一種薏米多酚提取物及製備方法與流程
2023-12-05 13:33:56 1
本發明屬於植物活性物質提取、加工領域，具體涉及一種薏米多酚提取方法。
背景技術：
薏米是一種藥食兩用的健康食品，在中國、印度、日本等東南亞國家多有種植（LEE，2008）。作為食品，薏米營養豐富，易於消化，含有豐富的維生素、礦物質等，被譽為「世界禾本科植物之王」。作為藥品，薏米可除痺止瀉，健脾滲溼，清熱排膿，許多現代研究表明，薏米具有降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗敏感等藥理活性。薏米的攝入能促進人體的健康，提高人體機能（Hidaka，1992；Huang，1999；Hsu，2003）。薏米的這些生理功能主要得益於其所含的豐富的植物化學物質：多酚類、黃酮類、維生素、纖維素、礦物質等（Poutanen,K（2012）Past and future of cereal grains as food for health.Trends Food Sci.Technol,25,58-62.）。植物多酚是廣泛存在於植物體內的重要次生代謝產物，具有抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟等多種生理功能。研究表明薏米中多酚的含量豐富（王立峰（2012）薏米中多酚類物質對抗氧化、抗腫瘤和降血脂作用的評價研究[D].博士論文,江南大學,無錫.），如何提高薏米中多酚的提取率是值得被研究的。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種以薏米為原料，通過溶劑法提取獲得薏米多酚的方法。
所述的一種薏米中多酚提取物的提取分離方法，按照下述步驟進行：
（1）薏米仁粉碎，過60~100目篩，薏米粉經石油醚震蕩脫脂後，用濾紙過濾除去脂類，殘渣採用相同的方法重複脫脂3次，將脫脂薏米粉烘乾，保存在-20℃冰箱；
（2）用20-100%的甲醇、乙醇和丙酮溶液對上述薏米粉末進行浸提，浸提樣品和溶液的質量體積比為1:10-30（g/mL），用恆溫搖床避光，40~80℃勻速浸提，每次浸提時間為20-100分鐘，提取次數為1-5次，用離心機離心後分離出上清液即為薏米多酚提取液。
（3）將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹12~24h，溫度為-70~-90℃，得到薏米多酚粉末。
所述的步驟（2）中：優選80%濃度的丙酮溶劑對薏米多酚進行提取。
所述的步驟（2）中：優選60℃恆溫搖床浸提對薏米多酚進行提取。
所述的步驟（2）中：優選樣品溶液的質量體積比（料液比）為1：25（g/mL）對薏米多酚進行提取。
所述的步驟（2）中：優選浸提時間80分鐘對薏米多酚進行提取。
按照本發明方法獲得的薏米多酚的含量為30-40mg/100g。
本發明還公開了通過上述提取方法製備得到的薏米多酚提取物，其中包含質量分數如下的酚類化合物：
N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺，1.01%；
對香豆酸，0.17%；
阿魏酸，0.21%；
蘆丁，0.12%。
其中所述的，N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺的結構式為：
其中所述的，對香豆酸的結構式為：
其中所述的，阿魏酸的結構式為：
其中所述的，蘆丁的結構式為：
本發明的有益效果：
1.本發明製備的薏米多酚為天然提取物，是天然的抗氧化劑，具有增強免疫功能，降血壓降血脂，抗腫瘤抗炎等功效。
2.利用80%濃度的丙酮溶劑提取，其薏米多酚的濃度較大，即提取效率高。
3.利用凍幹將薏米多酚粗提液製成粉末，低溫凍幹有利於提高薏米多酚的活性以及後續保存，並且有利於稱取以及實驗定量的需求。
4.本方法操作簡單，適合提升薏米的綜合利用率，提升其附加價值，將其生產鏈延長，具有廣闊的市場前景。
附圖說明
圖1為實施例1通過冷凍乾燥所得薏米多酚粉末進樣液相圖；
圖2為對比例1通過熱風乾燥所得薏米多酚粉末進樣液相圖；
圖3為N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺的液相圖；
圖4為N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺的質譜圖；
圖5為對香豆酸的液相圖；
圖6為對香豆酸的質譜圖；
圖7為阿魏酸的液相圖；
圖8為阿魏酸的質譜圖；
圖9為蘆丁的液相圖；
圖10為蘆丁的質譜圖。
具體實施方式
以下結合具體實施方式對本發明作進一步說明。
實施例1：
1）原料預處理：薏米仁粉碎，過60~100目篩，薏米粉經石油醚震蕩脫脂後，用濾紙過濾除去脂類，殘渣採用相同的方法重複脫脂3次，將脫脂薏米粉烘乾，保存在-20℃冰箱中；2)加入浸提溶劑：按料液比1：25加入體積分數為80%的丙酮溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置於60℃的恆溫振蕩箱浸提80分鐘，提取1-5次；4)離心；5)旋轉蒸發：將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍幹：用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹12h，溫度為-90℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為36.52mg/100g。
所述的測多酚含量的方法為福林酚法：取1mg樣品溶於1mL 70%的甲醇水溶液；取100μL樣品溶液 (或沒食子酸標準溶液) 與400μL去離子水混合，接著與0.1mL的福林酚溶液混合，在避光條件下放置5-8分鐘；再與1 mL 7%的碳酸鈉溶液和0.8mL的去離子水混合，在室溫下避光反應90min。將200μL最終反應溶液添加到96孔板中，使用酶標儀在760nm處測定吸光度。計算多酚含量。
對比例1：
採用與實施例1相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍乾燥改變為熱風乾燥。測量其多酚濃度為26.22mg/100g。
實施例2：
1)原料預處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：10加入體積分數為80%的甲醇溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置於40℃的恆溫振蕩箱浸提100分鐘；4)離心；5)旋轉蒸發：將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍幹：用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹24h，溫度為-70℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為32.08mg/100g。
對比例2：
採用與實施例2相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍乾燥改變為熱風乾燥。測量其多酚濃度為23.25mg/100g。
實施例3：
1)原料預處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：30加入體積分數為60%的丙酮溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置於80℃的恆溫振蕩箱浸提20分鐘；4)離心；5)旋轉蒸發：將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍幹：用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹18h，溫度為-80℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為32.34mg/100g。
對比例3：
採用與實施例3相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍乾燥改變為熱風乾燥。測量其多酚濃度為23.92mg/100g。
實施例4：
1)原料預處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按一定的料液比1：25加入體積分數為20%的乙醇溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置於40℃的恆溫振蕩箱浸提80分鐘；4)離心；5)旋轉蒸發：將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍幹：用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹15h，溫度為-90℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為33.29mg/100g。
對比例4：
採用與實施例4相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍乾燥改變為熱風乾燥。測量其多酚濃度為24.51mg/100g。
實施例5：
1)原料預處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：15加入體積分數為50%的丙酮溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置於60℃的恆溫振蕩箱浸提80分鐘；4)離心；5)旋轉蒸發：將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍幹：用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹20h，溫度為-70℃，得到薏米多酚粉末。測量其總酚濃度為35.13mg/100g。
對比例5：
採用與實施例5相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍乾燥改變為熱風乾燥。測量其多酚濃度為25.45mg/100g。
實施例6：
1)原料預處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：20加入體積分數為100%的乙醇溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置於60℃的恆溫振蕩箱浸提50分鐘；4)離心；5)旋轉蒸發：將離心後的濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍幹：用蒸餾水溶解旋轉蒸發的多酚粗提液，在冷凍乾燥機裡凍幹22h，溫度為-90℃，得到薏米多酚粉末。測量其總酚濃度為30.87mg/100g。
對比例6：
採用與實施例6相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍乾燥改變為熱風乾燥。測量其多酚濃度為21.78mg/100g。
對上述製備得到的薏米多酚進行測試：將相同質量的實施例1和對比例1製備得到的薏米多酚粉末溶於甲醇，過膜後分別進樣，以甲醇和水作為洗脫劑。冷凍乾燥的液相圖見附圖圖1，熱風乾燥的液相圖見附圖圖2。通過對比可知，冷凍乾燥所得的薏米多酚種類多且濃度高，而通過熱風乾燥所得薏米多酚品質不如前者。說明通冷凍乾燥法所得薏米多酚品質更好。
通過上述實例可知，實施例1方法提取的薏米多酚其多酚濃度高，有利於薏米多酚的充分提取。以下將對實施例1中獲得的薏米多酚粗提物進行分離純化，並鑑定各純化物的化學結構，以便進一步研究各純化物的生理活性。
將上述實施例製備得到的薏米多酚粉末溶於去離子水中，先後用石油醚和正丁醇分別萃取三次，凍幹，得正丁醇相和水相。
正丁醇相溶於80%的乙醇溶液，過0.45 µm濾膜。洗脫液為80%的乙醇溶液，恆流泵的流速為40 mL/h，紫外吸收波長為280 nm，用自動收集器每10ml收集一管餾分。將所需餾分經旋轉蒸發、冷凍乾燥得三種薏米多酚純化物亞組分（亞組分一、亞組分二和亞組分三），亞組分一主要為雜質，不再純化。
亞組分二和亞組分三採用半製備RP-HPLC進一步分離純化。製備柱採用Waters C18 製備柱(10 μm，19 mm×250 mm)，柱溫為30℃。流動相A相為水溶液，B相為乙腈，進行梯度洗脫。樣品溶於甲醇，進樣前需過0.22 µm濾膜，濃度為10 mg/ml，單次進樣100 μL，最佳吸收波長設置為280 nm。製得四種薏米多酚純化物。
液質聯用結合核磁共振譜的手段測定這四種化合物的結構。四種酚類化合物結構經鑑定分別是N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁。四種酚類化合物的液相圖、質譜圖如附圖3~10所示。值得注意的是，N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺首次在薏米中分離並鑑定。
功效實驗補充：分別測試四種純化酚類化合物對人體肝癌HepG2腫瘤細胞、人體乳腺癌MCF-7腫瘤細胞和人體結腸癌Caco-2腫瘤細胞的抗腫瘤能力採用MTT法分析。薏米多酚純化物對HepG-2，MCF-7和CaCo-2三種腫瘤細胞的抑制作用見表1。
表1 薏米多酚純化合物對HepG-2，MCF-7和CaCo-2三種腫瘤細胞的抑制作用
表1顯示了N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺、對香豆酸、阿魏酸和蘆丁的抗腫瘤IC50值，從結果可以看出，N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺對三種腫瘤細胞的抗增殖能力均高於其他三種化合物，IC50值分別為46.34±3.99，61.52±6.02和92.69±5.63 µg/mL。其他依次為對香豆酸（IC50值分別為105.06 ± 7.64，118.84 ± 10.86和131.06 ± 9.07 µg/mL），阿魏酸（IC50值分別為126.60 ± 10.86，147.38 ± 14.04和192.76 ± 11.80 µg/mL），而蘆丁沒有展現出抗腫瘤能力。N1,N5-雙(對香豆醯)亞精胺、對香豆酸和阿魏酸對三種腫瘤細胞均呈現出抗增殖的量效關係。此外，對於三種腫瘤細胞而言，HepG2 肝癌細胞比MCF-7乳腺癌細胞和Caco-2結腸癌細胞對薏米多酚更為敏感。因此，N1,N5-雙（對香豆醯）亞精胺、對香豆酸和阿魏酸是薏米多酚提取物中主要的抗腫瘤成分。