多元細胞信號轉導測定的製作方法

2023-12-05 22:00:31 2

專利名稱：多元細胞信號轉導測定的製作方法
技術領域：
本發明涉及高容量的細胞篩選測定(high-content cellular screeningassay)，更具體
地涉及用於篩選細胞刺激劑並在單細胞或單細胞群中採用報告分子的多元監測的測定。
背景技術：
發現一種新的治療劑的過程傳統上包括以下階段，在患者或者合適的模型系統 中i)鑑定藥物靶標；ii)驗證該靶標；iii)篩選影響靶標活性的化合物；iv)測定先導 化合物的毒性；V)測定先導化合物的副作用；和Vi)考查先導化合物的代謝及穩定性。 一旦鑑定並驗證潛在的治療靶標，藥物發現的初始階段需要篩選通常是成數十萬種化合 物，來鑑定那些以適當治療方式調節靶標的藥物。這種篩選過程需要開發能夠迅速廉價 地測量調節目的靶標因子的化合物的效力的測定技術。這些高通量的篩選測定可採取各 種形式，其包括通常依靠基於比色、螢光、放射性測量或發光的檢測的基於細胞的測定 或生化測定，以測量受體激活、RNA濃度、蛋白濃度、酶活性或蛋白質間形成功能複合 體的物理相互作用。藥物發現領域面臨的始終的挑戰是提高速度和效率，依賴這種速度 和效率從化合物篩選庫中所測定的數十萬種化學化合物裡鑑定出潛在的先導化合物，然 後優化成新的藥物。在先導化合物優化過程中遇到的一個普遍問題是，最初根據其調節 一種或幾種特定靶蛋白活性的能力鑑定出的候選藥物，也常常有一種或多種禁忌症。化 合物缺乏特異性從而導致藥物除了既定的靶標外還靶向範圍廣泛的因子和生物過程，這 能夠產生有害作用。令人關注的其它領域包括藥物毒性和代謝，這些引起毒性反應的化 合物能破壞正常細胞和組織的功能，導致細胞死亡。某些化合物也已被證實調控其自身 代謝，藉此刺激該靶物質分解並從機體排洩，導致藥效降低。目前高通量的篩選測定通常集中於測量化合物在調控單一因子或靶標的活性中 的效用，並依賴於二次篩選及後續分析(follow-upanalyse)的延續過程，以便測定化合物 功能的其它特性，例如特異性和毒性。這增加了將化合物開發並優化為具有高治療指數 (即高效率、高特異性、低毒性)的藥物所需的時間及花費。結果，很多因為其對靶標的 活性而原本被選定的化合物，最終因為後續發現的副作用被放棄，導致在先導藥物評價 上所做的努力浪費，這最終證明不能令人滿意。在藥物發現和先導藥物優化過程中，需要更快速、更高效、更廉價、特別是信 息豐富的篩選測定，這樣的測定同時提供關於各種化合物特性及其對各種細胞途徑作用 的信息(即功效、特異性、毒性和藥物代謝)。例如，先前採用過的一種方法闡述於US 2005/0164321 (PromegaCorp)中，其闡
述了用酶介導反應的方法，該方法用於在同一孔中的多元發光和不發光測定，以檢測樣 品中一個或多個部分的量(例如活性)或存在情況，所述部分包括酶促反應的輔因子(例 如ATP)、結合和/或改變分子構象的蛋白質(肽或多肽)(例如修飾或剪切肽或多肽底物 的蛋白質)或被蛋白質結合和/或改變的分子。WO 98/58074(Allelix Biopharma)闡述了用於篩選化學化合物以鑑定受體(包括
G-蛋白質偶聯受體)的配體的測定方法和組合物。該發明採用的細胞為其中目標受體通過第二信使系統被偶聯到受環核苷酸門控(gate)的離子通道的細胞。受體刺激導致第二 信使系統產生環核苷酸，這導致可測量的離子通過通道流入。該發明還提供了這樣的多 元系統，其中用不同的離子內流(ion influx)螢光報告分子裝載表達不同受體類型的混合 細胞培養物。EP1439384(Cellomics Inc)提供用於測定細胞中螢光標記報告分子的分布、環境 或活性的方法和分析系統，所述方法和分析系統的目的是篩選大量的特異性影響特定生 物功能的化合物。Bertelsen, M.，(Methods in Enzymology，(2006), 414 348-363)闡述了使用 高容量的成像系統進行炎症信號轉導和細胞內蛋白質易位的多元分析。Howell, B.J.等(Methods in Enzymology，(2006)，284-300，2006)闡述
了基於細胞的多元成像測定的開發和實施，所述測定採用螢光顯微鏡監測細胞增殖、細 胞周期階段和細胞凋亡。Nickischer, D.等(Methods in Enzymology，(2006), 414, 389-418)闡述了三 種促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)細胞內信號轉導途徑成像測定的開發和實施，以便 為激酶抑制劑提供MAPK模塊選擇性概況分析(profiling) MK2-EGFP易位、c_JUN和 ERK活化。Hanson, B.等(J.Biomolecular Screening，(2006)，U, 644-651)闡述了多元細 胞內測定，其通過聯合fluo-4鈣遷移測定和β內醯胺酶報告系統，使得可以用單細胞系 進行兩個G-蛋白偶聯受體測定藥物篩選。Jonas, J-C.等(Diabetes，(1998)，47, 1266-1273)闡述了細胞內 Ca2+濃度和細 胞外胰島素從用葡萄糖刺激的分離的胰島細胞的細胞灌流液中分泌之間的時間和數量關 系，所述胰島素。在含有葡萄糖的培養基中用鈣指示劑fUra-PE3裝載培養的胰島，並將 單個胰島轉移到灌注室中。用螢光顯微鏡測量[Ca2+]，而用RIA測定灌流液下遊收集的 組分中的胰島素。因此，本文闡述了 [Ca2+]與大群混合(即異質)的細胞群的胰島素分 泌之間的關係，因此在單細胞水平上，細胞刺激與相關的分析物的產生之間沒有特定的 相關性。此外，Jonas等沒有闡述細胞相關的分子/分析物的多元測定或測量。Marriott 等(J.Cellular Physiology，1998，177，2，232-240)闡述了鼠腹腔巨隨 細胞內白細胞介素6mRNA表達的誘導和細胞內鈣的測量。mRNA和細胞內鈣的測量都 是細胞內事件，因為mRNA不被細胞分泌。Veronesi 等(Neurotoxicology，2003，24，463-473)闡述了支氣管-氣管上皮細 胞的胞內鈣和胞外IL-6測量。在該論文中，IL-6與細胞無關，用ELISA進行下遊測量。McMillen等(Clinical Care Medicine，1995, 23, (1) 34-40)闡述了用下遊放射免 疫分析法進行人單核細胞的胞內鈣的測量和胞外IL-6的測量，這種方法的實施不需細胞 洗滌步驟。Dracker 等(Blood，2002，100，(11)，摘要編號 5025)報導了用下遊 ELISA 進
行多發性骨髓瘤細胞系的胞內鈣和胞外IL-6的測量，其不需細胞洗滌步驟。Kohno等(Diabetes，2003，墜，(4)948-956)披露了在同一細胞群中細胞內鈣的 測量和神經肽Y(NPY)的免疫化學染色。在用4%低聚甲醛對死細胞進行細胞固定後檢 測 NPY。
Lundgren 等(World Journal of Surgery，1996，20, (7)727-735)闡沭了通過下遊 放射免疫分析法測量人甲狀旁腺細胞的胞內鈣和胞外PTH，其不需細胞洗滌步驟。以上方法都沒有給出來自刺激活細胞的即時及多元的高容量信息，其中在來自 單一同質細胞群的細胞中測量胞內及與細胞相關的信號轉導因子。因此，以上方法不能 使特定細胞內事件和細胞相關分析物的下遊產生相關聯。本發明解決了這些限制，並提 供了優於已知方法的很多優點。發明概述本發明提供用於採用成像儀器進行化合物篩選的基於細胞的多元測定方法， 所述測定提供高容量的信息，這些信息涉及檢測試劑的生物效能、脫靶效應(off-target effect)和潛在候選藥物的細胞毒性。因此，本發明的第一方面提供用於在單個活細胞群 中測量至少一種細胞內事件和細胞相關分析物的方法，其中所述至少一種細胞內事件和 細胞相關分析物是在細胞中運行的協同生化過程的各個組分，所述方法包括以下步驟a)提供含有單個活細胞群的樣品；b)讓單個細胞群中的至少一個活細胞與引起或懷疑引起至少一個細胞產生細胞 相關分析物的檢測試劑接觸；c)測量在至少一個細胞中的物理性質的變化，作為至少一種細胞內事件的度量 (measure)；d)洗滌細胞以去除細胞外液體；e)測量細胞相關分析物的存在、含量或活性；和f)將至少一個細胞中的至少一種細胞內事件的變化與細胞相關分析物的存在、 含量或活性相聯繫。因此，本發明提供綜合性的高容量、高通量的基於細胞的測定方法，所述方法 能夠產生關於外源性藥物對細胞作用的生物活性數據。活細胞通過在時間和空間上調控 的複雜的生物化學途徑網絡不斷響應其環境中的重要信號，以給細胞提供對協調響應必 不可少的綜合信息交換。激素、生長因子和神經遞質都屬於已被廣泛研究的信號轉導物 質。另外，本發明提供用於測量同一細胞中發生的多個事件的信息豐富的方法，所述方 法能協助生物化學途徑分析。這進而有助於闡明與臨床病況相關的各種途徑，所述臨床 病況如癌症、動脈粥樣硬化、銀屑病、類風溼關節炎、多發性硬化症、哮喘和慢性阻塞 性肺疾病。在本文所述方法中採用的樣品將合適地含有單細胞群。按照所述方法，細胞 與檢測試劑接觸，以刺激細胞引發下遊生化過程(或事件)級聯。所述過程可導致細胞內 的激素、第二信使、氣體、酶、轉錄因子、反應元件和/或基因表達產物水平改變。此 外，還可能將觀察到的細胞刺激後的細胞內事件的變化與因響應所述細胞刺激而可能產 生的細胞相關分析物的形成相關聯，所述變化的特徵在於一種或多種相應的細胞內效應 分子的水平或數量變化。在一個實施方案中，可將在檢測試劑存在下測量的細胞內事件的變化和細胞相 關分析物的存在、含量或活性的變化，與在缺少檢測試劑時的至少一種細胞內事件和所 述細胞相關分析物的存在、含量或活性每一種的對照值比較。對照值可方便地以電子形 式存儲在資料庫中或其它電子格式中。檢測試劑可為化學實體，例如藥物、食用色素、激素、毒素、烷基化劑、氧化劑或致癌物。或者，檢測試劑為物理因子，例如電磁輻射(例如UV、X-射線、微波)、 β —輻射或熱。技術人員應理解，去除細胞外液體的洗滌步驟d)可在步驟b)之後但在步驟C) 之前實施。本文所述術語「多元測定」或「多元方法」涉及測量或傳達來自同一來源的 兩種或多種信使的信息或信號的方法(多元測定的實例由Ugozzoli等闡述(Analytical Biochemistry, 2002，MI，47-53))。本文所用術語「高容量篩選」是藥物發現方法，其用活細胞作為分子發現的試 管。它闡述了利用空間或時間解決的方法，以便從單獨實驗中比從僅含一個單獨輸出的 一個單一實驗中發現更多。其運用細胞生物學與分子工具的組合，通常用自動高解析度 顯微鏡和自動化處理(Giuliano等，J Biomol Screen.，1997, 2, 249-259)。本文所述方 法闡述用活細胞的測定方法的用途。本文所述術語"細胞內事件"意欲指與細胞信號傳導和信號轉導相關的基本的 細胞過程，包括例如受體激活、鈣釋放、第二信使產生、氧化氮釋放、磷酸化、酶激 活、轉錄因子和響應元件激活及基因表達。因此，在本發明的情況中，將檢測物理性質 的變化作為細胞內事件的度量，意欲指檢測細胞內效應分子的存在與否或測量其水平或 含量的變化，或測量細胞內酶、第二信使、氧化氮、轉錄因子、響應元件或一種或幾種 基因表達產物活性的變化。優選細胞內事件為離子濃度(例如細胞內鈣)增加和/或基 因表達增加。本文所述術語〃細胞過程〃意欲包括活細胞經歷的正常過程並包括生物合 成、吸收、運輸、調控、受體結合和內化、代謝、細胞生理、生化應答、細胞呼吸作 用、生長和細胞死亡。另外的細胞過程可包括細胞粘附(其中細胞經由細胞粘附分子附 著到另一個細胞或底層基底或基質)、細胞信號轉導、形態發生、複製和響應刺激物。本文所述術語〃細胞相關分析物(cell-associated analyte)「意欲指在刺激細胞後 通常由協同的生化過程或途徑產生的細胞組分，這種組分隨後可由細胞分泌，但在測量 細胞相關分析物的存在、含量或活性時其與細胞在物理上相連(physically associated)。本 發明闡述了經過設計以測量存在於細胞內和細胞外液體中的兩種或多種不同分析物的聯 合測定或多元測定。例如，細胞內分子可存在於細胞質和細胞核中，而細胞相關分析物 可存在於沐浴細胞直接表面的液體中。在優選實施方案中，將測定設計為測量與細胞緊 密相連的細胞相關分析物，例如與細胞膜結合或存在於細胞直接環境中的細胞相關分析 物，因為這樣可以提供對分泌因子或分析物的表達水平及產生水平的時間特性的準確測 量。本發明方法適用於幾乎任何類型的細胞。在一個實施方案中，細胞群為正常 (即未經修飾的)細胞，其在來源方面可來自任何公認來源，包括哺乳動物細胞、細菌細 胞、植物細胞、昆蟲細胞和酵母細胞。在優選實施方案中，採用真核細胞類型，例如哺 乳動物細胞。實例包括CHO、3T3、Cos-7、HEK-293、Jurkat、HeLa、Sf_9、HUVEC> HMEC> HL-60、U20S、J774、BHK、ECV304 和 THP-1 細胞。備選細胞包括酵母細 胞和昆蟲細胞。在另一實施方案中，通過用重組表達載體轉染來修飾細胞，所述表達載體包含第一報告基因構建體，所述構建體包含編碼第一可檢測報告分子的核酸序列，所述核酸 序列與表達控制元件可操作地連接並在其控制之下。在該實施方案中，第一方面的接觸 步驟b)合適地在允許報告基因構建體表達的條件下進行。本文所述術語"可操作地連接"表明對包含報告基因構建體的元件的安置使其 功能與其預期目的一致，即對報告基因構建體的安置使轉錄在啟動子中啟動並經過編碼 報告分子的DNA序列來進行。在再一實施方案中，報告基因構建體可另外編碼目的蛋白，例如綠色螢光蛋白 (GFP)、硝基還原酶報告分子(NTR)或催化螢光素產生光的螢光素酶基因。另一種細 菌中常用的報告分子是IacZ基因，其編碼半乳糖苷酶蛋白，從而導致細胞表達該基 因，以便當細胞生長在含有底物類似物X-gal的培養基時出現藍色。如本文所述，報告基因(或報告分子)是在培養中的細胞中連接到另一目的基因 (表達例如螢光素酶)上的基因。選擇某些基因作為報告分子，是因為它們賦予表達它 們的生物體的特性易於被鑑定並檢測，或者因為這些基因為細胞內事件或分子的選擇標 記，並因此可被用於諸如綠色螢光蛋白(GFP)易位測定等技術。用報告基因來確定目的 基因是否被細胞吸收或被表達，或在細胞或細胞群中基因表達是否被激活或改變。為了 將報告基因導入生物體中，將報告基因和目的基因安置在同一核酸構建體中，將該構建 體插入或轉染到細胞或細胞群中。例如，對培養的細菌或真核細胞而言，眾所周知這種 構建體通常是環狀(質粒)DNA形式。在一個實施方案中，通過用第一報告基因構建體轉染來修飾的細胞包含編 碼螢光蛋白的核酸序列，所述螢光蛋白例如綠色螢光蛋白(GFP)或來源於維多利亞 水母(Aequorea Victoria)的GFP功能類似物。用於所述方法中的優選螢光蛋白包括 EGFP (Cormack, B.P.等，Gene，(1996)，173, 33-38) ； EYFP 和 ECFP (US 6066476， Tsien，R.等)；F64L-GFP (US 6172188，Thastrap, O.等)；BFP, (US 6077707， Tsien, R.等)。其它螢光蛋白包括 NFP (Clontech)和 Renilla GFP (Stratagene)。在另一實施方案中，修飾的細胞包含第一報告基因構建體，所述報告基因構建 體包含編碼酶的核酸序列，例如螢光素酶、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶和硝基還原酶。 在特別優選的實施方案中，報告基因構建體編碼硝基還原酶。合適的酶報告分子是能夠 在該酶的底物中產生可檢測信號(例如螢光信號或發光信號)的報告分子。特別適合的 酶/底物包括螢光素酶/螢光素；β 「半乳糖苷酶/DDAO半乳糖；β -半乳糖苷酶/ 螢光素二 - β -D-半乳糖苷；鹼性磷酸酶/Attophos ；硝基還原酶/CytoCy5S (如WO 2005/118839 中所述)。用多種酶基因作為報告基因的方法眾所周知(見綜述Naylor L.H.，Biochemical Pharmacology, (1999)，巡，749-757)。選擇報告基因以使在其它細胞蛋白存在下可測
量該基因的產物，並在所選擇的調控序列控制下將該報告基因轉入細胞，所述調控序列 響應宿主細胞中基因表達的變化。典型的調控序列包括響應激素的那些調控序列和其它 細胞控制因子和信號轉導因子。例如，已知結合七種跨膜受體的激動劑能調控包括cAMP 響應元件、NFAT、SRE和APl在內的啟動子元件；MAP激酶激活導致SRE調節，從而 導致Fos和Jun轉錄；DNA損傷導致DNA修復酶和腫瘤抑制基因p53轉錄激活。可通 過選擇適當的調控序列，用報告基因來測定加入的試劑對涉及所選擇的研究中的調控序列的細胞過程的作用。用作報告分子的硝基還原酶基因可用眾所周知的方法分離，例如用聚合酶鏈式 反應(PCR)從 cDNA 文庫中擴增(Molecular Cloning，ALaboratory Manual (分子克隆，實 驗手冊)，第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第 14.5-14.20 頁)。一旦被 分離，可將硝基還原酶基因插入到適用於哺乳動物啟動子的載體中(Molecular Cloning， ALaboratory Manual (分子克隆，實驗手冊)第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第16.56-16.57頁)，所述啟動子與研究中的基因調控序列相連並受其控制。然 後可將含有硝基還原酶報告分子和相關調控序列的載體，通過用眾所周知的技術轉染 引入到宿主細胞中，所述轉染技術例如用DEAE-葡聚糖或磷酸鈣(Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989,第 16.30-16.46 頁)。其它合適的技術為本領域技術人員所熟知。業已證明以這種方式表達時硝基還原 酶被保留在細胞中(見 Bridgewater 等，Eur.J.Cancer 31a, 2362-70)。可通過本領域技術人員熟知方法通過限制酶切消化、連接、轉化和質粒 純化的標準重組分子生物學技術製備DNA構建體，所述方法在Sambrook，J.等
(1989), Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press中闡述。或者，可通過已建立的方法來合成製備構建體，所述方法例如 Beaucage 和 Carathers (Tetrahedron Letters，(1981)，22, 1859-1869)闡述的亞磷醯胺 (phosphoramidite)方法或 Matthes 等(EMBOJ.，(1984), 3, 801-805)闡述的方法。根 據亞磷醯胺方法，例如在自動DNA合成儀上合成寡核苷酸，純化、退火、連接並克隆 到合適的載體中。還可通過聚合酶鏈式反應(PCR)用特異引物製備DNA構建體，例如 其如 US4683202 中或由 Saiki 等(Science，(1988)，239, 487-491)所述。在 PCR 方案
(1990)，AcademicPress, SanDiego, California, U.S.A.中可找到 PCR 方法的綜述。在製備DNA構建體的過程中，必須讓編碼報告分子的基因序列與細胞周期階段 特異性破壞控制元件在讀框架內連接，並任選空間定位控制元件。然後將得到的DNA構 建體置於合適的細胞周期階段特異性表達控制元件的控制之下。可通過採用對所述分子特異的螢光探針，通過檢測及定量測量由細胞發射的熒 光來合適地完成細胞內事件(例如在細胞刺激後激素、第二信使或鈣的水平變化)的測 量。可用已知的方法完成細胞內激素、第二信使、轉錄因子等的測量。可測量的細胞內 事件和相關的效應分子的實例包括j)細胞鈣流或鈣瞬變測定所述測定採用細胞滲透螢光指示染料分子，例如Fluo-2和Fluo-4，以使探針與 鈣離子結合引起的螢光發射增加。參見例如"CellularCalcium，A Practical Approach 「， 由 McCormack 和 Cobbold (1991)編輯，IRL Press。
) GFP標記的易位測定這些測定需要表達GFP的核酸構建體，致使可鑑定出在細胞質與細胞膜、早 期內體或細胞核之間發生蛋白質易位。參見例如Hancock等，生物分子篩選學會(The Society for Biomolecular Screening)，第九屆年度會議禾口展覽(9th Annual Conference and Exhibition), DrugDiscovery at the Cutting Edge(2003), Portland, Oregon),其闡述了用
於監測和定量多種信號轉導事件(包括AKT-I激活)的活細胞內GFP標記的蛋白易位測定。jjj)報告基因測定可將報告基因測定用於檢測目的基因的表達，所述基因的表達產生對培養的細 胞幾乎沒有明顯的或立刻的作用的細胞蛋白質。本文將報告分子直接標記目的基因以形 成基因融合。這兩個基因受同一啟動子的控制，並被轉錄成單個信使RNA分子，進而被 翻譯成蛋白質例如酶報告分子。重要的是這些例子中兩種蛋白質都能正確摺疊成有活性 的構象，其儘管融合但仍與它們的酶底物相互作用。在DNA構建體的形成中，通常包括 編碼柔性多肽接頭區的DNA區段，致使報告分子與基因產物之間的幹擾減至最小。所述 方法實例眾所周知，參見例如 Bronstein 等，Chemiluminescent and Bioluminescent Reporter GeneAssays(化學發光和生物發光報告基因測定)，Analytical Biochemistry, (1994)， 219, 169-181。jy)細胞裂解測定本文在細胞裂解液中測定細胞內組分，所述細胞裂解液經常加有使細胞膜離解 的去汙劑。所述細胞裂解步驟和測定的實例可在US6900019 (Horton)中找到。測量細胞相關分析物的存在、含量或活性的測定眾所周知，其包括免疫細胞化 學、蛋白質結合測定和酶測定。測定的組分通常可包括a)含有或疑似含有將被測定的分析物的細胞樣品；b)分析物的未標記的特異性結合配偶體(binding partner)，其被或能夠被固定在 固相支持體上；c)分析物的特異性結合配偶體或類似物，其被標記或者不被標記，並能夠被標記。在一個實施方案中，所述測定為酶測定。在這種形式中，微孔板的孔中含有 組分a)、b)和c)，組分c)為待測定化合物的酶標記的特異性結合配偶體。通過將適 用於檢測酶標記的檢檢測試劑加入到孔中來啟動所述測定的測量。參見例如Berg，J.， Tymoczko J 禾口 Stryer L，Biochemistry，W.H.Freeman and Company，(2002) 0在另一實施方案中，被標記的特異性結合配偶體可包括螢光標記。適用於通過 免疫細胞化學測定法測量分析物的合適的螢光標記物眾所周知，其包括例如螢光素、羅 丹明和花菁染料。在另一實施方案中，採用酶聯免疫斑點(ELISPOT)測定來測量細胞相關分析 物。參見 Czerkinsky，C.,等，J.Immunol.Methods，(1983)，65(1-2), 109-21)。在該 實施方案中，可用半透明(PVDF)膜測定細胞相關分析物，所述膜起抗體或其它結合試 劑的固相支持體的作用，用酶標記的探針和螢光底物檢測細胞相關分析物。在又一實施方案中，可用活細胞ELISA技術進行細胞相關分析物的測量，其中 可能含有待測量的分析物的細胞樣品包含在容器中，並用合適的探針和發光體或螢光底 物檢測細胞相關分析物。參見例如Granow，R.等，J.Immunological Methods，(1994)， 171， 93-102。細胞相關分析物的性質不是本發明關鍵，除非所述分析物的存在、活性或數量 可與細胞內事件(其通過細胞內組分或報告基因激活或GFP易位的改變來測定)相關 聯。特異性結合配偶體所適用的任何細胞相關分析物原則上可用於本發明中。適用於本發明的典型特異性結合配偶體組合可選自半抗原_抗體、配體-受體、DNA-DNA、 RNA-RNA、DNA-RNA、生物素_鏈黴親和素、蛋白質_抗體、肽-抗體和多肽-抗體 相互作用。優選特異性結合測定為蛋白質結合測定，或更具體為免疫細胞化學測定。典 型的分析物包括蛋白質、肽、神經遞質、神經營養因子、維生素、肽激素、酶、生長因 子、類固醇激素、前列腺素、整聯蛋白、基質組分、粘附素、分化分子簇、細胞因子、 趨化因子、淋巴因子和白三烯等。對某些細胞內組分的測量指示細胞內事件的變化，所述組分包括第二信使、 ADP> ATP> AMP、環 ADP-核糖、細胞鈣、cGMP、cAMP、IP3> IP1^ IP4> 絲氨酸-蘇 氨酸激酶、PI3-激酶、甘油二酯、AKT-1、核糖體蛋白S6激酶、SMAD-9、磷脂酶C、 磷脂酶CS-1、β澱粉樣蛋白前體、ras同源基因家族、成員A.PARAPARA(ARHA)、 與受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶2、熱休克蛋白70-kD 1A、(HSPAlA)、鞘氨醇 激酶-I (SPHKl)、SPHK2、Forkhead Box OlA (FOXO-IA)、糖皮質激素受體(GCCR)、 半胱氨酸蛋白酶、AKTl和轉錄因子。可例如用以下方法分別測量這些細胞內分析物 GFP易位標記物、報告分子-基因測定法、螢光或發光探針、酶介導的測定、蛋白結合 技術、電生理法、光譜法、核磁共振技術、流式細胞術、離子運輸、顯微鏡法和放射測 定。可用光學成像方法進行螢光強度變化的檢測和測量，其採用結合電荷耦聯裝置 (CCD)成像器(例如掃描成像器或區域成像器)的儀器。例如，LEADseeker 多模態 成像統(Multimodality Imaging System) (GEHealthcare)特徵在於 CCD 相機，其使得可以 單向(single pass)對高密度微孔板進行定量螢光成像。或者，可用IN Cell 1000分析儀光 學成像系統(Analyzer Optical Imaging System) (GE Healthcare)以〃活細胞〃形式對細胞成 像。在這種方式中，應該將合適的細胞標記物引入到細胞中，所述細胞標記物例如細胞 質、細胞核或細胞膜螢光標記物，其具有與目的化合物的螢光發射波長不同且可區別的 螢光發射波長。根據本發明，可聯合各種方法，使得能在用檢測試劑處理的單細胞或單一同質 細胞群中並行監測細胞內和細胞外的細胞相關事件。因此，本發明提供了一種有利的方 法，其用於直接測定推定藥物或試劑對單細胞或單細胞群的作用效果，由此減少開發和 優化高療效的化合物所需的時間和花費。發明簡述為清晰起見，本發明某些實施方案將通過參考以下附圖舉例闡述，其中

圖1顯示來自實施例1的聯合測定結果。通過結合鈣敏感的細胞滲透性染料 Fluo-4,來檢測鈣離子載體A23187刺激的來源於單個群體的U20S細胞引起的細胞質中 胞內鈣的增加。用IN Cell 1000分析儀光學成像系統測量螢光發射(入發射=535nm)，用 IOx物鏡、505光通過二色性475/535濾光器裝置及200毫秒曝光來成像。圖2為免疫細胞化學分析圖像，其顯示根據實施例4來源於單個群體的A23187 刺激的U20S細胞的細胞相關分泌性人IL-6。在IN CelllOOO分析儀上測量螢光。圖3顯示來自U20S細胞的鈣離子載體刺激的IL-6的產生，這表明根據實施例 3細胞相關的IL-6從培養中的A23187刺激的單U20S細胞群分泌。讓細胞與檢測試劑 (鈣離子載體A23187)接觸4小時，在用檢測試劑刺激細胞後測量細胞相關IL-6。刺激後潷出細胞上清液，在與抗IL-6抗體孵育前，用PBS徹底洗滌細胞3次。在添加化學 發光底物前，用PBS徹底洗滌細胞3次。在獲得IL-6結果之前用相同的細胞群獲得鈣 瞬變結果。與圖1所示結果聯合獲得數據。用LEADseeker多模態成像系統曝光20秒獲 得結果(圖3)，其使用化學發光底物和發光信號報告分子(用辣根過氧化物酶標記的抗 IL-6)。圖4顯示實施例2的聯合測定的結果。通過結合鈣敏感的細胞滲透性染料 Fluo-4,來檢測用組氨酸刺激的來源於單個群體的U20S細胞引起的細胞質中胞內鈣的增 加。用IN Cell 1000分析儀測量螢光發射(λ S|i= 535nm)，用IOx物鏡、505光通過二 色性475/535濾光器裝置及200毫秒曝光來成像。圖5顯示根據實施例3來源於單個群體的人U20S細胞產生組氨酸刺激的IL-6。 讓細胞與組氨酸檢測試劑過夜接觸，在刺激細胞後測量細胞相關IL-6。用LEADseeker多 模態成像系統曝光20秒獲得結果，其使用化學發光底物和發光信號報告分子(用辣根過 氧化物酶標記的抗IL-6)。圖6顯示已知量的重組IL-6的標定曲線，其用已知量的重組IL-6(0.48_1500pg/ ml)用實施例3的化學發光測定(R&D Systems,目錄代碼Q6000B)來製作。在 LEADseeker多模態成像系統中測量結果。圖7顯示來自鈣離子載體A23187刺激的培養中生長的人U20S細胞的鈣瞬變， 其聯合實施例4的IL-6測量數據獲得。在IN Cell 1000分析儀上實施圖像分析，用IOx 物鏡、505光通過二色性475/535濾光器裝置及200毫秒曝光來成像。螢光測量顯示與無 刺激的對照(0離子載體)相比，細胞內鈣增加。圖8顯示來自A23187刺激的U20S細胞的細胞內鈣和細胞相關IL_6之間的關 系，細胞內鈣和細胞相關分子二者都顯示隨著離子載體A23187濃度的增加而劑量依賴性 增加。細胞來源於單個群體。用INCell 1000分析儀按照實施例4獲得結果。圖9顯示來自A23187刺激的來源於單個群體的U20S細胞的細胞內鈣和細胞相 關IL-6之間的關係。數據顯示當細胞僅與檢測試劑接觸時細胞內鈣和細胞相關IL-6增 加。無刺激(對照)的細胞顯示在細胞內鈣和細胞相關IL-6之間沒有相關性。用INCell 1000分析儀按照實施例4獲得結果。圖10顯示來自A23187刺激的來源於單個群體的人U20S細胞的細胞內鈣和細胞 相關IL-6之間的良好的相關性(相關係數> 0.99)。用IN Cell 1000分析儀按照實施例4
獲得結果。圖11顯示來自EGFP易位和PDGF測量(細胞相關分子)的聯合測定的 EGFP-NFATIc 易位。圖12顯示從EGFP-NFATlc轉染的U20S細胞釋放的洛諾黴素(ionomycin)刺激 的PDGF，其與EGFP-NFATlc易位聯合。圖13顯示細胞內NFATlc易位和細胞相關PDGF之間的相關性，所述細胞相關 PDGF來自洛諾黴素刺激的EGFP-NFATlc轉染的來源於單個群體的U20S細胞。圖14顯示在用洛諾黴素+PMA刺激轉染的細胞時的EGFP-NFATlc易位，其用
成像系統測量。圖15顯示與EGFP-NFATlc易位聯合獲得的從EGFP-NFATlc轉染的U20S細胞中釋放洛諾黴素+PMA刺激的TNF α。圖16顯示細胞內NFATlc易位和細胞相關人TNF α的相關性，所述細胞相關人 TNF α來自洛諾黴素+PMA刺激的EGFP-NFATlc轉染的U20S細胞。發明詳述
實施例1.在離子載體A23187刺激的U20S細胞中測量鈣瞬變1.1 材料鈣流緩衝液(calciumflux buffer) (5mM KCl，含有 ImM MgS04、IOOmM HEPES> IOmM D-葡萄糖、145mM NaCl 和 ImM CaC12，pH7.4)。Fluo-4 (InVitrogen)Hoescht 33342 (InVitrogen)7.5% 白蛋白(Sigma)鈣離子載體A23187 (Sigma)U20S 細胞(歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of CellCultures)， Porton Down, UK)1.2方法和結果i)以6000個細胞/孔將U20S細胞接種到96孔Greiner聚簇板(cluster plate)， 於100 μ 1完全McKoys培養基中，並在37°C、5% CO2中孵育過夜。ii)用42.8ml鈣流緩衝液與6.65ml的7.5%白蛋白製備加樣緩衝液。將該緩衝液 保存在37 °C。iii)用118.16ml鈣流緩衝液和1840ul的7.5%白蛋白製備120ml維持緩衝液。iv)將5mg鈣離子載體A23187溶解在Iml的DMSO中。隨後用完全維持緩衝 液稀釋離子載體，以獲得在1.56-100 μ M範圍內的離子載體終濃度。通過將456μ1的 DMSO加到50 μ g小瓶中來製備Fluo-4染料，充分混合小瓶以提供100 μ M濃度的Fluo_4 儲液。將100 μ 1的100 μ M Fluo-4染料和6 μ 1的16mM Hoescht細胞核染料加到9.894ml 加樣緩衝液中。從細胞培養板中去除培養基，加入100 μ 1/孔的經溫熱的完全加樣緩衝 液。讓板在37°C、5% CO2中孵育40分鐘。孵育後去除加樣緩衝液，加入150 μ 1/孔 的維持緩衝液。將板轉移到IN Cell 1000分析儀(Kinetic Module)上，使用IOx物鏡、 505光通過二色性475/535濾光器裝置(Fluo_4)、200毫秒曝光、360/460濾光器裝置 (Hoescht)、300毫秒曝光。在以下時間後每五秒獲取一次圖像0秒、5-60秒。20秒 後分配(dispense)離子載體，繼續採集圖像。用目標強度算法(object intensity algorithm) (INCell Investigator 軟體)分析結果。ν)圖1顯示來自用鈣離子載體Α23187 (1.56-100 μ Μ)刺激在培養中生長的U20S 細胞後細胞內鈣濃度的聯合測定的結果。圖3顯示細胞相關IL-6的增加。數據顯示用 鈣離子載體刺激時細胞響應為細胞質胞內鈣增加，其如由細胞滲透性染料Fluo-4U = 535nm)發射的螢光的增加所顯示。圖1顯示細胞內鈣經八分鐘增加，表明細胞內鈣水平 峰值和下降的時間變化。細胞內事件的變化也取決於測定中採用的鈣離子載體的劑量。2.組氨酸刺激的U20S細胞中鈣瞬變的測量
2.1 材料鈣流緩衝液(5mMKCl，含有lmMMgS04、IOOmM HEPES> IOmMD-葡萄糖、 145mM NaCl 和 ImM CaCl2, pH 7.4)。Fluo-4 丐螢光(calcium fluor) (InVitrogen)Hoesch 33342 DNA 染色液(InVitrogen)7.5% 白蛋白(Sigma)組氨酸(Sigma)U20S細胞(歐洲細胞培養物保藏中心，Porton Down, UK)2.2方法和結果i)以6000個細胞/孔將U20S細胞接種到96孔Greiner聚簇板，於100 μ 1完全 McKoys培養基中，並在37°C、5% CO2中孵育過夜。ii)用42.8ml鈣流緩衝液與6.65ml的7.5%白蛋白製備加樣緩衝液。將該緩衝液 保存在37 °C。iii)用118.16ml鈣流緩衝液和1840 μ 1的7.5%白蛋白製備120ml維持緩衝液。iv)稱取25.3mg組氨酸，並將其溶解在Iml經溫熱的維持緩衝液中。隨後用 完全維持緩衝液稀釋組氨酸，以獲得在1.56-100 μ M範圍內的組氨酸終濃度。通過將 456 μ 1的DMSO加到50 μ g小瓶中來製備Fluo_4染料，充分混合小瓶以提供100 μ M濃 度的Fluo-4儲液。將100 μ 1的100 μ M Fluo_4染料和6 μ 1的16mM Hoescht細胞核染料 加到9.894ml加樣緩衝液中。從細胞培養板中去除培養基，加入100 μ 1/孔的經溫熱的完 全加樣緩衝液。讓板在37°C、5% CO2中孵育40分鐘。孵育後去除加樣緩衝液，加入 150 μ 1/孔的維持緩衝液。將板轉移到IN Cell 1000分析儀(Kinetic Module)上，使用IOx 物鏡、505光通過二色性475/535濾光器裝置(Fluo-4) 200毫秒曝光、360/460濾光器裝置 (Hoescht)，300毫秒曝光。在以下時間後每五秒獲取一次圖像0秒、5-60秒。20秒 後分配組氨酸，繼續採集圖像。用目標強度算法(IN Cell Investigator軟體)分析結果。ν)圖4顯示來自用組氨酸(1.56-100μΜ)刺激在培養中生長的U20S細胞後細胞 內鈣濃度聯合測定的結果。圖5顯示細胞相關IL-6的增加。數據顯示用組氨酸檢測試劑 刺激時細胞群響應為細胞質胞內鈣增加，其如由細胞滲透性染料Fluo-4 (λ S|i= 535nm) 發射的螢光的增加所顯示。圖4顯示細胞內鈣經八分鐘升高，亦表明細胞內鈣水平峰值 和下降的時間變化。細胞內事件的變化也取決於測定中採用的組氨酸檢測試劑的劑量。3.在測量鈣瞬變後對來自組氨酸或鈣離子載體A23187刺激的U20S細胞的人白 細胞介素_6的聯合測定3.1 材料抗人IL-6 抗體(R&D SYSTEM, SQ6000B)發光底物(R&DSYSTEM，SQ6000B)鈣離子載體A23187 (Sigma)組氨酸(Sigma)U20S細胞(歐洲細胞培養物保藏中心，Porton Down，UK)3.2方法和結果i)以6000個細胞/孔將U20S細胞接種到96孔Greiner聚簇板，於100 μ 1完全McKoys培養基中，並在37°C、5% CO2中孵育過夜。 )用A23187或組氨酸刺激細胞(參見以上實施例1和2)，並測量鈣瞬變(見圖 1和4)。用離子載體或組氨酸刺激後，潷出細胞上清液，用PBS徹底洗滌細胞3次，然 後與抗IL-6抗體孵育。在加入化學發光底物之前，用PBS洗滌細胞3次。在獲得IL-6 結果之前用同一單細胞群獲得鈣瞬變的結果。iii)聯合圖1和4所示的結果獲得IL-6數據。在LEADseeker多模態成像系統中 用化學發光底物和發光信號報告分子(用辣根過氧化物酶標記的抗IL-6)曝光20秒獲得 結果(表1和圖3為離子載體剌激；圖5為組氨酸刺激)。iv)用已知量的重組IL-6作為標準的標定曲線結果如表2和圖6所示，其使得可 準確測量細胞相關的IL-6。結果(表2和圖6)顯示隨著IL-6濃度增加化學發光信號增 加。從LEADseeker多模態成像系統中獲得這些數據。表1來自培奍中經刺激的U20S的白細朐介素-6樣品測量結果
權利要求
1.用於在單個活細胞群中測量至少一種細胞內事件及細胞相關分析物的方法，其中 所述至少一種細胞內事件和所述細胞相關分析物是在所述細胞中運行的協同生物化學過 程的各個組分，所述方法包括以下步驟a)提供含有單個活細胞群的樣品；b)讓所述單個細胞群中的至少一個活細胞與引起或懷疑引起所述至少一個細胞產生 細胞相關分析物的檢測試劑接觸；c)在所述至少一個細胞中測量物理性質的變化，作為至少一種細胞內事件的度量；d)洗滌所述細胞以去除細胞外液體；e)測量所述細胞相關分析物的存在、含量或活性；和f)將所述至少一個細胞中的所述至少一種細胞內事件的變化與所述細胞相關分析物 的存在、含量或活性相聯繫。
2.權利要求1的方法，其中在步驟a)中所述細胞群體的每一個細胞包含第一報告基 因構建體，所述報告基因構建體包含編碼第一可檢測報告分子的核酸序列，所述核酸序 列與表達控制元件可操作地連接並在其控制下；其中所述接觸步驟b)在允許所述第一報 告基因構建體表達的條件下進行。
3.權利要求2的方法，其中所述第一報基因構建體包含編碼螢光蛋白的核酸序列。
4.權利要求3的方法，其中所述螢光蛋白為綠色螢光蛋白(GFP)或GFP功能類似物。
5.權利要求2的方法，其中所述第一報告基因構建體包含編碼酶的核酸序列。
6.權利要求5的方法，其中所述酶選自螢光素酶、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶和硝 基還原酶。
7.權利要求1的方法，其中所述細胞內事件為離子濃度增加和/或基因表達增加。
8.權利要求1的方法，其中在步驟C)中通過細胞發出的螢光變化來測量所述至少一 種細胞內事件。
9.權利要求1的方法，其中在步驟C)中通過光學成像方法來測量所述至少一種細胞 內事件。
10.權利要求1的方法，其中通過免疫化學方法測量所述細胞相關分析物的存在、含量或活性。
11.權利要求1的方法，其中通過光學成像方法來測量所述細胞相關分析物的存在、 含量或活性。
12.權利要求1-12中任一項的細胞，其中所述細胞群由真核細胞組成。
13.權利要求12的細胞，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中所述檢測試劑為選自以下的化學實體藥 品、食用色素、激素、毒素、烷化試劑、氧化劑和致癌物質。
15.權利要求1-13中任一項的方法，其中所述檢測試劑為選自以下的物理因子電 磁輻射(例如UV、X-射線、微波)、β-輻射和熱。
16.權利要求1的方法，所述方法進一步包括a)在所述檢測試劑存在下實施權利要求1-15中任一項的方法；和b)將所述至少一種細胞內事件的變化及所述細胞相關分析物的存在、含量或活性的變化，與不存在檢測試劑時所述至少一種細胞內事件及所述細胞相關分析物的存在、含 量或活性中的每一種的對照值進行比較。
17.權利要求16的方法，其中所述對照值以電子形式存儲在資料庫或其它電子格式中。
全文摘要
本發明公開了用於採用成像儀器進行化合物篩選的基於細胞的多元測定的方法。本文所述方法提供關於檢測試劑的生物效價、脫靶效應和潛在候選藥物的細胞毒性等的高容量的信息。
文檔編號G01N33/50GK102016580SQ200980110787
公開日2011年4月13日 申請日期2009年1月15日 優先權日2008年1月18日
發明者J·K·霍爾頓 申請人:通用電氣醫療集團英國有限公司