豬口蹄疫重組免疫複合肽的製備方法及應用的製作方法
2023-11-01 17:04:27 3
專利名稱：豬口蹄疫重組免疫複合肽的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及豬口蹄疫重組免疫複合肽的製備方法及應用，屬於生物技術製藥工業中 的基因工程生產免疫佐劑的技術領域。
背景技術：
口蹄疫(foot-and-mouth disease ， FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus ， FMDV)引起的烈性傳染病，主要感染偶蹄目動物。除動物死亡造成直接經濟損失外，動 物在患病期間肉和奶的生產停止導致該地區甚至該國家的畜產品進出口貿易停止，也造 成巨大的經濟損失。因此，世界各國都很重視本病的防制。
FMDV感染機體產生中和性抗體需要B細胞和T細胞的參與，感染FMDV的小鼠 血清中既存在T細胞依賴性IgGl和IgG2，也存在非T細胞依賴性IgG3，表明T細胞 在FMDV的抗原構成和免疫應答中起重要的作用。FMDV的VP1 G-H環內有誘導生成 B細胞的位點，也有激發產生Th細胞的位點。試驗發現在VP1的41 209胺基酸殘基 位上至少存在11個不同的T細胞表位。含有T細胞表位的多肽能增強Th細胞的活性， 並同時協同誘導機體產生抗病毒抗體。含有Asia I型FMDV的B細胞和T細胞表位的 融合蛋白能引起豚鼠免疫反應，該融合表位為抗Asial型FMDV提供了選擇。
疫苗是控制FMD的最有效措施，FMD弱毒疫苗和滅活疫苗等常規疫苗都具有良好 的免疫原性，在預防和控制FMD的過程中發揮著重要作用，但在滅活疫苗的生產、使用 過程中有誘發FMD的危險，這促使基因工程疫苗逐漸成為FMD疫苗研究的熱點。但基 因工程疫苗在誘導機體免疫反應方面還存在一些不盡如人意之處，因此，研究者試圖從 多方面增強FMD疫苗的免疫效果。法氏囊(bursaofFabricus,BF)是禽類重要的中樞免 疫器官，法氏囊超濾物(1KD以下)中含有許多生物活性物質，特別是一些小肽對禽類 具有免疫調節功能，能促進禽類、哺乳動物細胞的分化發育，促進免疫器官的成熟。其 中的囊素三肽(K-H-G)作為BF組織中活性成分的重要組成部分不僅對禽類具有免疫調節 功能，而且對哺乳動物及人類淋巴細胞也具有明顯的免疫學及生理學活性。由於天然的 BS只能從雞的法氏囊組織中提取，來源受到很大的限制，而且其它雜蛋白含量高,純化 難度大，其實際效果也受到很大程度的影響。化學合成的BS成本高，不適合田間推廣。 因此利用基因工程技術,體外大量表達BS活性肽，將可能使BS作為一種有效的免疫增 強劑而得到最為廣泛的應用。
本發明為製備重組的豬口蹄疫免疫複合肽提供了切實可行的技術路線，按本方法制 備的豬口蹄疫重組免疫複合肽可作為豬口蹄疫疫苗新型的基因工程多肽疫苗佐劑。
發明內容
技術問題本發明的目的在於研製出具有良好免疫效果的基因工程多肽，為臨床上
的豬口蹄疫防治提供一個合適的免疫佐劑。同時提供一種以大腸桿菌為宿主的基因工程 免疫多肽的製備方法。本發明還涉及基因工程豬口蹄疫免疫複合肽在豬口蹄疫防治中的 應用。
技術方案
1) 本發明技術要點之一提供一種基因工程豬口蹄疫免疫複合肽及其基因
豬口蹄疫重組免疫複合肽基因其特徵是由豬口蹄疫輔助性T細胞表位基因和雙拷 貝的囊素模擬肽基因通過柔性Linker (G-G-G-S)基因串聯而成連接，並在5'端加有腸 激酶識別位點基因序列。該串聯基因推導的胺基酸多肽為豬口蹄疫重組免疫複合肽。該 豬口蹄疫重組免疫複合肽其特徵在於將T細胞表位多肽和囊素模擬肽串聯而成。 一方 面，T細胞表位多肽能增強Thl細胞的活性，並同時協同誘導機體產生抗口蹄疫病毒抗 體。同時，囊素模擬肽能促進B細胞的分化成熟，誘導抗體生成。二者通過柔性胺基酸 連接，在保持獨立的空間結構的同時能有效發揮各自的生物學功能。5'端加有腸激酶識 別位點序列，能在該酶的作用下，可獲得保持天然N端的豬口蹄疫重組免疫複合肽。
2) 本發明技術要點之二提供了一種能高效表達豬口蹄疫重組免疫複合肽的基因工程菌 的構建方法
為生產成本低的豬口蹄疫重組免疫複合肽，須構建一種高效表達豬口蹄疫重組免疫 複合肽，即能生產豬口蹄疫重組免疫複合肽的基因工程菌，本發明基因工程菌是攜帶重 組載體的大腸桿菌BL21(DE3)，重組載體是含有豬口蹄疫重組免疫複合肽基因的pET32a載體。
3) 本發明技術要點之三提供一種可溶性的基因工程豬口蹄疫免疫複合肽製備方法
技術領域：
本發明選用大腸桿菌表達系統，pET32a載體以T7啟動子，在IPTG誘導下能高效 表達外源基因。將豬口蹄疫重組免疫複合肽棊因插入硫氧還蛋白(TRX)基因C端，利用 硫氧還蛋白分子伴侶作用，獲得了可溶性的基因工程豬口蹄疫免疫複合肽融合蛋白。該 融合蛋白，首先經Ni柱親和層析純化後，再通過N端帶有His標籤的腸激酶酶切去除 硫氧還蛋白，可獲得保持天然N端的豬口蹄疫重組免疫複合肽。再次進行親和層析，收 集穿透峰，冷凍乾燥，得到純度極高的豬口蹄疫重組免疫複合肽。
4) 本發明技術要點之四提供了基因工程豬口蹄疫免疫複合肽的應用 本發明利用小鼠動物模型，將豬口蹄疫免疫複合肽配合豬口蹄疫滅活疫苗使用。通
過免疫小鼠的抗體和抗體亞型、脾淋巴細胞增殖、血清中IL-4和IFN-Y的測定。評
價基因工程豬口蹄疫免疫複合肽的免疫佐劑效果。
為實現以上技術要點，下面詳細介紹本發明的技術方案
一種高效表達豬口蹄疫重組免疫複合肽的基因工程菌株，其構建包括以下步驟
1)豬口蹄疫重組免疫複合肽基因SEQ.ID.NCU的重疊PCR(SOE)擴增。設計了三條 PCR引物
引物F1， SEQ.ID.N0.2:
GAAATTAAAGGCGTG-3' 引物F2， SEQ.ID.N0.3:
ACGCCTTTAATTTCG-3' 引物F3， SEQ.ID.NO.4:
GGCTAAGTCGACTCG-3,扁
PCR反應體系50^1:10xPCRBuffer, 5ML,MgCl2， 3pL ; dNTP， 10mmol/L， lpL;引 物F1 、 F2禾Q引物F2，終濃度為20pmol/L各2pL; TaKaRa ExTaq 0.5^L;滅菌超純水， 34單；
PCR反應條件94。C預變性2min,進入TD-PCR循環:94t:30s,退火溫度從55。C,每循 環lrnin，共30個循環;72X:延伸6min，經過膠回收後獲得豬口蹄疫重組免疫複合肽基因；
2) 高效表達權利要求1所述豬口蹄疫重組免疫複合肽基因的基因工程菌株的構建 上述豬口蹄疫重組免疫複合肽基因PCR產物和pET32a均用五coi I、5WI雙酶切,T4 DNA Ligase連接，連接產物轉化E.coli DH5a,重組表達質粒進行和Sa/1雙酶切鑑定； 酶切鑑定為陽性的質粒測序，命名為pET32a—KCMP;
3) 採用CaCl2轉化法，將重組質粒pET32a-KCMP轉化進入大腸桿菌BL21 (DE3)
中，篩選陽性克隆。
可溶性的基因工程豬口蹄疫免疫複合肽製備方法，包括以下步驟
1)豬口蹄疫重組免疫複合肽的表達
挑取基因工程菌單菌落接種到盛有3 ml LB液體培養基(50pg/ml氮苄青黴素)試 管中，於37'C振搖培養過夜，第二天從中取出一定量的菌體加到另一盛有3 mlLB液 體培養基中，使菌體濃度達到OD6oo"0.1， 37 'C振搖培養2~4小時，當菌體濃度 OD6"0.4-0.6時，加入終濃度為1 mM的IPTG進行誘導表達4 6 h，每隔1小時收集 100pL菌液。4000 rpm，離心10min，收集菌體，將收集的菌體用100 nLPBS重懸後， 加等體積的2xSDS凝膠加樣緩衝液(100 mmol/L Tris，Cl(pH6.8); 200 mmol/L 二硫蘇糖 醇(DTT); 4。/。SDS(電泳級)；0.2%溴酚藍；20°/。甘油)，100'C煮沸5min以使蛋白質變 形，取10nL加樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。
2)豬口蹄疫重組免疫複合肽融合蛋白的純化
將誘導表達的菌液於12 000 rmp離心lOmin收穫沉澱，以洗滌液(5 mM咪唑，0.5 MNaCl， 20mMTris-HCl， pH7.9)重懸菌體，後經超聲波裂解10 min，隨後12 000rmp 離心10 min收穫包涵體沉澱和上清，經SDS-PAGE電泳鑑定表達產物主要以可溶性表 達。將此上清用Ni-NTA親合層析柱進行純化。3)腸激酶酶切豬口蹄疫重組免疫複合肽及純化 再通過N端帶有His標籤的腸激酶切去除硫氧還蛋白，可獲得保持天然N端的豬口 蹄疫重組免疫複合肽。再次進行親和層析，收集穿透峰，將純化的蛋白用PBS進行透析， 得到純度極高的豬口蹄疫重組免疫複合肽。並在GeneQuant pro RNA/DNA Calculator 定量後冷凍乾燥。
基因工程豬口蹄疫免疫複合肽的應用，包括以下步驟利用小鼠動物模型，將豬口蹄疫 免疫複合肽配合豬滅活疫苗使用。通過免疫小鼠的抗體和抗體亞型、脾淋巴細胞增殖、 血清中IL-4和IFN-Y的測定。評價基因工程豬口蹄疫免疫複合肽的免疫佐劑效果。 有益效果
1提高豬口蹄疫疫苗免疫效果
本發明應用豬口蹄疫重組免疫複合肽作為分子佐劑，將豬口蹄疫輔助性T細胞表 位和雙拷貝的囊素模擬肽通過柔性Linker (G-G-G-S)融合形成新型的豬口蹄疫重組免 疫複合肽，可以增強豬口蹄疫滅活疫苗的免疫原性，將豬口蹄疫重組免疫複合肽配合 豬口蹄疫滅活疫苗聯合免疫BALB/c小鼠後，.其體液免疫和細胞免疫都比單獨的豬口 蹄疫滅活疫苗免疫效果好，並且無任何過敏反應。 2易於實現大量生產
本發明在使用豬口蹄疫重組免疫複合肽作為分子佐劑時選擇原核表達載體，其 優點在於技術簡單，成本低，產量高，純化工藝簡單，易於實現大量生產。
圖1豬口蹄疫免疫複合肽的表達設計圖
圖2豬口蹄疫免疫複合肽的基因PCR擴增及重組表達載體鑑定圖
M. DL2000 Marker; 1, 3 5coi I和5W I雙酶切鑑定陽性質粒；2豬口蹄疫免疫複合肽的 基因PCR擴增
圖3豬口蹄疫免疫複合肽融合蛋白純化的SDS-PAGE分析，產物
M.蛋白Marker; 1， 2， 3豬口蹄疫免疫複合肽融合蛋白純化的收集峰
圖4豬口蹄疫免疫複合肽Tricine-SDS-PAGE'
Ml、 M2.蛋白Marker; 1， 2， 3豬口蹄疫免疫複合肽純化的收集峰 圖5淋巴細胞增殖(MTT)分析
1:PBS組2:滅活疫苗組3:滅活疫苗+豬口蹄疫重組免疫複合肽組
圖6 口蹄疫病毒抗體和抗體亞型檢測
圖7小鼠血清中細胞因子的含量 ，
A: IFN-Y含量1: PBS組2:滅活疫苗組3:滅活疫苗+豬口蹄疫重組免疫複合肽組 B: IL-4含量1: PBS組2:滅活疫苗組3:滅活疫苗+豬口蹄疫重組免疫複合肽組
具體實施例方式
1豬口蹄疫重組免疫複合肽基因的重疊PCR(SOE)擴增根據大腸桿菌偏嗜密碼子設計豬口蹄疫重組免疫複合肽基因，分別在引物F1加上五co/ I 酶切位點、引物F3中加上終止密碼子和5WI酶切位點。豬口蹄疫重組免疫複合肽的表 達設計圖見(圖1)
引物F1， SEQ.ID.N0.2:
GAAATTAAAGGCGTG-3'五coi I 引物F2， SEQ.ID.NO.3:
ACGCCTTTAATTTCG-3' 引物F3， SEQ.ID.N0.4:
GGCTAAGTCGACTCG-3' &/I
引物由上海Invitrongen公司合成
PCR反應體系50^1:10xPCRBuffer, 5nL，MgCl2， 3pL ; dNTP， 10mmol/L， lpL; 引物F1 、 F2和引物F2，終濃度為20pmol/L各2pL; TaKaRa ExTaq 0.5pL;滅菌超 純水，34.5pL;
PCR反應條件9fC預變性2min，進入TD-PCR循環:94"C30s,退火溫度從55'C,每循 環lmin,共30個循環;72t;延伸10min， PCR產物經含有溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，切下目的條帶，隨後按膠回收試劑盒(大連TaKaRa 公司)使用說明進行回收，並對回收產物進行電泳鑑定約144bp大小片段即為豬口蹄疫 重組免疫複合肽基因(圖2)，對基因序列測定後，推導其編碼的豬口蹄疫重組免疫複合 肽為48個胺基酸。
2豬口蹄疫重組免疫複合肽基因的基因工程菌株構建
用￡coR I ， I對豬口蹄疫重組免疫複合肽基因和質粒載體pET-32a進行雙酶切, 並置於37 "C水浴作用2 h，酶切產物同樣經1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，膠回收試劑盒 進行回收鑑定。經過酶切的豬口蹄疫重組免疫複合肽基因和pET-32a載體按1: 3的摩 爾比4。C過夜連接。取連接產物加入含有100nL感受態DH5a的聚丙烯離心管中，輕輕 混勻後冰浴30min。將聚丙烯離心管從冰中取出後42。C熱休克90sec，然後立即冰浴2 min。加入800 pL37 。C預熱的LB培養基，於37。C振搖(100 150rpm) 45 min。取100 pL菌液均勻塗布含氨苄青黴素(Amp) 50嗎/ml的瓊脂LB平板，在37 'C正置20 min後， 倒置培養16~20 h。按《分子克隆實驗指南》上的鹼裂解法提取質粒。對提取質粒進行 五ca I和I雙酶切鑑定。以酶切出現144bp左右大小DNA片段的質粒為陽性質粒(圖 2)。並將陽性質粒命名為pET32a-KCMP。送上海Invitrongen公司測序。採用CaCl2轉 化法，將重組質粒pET32a-KCMP轉化進入大腸桿菌BL21 (DE3)中，篩選陽性克隆，
即為基因工程菌株。
3豬口蹄疫重組免疫複合肽的表達
挑取基因工程菌株單菌落接種到盛有3 ml LB液體培養基(50 pg/ml氨苄青黴素) 試管中，於37 'C振搖培養過夜，第二天從中取出一定量的菌體加到另一盛有3 ml LB 液體培養基中，使菌體濃度達到OD6W)"0.1， 37 r振搖培養2~4小時，當菌體濃度 OD,"0.4-0.6時，加入終濃度為1 mM的IPTG進行誘導表達4~6 h，每隔1小時收集 lOO[iL菌液。4000rpm，離心10min，收集菌體，將收集的菌體用100 ^LPBS重懸後， 加等體積的2xSDS凝膠加樣緩衝液(100 mmol/L Tris《l(pH6.8); 200 mmol/L 二硫蘇糖 醇(DTT); 4。/。SDS(電泳級)；0.2%溴酚藍；20%甘油)，100。C煮沸5min以使蛋白質變 形，取10 加樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，SDS-PAGE電泳凝膠的配製及電泳條件參 照分子克隆手冊。
將上述液體混勻後覆蓋在分離膠之上，隨後插入梳子，於室溫下放置10 min待膠 凝固後，拔去梳子，向電泳槽內倒入Tris-甘氨酸電泳緩衝液(25 mmol/LTris; 250 mmol/L 甘氨酸(電泳級)(pH8.3); 0.1% SDS)，加樣結束後接通電源。電源負極端接上槽，正極 端接下槽。在濃縮膠中電壓為80V，進入分離膠中電壓調整為120V。直到樣品到達分 離膠底部後關閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍染色lh，隨後在脫色搖床上脫色1-2h， 觀察結果。
4豬口蹄疫重組免疫複合肽融合蛋白的純化'
將誘導表達的菌液於12 000 rmp離心10 min收穫沉澱，以洗滌液(5 mM咪唑，0.5 MNaCl， 20mMTris-HCl， pH7.9)重懸菌體，後經超聲波裂解10 min，隨後12 000rmp 離心10 min收穫包涵體沉澱和上清，經SDS-PAGE電泳鑑定表達產物主要以可溶性表 達。將此上清用蛋白質Ni柱親和層析進行純化，具體操作過程如下；
將樹脂搖勻後，向柱子裡加入5.0ml樹脂懸液，置於室溫下使其自然沉降，確保柱 床體積為2.5 ml，隨後分別加入3倍體積得純水、5倍體積lxCharge buffer、 3倍體積 lxBinding buffer。當lxBinding buffer流到柱床底部時，向柱子裡加入表達產物，控制 流速，以每小時25 ml的流量過柱，確保蛋白能充分地結合到柱子上。接著加入25ml lxBingding buffer進行洗滌，隨後用15 ml lxWash buffer洗滌，最終用15ml的lxElute buffer洗脫蛋白，即得到豬口蹄疫重組免疫複合肽融合蛋白的純化產物，分子量約 26KDa。該融合蛋白在豬口蹄疫重組免疫複合肽N端連有硫氧還蛋白。(圖3)。 5腸激酶酶切豬口蹄疫重組免疫複合肽及純化
再通過N端帶有His標籤的腸激酶切去除硫氧還蛋白，可獲得保持天然N端的豬 口蹄疫重組免疫複合肽。再次進行Ni柱親和層析，收集穿透峰，將純化的蛋白用PBS 進行透析，得到純度極高分子量約6KDa的豬口蹄疫重組免疫複合肽(圖4)。並在 GeneQuant pro RNA/DNA Calculator定量後冷凍乾燥。 6免疫小鼠
用上述純度極高分子量約6KDa的豬口蹄疫重組免疫複合肽，配合豬口蹄疫疫苗聯 合免疫，評價其免疫增強效果。6周齡雌性BALB/c小鼠分為3組(滅活疫苗組、滅活 疫苗+豬口蹄疫重組免疫複合肽組、PBS對照組)，每組10隻，豬口蹄疫重組免疫複合 肽所用劑量為20ug/鼠。採用腹膜內注射，間隔兩周免疫一次，共免疫三次。並且最後 一次免疫一周尾靜脈採血。檢測口蹄疫病毒抗體和抗體亞型以及血清中il-4和ifn-y 的含量。同時分離脾臟淋巴細胞檢測脾淋巴細胞增殖。O型FMD滅活疫苗為中牧股份 蘭州生物藥廠產品。 7四甲基偶氮唑藍法(MTT)
單獨滅活疫苗免疫的小鼠組0D570平均值為0. 46±0. 032b，滅活疫苗+豬口蹄疫重組 免疫複合肽組為0.72土0.012 PBS組為O. 15±0.033、這三組經統計學分析，滅活疫苗 +豬口蹄疫重組免疫複合肽組和單獨滅活疫苗組差異顯著(P<0.05)，這一結果表明滅 活疫苗+豬口蹄疫重組免疫複合肽組淋巴細胞增殖強於單獨滅活疫苗組(圖5)。
8 口蹄疫病毒抗體和抗體亞型檢測
IgG亞型檢測結果表明常規滅活疫苗主要誘導IgGl的產生，而滅活疫苗+豬口蹄疫重 組免疫複合肽組不但能誘導高水平IgGl的產生，而且誘導IgG2a的產生的能力好於滅活 苗。滅活疫苗和豬口蹄疫重組免疫複合肽二者聯合免疫後誘導小鼠的抗體分泌水平強於 滅活疫苗單獨免疫(圖6) 。 ■
9 血清中il-4和ifn-y的測定
應用定量ELISA對血清中的IL-4和IFN-Y進行定量分析發現滅活苗主要誘導IL-4的分 泌，免疫複合肽組但是加入免疫複合肽組誘導IFN-Y的分泌明顯高於滅活苗組。如圖7。南京農業大學
<120〉豬口蹄疫重組免疫複合肽的製備方法及應用
說明書
00
2008-09-18
5
Patentln version 3.1
<210〉 1
<211〉 147
DNA
〈213〉人工合成
<221〉豬口蹄疫重組免疫複合肽的基因
<222〉 (1)..(147) <223〉
1
ggcggcggcg gcagcgatga tgeitgataaa attagcatta gcga組taa aggcgtgatt 60 gtgcata肌a ttga肌ccat tctgtttggc ggcggcggca gcaccccgaa cctgaaacat 120 ggcaccccga acctgaaaca tggctaa 147
2
66
<212〉 DNA 人工合成
引物F1
(l)..卿
2
ccggaattcg gcggcggcgg cagcgatgat gatgataaaa t;agcattag cgaaattaaa 60
ggcgtg
<210〉3
66
〈212>DNA
人工合成
〈220〉
〈221〉引物F2
〈222〉(1)…(66)
3
ggggtgctgc cgccgccgcc aaacagaatg gtttcaattt tatgcacaat cacgccttta GO
atttcg
<210〉4
〈211>65
<212〉DNA
人工合成
<220〉
引物F3
(1)…(65)
〈223> 4
gcggcggcag caccccgaac ctgaaacatg gcaccccgaa cctgaaacat ggctaagtcg 60 actcg 65 5 48 <212〉 PRT 人工合成 〈220〉
豬口蹄疫重組免疫複合肽 (1)..(48) <223〉 <400〉 5
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys lie Ser lie 1 5 10
Lys Gly Val lie Val His Lys lie Glu Thr lie Leu Phe
20 25 Gly Ser Thr Pro Asn Leu Lys His Gly Thr Pro Asn Leu 35 40 45
Ser Glu lie 15
Gly Gly Gly 30
Lys His Gly
權利要求
1、一種基因工程豬口蹄疫重組免疫複合肽基因，其序列為SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
2、 一種基因表達的豬口蹄疫重組免疫複合肽，其序列為SEQ.ID.N0.5所示的胺基酸序 列。
3、 權利要求2所述豬口蹄疫重組免疫複合賊的應用。
4、 一種高效表達權利要求2所述豬口蹄疫重組免疫複合肽基因工程菌株，其構建包括 以下步驟1) 豬口蹄疫重組免疫複合肽基因的重疊延伸拼接PCR擴增SOE-PCR: 設計三條PCR引物引物F1， SEQ.ID.N0.2:GAAATTAAAGGCGTG-3' 引物F2， SEQ.ID.N0.3:ACGCCTTTAATTTCG-3' 引物F3， SEQ.ID.N0.4:GGCTAAGTCGACTCG-3'PCR反應體系50jxl:10xPCRBuffer, 5pL，MgCl2， 3pL ; dNTP， 10腿ol/L， lpL; 引物F1 、 F2和引物F2，終濃度為20pmol/L各2pL; TaKaRa ExTaq 0.5pL;滅菌超 純水，34.5pL;PCR反應程序94r預變性2min，進入TD-PCR循環:94t)30s，退火溫度從55°C, 每循環lmin,共30個循環;72'C延伸6min，經過膠回收後獲得豬口蹄疫重組免疫複合 肽基因；2) pET32a重組表達載體的構建上述豬口蹄疫重組免疫複合肽基因PCR產物和pET32a均用五co及I、 &/I雙酶切,T4 DNA Ligase連接，連接產物轉化E.coli DH5a，重組表達質粒進行五coi I和I雙酶 切鑑定；酶切鑑定為陽性的質粒測序，命名為pET32a—KCMP;3) 重組表達質粒pET32a—KCMP轉化大腸桿菌BL21，篩選陽性克隆，即為所獲得的高效表達豬口蹄疫重組免疫複合肽基因的基因工程菌株。
5、 用權利要求4所述基因工程菌株製備的可溶性基因工程表達產物豬口蹄疫重組免疫 複合肽。
6、 權利要求5所述表達產物豬口蹄疫重組免疫複合肽的應用。
全文摘要
本發明涉及豬口蹄疫重組免疫複合肽的構建方法和應用，屬於生物工程技術領域。該免疫多肽佐劑為口蹄疫病毒新型輔助T細胞表位(I-S-I-S-E-I-K-G-V-I-V-H-K-I-E-T-I-L-F)和囊素模擬肽(T-P-N-L-K-H-G)通過柔性Linker融合而成。融合基因插入表達載體，轉化大腸桿菌，獲得高效表達豬口蹄疫重組免疫複合肽的基因工程菌，通過液體培養、純化製得的豬口蹄疫重組免疫複合肽融合蛋白，該融合蛋白經N端帶有His標籤的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經親和層析純化，可獲得單一的豬口蹄疫重組免疫複合肽，樣品純度極高。該重組免疫複合肽可作為口蹄疫疫苗的新型多肽免疫佐劑。動物免疫實驗證實，安全性好，無毒副作用。能夠有效增強機體細胞免疫和體液免疫水平。
文檔編號A61K39/39GK101376887SQ20081015572
公開日2009年3月4日 申請日期2008年10月8日 優先權日2008年10月8日
發明者斌 周, 曹瑞兵, 臣 王, 陳溥言, 魏建超 申請人:南京農業大學