鼠腹腔0. 5 1. OmL/只，1 周后再注入2X IO6個雜交瘤細胞。根據小鼠的腹部膨大情況，10 14d後收集腹水，間接 ELISA方法測定腹水單抗效價，採用辛酸一硫酸銨法對腹水進行純化，SDS-PAGE電泳分析， 利用在凝膠中的相對遷移率與相對分子質量回歸方程計算分子量；用單抗亞類鑑定試劑盒 鑑定單抗亞類。根據文獻計算親和常數；用競爭ELISA法對相關類似毒素作交叉反應測定。實施例2 1. OA-OVA抗原的製備大田軟海綿酸0kadaicAcid，OA卵清蛋白0valbumin，OVA採用活潑酯法製備免疫原兼檢測原0A-0VA，操作方法如下lmg大田軟海綿酸0A、 0. 155mg N-羥丁二醯亞胺、0. 285mg N, N雙環乙烷碳二亞胺於IOOyL N, N 二甲基甲醯胺 (N，N-DMF)中混均，室溫孵育2h，加入2. 5mg OVA (溶於50 μ L 0. lmol/L NaHCO3)，室溫繼續孵育2h，未反應的物質通過超濾離心去除，將偶聯抗原用250 μ L的PBS緩衝液(ρΗ 7.4)溶 起，使其蛋白濃度為10mg/mL，_20°C保存備用。2.動物免疫與效價測定採用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μ gOA-OVA與 等量福氏完全佐劑混勻分3次腹腔注射，間隔2d ；3周後再用100 μ gOA-OVA與等量福氏不 完全佐劑混勻，腹腔分3次免疫。此後每2周用半量0A-0VA重複腹腔加強免疫；用OVA競爭 ELISA法測定血清效價，其具體ELISA程序如下0A_0VA用0. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩衝 液稀釋至1 μ g/mL,每孔100 μ L包被96孔酶標板，4°C過夜；用PBST洗板3次，每次3min ； 加入OVA (1 μ g/mL)與等量系列稀釋的血清共100 μ L，37°C反應40min ；洗板3次；加入酶標 羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液， 每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值， 用陰性血清作對照。3.細胞融合與篩選效價達到4000倍以上，尾靜脈加強免疫1次，3d後取脾臟，採用PEG細胞融合技術 將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合，採取如下改進正篩負篩結合法對雜交瘤細 胞進行篩選(1)負篩選擇去除針對載體克隆對融合細胞先用載體進行篩選載體抗原OVA用 0. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋至1 μ g/mL，4°C過夜包被96孔酶標板，用PBST洗 板3次，每次3min ；加入細胞培養上清液100 μ L，37。C反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，去除 大量針對載體的陽性孔，陰性克隆進入下一輪篩選；(2)正篩選擇針對OA的目標克隆用貝毒素偶聯抗原篩選針對小分子抗體的雜瘤 細胞用OA-OVAd μ g/mL)包被ELISA板過夜，洗滌後加入細胞培養上清100μ L，37°C板內 反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min，洗板3 次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔1001^，371，10-151^11;加入501^終止液，酶聯免疫 檢測儀測定490nm處吸光度值，用陰性和陽性血清作對照；選擇陽性克隆進入下一輪篩選；(3)競爭優選雜交瘤細胞經上述篩選得到的貝毒素陽性克隆再次用抗原競爭法 篩選具有抗原競爭活性的抗體用OA-OVAd μ g/mL)包被ELISA板，洗滌後加入OA標準品 (20ng/mL)與細胞培養上清各50 μ L，37°C板內競爭反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，OD值 最小者為最具競爭活性的抗體，此細胞株繼續克隆直至全部為陽性，即為優選出的雜交瘤 細胞；4.腹水製備與抗體特性研究將高壓滅菌的石蠟油注射到10周齡的雌性BALB/c小鼠腹腔0. 5 1. OmL/只，1 周后再注入2X IO6個雜交瘤細胞。根據小鼠的腹部膨大情況，10 14d後收集腹水，間接 ELISA方法測定腹水單抗效價，採用辛酸一硫酸銨法對腹水進行純化，SDS-PAGE電泳分析， 利用在凝膠中的相對遷移率與相對分子質量回歸方程計算分子量；用單抗亞類鑑定試劑盒鑑定單抗亞類。根據文獻計算親和常數；用競爭ELISA法對相關類似毒素作交叉反應測定。實施例3 1. OA-hlgG抗原的製備大田軟海綿酸0kadaicAcid，OAA^iiSitSS human immunoglobulin G, hlgG採用活潑酯法製備免疫原兼檢測原OA-hlgG，操作方法如下lmg大田軟海綿酸 0A、0. 155mg N-羥丁二醯亞胺、0. 285mg N，N雙環乙烷碳二亞胺於IOOyL N，N 二甲基甲醯 胺(N，N-DMF)中混均，室溫孵育2h，加入4. Omg hlgG(溶於50yL 0. lmol/L NaHCO3)，室溫繼 續孵育2h，未反應的物質通過超濾離心去除，將偶聯抗原用400yL的PBS緩衝液(pH 7.4) 溶起，使其蛋白濃度為10mg/mL，-20°C保存備用。2.動物免疫與效價測定採用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100yg0A-hIgG與 等量福氏完全佐劑混勻分3次腹腔注射，間隔2d ；3周後再用100 μ gOA-hlgG與等量福氏不 完全佐劑混勻，腹腔分3次免疫。此後每2周用半量OA-hlgG重複腹腔加強免疫；用hlgG競 爭ELISA法測定血清效價，其具體ELISA程序如下0A_hIgG用0. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽 緩衝液稀釋至0. 5 μ g/mL，每孔100 μ L包被96孔酶標板，4°C過夜；用PBST洗板3次，每次 3min ；加入hlgG (0. 5 μ g/mL)與等量系列稀釋的血清共100 μ L，37°C反應40min ；洗板3次； 加入酶標羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD) 顯色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸 光度值，用陰性血清作對照。3.細胞融合與篩選效價達到4000倍以上，尾靜脈加強免疫1次，3d後取脾臟，採用PEG細胞融合技術 將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合，採取如下改進正篩負篩結合法對雜交瘤細 胞進行篩選(1)負篩選擇去除針對載體克隆對融合細胞先用載體進行篩選載體抗原hlgG 用0. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋至0. 5 μ g/mL, 4°C過夜包被96孔酶標板，用PBST 洗板3次，每次3min ；加入細胞培養上清液100 μ L，37。C反應40min ；洗板3次；加入酶標羊 抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每 孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，去 除大量針對載體的陽性孔，陰性克隆進入下一輪篩選；(2)正篩選擇針對OA的目標克隆用貝毒素偶聯抗原篩選針對小分子抗體的雜瘤細胞用OA-hlgG (0. 5 μ g/mL)包被ELISA板過夜，洗滌後加入細胞培養上清100 μ L，37°C 板內反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min， 洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶 聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，用陰性和陽性血清作對照；選擇陽性克隆進入下一 輪篩選；(3)競爭優選雜交瘤細胞經上述篩選得到的貝毒素陽性克隆再次用抗原競爭法 篩選具有抗原競爭活性的抗體用OA-hlgG (0. 5 μ g/mL)包被ELISA板，洗滌後加入OA標 準品(20ng/mL)與細胞培養上清各50 μ L，37°C板內競爭反應40min ；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加鄰苯二胺(OPD)顯色液， 每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值， OD值最小者為最具競爭活性的抗體，此細胞株繼續克隆直至全部為陽性，即為優選出的雜 交瘤細胞；4.腹水製備與抗體特性研究將高壓滅菌的石蠟油注射到10周齡的雌性BALB/c小鼠腹腔0.5 1. OmL/只，1 周后再注入2X IO6個雜交瘤細胞。根據小鼠的腹部膨大情況，10 14d後收集腹水，間接 ELISA方法測定腹水單抗效價，採用辛酸一硫酸銨法對腹水進行純化，SDS-PAGE電泳分析， 利用在凝膠中的相對遷移率與相對分子質量回歸方程計算分子量；用單抗亞類鑑定試劑盒 鑑定單抗亞類。根據文獻計算親和常數；用競爭ELISA法對相關類似毒素作交叉反應測定。
權利要求
一種海洋貝毒素單抗製備方法，其特徵在於製備小分子貝毒素單抗用於動物免疫和雜交瘤篩選的抗原為同一偶聯物，並採用了正篩法和負篩法相結合的篩選法進行小分子貝毒素單抗雜交瘤細胞的篩選，其步驟如下(1)、抗原的製備採用活潑酯法製備免疫原兼檢測原，操作方法如下1mg貝毒素大田軟海綿酸OA、0.155mg N-羥丁二醯亞胺、0.285mg N，N雙環乙烷碳二亞胺於100μL N，N二甲基甲醯胺N，N-DMF中混均，室溫孵育2h，以載體蛋白與小分子物質摩爾比為1∶20～1∶50的比例加入載體蛋白，並試先用50μL 0.1mol/LNaHCO3溶解，室溫繼續孵育2h，未反應的物質通過超濾離心去除，將偶聯抗原用一定體積的PBS緩衝液(pH 7.4)溶起，-20℃保存備用；(2)、動物免疫與效價測定採用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μg偶聯抗原與等量福氏完全佐劑混勻分3次腹腔注射，間隔2d；3周後再用100μg偶聯抗原與等量福氏不完全佐劑混勻，腹腔分3次免疫。此後每2周用半量偶聯抗原重複腹腔加強免疫；用載體競爭ELISA法測定血清效價，其具體ELISA程序如下偶聯抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶標板，4℃過夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入載體蛋白1μg/mL與等量系列稀釋的血清共100μL，37℃反應40min；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG14000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加鄰苯二胺OPD顯色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，用陰性血清作對照；(3)、細胞融合與篩選效價達到4000倍以上，尾靜脈加強免疫1次，3d後取脾臟，採用PEG細胞融合技術將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合，採取如下改進正篩負篩結合法對雜交瘤細胞進行篩選①負篩選擇去除針對載體克隆對融合細胞先用載體進行篩選載體抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋至1μg/mL，4℃過夜包被96孔酶標板，用PBST洗板3次，每次3min；加入細胞培養上清液100μL，37℃反應40min；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG14000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加鄰苯二胺OPD顯色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，去除大量針對載體的陽性孔，陰性克隆進入下一輪篩選；②正篩選擇針對OA的目標克隆用貝毒素偶聯抗原篩選針對小分子抗體的雜瘤細胞用偶聯抗原1μg/mL包被ELISA板過夜，洗滌後加入細胞培養上清100μL，37℃反應40min；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG14000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加鄰苯二胺OPD顯色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值；選擇陽性克隆進入下一輪篩選；③競爭優選雜交瘤細胞經上述篩選得到的貝毒素陽性克隆再次用抗原競爭法篩選具有抗原競爭活性的抗體用偶聯抗原1μg/mL包被ELISA板，洗滌後加入OA標準品20ng/mL與細胞培養上清各50μL，37℃板內競爭反應40min；洗板3次；加入酶標羊抗小鼠IgG14000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加鄰苯二胺OPD顯色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL終止液，酶聯免疫檢測儀測定490nm處吸光度值，OD值最小者為最具競爭活性的抗體，此細胞株繼續克隆直至全部為陽性，即為優選出的雜交瘤細胞。
2.根據權利要求1所述的一種海洋貝毒素單抗製備方法，其特徵在於所述的海洋貝毒 素是腹瀉性貝毒素大田軟海綿酸，所述的免疫原兼檢測原為大田軟海綿酸與載體蛋白牛血 清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA或人免疫球蛋白hlgG等經活潑酯法製備的偶聯物；其大田軟 海綿酸單克隆抗體屬於IgGl亞類，相對分子質量約為160kD，抗體滴度為2. 56X 106，抗體 親和力為9.0 X^8L/mol。
3.根據權利要求1所述的一種海洋貝毒素單抗製備方法，其特徵在於所述的在單抗雜 交瘤細胞篩選過程中採用了正篩負篩相結合的篩選法，即先用載體蛋白對融合雜交瘤細胞 進行篩選，去除大量針對載體蛋白呈陽性的雜交瘤細胞株；陰性克隆繼續用免疫原兼檢測 原與標準品競爭篩選針對目標毒素的雜交瘤。
全文摘要
本發明涉及一種海洋貝毒素單抗製備方法，其特徵在於製備小分子貝毒素單抗用於動物免疫和雜交瘤細胞篩選的抗原為同一偶聯物，減少了常規小分子物質單抗製備方法中免疫原與檢測原不同製備的麻煩與浪費；並採用了正篩法和負篩法相結合的篩選法進行單抗雜交瘤細胞的篩選，可減少大量標準抗原的消耗，其篩選的雜交瘤細胞分泌的抗體具有較好的抗原競爭活性。本發明積極效果是抗原製備簡單、標準抗原用量小，節約成本，抗體競爭活性好。
文檔編號C12N5/20GK101845097SQ20101015334
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者於師宇, 任洪林, 盧士英, 周玉, 孟憲梅, 李樂, 李兆輝, 李巖松, 林超, 柳增善, 王裡奇, 閆東明 申請人:吉林大學