促進生物反應的屏障的製作方法

2023-11-05 11:15:02

專利名稱：促進生物反應的屏障的製作方法
技術領域：
本發明涉及進行生物反應的系統、裝置和方法。本發明特別涉及疏水性、水不混溶性或者親脂性屏障在樣品分離、純化、修飾、和分析過程中的用途。
背景技術：
有成本效益的、易於使用的用於分析生物樣品的系統、方法和裝置是非常需要 的。許多可商購的系統需要花費幾萬至幾十萬美元，且具有許多活動部件，使其趨於失 靈。由於這種系統的成本和複雜性，其使用通常局限於具有支持其運行和維持的人員及 業務的臨床實驗室。由 Abbott Architect、Siemens Centaur、Roche Elecsys 等所代表的一類充分集成的 自動化分析儀進行免疫測定。由 Abbott m2000、Roche COBAS，bioMerieux NucliSENS
等所代表的另一類模塊分析儀進行核酸測定。這些系統的複雜性大部分是進行測定中所 涉及的分離步驟的結果。模塊系統也常用於研究實驗室中。免疫測定分離可以通過平板洗滌器如Titertek MAP-C2、BioTek ELx50、Tecan PW 96/384等進行。核酸分離通過如下系統進行， 如 Applied Biosystems PRISM 6100> Invitrogen iPrep、 Thermo Scientific KingFisher、 Promega Maxwell 等。特別關注的是可獲得低成本可靠的分析儀，因為其涉及世界範圍內疾病的診斷 和管理。這個問題由與HIV感染管理相關的問題生動地說明。存在許多技術可以檢測 HIV相關的核酸或者蛋白質水平。這種檢測對於感染HIV患者護理的管理非常重要。然 而，這些系統的成本和複雜性阻止了其廣泛應用。發明概述本發明涉及進行生物反應的系統、裝置和方法。本發明特別涉及疏水性、水或 醇不混溶性或者親脂性屏障在樣品分離、純化、修飾和分析過程中的用途。在一些實施方案中，本發明提供了生物樣品純化和/或分析裝置，包括多個 樣品處理室，其包含用於生物分子或者細胞純化、修飾、分析和/或檢測的試劑；以及 在兩或多個室之間(例如分隔兩或多個室)的親脂性物質。在一些實施方案中，所述親 脂性物質是蠟。在一些實施方案中，所述蠟是相變蠟，其可以取液體或者固體形式的預 定溫度。例如，在一些實施方案中，所述蠟在貯存或者運輸溫度下取固體形式而在反應溫度(例如室溫)取液體形式。在一些實施方案中，所述親脂性物質是油。在一些實施 方案中，有兩個反應室。在一些實施方案中，有三個反應室。在一些實施方案中，有四 個反應室。在一些實施方案中，有五個反應室。在一些實施方案中，有六個或者更多個 反應室(例如7、8、9、10、11、……、20個、……)。在一些實施方案中，所述親脂 性材料提供了兩或多個室之間毗鄰的屏障(即樣品從第一個室直接進入所述親脂性材料 以及直接穿過所述親脂性材料進入第二個室)。在其它實施方案中，在所述親脂性材料和 一或多個室之間存在空氣、液體或者其它材料。在這種實施方案中，所述親脂性材料以 這樣的位置放置，從而使要處理的樣品或者生物分子在某點間穿過該親脂性材料從第一 個室轉運至第二個室。 在一些實施方案中，所有或者部分反應室專用於樣品純化。例如，一或多個 反應室含有導致發生樣品純化現象包括但不限於細胞分解、生物分子捕獲、生物分子分 離，以及細胞培養、純化和/或分析的試劑。在一些實施方案中，所有或者部分反應室 專用於樣品修飾。例如，一或多個反應室含有導致發生生物分子(例如核酸、蛋白質、 脂質等)或者細胞修飾現象包括但不限於擴增、連接、分裂、標記、延伸、降解、與配 體結合、低聚反應、轉染、轉化、轉基因、分裂、分化及類似等的試劑。在一些實施方 案中，所有或者部分反應室專用於樣品分析。例如，一或多個反應室含有使得可以對感 興趣的生物分子或者細胞進行檢測或者其它類型的分析的試劑或者其它成分。在一些實 施方案中，所述反應室含有可以產生顏色、螢光信號、發光信號或者其它可檢測特性的 試劑。在一些實施方案中，將所述反應室配置為通過信號讀出器(例如顏色讀出器、熒 光讀出器、發光讀出器、人眼等)來優化信號檢測。一或多個反應室可用於多種不同任 務，包括純化、修飾、分析和/或檢測。本發明不受所述反應室的配置和與彼此分離的方式所限。所述反應室每個都可 以與另一個是相同大小和形狀，或者不同大小或形狀。可以使用各種不同的配置。在 一些實施方案中，所述處理室是孔且所述親脂性屏障位於所述孔的上面或者下面，從而 由一個室向另一個室轉移的任何材料必須通過向上或向下以及越過移動來穿過親脂性材 料。在一些實施方案中，所述室通過親脂性材料的存在而形成。例如，在一些實施方案 中，將親脂性材料在一或多個通道中(例如在玻璃、塑料或者陶瓷管中)沿一或多個點沉 積以在所述一或多個通道中區域之間形成屏障。所述通道可以是任何尺寸，包括小尺寸 的如毛細管或者微流體槽。在一些實施方案中，將所述室和屏障進行配置，從而使感興 趣的樣品或者生物分子必須穿過線性系列反應室。然而，在其它實施方案中，第一個反 應室中的樣品或者生物分子可任選地跳過一個或多個其它室。在一些實施方案中，將所 述室放置在裝置中，該裝置具有配置好的大小或者形狀以適合現有的實驗設備(例如自 動化機械臂、平板支託物(例如96-孔)、熱循環儀、螢光檢測儀等)。在一些實施方案 中，通道用於分隔反應室，其中所有或者部分通道含有親脂性材料。例如，在一些實施 方案中，將所述裝置配置為與96孔或者384孔平板類似，具有連接兩個更多孔的通道。 在一些實施方案中，兩個室之間的路徑含有空氣、水或者其它流體，其中所述樣品在進 入或者離開所述親脂性材料之前和/或之後穿過所述空氣、水或者其它流體。在一些實施方案中，反應室是含有親水性溶液的微孔或者微管，而親脂性物質 在部分所述室或者在單獨的室中被置於溶液的上面或者下面。
在一些實施方案中，所述裝置包括傳送機制，可以將所希望的材料從一個反應 室中經過親脂性材料轉移至另一個反應室中。例如，在一些實施方案中，在一個反應室 中感興趣的生物分子與磁性顆粒如磁珠結合。通過應用磁場(例如來自磁體)使得磁性 顆粒從第一個室經過親脂性屏障移動至第二個室，從而使感興趣的生物分子從一個室移 動到另一室。在其它實施方案中，形成電場以使用電荷將生物分子或者與所述生物分子 結合的成分(例如配體、珠、電荷標記等)從一個反應室移動至另一反應室。在一些實 施方案中，使用離心 力將感興趣的生物分子從一個室經過親脂性屏障移至另一室。在一 些實施方案中，使用來自真空或者抽吸的壓力在室之間移動材料。本發明不受傳送機制 的限制。在一些實施方案中，所述裝置包括蒸汽屏障(vapor barrier)以防止或者減少在處 理或者使用期間的液體損失。在一些實施方案中，所述裝置由互相疊放在一起的多個薄 層材料組成。例如，在一些實施方案中，所述薄層包含夾在塑料層之間的鋁箔層。在一些實施方案中，本發明的裝置以系統(例如試劑盒)形式提供，其包含可以 進行樣品採集、樣品處理、樣品處置、數據收集、數據分析以及數據提示的一或多種其 它成分。這些成分可以是單獨的裝置或者可以集成在單一的多成分裝置中。這些成分 可包括但不限於醫學裝置、環境樣品處理裝置、蛋白質純化裝置、核酸純化裝置、計算 機、軟體等。所述系統或者裝置的一或多個成分可以是自動化的。在一些實施方案中， 所述系統的一或多個成分被配置為無自動化運行。例如，在非自動化系統中，提供手持 磁體將樣品從一個室移動至另一室，使用加熱模塊(heat block)或者水浴產生所希望的反 應溫度，使用手持螢光檢測儀檢測信號，或者通過肉眼觀測信號。本發明的系統和裝置可用於多種樣品。例如，在一些實施方案中，樣品是生物 或者環境樣品。生物樣品可得自動物(包括人)，並涵蓋液體、固體、組織以及氣體。 生物樣品包括血液產品如血漿、血清等，以及腦脊液、痰液、支氣管洗滌液(bronchial washing)、支氣管抽吸液(bronchial aspirates)、尿液、淋巴液，以及呼吸道、腸道和泌 尿生殖道的各種外分泌物，眼淚、唾液、乳汁、白細胞、骨髓瘤、生物液如細胞培養上 清、組織(固定或者未固定的)、細胞(固定或者未固定)等。環境樣品包括但不限於環 境材料，如表面物質、土壤、水以及工業樣品。附圖描述

圖1示出本發明的一些實施方案的用於樣品純化和PCR的藥筒(cartridge)。圖 Ia示出原型藥筒。圖Ib示出液體蠟通道的圖樣。圖2示出本發明一些實施方案的用於樣品純化的藥筒。圖3示出用於構建本發明一些實施方案藥筒的箔層壓板(foil laminate)的層。圖4示出用於本發明一些實施方案中的箔層壓板藥筒的圖樣。圖5示出(a)永磁體相對於兩個不混溶流體的位置，以及(b)在χ和y方向作用 於顆粒上的磁力的表面圖。圖6示出使用落重法(weight drop method)評估表面張力的實驗安排。圖7示出在基於管的微流體系統中夾層測定各個階段的圖示。圖8示出FLl高度對應Log(生物素濃度)的圖示。圖9示出由流式細胞計量儀記錄的事件對應於前向散射、側向散射和FLl高度的圖示。圖10示出鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性顆粒從一個毛細管向另一毛細管的移動 及隨後與生物素反應的圖示。圖Ila示出在移動穿過含有螢光染料的油之後鏈黴抗生物素蛋白包被顆粒的信 號。圖lib示出在移動穿過含有螢光染料的油以及隨後在PBS緩衝液中攪動該顆粒之後 鏈黴抗生 物素蛋白包被顆粒的信號。圖12示出在本發明一些實施方案中使用的兩室小透明容器(cuvette)的示意圖。圖13示出在本發明一些實施方案中使用的兩室小透明容器的示意圖。圖14示出使用不混溶相過濾(IPF)方法對來自血漿的HIV-I進行的qRT_PCR 相對IogltlHIV-I病毒拷貝數繪製的一式兩份運行的4種不同RNA濃度的Ct值的標準曲線。圖15示出對比IPF和人工純化方法的Bland-Altman圖實心黑色方塊示出兩種
方法之間的差異，實線(y =-0.00772)示出兩種方法之間的平均差異，虛線示出平均值 +2和-2標準差(SD)。圖16示出通過來自尿液樣品衣原體qPCR的IPF量化。圖17示出通過來自尿液樣品淋病qPCR的IPF量化。圖18示出對比衣原體的IPF和人工純化方法的Bhnd-Altrmn圖。圖19示出對比淋病的IPF和人工純化方法的Bhnd-Altrmn圖。圖20示出對來自25 μ L WB的前病毒DNA的IPF PCR。圖21示出對比IPF和人工純化方法的Bland-Altman圖。定義為了便於理解本發明的揭示，術語定義如下。如本文所用，術語「親脂性材料」是指在水、醇或者其它親水性或者水成液體 中基本上不混溶的任何物質。在一些實施方案中，本發明的親脂性材料對於幹擾特定生 物過程如核擴增或者生物分子檢測的物質具有低溶解性。在一些實施方案中，本發明的 親脂性材料具有低蒸汽壓。親脂性物質趨於通過範德華力與其自身以及與其它物質相互 作用。它們具有很小能力乃至沒有能力形成氫鍵。親脂性物質典型具有大o/w(油/水) 分配係數。術語「不溶於水」以及「疏水性」材料在本說明書中可同義使用。該術語包括 在水中幾乎不溶並在揮發性親脂性溶劑如二氯甲烷以及非揮發性親水性溶劑特別是N-甲 基吡咯烷酮(NMP)中可自由溶解的聚合物。「水混溶性」或者「親水性」材料是指可以用至少等量部分的水稀釋而不分離 的有機液體。「水不混溶性」或者「親脂性」材料的性質是其不能用至少等量部分的水稀釋 而不分離。「純化的多肽」或者「純化的蛋白質」或者「純化的核酸」是指感興趣的多 肽或核酸或者其片段，其基本上沒有與所述感興趣的多肽或者多核苷酸天然結合的細胞 成分，例如含有低於大約50%、優選低於大約70%、以及更優選低於大約90%的所述成 分。
術語「分離的」是指將所述材料從其原始環境(例如如果其是天然發生的，則 為天然環境)中取出。例如，存在於活動物體內的天然發生的多核苷酸或者多肽不是分 離的，但是與一些或者所有天然系統中共存的材料分開的相同多核苷酸或者DNA或者多 肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或者多肽可以是 組合物的一部分，且在所述載體或者組合物不是其天然環境的一部分的情況下仍是分離 的。「多肽」和「蛋白質」在本文可互換使用，並包括下文描述的所有多肽。多肽的基本結構為本領域熟知且已經在本領域的眾多教科書及其它出版物中有描述。在此背 景下，該術語在本文是指包含兩個或更多個在線性鏈中通過肽鍵彼此連接的胺基酸的任 何肽或者蛋白質。如本文所用，該術語既是指短鏈通常在本領域也稱作肽、寡肽和寡聚 體，也是指長鏈通常在本領域稱作蛋白質，其有許多類型。應意識到多肽常含有除了通常稱作20個天然發生胺基酸的20個胺基酸之外的 胺基酸，且許多胺基酸、包括末端胺基酸在給定的多肽中可以是修飾的，所述修飾或者 通過天然過程如加工及其它翻譯後修飾進行，也可以通過本領域熟知的化學修飾技術進 行。儘管在多肽中天然發生的一般修飾太多以至於不能在此詳盡地列出，但是其在基 礎教科書中和在更詳細的專著中以及在眾多研究文獻中有很好的描述，並且為本領域 技術人員所熟知。在可以出現於本發明多肽中的已知修飾中，用於舉例提及的有乙醯 化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷 酸或者核苷酸衍生物的共價附著、脂質或者脂質衍生物的共價附著、磷脂醯肌醇的共 價附著、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯形成、胱氨酸形成、焦穀氨 酸形成、甲醯化、Y-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化 (myrisoylation),氧化、蛋白酶解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒化、硫酸 化、轉移-RNA介導向蛋白質添加胺基酸，如精氨醯化，以及泛素化。這些修飾為本領域技術人員熟知，且已經在科學文獻中有詳細描述。一些 特別常見的修飾例如糖基化、脂質附著、硫酸化、穀氨酸殘基的Y-羧化、羥基化以 及ADP-核糖基化在大部分基礎教科書中描述，例如Proteins—Structure and Molecular Properties, 2.sup.nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York (1993)。 在此問題上也有許多詳細的綜述可用，如例如Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications Perspectives and Prospects, pg.1—12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)、Seifter et al.，Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth.Enzymol.182 : 626-646 (1990)以及 Rattan et al.， Protein synthesis Posttranslational Modifications and Aging, Ann N.Y.Acad. Sci.663 48-62(1992)所述。應意識到且為本領域熟知及如上所述，多肽不總是完全線性的。例如，作為泛 素化的結果，多肽可以是分支的，且其可以是有或者沒有分支的環狀，通常是作為翻譯 後修飾的結果，包括天然處理結果以及非天然發生的人工操控帶來的結果。環狀的、分 支的以及分支環狀的多肽也可以通過非翻譯天然過程合成以及通過完全合成方法合成。修飾可以在多肽的任何部位發生，包括肽主鏈、胺基酸側鏈以及氨基或者羧基 末端。事實上，通過共價修飾封閉多肽中氨基或者羧基基團或者二者在天然發生的和合成的多肽中是常見的。例如，在大腸桿菌中產生的多肽的氨基末端殘基在蛋白酶解處理 之前幾乎總是N-甲醯甲硫氨酸。在多肽中發生的修飾通常與其如何產生相關。例如對於通過在宿主中表達克隆 的基因而產生的多肽而言，修飾的性質和程度大部分取決於宿主細胞翻譯後修飾能力以 及在多肽胺基酸序列中存在的修飾信號。例如，眾所周知，通常在細菌宿主如大腸桿菌 中不發生糖基化。因此，當需要糖基化時，多肽應在糖基化宿主、一般為真核細胞中表 達。昆蟲細胞通常進行與哺乳動物細胞相同的翻譯後糖基化，且因此昆蟲細胞表達系統 已經被開發以有效表達具有糖基化天然模式的哺乳動物蛋白質。相似的考慮適用於其它 修飾。 應意識到相同類型的修飾可以以相同或者不同程度存在於給定多肽的幾個部 位。給定多肽也可以含有許多類型的修飾。通常，如本文所用，術語多肽涵蓋了所有這些修飾，特別是通過在宿主細胞中 表達多核苷酸而合成的多肽中存在的那些修飾。術語「成熟」多肽是指已經經歷適於所述多肽和起源細胞的完全的翻譯後修飾 的多肽。特定多肽的「片段」是指這樣的胺基酸序列，其包含衍生自該特定多肽的至少 大約3-5個胺基酸，更優選至少大約8-10個胺基酸以及更優選至少大約15-20個胺基酸。術語「免疫學可鑑別」是指也存在於且為指定多肽所特有的表位和多肽的存 在。免疫學相同性可以通過抗體結合和/或結合競爭確定。表位的獨特性也可以通過計 算機在已知資料庫如GenBank檢索編碼表位的多核苷酸序列以及通過與其它已知蛋白質 進行胺基酸序列對比而確定。如本文所用，「表位」是指多肽或者蛋白質的抗原決定簇。可以想像，表位在 對該表位是獨特的空間構象中可包含三個胺基酸。通常，表位由至少5個這種胺基酸組 成，而更通常是由至少8-10個胺基酸組成。檢驗空間構象的方法為本領域已知，包括例 如X射線結晶學和二維核磁共振。「構象表位」是這樣的表位，其包含在免疫學可識別結構中胺基酸的特定並列 (juxtaposition)，這種胺基酸以毗鄰或者非毗鄰順序存在於同一多肽上或者存在於不同多 肽上。當多肽由於所述多肽中含有的特定表位的抗體識別能力而與抗體結合時，則所 述多肽與抗體是「免疫學反應性的」。免疫學反應性可以通過抗體結合確定，更特別是 可通過抗體結合動力學和/或通過使用已知多肽作為競爭劑的結合競爭而確定，所述已 知多肽含有抗體所針對的表位。確定多肽是否與抗體是免疫學反應性的方法為本領域已 知。如本文所用，術語「含有感興趣表位的免疫原性多肽」是指天然發生的感興趣 多肽或者其片段，以及通過其它方式製備的多肽，例如通過化學合成或者在重組生物體 中多肽的表達。「純化的產物」是指這樣的產物製備物，其已經與所述產物正常相關聯的細胞 組成部分及與可以存在於感興趣的樣品中的其它類型細胞分離。
如本文所用，「分析物」是測試樣品中可能存在的待檢測的物質，包括感興趣 的生物分子、小分子、病原體等。分析物可包括蛋白質、多肽、胺基酸、核苷酸靶等。 分析物可在如血液、血漿或者血清、尿液等體液中是可溶的。分析物可以在組織中，在 細胞表面或者在細胞內。分析物可以在分散於體液如血液、尿液、乳房抽吸液中的細胞 上或其內，或者作為活組織檢查的樣品而獲得。如本文所用，「特異性結合成員」是指特異性結合對的成員。即兩個不同的分 子，其中一個分子通過化學或者物理方式特異性結合另一分子。因此，在通常的免疫測 定的抗原與抗體特異性結合對之外，其它特異性結合對可包括生物素和抗生物素蛋白、 碳水化合物和凝集素、互補核苷酸序列、效應物和受體分子、輔因子和酶、酶抑制劑、 以及酶等。此外，特異性結合對可包括是原始特異性結合成員的類似物的成員，例如分 析物-類似物。免疫反應性特異性結合成員包括抗原、抗原片段、抗體以及抗體片段、 其單克隆和多克隆及複合物，包括通過重組DNA分子所形成的那些。特異性結合成員包括「特異性結合分子」。「特異性結合分子」意指任何特異 性結合成員，特別是免疫反應性特異性結合成員。如此，術語「特異性結合分子」涵 蓋抗體分子(得自多克隆和單克隆製備物)以及如下雜種 (嵌合)抗體分子(見例如 Winter, etal，Nature 349 293-299 (1991)和美國專利 No.4,816,567) ； F(ab' )jPF(ab) 片段；Fv 分子(非共價異源二聚體，見例如 Inbar，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69 2659-2662(1972)和 Ehrlich，et al., Biochem.19 4091-4096(1980))；單鏈Fv分子(sFv) (見例如 Huston，et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 5879-5883(1988))；人源化抗體分 子(見例如 Riechmann，etal., Nature 332 323-327 (1988)，Verhoeyan, et al., Science 239 1534-1536(1988)以及1994年9月21日公開的英國專利出版物No.GB2,276,169)； 以及得自這種分子的任何功能片段，其中這種片段保留親代抗體分子的免疫學結合性 質。如本文所用，術語「半抗原」是指部分抗原或者非蛋白質結合成員，其能結合 抗體，但是除非其與載體蛋白(carrierprotein)結合否則不能激發抗體形成。如本文所用，「捕獲試劑」是指未標記的特異性結合成員，其特異於夾層測定 中的分析物、特異於競爭測定中的指示試劑或者分析物，或者特異於輔助特異性結合成 員，其自身如在間接測定中一樣特異於分析物。所述捕獲試劑在進行所述測定之前或 者期間可以直接或者間接結合於固相材料，從而使得可以從檢測樣品中分離固定的複合 物。「指示試劑」包含「產生信號的化合物」(「標記」)，其能夠生成以及產生可 通過外部方式檢測的可測量信號。在一些實施方案中，所述指示試劑與特異性結合成員 綴合(附著)。除了是特異性結合對的抗體成員之外，所述指示試劑也可以是任何特異性 結合對的成員，包括半抗原-抗-半抗原系統如生物素或者抗生物素、抗生物素蛋白或者 生物素、碳水化合物或者凝集素、互補核苷酸序列、效應物或者受體分子、酶輔因子和 酶、酶抑制劑或者酶等。免疫反應性特異性結合成員可以是抗體、抗原、或者抗體/抗 原複合物，其在夾層測定中能結合感興趣的多肽、在競爭測定中能結合捕獲試劑或者在 間接測定中能結合輔助特異性結合成員。當描述探針和探針測定時，可以使用術語「報 道分子」。報導分子包含如上文所述的產生信號的化合物，其與特異性結合對的特異性結合成員綴合，如咔唑或者金剛烷。預期的各種「產生信號的化合物」(標記)包括產色原(chromagen)，催化劑如 酶，發光化合物如螢光素和羅丹明，化學發光化合物如二氧環乙烷(dioxetane)、吖啶鐺 (acridinium)、菲啶鐺(phenanthridinium)以及魯米諾，放射性元素和直接觀測標記。酶
的例子包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶及類似等。特定標記的選擇 不是關鍵的，但是其應能夠由其自身或者與一或多種其它物質一起產生信號。「固相」(「固體支持物」)為本領域已知的那些，包括反應盤的孔壁、試管、 聚苯乙烯珠、磁性或者非磁性珠、硝化纖維條、膜、微粒如乳膠顆粒等。所述「固相」 不是關鍵的，可以由本領域技術人員選擇。因此，乳膠顆粒、微粒、磁性或者非磁性 珠、膜、塑料管、微滴定孔壁、玻璃或者矽晶片均是合適的例子。預期到並且在本發明 範圍內的是，所述固相也可包含任何合適的多孔材料。如本文所用，術語「檢測」可以描述對可檢測地標記的組合物進行的一般性的 揭示或者識別的行為作用或者特異性的觀測。術語「多核苷酸」是指核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、修飾的RNA 或者DNA、或者RNA或DNA模擬物的聚合物。因此，這個術語包括由天然發生的核鹼 基、糖和共價核苷酸間(主鏈)鍵組成的多核苷酸，以及具有起相似作用的非天然發生部 分的多核苷酸。這種修飾的或者取代的多核苷酸為本領域所熟知，且對於本發明的目的 而言被稱作「類似物」。如本文所用，術語「核酸分子」是指任何含有核酸的分子，包括但不限於DNA 或者RNA。該術語涵蓋了包括DNA和RNA的任何已知鹼基類似物的序列，包括但不 限於4-乙醯-胞嘧啶、8-羥基-Ν6-甲基腺苷、氮雜環丙基-胞嘧啶、假異胞嘧啶、 5_(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧 啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺 嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基 腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥 嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮 苷(β-D-mannosylqueosine)、5，-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基 硫-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧基丁氧苷 (oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2-硫胞嘧、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿 嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、 假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。術語「基因」是指核酸(例如DNA)序列，其包含產 生多肽、前體或者RNA(例 如rRNA、tRNA)所必需的編碼序列。多肽可以由全長編碼序列或者由所述編碼序列的任 何部分編碼，只要保留所希望的其全長或者片段的活性或者功能性質(例如酶活性、配 體結合、信號轉導、免疫原性等)即可。該術語也涵蓋結構基因的編碼區和在5』和3』 末端分別與該端距離大約Ikb或更多鄰近編碼區的序列，由此所述基因相應於全長mRNA 的長度。位於編碼區5』端並在mRNA上出現的序列被稱作5』非翻譯序列。位於編 碼區3』端或者下遊並在mRNA上出現的序列被稱作3』非翻譯序列。術語「基因」涵 蓋了基因的cDNA和基因組形式。基因的基因組形式或者克隆含有由稱作「內含子」或者「間插區」或者「間插序列」的非編碼序列中斷的編碼區。內含子是基因被轉錄到核 RNAChnRNA)內的節段；內含子可含有調節元件如增強子。內含子從核或原始轉錄物中 被除去或者「剪除」，因此內含子在信使RNA(mRNA)轉錄物中缺失。mRNA在翻譯期 間給定新生多肽中胺基酸的序列或者順序。術語「核酸擴增試劑」包括用於擴增反應的常規試劑，包括但不限於具有聚合 酶活性的一或多種酶、酶輔因子(如鎂或者煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD))、鹽、緩衝 液、脫氧核苷三磷酸(dNTP ；例如脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸 以及脫氧胸苷三磷酸)以及調節聚合酶活性或者引物特異性的其它試劑。
如本文所用，術語「互補」或者「互補性」用於描述根據鹼基配對規則相關聯 的多核苷酸(即核苷酸如寡核苷酸或者靶核酸的序列)。互補性可以是「部分的」，其中 根據鹼基配對規則僅一些核酸鹼基匹配。或者，核酸之間可以是「完全」或者「全部」 互補性。核酸鏈之間的互補性程度對於核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著作用。這 在擴增反應以及依賴於核酸之間結合的檢測方法中是特別重要的。術語「同源性」是指相同性的程度。可以有部分同源性或者完全同源性。部 分相同的序列是與另一序列低於100%相同。如本文所用，術語「雜交」用於描述互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即核 酸之間結合的強度)受這樣的因素影響，即核酸之間互補性的程度、所涉及條件的嚴格 性、形成雜交體的Tm，以及核酸中G C比率。如本文所用，術語「Tm」用於描述「解鏈溫度」。解鏈溫度是在此溫度下雙 鏈核酸分子群變成一半解離為單鏈的溫度。計算核酸Tm的公式為本領域熟知。如標準 參考所示，當核酸在IM NaCl水溶液中時，對Tm值的簡便估計可以通過如下公式計算 Tm = 81.5+0.41 (% G+C)(見例如 Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)。其它參考包括更精密的計算，其在對Tm的計算中 考慮到結構以及序列特性。如本文所用，術語「嚴格性」用於描述溫度、離子強度和其它化合物的存在的 條件，在此條件下進行核酸雜交。在「高嚴格性」條件下，核酸鹼基配對將僅在具有高 頻率互補鹼基序列的核酸片段之間發生。因此，當希望雜交或者退火到一起的核酸彼此 不完全互補時，通常需要「弱」或者「低」嚴格性條件。術語「野生型」是指具有分離自天然發生來源的基因或者基因產物的特性的基 因或者基因產物。野生型基因是在群體中最常觀測到的，並因此被專稱作基因的「正 常」或者「野生型」形式。相反，術語「修飾的」或者「突變體」是指當與野生型基 因或者基因產物對比時在序列和/或功能性質(即改變的特性)中呈現修飾的基因或者基 因產物。注意的是天然發生的突變體可以是分離的；這些通過這樣的事實鑑別即當與 野生型基因或者基因產物相比時其具有改變的特性。如本文所用，術語「寡核苷酸」定義為包含兩或更多個脫氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸的分子，優選至少5個核苷酸、更優選至少大約10-15個核苷酸以及更優選至少大 約15-30個核苷酸或者更長。精確大小取決於許多因素，這些因素又繼而取決於寡核苷 酸的最終功能或者用途。寡核苷酸可以以任何方式產生，包括化學合成、DNA複製、逆 轉錄或其組合。
由於單核苷酸以如下方式反應產生寡核苷酸，即一個單核苷酸戊糖環的5』磷酸 通過磷酸二酯鍵在一個方向與其相鄰的3』氧原子附著，如果其5』磷酸未與單核苷酸戊 糖環的3』氧原子連接，則將寡核苷酸的末端稱作「5』末端」，如果其3』氧原子未與 隨後的單核苷酸戊糖環的5』磷酸連接，則將寡核苷酸的末端稱作「3』末端」。如本文 所用，即使核酸序列位於較大的寡核苷酸的內部，也可以稱其具有5』和3』末端。當 以5』至3』方向沿著核酸鏈行進時，如果沿核酸鏈的第一個區域的3』末端在第二個區 域的5』末端之前，則稱第一個區域在另一區域的上遊。當兩個不同的非重疊的寡核苷酸退火至相同線性互補核酸序列的不同區域並且 一個寡核苷酸的3』末端朝向另一個的5』末端時，前者可以稱作「上遊」寡核苷酸， 後者稱作「下遊」寡核苷酸。術語「引物」是指這樣的寡核苷酸，當將其置於引物延伸起始的條件下時能發 揮作為合成的起始點的作用。寡核苷酸「引物」可在如純化的限制性消化中天然發生， 或者可以合成產生。
發明詳述本發明涉及進行生物反應的系統、裝置和方法。本發明特別涉及親脂性屏障在 樣品分離、純化、修飾和分析過程中的用途。如果需要，本發明的系統、裝置和方法可以配置為便宜且易於使用的樣品純化 和/或修飾和/或分析和/或檢測系統。例如，本文描述的本發明的實施方案提供了 經濟的方法用於廣泛的生物分子檢測、分析和鑑定。這些系統、裝置和方法具有許多用 途。為了舉例說明本發明的方面和益處，下文提供了其在核酸和蛋白質分析、特別是監 測HIV感染和狀態中的應用。本發明不限於這些舉例說明性的實施方案。在一些實施方 案中，本發明的系統、裝置和方法與現有複雜昂貴的樣品分離、純化、修飾和分析設備 一起應用。例如，在一些實施方案中，本發明的方法用於在使用傳統設備(例如熱循環 儀、質譜分析儀、NMR裝置等)修飾和/或分析之前進行樣品分離(例如核酸或者多肽 純化)。有三千五百萬成年人和兒童忍受HIV/AIDS，其中兩千兩百萬在撒哈拉沙漠以南 非洲。在非洲一般的診所治療大約400名患者，而運輸的問題導致診所數目增加而不是 大型中心機構的增長。因此，需要超過100,000臺病毒負荷測量儀器。目前可利用的病 毒負荷測定的主要局限包括所需儀器的成本、複雜耗時的程序，導致需要高度培訓的人 員及需要試劑的低溫運輸。可負擔的簡便HIV病毒負荷測定的開發是在發展中國家改善AIDS患者護理質 量的關鍵步驟。這需要將通常在中心實驗室進行的自複雜診斷程序自動化成小的床旁 (POC)裝置；這個能力可以準許衛生保健工作人員和患者即使在最遠程情況下也獲得重 要健康相關信息。所需的HIV病毒負荷測定應優選在床旁給予答覆，但是將其從遠程中 心實驗室轉移至距患者較近的社區醫院實驗室將改善結果。這種裝置將以短的周轉時間 和可負擔的成本進行HIV的分離、擴增和檢測。短時是關鍵，因為這樣將減少門診需要 的機器數量以及縮短患者在門診花費的時間，從而降低實際成本。當在中心實驗室及外出到現場(out in the field)進行HIV病毒負荷測定時必須克
服許多挑戰。大的實驗室使用自動化或者半自動化機器人系統來進行大體積HIV病毒負荷測定。然而，樣品處理是這些檢測的典型地最麻煩部分。目前，樣品處理程序包括許 多步驟，通常需要離心和提取步驟。這些方法通常也不足以純化靶核酸。其通常在反應 混合物中遺留抑制性或者幹擾物質，引起擴增反應的抑制以及導致假陰性結果。目前樣 品處理技術的人工操作性質也可導致標本交叉汙染，其可導致假陽性結果。已經進行可觀的嘗試試圖使樣品製備過程自動化，因為這樣可以更廣泛使用 PCR或者其它核分析技術。然而，現有的自動化高通量系統進行多個提取和純化步驟， 且仍需要某些人工製備，包括樣品和試劑裝載以及廢棄物去除。因此，需要高度培訓的 技術人員來進行測定和維護儀器。自動化系統非常昂貴，因為其使用複雜的機械臂來轉 移溶液或者磁性顆粒以及使用精確儀器來對液體進行移液。自動化系統的成本通常難以 適合較小的實驗室，尤其是在資源有限的那些實驗室。交叉汙染也是一個問題，因為其 應用擴增技術。臨床實驗室通常使用單獨的室進行試劑製備、樣品製備、擴增和擴增後 分析。由於這些原因，儘管已自動化，病毒負荷檢測在臨床實驗室改進修正案(CLIA)中 仍被認為是高複雜性測試。迄今為止，對於免除CLIA的狀況(CLIA-waived status)還沒 有合格的核酸測試(NAT)系統，大部分是由於使樣品製備和試劑處理自動化中的困難所 致。進行現場使用或者接近患者的NAT涉及甚至更多挑戰，尤其是因為其不可避免 地由經驗較少的使用者在非實驗室環境中進行。目前已經開發了如下系統用於在現場部 署 NAT。Cepheid(Sunnyvale, CA)的GeneXpert系統是最早的基於PCR的儀器之一，其
集成了樣品製備、擴增和檢測。可拋棄性的單次測試GeneXpert樣品製備藥筒(cartridge) 由四個功能部件組成蓋子、筒體、閥門體組件以及小體積PCR反應管。筒體內部分為 許多各種大小和功能的室，一些室含有凍幹的試劑珠，並且每個在底部均具有一個開口 (port)用於流體流入和流出。所述室圍繞中心的注射桶成放射狀排列。閥門體組件位於 筒體下面，是細胞分解和DNA純化部位，在軟體控制下，儀器上的旋轉閥使得閥門體組 件移動，從而使流體可以從合適的室內吸出或者分配至其中，用於根據程序化測定方案 來進行混合、稀釋和洗滌。反應管突出於筒體外，接受製備的樣品並連接PCR反應器以 進行靶分析物的擴增和檢測。為了在GeneXpert系統上進行測試，操作者打開筒蓋，將 液體樣品裝載入樣品室內。當操作者關閉蓋時，所述藥筒在整個檢測程序和生物毒害清 除中被持久密封，消除樣品交叉汙染的任何風險。通過在藥筒下直接產生的超聲攪動閥 門體組件中的微小玻璃珠而使細胞分解。提取的DNA流入含有固定化DNA探針的微流 體通道中，DNA作為細胞碎片流經所述探針。之後結合的DNA被從其附著部位釋放並 洗脫以進行PCR擴增。由 IQuum Inc (Allston，MA)開發的另一系統是 Liat Molecular Analyzer，基於其 專有的lab-in-a-tube(Liat)技術平臺。所述Liat試管使用柔性試管作為樣品容器，並在 試管節段中含有預先包裝的所有測定試劑。單位劑量試劑和內部對照物可以通過使用可 剝離的封條以用於測定的順序分別地置於一系列試管節段中。所述可剝離的封條通過塑 料試管的熱焊接形成。通過對鄰近每個封條的試管節段施加壓力，所述封條可爆開而釋 放試劑。在Liat分析儀中，多個樣品處理器模塊與Liar試管排列在一起。每個模塊由 執行器(actuator)和夾具組成，其位置可被控制以操縱試管內的測試樣品。可收回的磁體附著於一個模塊以操縱磁珠。當將試管裝載入分析儀中時，所述執行器和夾具相繼擠壓 試管以使試劑和對照物從一個節段移動到另一個。相似地，通過同步執行器與夾具的動 作，可以在試管內進行各種樣品處理過程。這些過程包括調節節段中的液體體積；釋放 試劑至相鄰節段；混合試劑與樣品；在給定溫度攪動並溫育反應混合物；以及洗滌及從 節段中除去廢棄物。廢棄物移向蓋子中的廢棄物室，而純化的樣品移向該管的更下層。 在最下面的室內，釋放的DNA被擴增。用於現場使用的其它商業化實時PCR裝置包括Idaho Technology Inc. (Salt Lake City)提供的 Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device、 Lawrence Livermore National Laboratory (Livermore, CA)提供的 Hand-HeldAdvanced Nucleic Acid Analyzer, 以及Smiths Detection (Pine Brook，NJ)提供的Bio-Seeq檢測儀。然而，這些裝置不具有
自動化樣品製備和試劑處理功能。上述系統是在正確方向上的步驟。然而，GeneXpert在操作上仍具有一定複雜性，並需要經培訓的技術人員操作。由於其需要使用者現場移液，因此需要精確測量儀 器，這進一步增加了該系統成本。儘管Liar MolecularAnalyzer不包括在現場測量精確液 體體積，但是由於需要複雜機械系統以精確移動流體而成本較高。Liat試管難以生產， 使得質量控制較難。所述試管難以貯存且具有滲漏問題。小量的分子如蛋白質和化學試劑的受控移動和輸送代表了微流體技術中的一個 現有的挑戰，且對於開發POC裝置如HIV病毒負荷裝置有關鍵重要性。大多數微流體系 統依賴於流體運動以使分子溶液從一個部位移向另一部位，結果這些系統非必須地消耗 溶劑和材料且涉及控制流體流動的複雜機械系統。本發明的實施方案提供了另外的方法 解決此問題，該方法使用磁性微粒作為載體使分子從一個反應介質移至下一介質並從該 系統中去除了所有的流體流。其中磁性顆粒由磁力操縱的這種方法使得可以進行複雜的 化學反應，如以低成本在密封藥筒中進行的病毒負荷測試。由於該反應中的驅動力是磁 場，因此該系統可以是自動化的，使得可以構建便攜可靠系統進行病毒負荷測試而無汙 染問題。雖然當前系統舉例用於HIV病毒RNA的樣品純化，但是該平臺可輕易地擴展 至其它核酸測試和免疫測定，以及其它感興趣的生物分子或者非生物分子的檢測。本發明的實施方案提供了用於在單一儀器中進行樣品純化和分析測定的裝置。 在一個舉例的實施方案中(見例如實施例1)，其包括使用磁性顆粒作為固相以捕獲 RNA,隨後純化及釋放RNA以進行擴增和檢測。常規裝置通過交換與固相接觸的溶液而進行測定。所述固相可以是微滴定孔、 微粒或者包裝的柱。即使當固相是順磁性顆粒(PMP)時，也典型在單一容器中通過磁性 捕獲微粒並交換溶液來進行測定。本發明的實施方案使用多個室容納測試樣品和基於水 或者水_醇混合物洗滌緩衝液以及進行分析的緩衝液。室內的基於水的溶液由與該溶液 不混溶的親脂性材料(例如蠟或者油)分隔。在一些實施方案中，使用蠟材料和孔進行 舉例說明。不同孔中的蠟彼此連接形成蠟通道(圖1)。所述蠟可以是固化的以便於貯存 和運輸。在測定期間，使蠟熔化並將PMP拖入蠟中，並通過將其從一個室穿過蠟移至另 一室。磁場用於產生移動PMP及使其穿過基於水的溶液與蠟之間界面所需要的力。最 大的力用於移動顆粒經過該界面並使用柔性頂部平板以使磁體接近該界面並降低產生所 述力所需的磁體的強度。
移動PMP而非液體消除了在自動化處理器中對泵和抽吸器的需要以及對培訓技 術人員等分液體的需要。蠟的使用消除了對在床旁分析儀中使用的單次使用測試藥筒中 室之間閥門的需求。通過減少從一個孔轉至(carryover)下一孔的液體量也減少了從一個 室轉至下一室的抑制劑的量。由於用於移動顆粒的力是磁力，因此該系統可以是完全密 閉的，顯著降低了汙染風險，汙染是靈敏性測定如PCR的主要問題。I.裝置 如上所述，本發明提供了產生和使用低成本裝置進行樣品製備和分析的能力。 在一些實施方案中，所述裝置是單次使用或者多次使用和可拋棄性的。在一些實施方案 中，所述裝置使用塑料(或者其它材料)藥筒，其包含多個樣品處理(例如樣品製備和/ 或分析)孔。每個孔包含用於樣品製備或者分析的試劑。試劑的性質依賴於所使用的特 定樣品及分析方法。在一些實施方案中，所述藥筒由化學惰性且提供適當機械強度的任 何材料組成。在一些實施方案中，所述藥筒使用箔層壓板構造，其包含用作蒸汽屏障目 的的鋁層以及與試劑接觸的惰性聚合物層。在涉及RNA純化和分析的實施方案中(例如 病毒檢測或者荷載測定)，優選所述藥筒是無RNA和RNAse的。本領域已知的滅菌方法 可用於在使用之前對所述藥筒進行滅菌。本發明實施方案的藥筒用分隔樣品處理室的材料覆蓋。在一些實施方案中，所 述材料是親脂性材料，其具有相變特性且與樣品製備和分析的試劑以及樣品中可幹擾擴 增和檢測的物質不混溶。在一些實施方案中，所述材料是蠟。在一些實施方案中，所 述蠟在室溫是液體。在其它實施方案中，所述蠟在室溫是固體而在適於反應的溫度是液 體。在其它實施方案中，所述親脂性材料是油。所述親脂性材料可以在使用溫度、大小 排阻、穩定性等方面加以選擇以最適用於感興趣的特定分子。在一些實施方案中，所述親脂性材料分隔樣品處理室。在其它實施方案中，所 述親脂性材料位於室之間，但是在室之間不形成物理屏障。在這種實施方案中，樣品在 穿過所述親脂性材料之前或者之後可以穿過空氣或者其它試劑。本發明不限於特定的親脂性材料。在一些實施方案中，親脂性材料在水和醇中 不混溶，在水中呈現出低溶解性(例如ppm)，是化學惰性的，具有與測定處理相適合的 熔點和沸點(例如全氟化己烷(perfluorohexame)具有56 °C的bp)，具有與水不同的比重 (例如在水中漂浮或者下沉)，具有低膨脹係數，以及在50°C長期穩定(例如幾周、幾個 月或者幾年)。可用於本發明實施方案中的可商購親脂性材料包括但不限於Chill-OutH蠟(MJ Research)，石蠟蠟如IGI 1070A,微晶蠟如IGI Micosere 5788A，大豆和棕櫚蠟如IGI R2322A，蠟燭蠟如IGI 6036A，熱固性蠟如IGI Astorstat75，熱熔性膠粘劑，無規聚丙烯
和聚烯烴化合物，石油蠟以及牙科用蠟。在其它實施方案中，使用天然蠟如動物蠟(例如蜂蠟、羊毛脂或者)牛脂，植物 蠟(例如巴西棕櫚蠟、大戟蠟和大豆蠟)或者礦物質蠟如化石或者泥土(例如地蠟或者褐 煤蠟)或者石油蠟(例如石蠟或者微晶蠟)。在其它實施方案中，使用合成的(人造)蠟 如乙烯(ethylenic)聚合物(例如聚乙烯或者多元醇醚-酯)、氯化萘或者碳氫化合物類型 蠟(例如 Fischer-Tropsch)。在一些實施方案中，使用油如礦物質油、石蠟油、矽油、氟矽氧烷、氟代烴油(例如來自3M的Fluorinert FC-40)、全氟化碳液(例如來自F2Chemicals的Flutec Fluids)、全氟萘烷(例如來自 Aldrich 的 P9900，FlutecPP6, FluoroMed APF-140HP)、全 氟全氫化菲(perfluoroperhydrophenanthrene)(例如 FluoroMed APF-2I5M)或者全氟化辛基 溴(perfluorooctylbromide)(例如 FluoroMed APF-PF0B)。其它的屏障材料包括但不限於1，4-二惡烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁醇、環己 酮、二氯甲烷、叔戊醇、叔丁基甲基醚、丁基乙酸酯、己醇、硝基苯、甲苯、辛醇、辛 烷、碳酸丙烯酯以及環丁碸(見例如 Chin et al.，Biotechnology and Bioengineering 44 140(1994)，以其全部內容援引加入本文)。
在進一步實施方案中，使用離子性液體(例如BMIM[PF6]、BMIM[Tf2N]和
0MA[TGN]，其中BMIM-雙(三氟甲烷磺醯基)亞胺，PF6 = 1-η_ 丁基-3-甲基咪唑 六氟磷酸酯/鹽，TfN2 =雙(三氟甲基磺醯基)亞胺，以及OMA =甲基三辛基銨)作 為屏障材料。在其它實施方案中，使用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽/酯EC0ENG 21M、 1-乙基-3-羥基甲基批啶鐺硫酸乙酉旨(l-Ethy:i-3-hydroxymethylpyridinium ethylsulfate)、丁基甲基吡咯烷鐺雙(三氟甲基磺醯基)亞胺(Butylmethylpyrrolidinium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide)、EC0ENG 212 或者 ECOENG 111IP (均可從 Solvent Innovations獲得)作為屏障材料。所述裝置的不同隔間中提供的試劑可以是進行樣品製備和分析的任何試劑。例 子包括但不限於細胞裂解緩衝液、洗滌緩衝液、親和性試劑、洗脫緩衝液以及用於生 物測定的反應成分。本發明的裝置適於純化各種生物分子，包括但不限於核酸(例如 RNA,基因組DNA、寡核苷酸等)、蛋白質(例如肽、肽片段、寡聚蛋白質、蛋白質複合 物、膜蛋白等)以及抗體。本發明的裝置適於進行任何數目的生物測定，包括但不限於 RNA或者DNA擴增(例如PCR、TMA、NASBA)、核酸檢測(例如雜交測定)以及免 疫測定。在一些實施方案中，所述裝置包括將樣品從該裝置的一個隔間轉運至下一隔間 的部件。在一些實施方案中，樣品與磁珠結合，轉運部件是磁體。在其它實施方案中， 轉運部件產生電流以轉運樣品。在進一步實施方案中，使用離心力轉運樣品，轉運部件 產生這種力(例如通過移動該裝置產生)。在其它實施方案中，使用比重大於水的流體， 從而該流體不用機械幹預而流動。在一些實施方案中，所述裝置包括檢測部件以檢測標記的或者另外存在的生物 樣品或者測定產物。例子包括但不限於分光光度計、質譜分析儀、NMR、顯微鏡等。在 一些實施方案中，從該裝置的最後隔間直接對產物讀數(例如使用用於分光術的窗)。在 其它實施方案中，從所述裝置取出產物(例如使用該裝置的自動化部件)進行檢測。本發明的實施方案進一步提供了這樣的裝置，其包含由親脂性材料「壁」分隔 的反應物的流動室(例如垂直柱)，所述「壁」防止反應物混合但是允許微粒通過(例如 由磁體轉運的磁性顆粒)。在一些實施方案中，所述裝置及其應用是自動化的。自動化系統包括樣品純化 和分析裝置、移動樣品通過該裝置的轉運部件，以及足夠或者用於過程自動化的任何其 它必需部件(例如預處理試劑和樣品轉運或者分析後檢測或者進一步分析部件)。在使用磁性轉運的一些實施方案中，轉運部件包含在該裝置的室之間移動的磁體。在其它實施 方案中，所述裝置相對於靜止磁體或者其它轉運裝置而移動。II.方法如上所述，本發明提供了樣品製備和分析裝置及使用所述裝置的方法。A.樣品根據本發明揭示的方法，可以檢測懷疑含有待純化和/或分析的預期材 料的任 何樣品。在一些實施方案中，所述樣品是生物樣品。這種樣品可以是細胞(例如懷疑 感染了病毒的細胞)、組織(例如活組織檢查樣品)、血液、尿液、精液，或者其一部分 (例如血漿、血清、尿液上清、尿液細胞沉澱或者前列腺細胞)，其可以得自患者或者其 它生物材料來源，例如屍檢組織樣品或者法醫學材料。在將樣品與裝置接觸之前或者作為裝置或者自動化系統的一個部件，樣品可以 被處理以分離或者富集樣品的所希望分子。使用標準實驗室實踐的各種技術可用於此目 的，如例如離心、免疫捕獲、細胞裂解以及核酸靶捕獲。在其它實施方案中，本發明實施方案的方法用於純化和/或分析完整細胞(例如 原核細胞或者真核細胞)。B.純化方法在一些實施方案中，本發明的裝置用於樣品製備和純化。可以利用任何合適的 純化方法，包括但不限於靶捕獲、洗滌、沉澱等等。在一些實施方案中，樣品純化完全 在所述裝置中進行，且不需要任何額外的純化步驟。純化可以在一或多個反應室中進 行。這樣將降低純化的複雜性以及減少成本。本領域技術人員意識到具體的純化方法取 決於靶生物樣品的性質。C.修飾/分析/檢測純化的樣品可以通過使用任何合適方法檢測，包括但不限於本文揭示的那些方 法。下文舉例描述了針對生物分子如核酸和蛋白質的示例技術。根據希望或者需要，其 它技術可用於生物分子或者非生物分子。i.核酸檢測核酸修飾/分析/檢測方法的例子包括但不限於核酸測序、核酸雜交以及核酸擴 增。用於舉例說明的非限制性核酸測序技術的例子包括但不限於鏈終止子(Sanger)測序 和染料終止子測序。本領域技術人員將意識到由於RNA在細胞中較不穩定且更易於受核 酸酶攻擊，因此實驗上RNA在測序之前通常被逆轉錄為DNA。用於舉例說明的非限制 性核酸雜交技術的例子包括但不限於原位雜交(ISH)、微陣列以及Southern或者Northern 印跡。核酸可以在檢測之前或者在檢測同時被擴增。用於舉例說明的非限制性核酸擴增技術的例子包括但不限於聚合酶鏈反應 (PCR) >逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、轉錄介導的擴增(TMA)、連接酶鏈反應 (LCR)、鏈置換擴增(SDA)以及基於核酸序列的擴增(NASBA)。本領域技術人員將意 識到某些擴增技術(例如PCR)需要在擴增前將RNA逆轉錄為DNA (例如RT-PCR)，而 其它擴增技術直接擴增RNA (例如TMA和NASBA)。聚合酶鏈反應(美國專利Νο.4,683,195、4,683,202、4,800,159 和 4,965,188， 每個專利均以其全部內容援引加入本文)，通常稱作PCR，其使用多次循環的變性、引物對與相反鏈退火以及引物延伸，使得靶核酸序列的拷貝數呈指數增長。在稱作 RT-PCR的變化中，逆轉錄酶(RT)用於從mRNA中產生互補DNA(cDNA)，然後通過 PCR擴增該cDNA產生DNA的多個拷貝。關於其它各種PCR的變化，見例如美國專 利 No.4,683,195、4,683,202 和 4,800,159 ； Mullisetal, Meth.Enzymol.155 335(1987)以 及Murakawa etal.，DNA 7 287 (1988)所述，所述每個文獻均以其全部內容援引加入本 文。
轉錄介導的擴增(美國專利No.5,480,784和5,399,491，所述文獻均以其全部內容 援引加入本文)，通常稱作TMA，其在基本恆定的溫度、離子濃度以及pH條件下自催化 地合成靶核酸序列的多個拷貝，其中靶序列的多個RNA拷貝自催化地產生另外的拷貝。 見例如美國專利No.5,399,491和5,824,518，所述文獻均以其全部內容援引加入本文。在 U.S.公開號20060046^5 (在此以其全部內容援引加入)中所描述的變化中，TMA任選結 合使用封閉部分、終止部分及其它修飾部分以改善TMA過程的靈敏性和精確性。
連接酶鏈反應(Weiss，R.，Science 254 1四2 (1991)，在此以其全部內容援引 加入)，通常稱作LCR，其使用與靶核酸的相鄰區域雜交的兩組互補DNA寡核苷酸。在 熱變性、雜交和連接的重複循環中，DNA寡核苷酸通過DNA連接酶共價連接，產生可檢 測的雙鏈連接的寡核苷酸產物。
鏈置換擴增(Walker,G.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 392-396 (1992)； 美國專利No.5,270,184和5,455,166，所述文獻在此以其全部內容援引加入)，通常稱作 SDA,其使用引物對序列與靶序列的相反鏈退火、在存在dNTP α S的條件下引物延伸循 環以產生雙鏈半硫代磷酸化(hemiphosphorothioated)引物延伸產物，內切核酸酶介導半修 飾的限制性內切核酸酶識別位點的切口，以及聚合酶介導的從切口的3』末端的引物延伸 以置換現有鏈及產生用於下一循環引物退火、切口和鏈置換的鏈，導致產物呈幾何級數 擴增。嗜熱SDA(tSDA)在基本相同的方法中在較高溫度使用嗜熱內切核酸酶和聚合酶 (EP Pat.No.O 684 315)。
其它擴增方法包括例如基於核酸序列的擴增(美國專利No.5,130,238，在此 以其全部內容援引加入)，通常稱作NASBA;其使用RNA複製酶擴增探針分子自身 (Lizardi etal.，BioTechnol.6 1197(1988)，在此以其全部內容援引加入)，通常稱作複製酶；基於轉錄的擴增方法(Kwoh etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 1173(1989))； 以及自動維持序列擴增(Guatelli et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 1874 (1990)，所 述文獻在此均以其全部內容援引加入)。對於已知擴增方法的進一步論述見Persing， David H., 「 In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques " in Diagnostic Medical Microbiology Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp.51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))。
未擴增的或者擴增的靶核酸可以通過任何常規方式檢測。例如，靶mRNA可以 通過與可檢測地標記的探針雜交及測量所得雜交體而進行檢測。用於舉例說明的非限制 性檢測方法的例子如下文描述。
一種用於舉例說明的檢測方法是雜交保護測定(HPA)，其涉及將化學發光寡核 苷酸探針(例如吖啶鐺酯(acridinium ester，AE)標記的探針)與靶序列雜交，選擇性水 解在未雜交探針上呈現的化學發光標記，以及在光度計中測量從剩餘探針中產生的化學發光。見例如美國專利 No.5,283,174 和 Norman C.Nelson et al.，Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J.Kricka ed., 2d ed.1995,所述文獻在此均以其全部內容援引加入本文)。
另一用於舉例說明的檢測方法提供了對擴增過程的實時定量評估。對擴增過程 的「實時」評估涉及在擴增反應期間持續或者定期確定反應混合物中擴增子的量，以及 使用所確定的值計算樣品中最初存在的靶序列的量。基於實時擴增的確定樣品中最初存 在的靶序列的量的許多方法是本領域熟知的。這些方法包括在美國專利No.6,303,305和 6,Ml,205中揭示的方法，所述文獻在此以其全部內容援引加入。不基於實時擴增的確定 樣品中最初存在的靶序列的數量的另一方法在美國專利No.5,710,0 中揭示，所述文獻在 此以其全部內容援引加入。
擴增產物可以通過使用各種自身雜交(self-hybridizing)探針實時檢測，大多數 所述探針具有莖-環結構。這種自身雜交探針被標記，從而其發射出可不同地檢測的信 號，這取決於探針是自身雜交狀態還是經與靶序列雜交改變的狀態。通 過非限制性例 子，「分子火炬(moleculartorch)」是一類自身雜交探針，其包含自身互補性的獨特區域 (稱作「靶結合結構域」和「靶閉合結構域(closing domain) 」)，其通過結合區(例如非 核苷酸接頭)連接起來且其在預定的雜交測定條件下彼此雜交。在優選的實施方案中， 分子火炬在靶結合結構域中含有單鏈鹼基區，其長度為1至大約20個鹼基且易於在鏈置 換條件下與存在於擴增反應中的靶序列接近而雜交。在鏈置換條件下，分子火炬的可以 完全或者部分互補的兩個互補區域的雜交是有優勢的，除非存在靶序列，其將結合靶結 合結構域中存在的單鏈區域並置換所有或者部分靶閉合結構域。分子火炬的靶結合結構 域和靶閉合結構域包含可檢測的標記或者一對相互作用標記(例如發光劑/猝滅劑)，所 述標記經定位使得當該分子火炬自身雜交時與該分子火炬與靶序列雜交時產生不同的信 號，從而可以在存在未雜交的分子火炬的條件下檢測出檢測樣品中的探針靶雙鏈體。 分子火炬和許多類型的相互作用標記對是已知的(例如美國專利No.6,534,274，所述文獻 在此以其全部內容援引加入)。
另一具有自身互補性的檢測探針的例子是「分子信標」(見美國專利 No.5,925,517和6,150,097，所述文獻在此以其全部內容援引加入)。分子信標包括這樣的 核酸分子，其具有靶互補序列、在擴增反應中不存在靶序列時使探針保持在密閉構象的 親和性對(或者核酸臂)、以及當探針處於密閉構象中時相互作用的標記對。靶序列與靶 互補序列的雜交分開親和性對的成員，從而使探針轉變為開放構象。向開放構象的轉變 可以檢測，這是因為標記對的相互作用降低，所述標記對可以是如螢光團與猝滅劑(例 如 DABCYL 與 EDANS)。
其它自身雜交探針也為本領域技術人員熟知。非限制性例子，具有相互作用標 記的探針結合對(例如見美國專利No.5,928,862，在此以其全部內容援引加入)可適用於 本文所揭示的組合物和方法中。也可以使用用於檢測單核苷酸多態性6NP)的探針系 統。其它檢測系統包括「分子開關」(例如見U.S.Publ.No.200500似638，在此以其全部內 容援引加入)。其它探針如那些包含插入染料和/或螢光染料的探針也可用於在本文揭示 的方法中檢測擴增產物(例如見美國專利No.5,814,447，在此以其全部內容援引加入)。
在一些實施方案中，檢測方法是定性的(例如特定核酸的存在與否)。在其它實施方案中，其是定量的(例如病毒負荷)。
ii.蛋白質檢測
蛋白質檢測方法的例子包括但不限於酶測定、直接觀測以及免疫測定。在一些 實施方案中，免疫測定使用針對純化蛋白質的抗體。這種抗體可以是多克隆或者單克隆 的、嵌合的、人源化的、單鏈或者Fab片段，其可以被標記或者未標記，所有這些均通過 使用熟知方法和標準實驗室技術產生。見例如Burns，ed.，Immunochemical Protocols, 3rd ed.， Humana Press (2005) ； Harlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ； Kozbor et al，Immunology Today 4 72(1983) ； Kohler andMilstein, Nature 256 : 495 (1975)。在一些實施方案中，使用可商購的抗體。
D.數據分析
在一些實施方案中，在純化和檢測之後，使用基於計算機的分析程序將由檢測 測定所產生的原始數據(例如指定靶分子的存在、不存在或者量)翻譯成提供給臨床醫生 或者研究人員的預測值的數據。在一些實施方案中，將軟體程序集成進自動化裝置中。 在其它實施方案中，其位於遠程。臨床醫生可以使用任何合適方式存取數據。因此，在 一些優選的實施方案中，本發明提供了進一步的益處，即不太可能經過遺傳學或者分子 生物學培訓的臨床醫生不需要理解原始數據。數據以其最有用的形式直接呈現給臨床醫 生。然後臨床醫生可以立即使用該信息優化對對象的護理。
能向和從進行測定的實驗室、信息提供、醫務人員和對象接受、處理和傳送信 息的任何方法均可以使用。例如，在本發明的一些實施方案中，樣品(例如活組織檢查 或者血清或者尿液樣品)得自對象並呈遞給服務機構(例如醫療機構的臨床實驗室，基因 組譜分析公司(genomic profiling business)等)，其位於世界上任何地方(例如在與所述對 象居住地或者信息的最終使用地不同的地區)以產生原始數據。當樣品包含組織或者其 它生物樣品時，對象可以去醫療中心以獲得樣品並送至譜分析中心，或者對象可以自己 收集樣品(如尿樣)並直接送至譜分析中心。當樣品包括先前確定的生物學信息時，所 述信息可以通過對象直接送至譜分析服務機構(例如含有所述信息的信息卡可以由計算 機掃描並用電子通訊系統將數據傳輸至譜分析中心的計算機)。一旦譜分析服務機構接收 後，樣品被處理並產生對象所需的特異於診斷或預後信息的譜(即表達數據)。
然後將譜數據製備成適合治療性臨床醫生解讀的格式。例如，不是提供原始數 據，而是製備格式可以代表對對象的診斷或風險評估(例如病毒載荷水平)，連同特定治 療選項的建議一起。數據可以通過任何合適方法展示給臨床醫生。例如，在一些實施方 案中，譜分析服務機構生成一份報告，報告可以列印給臨床醫生(例如在床旁)或者在計 算機監視器上展示給臨床醫生。
在一些實施方案中，首先在床旁或者在地區性機構分析信息。然後將原始數據 輸送至中心處理機構做進一步分析和/或將該原始數據轉變成可為臨床醫生或者患者所 用的信息。中心處理機構提供數據分析的隱私性(所有數據均在統一安全方案下貯存在 中心機構中)、速度和一致性的優勢。然後中心處理機構可在治療對象後控制數據結局 (fate) 0例如，使用電子通訊系統，中心處理機構可以為臨床醫生、對象或者研究人員提 供數據。
在一些實施方案中，對象能夠使用電子通訊系統直接存取數據。所述對象基於結果可以選擇進一步介入或者諮詢。在一些實施方案中，所述數據用於研究用途。 例如，數據可用於進一步優化作為疾病特定狀況或階段的有用指示的標記的包含或者清 除。
E.組合物與試劑盒
在一些實施方案中，本發明的系統和/或裝置以含有進行純化和分析必需的所 有成分(例如預加載在裝置中)來交付。在其它實施方案中，另外的反應成分可以在分 隔的容器中提供，所述容器包裝在一起形成試劑盒。
任何這些組合物，單獨或者與本文揭示的或者本領域熟知的其它組合物組合， 可以以試劑盒形式提供。試劑盒可進一步包含合適的對照物和/或檢測試劑。可用於本 發明所述任何方法中的任一種或多種試劑均可提供在所述試劑盒中。
實驗
如下實施例是提供用來證明和舉例說明本文所揭示的組合物和方法的某些優選 的實施方案和方面，但是不應被理解為限制本發明的範圍。
實施例1
這個實施例描述了使用磁力移動順磁性微粒以捕獲RNA，隨後純化以及釋放 RNA用來擴增和檢測。其還顯示了液體蠟的使用，作為例證的親脂性材料，以及作為各 個室之間的閥門，其允許順磁性微粒移動同時在各個洗滌緩衝液之間形成屏障。
(a)藥筒的製作
通過加工無菌清潔的圓底聚苯乙烯96孔平板製備進行測定用的單個藥筒(圖 la)。使用符合FDA的光面(plain back) 1/16〃聚丙烯薄板來製成蠟通道。為了製作蠟 通道，將準備用於低表面能基材的9495LE丙烯粘性傳送帶(adhesive transfer tape) (3M， St.Paul, MN)粘在切割成適當規格的長方形塑料片兩側。從塑料片碾壓(mill out)出長方 形通道。碾壓過程也切削膠帶。鑑於聚丙烯的不良熱傳導性和低熔點，在加工時要特別 小心。在通道的加工期間形成的毛邊使用刀片除去。頂板也是用聚丙烯薄板製成。在 頂板上穿幾個小孔以用於導入流體。
聚丙烯用於製成頂板和通道是由於其極佳的化學抗性。飽和的烯鏈對大多數油 和溶劑以及基於水的化合物、肥皂和中等酸和鹼產生抗性。很少數具有聚丙烯強度性質 的其它材料達到匹配聚丙烯的化學抗性。聚丙烯堅硬的、高度光滑的表面使其對於擔心 會干擾藥筒的流動滅菌的環境是理想的優選在檢測期間維持無RNA環境。雖然商購 的塑料平板是用Y射線照射來滅菌，開發了可以在實驗室容易進行的對塑料部分進行滅 菌的方案。在對所述平板進行加工之前，將待用於測試的孔用粘性帶密封。在加工完成 後，使用如下方案洗滌所述藥筒
a.用水洗滌兩次
b.用100 %乙醇洗滌兩次
c.用 RNaseZap RNase 淨化溶液(Ambion，Austin, TX)洗滌
d.用水洗滌兩次。
在完成洗滌之後，將藥筒在50°C乾燥過夜。
RNA純化測定
使用400 μ L 含有 IO6 個拷貝 /mL Armored RNA (Abbott Molecular, DesPlaines,IL)的血漿樣品進行測定。使用Armored RNA而不是裸RNA作為檢測樣品是因為其對核 糖核酸酶具抗性且易於通過RNA拷貝數量化。其也是非感染性的，這使其易於操作。
為了從血漿樣品純化RNA，使用MagMAXViral RNA Isolation試劑盒(Ambion， Austin, TX)。在這種方法中，使用基於硫氰酸胍溶液的傳統方法破壞細胞。這同時釋 放病毒RNA及使樣品基質中的核酸酶失活。然後所述RNA在存在離液劑和醇的條件下 結合二氧化矽包被的磁珠。然後將該珠在水性低鹽緩衝液中洗滌和洗脫。
裂解/結合溶液和珠混合物的製備在表1所示裂解/結合溶液濃縮物中加入載 體RNA並簡單混合。隨後加入100%異丙醇。為了製備珠混合物，對每個反應將10 μ L RNA結合珠與10 μ L裂解增強劑混合。該珠經渦旋之後分成等份。
表1 :為製備裂解緩衝液加入的試劑體積
權利要求
1.生物樣品處理裝置，其包括a)兩或更多個包含樣品處理試劑的樣品處理室；以及b)在至少兩個所述兩或更多個樣品處理室之間的水和醇不混溶性、疏水性或者親脂 性材料，由此當樣品在第一和第二處理室之間移動時移動穿過所述材料。
2.權利要求1的裝置，其具有由所述材料分隔的三或更多個樣品處理室。
3.權利要求1的裝置，其具有由所述材料分隔的四或更多個樣品處理室。
4.權利要求1的裝置，其具有由所述材料分隔的五或更多個樣品處理室。
5.權利要求1的裝置，其中每個所述樣品處理室均包含樣品純化試劑。
6.權利要求1的裝置，其中所述樣品處理室選自由以下組成的組包含樣品純化試 劑的樣品純化室，包含樣品分析試劑的樣品分析室以及樣品純化室和樣品分析室的混合 物。
7.權利要求1的裝置，其中所述親脂性物質是蠟。
8.權利要求1的裝置，其中所述親脂性物質是油。
9.權利要求1的裝置，其進一步包含安置的磁體以使磁性顆粒從所述樣品純化室移動 到所述樣品分析室。
10.權利要求1的裝置，其中所述裝置包括蒸汽屏障。
11.權利要求1的裝置，其中所述裝置包括夾在塑料層之間的鋁箔層。
12.—種系統，其包含a)生物樣品處理裝置，其包括兩或更多個包含樣品處理試劑的樣品處理室，以及 在所述至少兩個所述樣品處理室之間的水和醇不混溶性、疏水性或者親脂性材料；以及b)配置為在所述樣品處理室之間轉運至少部分樣品的樣品轉運部件。
13.權利要求12的系統，其中所述樣品轉運部件包括磁體。
14.權利要求12的系統，其進一步包括樣品檢測部件。
15.—種處理生物樣品的方法，包括a)將樣品置於第一室內，所述第一室包含第一處理試劑以產生經處理的樣品；b)使所述經處理的樣品移動穿過水和醇不混溶性、疏水性或者親脂性屏障至第二室；c)在所述第二室內用第二處理試劑處理所述經處理的樣品，產生經進一步處理的樣品 O
16.權利要求15的方法，其中所述第一和/或第二處理試劑是純化試劑。
17.權利要求16的方法，其中所述第一試劑是捕獲試劑，所述第二試劑是洗滌試劑。
18.權利要求16的方法，其中所述第一試劑是純化試劑，所述第二試劑是分析試劑。
19.權利要求15的方法，其中所述純化的樣品包含與磁性顆粒結合的所述生物分子。
20.權利要求19的方法，其中所述移動包括使用磁體從所述第一室拖動所述磁性顆粒 進入所述屏障，然後進入所述第二室。
21.權利要求15的方法，其中所述生物分子是完整細胞、RNA、DNA或者蛋白質。
22.權利要求15的方法，其中將所述純化的樣品在移至所述第二室之前移動至一或多 個其它室。
23.權利要求22的方法，其中所述一或多個其它室包含洗滌試劑。
24.權利要求15的方法，其中所述第二處理試劑包含核酸擴增試劑。
25.權利要求15的方法，其中所述第二處理試劑包含核酸檢測試劑。
26.權利要求15的方法，其中所述第二處理試劑包含多肽檢測試劑。
全文摘要
本發明涉及進行生物反應的系統、裝置和方法。本發明特別涉及親脂性、水不混溶性、或者疏水性屏障在樣品分離、純化、修飾和分析過程中的用途。
文檔編號B01L7/00GK102027367SQ200980115366
公開日2011年4月20日 申請日期2009年2月27日 優先權日2008年2月29日
發明者D·M·凱爾索, S·庫納爾, Z·帕爾皮亞 申請人:西北大學