一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑的製作方法
2023-12-05 04:00:01 1
專利名稱：一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種農藥，尤其是涉及一種通過微生物發酵法所提取的具有殺菌活性物質的防治水稻稻瘟病的殺菌劑。
背景技術：
自從20世紀40年代有機氯和有機汞農藥問世以後，人們在與農業害蟲和雜草鬥爭過程中，主要是依靠化學農藥這一現代化武器。但是，隨著化學農藥的品種和產量激增，施用範圍日益擴大，農藥殘毒汙染而造成世界性公害，引起人們的憂慮。隨著人類環保意識的增強，對人畜安全，無毒，不汙染環境，不毒害殺害蟲天敵的生物農藥的生物農藥的異軍突起。在生物農藥中微生物源農藥是目前應用最廣、發展最快、最有前途的一類，也越來越受人們的青睞。為了保護生態環境和促進農業可持續發展，開發微生物農藥具有廣闊的前景和深遠的意義。而微生物農藥以農用抗生素最為典型。農用抗生素來源於微生物，特別是放線菌。據統計，在1000多種抗生素中約有2/3以上是由放線菌產生的，而鏈黴菌屬放線菌產生的抗菌素又佔放線菌目的90％以上；且放線菌是土壤生態系中微生物三大類群之一，廣泛存在於各類土壤中。單就微生物而言，已被人類研究過的不足自然界存在的1‰，而這些研究過的微生物中，只發現了其中的1％能產生生物活性物質，何況微生物是易變的，由於基因重組和染色體畸變，天天都在產生新的變種，因此對這一領域的研究可以說是永無止境的。我國農用抗生素的研究和應用始於50年代初。從60年代起滅瘟素、井岡黴素、春雷黴素、慶豐黴素等農抗品種相繼研製和應用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其通過微生物發酵，提取到了具有殺菌活性的物質瑞拉菌素，經過大量的藥效試驗表明，它對植物的很多病原都具有很好的防治作用，並且與環境相容，具有殘留低、防效高、殺菌譜廣等特點。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於殺菌劑有效成分為具有殺菌活性的物質瑞拉菌素 該活性物質是從土壤中經過分離、篩選，然後經微生物發酵所提取出來的。
上述活性物質瑞拉菌素分離、篩選，提取的工藝步驟為1採集土樣2土壤放線菌的分離3頡頏菌的篩選3.1抗菌活性初篩3.2頡頏放線菌的復篩
3.3單孢分離3.4單孢菌的頡頏性篩選3.5頡頏菌發酵條件的優化3.5.1發酵培養基的選擇(1)有機氮源的選擇(2)有機碳源的選擇(3)無機離子的選擇(4)最優培養基正交實驗3.5.2發酵培養基PH的選擇3.5.3發酵時間的選擇3.5.4發酵溫度的選擇3.5.5搖床轉速的選擇3.5.6放線菌菌絲的生長與抗生素的產生量之間的關係3.6高效菌株S-159-05活性產物的提取3.6.1發酵液的預處理3.6.2粗提3.6.3精提上述殺菌劑包括有效成分瑞拉菌素，該殺菌劑還包括表面活性劑、消泡劑、增效劑、高滲劑、乳化劑、水等，可製成水乳劑，其組成為瑞拉菌素 12重量份表面活性劑3重量份消泡劑2重量份增效劑3重量份助劑 2重量份乳化劑2重量份高滲劑2重量份其餘為水上述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，消泡劑為二甲基聚矽氧烷，增效劑是由茶皂甙15％脂肪胺3％和水72％製成的增效劑，高滲劑為脂肪醇聚氧乙烯(6-7)醚，乳化劑為順丁二酸單酯磺酸鈉，助劑為三聚磷酸鈉。
上述殺菌劑包括用於作物殺菌的各種農藥劑型。
上述殺菌劑為水乳劑。
與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下本發明具有低殘留高防效的特點，殺菌譜廣，對多種菌具有很好的防治作用。
四
圖1為本發明的總體工藝圖；圖2為本發明的具體工藝流程圖。
五具體實施例方式本發明屬於一種農藥，來源於秦嶺土壤中的委內瑞拉鏈黴菌秦嶺變種通過發酵製備的新型農用抗生素，其殺菌活性物質為瑞拉菌素，具有低毒、高效、低殘留的特點，可有效防治水稻稻瘟病。
實施例活性物質瑞拉菌素分離、篩選、提取的具體工藝步驟和工藝參數1、採集土樣選取具有代表性的地點，按照多點取樣(不同地點、不同土層深度)混合的方法，鏟去表層土，採用簡易打孔器，打取深度為3-15cm的土樣，裝入無菌牛皮紙袋或鋁盒中，做好記錄。採集的土樣應沒有大的顆粒，帶回實驗室陰乾後立即進行放線菌的分離。
2、土壤放線菌的分離(1)製備土壤懸浮液取一定量(約10g)陰乾的土壤，放在已滅菌的研缽內，在無菌操作臺上研磨，至土壤顆粒較均一，無大顆粒時停止。稱取1g研磨好的土樣裝入滅菌的試管中，加入10ml無菌水充分震蕩30分鐘，製成1∶10的土壤稀釋液。從上述溶液中取出1ml，加入9ml無菌水充分震蕩做成1∶102的稀釋液，依此類推，製成1∶103、1∶104、1∶105的土壤稀釋液後備用。
(2)平板接種採用塗抹法和混菌法接種塗抹法分別取上述5個濃度土壤稀釋液0.05ml，分別加入已做好的高氏1號平板上，用滅菌的玻璃刮刀將稀釋液均勻的塗布開。放入28℃恆溫箱中培養。設三個重複。
混菌法分別取上述5個濃度土壤稀釋液1ml，加入培養皿中，將已熔化的45-50℃的高氏1號培養基倒入，輕輕搖轉使樣品和培養基混合均勻，待培養基凝固後放入培養箱28℃恆溫培養。設三個重複。
(3)純化隨時觀察並記錄菌株的原始培養結果，統一編號。根據放線菌的特徵及時挑取單個放線菌菌落至高氏一號平板上，採用劃線分離的方法純化。
3、頡頏菌的篩選3.1抗菌活性初篩將2.2.2中保存的放線菌菌株活化，採用十字交叉法，用皿內瓊膠平板直接測定。具體步驟為PDA的平板上以原點為中心劃垂直的十字線，中心點先接病原菌，十字的一條線的兩端距中心相同距離接同一种放線菌，另一條線的兩端接另一种放線菌。病原菌與放線菌生長快慢相差不多的可同時接，病原菌生長慢的要延遲1-2d接。培養一定的時間，看是否有抑菌圈產生。有抑菌圈的，測量抑菌圈的相對半徑(抑菌圈半徑—病原菌菌落半徑)。選擇頡頏性好的放線菌進入復篩。
3.2頡頏放線菌的復篩選擇在初篩中頡頏性好的放線菌，以液體發酵培養的方法進行繁殖，測定發酵濾液對病原菌的頡頏性，其方法為(1)放線菌接入發酵培養基，恆溫水浴搖床培養，28℃，培養72h。
(2)發酵液預處理 放線菌液體培養72h後取出，用草酸(0.5m/l)調PH到4，靜置1h後，在無菌條件下過濾，得發酵濾液。
(3)生長速率法測定頡頏性將發酵濾液取3ml注入培養皿中，然後將熔化的PDA培養基(約25ml)倒入皿中與發酵濾液混合均勻，冷卻後接病原菌的菌餅。加蒸餾水和草酸作對照。24h、48h、72h後測量菌落直徑，計算抑制率。
(4)選出頡頏性最好的菌株，用生長素率法測定不同濃度的發酵濾液對病原菌菌絲生長的影響。
3.3單孢分離選擇復篩中抗菌譜較廣，且頡頏性較好的菌株進行單孢分離。具體步驟如下(1)製作高氏1號平板。
(2)放線菌的孢子(不帶培養基)加入到10ml的無菌水中製成1∶10的孢子懸浮液，充分振蕩10分鐘，然後取出1ml加入9ml無菌水中製成10-2的孢子懸浮液，依此類推，製成10-3、10-4、10-5、10-6的孢子懸浮液。
(3)用移液槍分別取稀釋後的孢子懸浮液0.5ml加到高氏1號平板上，用刮刀塗均勻，每處理設3個重複。28℃培養7h。
(4)選取出現5-20個菌落的皿，給菌落編號，分別將單孢菌落挑入高氏1號斜面上培養7d後放入4℃冰箱保存。
3.4單孢菌的頡頏性篩選用生長素率法測定每個單孢菌的發酵濾液的頡頏性。方法同3.2放線菌復篩的方法。選出頡頏性最好的菌株作為目標放線菌菌株。
3.5頡頏菌發酵條件的優化以下發酵培養基的優化，培養基PH、發酵時間、發酵溫度、搖床轉速的優化均以生長速率法測定的發酵濾液(50ml/l)的抑制率為指標，供試病原菌為番茄灰黴，培養溫度28℃，測定時間為接病原菌後48h。設三個重複。發酵濾液的製備和抑制率計算公式同3.2。
3.5.1發酵培養基的選擇(1)有機氮源的選擇在原篩選試驗用發酵培養基的基礎上，保持碳源含量不變，發酵培養基只改變氮源的組成，用生長速率法測定發酵濾液的抑制率，比較發酵濾液抑菌活性的強弱。所選用的氮源組合為蛋白腖、酵母粉、黃豆餅粉、黃豆餅粉+玉米粉、黃豆餅粉+KNO3、蛋白腖+玉米漿、酵母粉+NH4SO4、麥麩+酵母粉+黃豆餅粉。
(2)有機碳源的選擇將已篩選到的黃豆餅粉+KNO3作為氮源，改變碳源的組成，測定發酵濾液的抑制率，比較發酵濾液抑菌活性的強弱。所選用的碳源為澱粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+糊精、葡萄糖+澱粉、澱粉+蔗糖、葡萄糖+玉米油。
(3)無機離子的選擇按照已篩選的最佳碳源、氮源，分別加入磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鋅，用L9(34)正交實驗，考察各無機鹽的三個水平對效價的影響。正交實驗方案如下表1 L9(34)正交實驗因素水平表
注I磷酸氫二鉀、II硫酸銅、III硫酸亞鐵、IV硫酸鋅(4)最優培養基正交實驗從上述的碳源和氮源的研究中，確定了最佳碳源和氮源的種類和比較合適的碳源、氮源濃度。另外，由於碳酸鈣在培養基中起到調節PH的作用，液體發酵培養基中往往要加入一定的量。為進一步研究相關營養源因子之間的相關性，選取黃豆粉餅、葡萄糖、澱粉、碳酸鈣四個因素，進行正交實驗。每個因素取3個水平，按正交表L9(34)安排實驗。如表2。
表2 L9(34)正交實驗因素水平表
注A黃豆餅粉、B葡萄糖、C澱粉、D碳酸鈣3.5.2發酵培養基PH的選擇用NaOH或HCl調成不同的PH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，根據發酵液對供試病菌的抑制率選擇最佳培養基PH值。
3.5.3發酵時間的選擇分別測定24、36、48、60、72、84、96、120h發酵液的抑制率，選擇最佳發酵時間。
3.5.4發酵溫度的選擇將放線菌分別於26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃和38℃在恆溫振蕩培養箱中培養，計算發酵液的抑制率，確定最佳發酵溫度。
3.5.5搖床轉速的選擇分別測試100r/min、150r/min、200r/min、250r/min的搖床轉速對發酵的影響。確定最佳搖床轉速。
3.5.6放線菌菌絲的生長與抗生素的產生量之間的關係(1)放線菌代謝過程中PH的變化的測定將放線菌在已優化的搖床發酵條件下培養，每隔24h取樣，測定發酵液的PH值，繪製PH的變化曲線。
(2)放線菌產生抗生素的曲線的繪製將放線菌在已優化的搖床發酵條件下培養，每隔12h取樣，觀察菌絲形態，測定發酵濾液的抑制率，繪製放線菌產生抗生素的曲線。
(3)放線菌生長曲線的繪製放線菌的生長曲線可以通過細胞堆積體積法測定每24h取發酵液10ml裝於刻度離心試管內，於3500rpm的轉速下離心5min，以沉澱體積百分含量作為相對菌絲濃度(重量)。以時間為橫坐標，沉澱體積百分含量為縱坐標，繪製放線菌的生長曲線。
根據以上測定結果分析放線菌菌絲生長與代謝的關係。
3.6高效菌株S-159-05活性產物的提取3.6.1發酵液的預處理將篩選到的高產菌株S-159-05選用正交試驗優化的培養基，在PH8.0、30-34℃、搖床轉速150r/min的條件下培養72h後取出。用1mol/L的草酸調節發酵液的PH，邊加草酸邊攪拌，並用PH計測量發酵液的PH值。至PH為4.0時，靜置0.5h後再調PH至4.0，再靜置半小時後過濾，收集濾液。
3.6.2粗提
(1)濾液在旋轉薄膜蒸發器中70℃減壓濃縮至小體積，用6mol/L的NaOH調PH至7.0，5000rpm離心30min，棄沉澱，取上清液。上清液用10倍體積的冰凍丙酮沉澱，棄上清液，取沉澱，乾燥。
(2)732陽離子交換樹脂吸附732陽離子樹脂用水浸泡2h後，減壓抽去氣泡，傾去水，再用大量無離子水洗至澄清，去水後加4倍量2mol/l的HCl，攪拌4h，除去酸液，水洗至中性，再加4倍量2mol/L NaOH，攪拌4h，除去鹼液，水洗至中性，用4倍量的2mol/LNaOH浸泡2h，轉為Na+型裝柱。將丙酮沉澱用重蒸水充分溶解，加樣，用蒸餾水衝洗至流出液無色、澄清，然後用3％氨水洗脫，分段收集洗脫液。用孢子萌發法檢測各段洗脫液的活性。活性部分減壓濃縮得粗提物。
3.6.3精提(1)大孔樹脂柱層析新樹脂先用無水乙醇浸泡3-4d後，裝入層析柱，用無水乙醇衝洗大孔樹脂，放置6h。待大孔吸附樹脂沉降緊實後，以6倍柱體積的蒸餾水衝洗柱體。然後用3-4倍體積的2％HCl溶液衝洗樹脂並浸泡2-4h，再用蒸餾水洗至出水為PH呈中性。用3-4倍體積的2％NaOH溶液衝洗樹脂，並浸泡2-4h，而後用蒸餾水洗至出水為PH呈中性。將離子交換樹脂提取的活性洗脫液靜態吸附到大孔樹脂上，分別用蒸餾水、40％乙醇、60％乙醇、100％乙醇作為洗脫劑，洗脫液每管收集20ml，減壓濃縮，用孢子萌發法測活，將活性洗脫液乾燥，得精提物。
(2)在反相製備柱高效液相色譜上對精提物進一步切割分離，製備色譜各峰用孢子萌發法測活性，對抑菌效果強的單組分進行分離製備，並對其進行理化性質和結構分析。
殺菌劑(水乳劑)農藥的具體製備過程1、原藥加水溶解瑞拉菌素易溶於水，水乳劑質量穩定，易儲運，有利於作物吸收，有利於環境保護，將得到的瑞拉菌素原藥加水溶解製成水乳劑。
2、發酵確定含量經多次發酵實驗證明該產品在正常發酵條件下，絕大多數批次瑞拉菌素產生菌發酵液中瑞拉菌素含量≥1.2％，為了確定產品質量，商品瑞拉菌素製劑以含量為1.2％為合格的產品標準。
表3 十批瑞拉菌素產生菌發酵液樣品中含量測定表
3、加乳化劑、消泡劑等加入表面活性劑十二烷基硫酸鈉，消泡劑二甲基聚矽氧烷，由茶皂甙15％脂肪胺3％和水72％製成的增效劑，高滲劑脂肪醇聚氧乙烯(6-7)醚，乳化劑順丁二酸單酯磺酸鈉，助劑為三聚磷酸鈉。其組成為
瑞拉菌素12重量份表面活性劑 3重量份消泡劑 2重量份增效劑 3重量份助劑2重量份乳化劑 2重量份高滲劑 2重量份水 74重量份4、攪拌5、包裝本發明活性物質瑞拉菌素水乳劑防治水稻稻瘟病田間藥效試驗1、作物和靶標供試作物水稻品種「三釐寸」防止對象水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae Cav.e)2、環境條件試驗在湖北孝感市雲夢沙河鎮郊農戶責任田進行，該地區稻瘟病常年中等偏重發生，實驗對象均為水稻葉瘟，試驗地土壤類型為壤土，各試驗小區的栽培條件均勻一致。
3、試驗設計和安排3.1藥劑
3.1.1試驗藥劑及使用劑量1.2％瑞拉菌素水乳劑(西安海浪化工有限公司提供)，設三個劑量每公頃有效成分用量15克、16.5克和18克。
3.1.2對照藥劑及使用劑量75％三環唑可溼性粉劑(四川省廣漢市小太陽農用化工廠生產)，每公頃有效成分用量225克。另設清水空白對照。
3.2小區安排本試驗共設五個處理，四次重複，共計20個小區，小區隨機區組排列，每小區35平方米。
3.3施藥方式3.3.1施藥時間和次數當發現水稻葉片上有零星稻瘟病斑，並有明顯上升趨勢時，根據以上3.1試驗設計，按每畝75公斤藥液量分別折算各小區藥液量進行噴霧(6月12日)，10天後(6月22日)噴施第二次藥，共噴施2次。噴藥器械為工農-16型手動噴霧器。
3.3.2氣象資料施藥期間日平均氣溫在24.5℃-32.0℃之間，6月18日、20日分別下過小到中雨或陣雨，有利於病情的發展。
4、調查4.1調查方法和分級標準各小區採用對角線五點取樣法，每點調查5叢，共計25叢。採用0-9級分級標準，第二次施藥後14天進行最終病情結果調查；分別計算病指、藥效，並進行生物統計分析(DMRT法)。觀察藥害情況。
水稻葉瘟病分級標準0級無病；1級葉片病斑少於5個，長度小於1cm；3級葉片病斑6-10個，部分病斑長度大於1cm；5級葉片病斑11-25個，部分病斑連成片，佔葉片面積10％-25％；7級葉片病斑26個以上，病斑連成片，佔葉片面積26％-50％；9級病斑連成片，佔葉面積50％以上。
4.2藥效計算方法病情指數＝∑(各級病葉數×相對級數值)/(調查總葉數×9)×100防治效果＝(空白對照病情指數-施藥處理病指)/空白對照病指×1005、試驗結果分析與討論5.1試驗結果與分析從試驗結果表4可以看出，供試藥劑1.2％瑞拉菌素水乳劑對水稻稻瘟病具有較理想的防效，且隨著用藥量的增加防效增高，採用該藥劑15克、16.5克、18克(每公頃有效成分用量，下同)在稻瘟病初見病時施藥，對水稻稻瘟病的防效分別為71.3％、76.3％和83.9％；對照藥劑75％三環唑可溼性粉劑225克的防效為86.3％。
統計分析結果表明，供試藥劑1.2％瑞拉菌素水劑18克處理的防效顯著高於16.5克處理的防效，16.5克處理的防效與15克處理的防效間差異不顯著；和對照藥劑防效相比，供試藥劑1.2％瑞拉菌素水劑18克的防效和對照藥劑75％三環唑可溼性粉劑225克防效相當。整個試驗未發現供試藥劑對水稻有不良影響。
表4 1.2％瑞拉菌素水劑防治水稻稻瘟病試驗結果
權利要求
1.一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於殺菌劑有效成分為具有殺菌活性的物質瑞拉菌素 該活性物質是從土壤中經過分離、篩選，然後經微生物發酵所提取出來的。
2.根據權利要求1所述的一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於所述活性物質瑞拉菌素分離、篩選、提取的工藝步驟為1、採集土樣；2、土壤放線菌的分離；3、頡頏菌的篩選；3.1抗菌活性初篩；3.2頡頏放線菌的復篩；3.3單孢分離；3.4單孢菌的頡頏性篩選；3.5頡頏菌發酵條件的優化；3.5.1發酵培養基的選擇；(1)有機氮源的選擇；(2)有機碳源的選擇；(3)無機離子的選擇；(4)最優培養基正交實驗；3.5.2發酵培養基PH的選擇；3.5.3發酵時間的選擇；3.5.4發酵溫度的選擇；3.5.5搖床轉速的選擇；3.5.6放線菌菌絲的生長與抗生素的產生量之間的關係；3.6高效菌株S-159-05活性產物的提取；3.6.1發酵液的預處理；3.6.2粗提；3.6.3精提。
3.根據權利要求1所述的一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於所述殺菌劑包括有效成分瑞拉菌素、表面活性劑、消泡劑、增效劑、高滲劑、安全劑、助劑、雜質、填料等，其組成為瑞拉菌素12重量份表面活性劑 3重量份消泡劑 2重量份增效劑 3重量份助劑2重量份乳化劑 2重量份高滲劑 2重量份水74重量份。
4.根據權利要求3所述的一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於所述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，消泡劑為二甲基聚矽氧烷，增效劑是由茶皂甙15％脂肪胺3％和水72％製成的增效劑，高滲劑為脂肪醇聚氧乙烯(6-7)醚，乳化劑為順丁二酸單酯磺酸鈉，助劑為三聚磷酸鈉。
5.根據權利要求4所述的一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於所述殺菌劑包括用於作物殺菌的各種農藥劑型。
6.根據權利要求5所述的一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其特徵在於所述殺菌劑為水乳劑。
全文摘要
本發明涉及一種活性物質為瑞拉菌素的殺菌劑，其通過微生物發酵，提取到了具有殺菌活性的物質瑞拉菌素，經過大量的藥效試驗表明，它對植物的很多病原都具有很好的防治作用，並且與環境相容，具有殘留低、防效高、殺菌譜廣等特點。殺菌劑有效成分為具有殺菌活性的物質瑞拉菌素，該活性物質是從土壤中經過分離、篩選，然後經微生物發酵所提取出來的。
文檔編號A01P3/00GK101032251SQ20071001778
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者安德榮, 張勤福, 焦少娟, 李晶 申請人:西北農林科技大學