一株惡臭假單胞菌及其轉化生產煙酸或異煙酸方法
2023-12-05 15:17:21 2
專利名稱：一株惡臭假單胞菌及其轉化生產煙酸或異煙酸方法
技術領域：
本發明屬於生物催化技術領域，涉及一株惡臭假單胞菌CGMCC3830 (I^eudomonas putida)及用該菌株轉化3-氰基吡啶製備煙酸和轉化4-氰基吡啶製備異煙酸的方法。
背景技術：
煙酸，又稱為3-吡啶甲酸，是人體必需的13種維生素之一，人和動物缺乏煙酸所表現的症狀主要為癩皮病症狀，故煙酸又稱為抗癩皮病維生素。煙酸在醫學上主要用於合成煙酸片用於防治糙皮病。現煙酸也用於糧食製品，肉品添加劑和飼料添加劑以預防糙皮病。特別是飼料中添加煙酸後可提高畜禽的抗病能力，加快生長速度，提高飼料的利用率， 可大量節省飼料，降低飼養成本。美國曾餵養添加煙酸飼料的奶牛與對照組相比，產奶量可提高15% -20%。煙酸在醫學上還可作為醫藥中間體用於合成治療各種高血壓症和冠心病等的藥物。另外煙酸還可作為形成活性汙泥的生化激素、空氣和廢氣的除臭劑。煙酸在染料工業、感光材料工業、染髮助劑、洗滌劑等方面也有一定的應用。異煙酸，又稱為4-吡啶甲酸，是一種重要的醫藥中間體，主要用於製備一線治療結核病的藥物異煙胼(雷米封)，異煙胼對結核桿菌有良好的抗菌作用，用量小，毒性相對較低，可用於治療各個時期的肺結核，也可用於結核性腦膜炎和其他肺結核等。異煙酸也可用於合成特非那丁和異煙腺、丙硫煙胺、異煙醯腙等衍生藥物。在農業上，異煙酸作為合成植物生長調節劑抗倒胺的前體物質。異煙酸在工業上也可作為抗腐蝕劑、電鍍添加劑、感光樹脂穩定劑、聚氯乙烯熱穩定劑和有色金屬浮選藥劑等，應用領域十分廣泛。煙酸的生產目前工業上應用的主要為化學法，所用原料為3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。從合成方法看，一般分為試劑氧化法、氨氧化法、 氣相氧化法、電解氧化法、生物氧化法和吡啶羥基化法等。目前最常用的方法是以3-甲基吡啶為原料空氣氧化法合成煙酸。將3-甲基吡啶、空氣和氨氣按比例通入流化床反應器中，在290 360°C、V2O5催化下反應生成煙腈；再於氫氧化鈉水溶液中、160°C下高壓水解生成煙酸鈉，最後用鹽酸酸化得煙酸。在這個合成過程中需要經過煙腈這一部中間產物，煙腈水解為煙酸需要高溫高壓、強酸強鹼，對設備具有一定的要求而且也會腐蝕設備，且對環境也不友好。清華紫光公司的專利CN114288A報導了用3-甲基吡啶一步催化生成煙酸，其過程為將3-甲基吡啶與硫酸反應生成甲基吡啶硫酸鹽，然後在氧化劑硝酸的作用下氧化生成煙酸硫酸鹽，煙酸硫酸鹽加入鹼溶液中和製得煙酸，原料收率為90%左右。此過程中需要硫酸、硝酸、鹼溶液等強酸強鹼物質，汙染嚴重。異煙酸的生產目前工業上是用化學法合成。合成異煙酸的主要原料有4-甲基吡唆、4-氰基吡唆、聚4-吡卩定乙烯、4-羥甲基吡唆、4-醛基吡卩定等。合成方法有高錳酸鍾氧化法、硝酸氧化法、氨氧化水解法等。其中氨氧化水解法是在工業上普遍應用的方法。氨氧化-水解法主要是以4-甲基吡啶為原料，在以五氧化二釩為主的催化劑作用下，與氨和空氣的混合物進行高溫氧化，生成4-氰基吡啶，然後4-氰基吡啶在鹼性條件下高溫高壓水解得到酸。該工藝過程方法存在反應時間長、需高溫高壓、產品收率較低、產品回收純化工藝較複雜、對環境汙染等缺點。在工業也可以通過以4-甲基吡啶一步氧化成異煙酸。由於 4-基吡啶α碳上的氫受芳環的影響變化比較活潑，容易被氧化，因此氧化4-甲基吡啶製備異煙酸的方法也是目前工業上常用的方法。但是4-甲基吡啶的甲基不僅可氧化成羧基，還可氧化成羥甲基、醛基甚至深度氧化成二氧化碳，而且吡啶環上的氮原子也易被氧化成氮氧化物，目標產物的選擇性低。浙江大學呂秀陽專利CN101463004A報導了近臨界水介質中異煙腈無催化水解製備異煙酸的方法，其過程為在高壓反應釜中加入去離子水和4-氰基吡啶，常壓下升溫至沸騰排氣，然後關閉排氣閥，繼續升溫至200-300°C水解30-600min得到異煙酸，收效為73% -90.4%。此過程中無需催化劑，但需要高溫，此過程尚處於研究階段。在煙酸、異煙酸化學合成過程中，都必須具備特定的高溫高壓環境或者採用強酸、 強鹼或化學催化劑處理，反應選擇性不高，副產物多，產品的收率不高，環境汙染大。相對而言，生物催化法具有底物選擇性高、催化效率高、反應條件溫和、環境汙染小等特點。此外， 生物催化劑的製備易放大，成本低，適合於大規模工業化生產應用。目前所報導能用於生物催化3-氰基吡啶製備煙酸的菌株有枯草芽孢桿菌、玫瑰色紅球菌、諾卡氏菌、茄病鐮刀菌， 催化4-氰基吡啶轉化為異煙酸的菌株有茄病鐮刀菌和黑麴黴，但無報導惡臭假單胞菌應用於產煙酸和異煙酸。
發明內容
本發明的目的在於克服上述不足之處，提供一株新的菌株惡臭假單胞菌惡臭假單胞菌CGMCC3830 O^seudomonas putida)以及在一定條件下應用惡臭假單胞菌 CGMCC3830 (Pseudomonas putida)全細胞催化3_氰基吡啶製備煙酸和催化4-氰基吡啶得到異煙酸。本發明所述的一株高效催化3-氰基吡啶產煙酸和高效催化4-氰基吡啶產異煙酸的菌株，該菌株分類命名為惡臭假單胞菌O^eudomonas putida)，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號， 保藏編號為CGMCC NO. 3830，保藏日期2010年5月11日。本發明所提供的菌株通過以下方法篩選獲得採集腈類化合物生產廠房周圍5-15cm處的土樣。取Ig 土樣放入三角瓶中，加入 15ml生理鹽水，加入玻璃珠，放在搖床上振蕩30min。取0. 2ml 土壤懸液，塗布於以3-氰基吡啶為唯一氮源固體篩選培養基，固體篩選培養基的組成為葡萄糖0. 5% -2%、磷酸二氫鉀 0. 01-0. 1%、硫酸鎂0. 005-0. 02%、硫酸亞鐵 0. 001-0. 005%、氯化鈣 0. 001-0. 005%、氯化鈉0. 05-0. 5%、3_氰基吡啶0. 05% -0. 2%、瓊脂2%、pH 7.0。30°C培養3天，挑取不同菌的菌落繼續劃線分離至單菌落。挑取20株純化好的菌株轉接至液體培養基中進行培養復篩。液體篩選培養基的組成為蛋白腖0. 5 % -1 %，酵母粉0. 25 % -0. 75， NaClO. 1_1%，ρΗ7. 0。搖床轉速120rpm，30°C培養3天。培養結束後，取該培養液IOOOOrpm離心IOmin收集菌體用於轉化3-氰基吡啶，用高效液相色譜法檢測反應體系中煙酸濃度，最終篩選得到得到產量最高的一株菌株即惡臭假單胞菌CGMCC3830 (Pseudomonas putida)。本發明所提供的惡臭假單胞菌CGMCCSSSOa^eudomonas putida)具有以下分類學特徵菌落呈圓形，乳黃色，表面溼潤，光滑，有光澤，粘稠，中央隆起，邊緣整齊並呈半透明狀，不產生水溶性色素。經顯微鏡觀察，菌體形態較小，呈短杆狀，經透射鏡觀察具端生鞭毛。革蘭氏染色呈陰性，有螢光，氧化型，過氧化氫酶試驗陽性、VP試驗陰性、MR試驗陰性、 吲哚試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陽性、明膠液化試驗陰性、澱粉水解試驗陰性、硝酸鹽還原試驗陰性、精氨酸雙水解試驗陽性。結合形態和生理生化特徵，確定該菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。本發明採用的技術方案是一種微生物催化水解3-氰基吡啶、4-氰基吡啶產分別產煙酸、異煙酸的方法，所述方法包括以3-氰基吡啶、4-氰基吡啶為底物，以發酵培養獲得的含高腈水解酶活性的惡臭假單胞菌 CGMCC3830 (Pseudomonas putida)細胞作為催化劑，於 pH6. 0-10. 0,0. I-IL 的磷酸鹽緩衝體系中，10-40°C下進行水解反應，通過流加的方式添加底物，反應一段時間後得到所述的煙酸、異煙酸。惡臭假單胞菌CGMCC3830 (I^eudomonas putida)可發酵產腈水解酶，腈水解酶可水解3-氰基吡啶、4-氰基吡啶的氰基為羧基，從而得到煙酸和異煙酸。含酶細胞由如下方法製備得到惡臭假單胞菌CGMCC3830 O^seudomonas putida) 由種子培養基中接種至發酵培養基，在25-35°C培養M-4 !，培養得到的發酵液經離心洗滌，得到所述含酶細胞。本發明中，所述適用於惡臭假單胞菌CGMCCSSSOO^eudomonas putida)的發酵培養基組成如下甘油0.5% _2%，胰蛋白腖0.5% _2%，酵母膏0. 25% _1%，磷酸二氫鉀
0.05% -2%，氯化鈉 0. 1% -1%，尿素 0. 5% -2%, pH 5. 6-8. 4。若沒有特別說明，本發明中百分比濃度均是質量百分比濃度(W/V)，某組分百分比濃度為是指IOOmL溶液中含有該組分lg。發酵培養可在搖瓶中進行，也可在發酵罐中進行。發酵培養可採用培養方式有搖床培養、通氣攪拌培養。搖瓶培養在三角瓶中裝入適量的發酵培養基，將菌體從種子培養基中接種至發酵培養基中，25-35°C，旋轉式搖床(100-220rpm)培養對-4他，得到含腈水解酶的菌體發酵液。發酵罐培養在5-10L的發酵罐中裝入適量的發酵培養基，將菌體從種子培養基中接種至發酵培養基中，通氣量0. 5-3mL/min,控制pH在6. 5-7. 0，攪拌速度100_600rpm， 25-35°C，經過Μ-4 !培養獲得含腈水解酶的菌體發酵液。將發酵液IOOOOrpm離心IOmin收集菌體，菌體用磷酸鹽緩衝液洗滌兩次後，菌體用磷酸鹽緩衝液(PH6-10)重懸。酶活的定義在反應條件下，IOmin轉化3-氰基吡啶/4-氰基吡啶生成1 μ M煙酸 /異煙酸所需的酶量定義為一個酶活單位。3-氰基吡啶、4-氰基吡啶的生物催化反應在ΡΗ6-10磷酸鹽緩衝液介質中加入生物催化劑，初始加入底物3-氰基吡啶或4-氰基吡啶0. 05Μ-0. 2Μ進行反應，間隙補加底物，反應溫度25-35°C之間，攪拌速度控制在50-300rpm之間，總加入底物濃度控制在
1.2M-1. 8M。
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具體應用過程如下(1)惡臭假單胞菌 CGMCC3830 (Pseudomonas putida)接種至種子培養基，30°C、 120rpm下培養Mh，得到種子液；所述種子培養基組成如下蛋白腖0. 5%，酵母粉0. 5%， NaClO. 5%, pH7. O。(2)發酵培養基以體積比接種量接種至發酵培養基，30°C下培養M-4 !， 得到發酵液。所述發酵培養基組成如下甘油0. 5% -2%，胰蛋白腖0. 5% -2%，酵母膏 0. 25% _1%，磷酸二氫鉀 0. 05% -2%，氯化鈉 0. 1% _1%，尿素 0. 5% -2%,pH 5. 6-8. 4。(3)取發酵液，高速離心得到的菌體細胞用磷酸鹽緩衝液洗滌2次，再用磷酸緩衝液重懸細胞，取細胞液以磷酸鹽緩衝液稀釋細胞至0. 5-5g/L (細胞乾重)，加入3-氰基吡啶或4-氰基吡啶0. 05M-0. 2M，於10-40°C，50-300rpm下進行反應，待底物濃度低於0. OlM 時，補底物至0. 05M-0. 2M，水解反應結束後，於水解液中得到所述煙酸或異煙酸。本發明中產物的分析測定方法取2ml反應液，加入200 μ 1 2Μ HCl終止反應，用0. 45 μ m濾膜過濾後，進行HPLC 分析檢測，色譜柱=Atlantis dC18色譜柱，5 μ m，4. 5 X 150mm ；流動相乙腈0. 025 %磷酸水溶液(60 40，V/V)；流速0. 7mL/min ；檢測波長 268nm ；柱溫 30°C。本發明的優點和有益效果是在自然界中篩選得到能夠催化3-氰基吡唆、4-氰基吡啶為煙酸、異煙酸的菌株，經鑑定為惡臭假單胞菌O^eudomonas putida)。在優化發酵條件下製備高催化活性高生物量的惡臭假單胞菌游離細胞。通過底物流加的方式，用游離的惡臭假單胞菌連續催化3-氰基吡啶能得到147-209g/L的煙酸，連續催化4-氰基吡啶能得到172-221g/L的異煙酸，轉化效率接近100%。這是首次報導用惡臭假單胞菌作為生物催化劑催化產煙酸和異煙酸。該菌株具有生長周期短，轉化效率高，轉化周期短等特點，大大降低了煙酸、異煙酸的生產成本，特別適合煙酸、異煙酸的大規模生產；本工藝還具有反應條件溫和，產率高，對環境友好等特點。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進一步描述實施例1 惡臭假單胞菌CGMCC3830 G^seudomonas putida)的分離鑑定(1)惡臭假單胞菌CGMCC383O (Pseudomonas putida)的富集篩選過程。採集腈類化合物生產廠房周圍5-15cm處的土樣。取Ig 土樣放入三角瓶中，加入 15ml生理鹽水，加入玻璃珠，放在搖床上振蕩30min。取0. 2mL 土壤懸液，塗布於以3-氰基吡啶為唯一氮源固體篩選培養基，固體篩選培養基的組成為葡萄糖0. 5%、磷酸二氫鉀0. 1 %、硫酸鎂0. 01 %、硫酸亞鐵0. 002 %、氯化鈣0. 002 %、氯化鈉0. 1 %、3_氰基吡啶 0. 1%、瓊脂2%、pH 7.0。30°C培養3d，挑取不同菌的菌落繼續劃線分離至單菌落。挑取20株純化好的菌株轉接至液體培養基中進行培養復篩。液體篩選培養基的組成為蛋白腖0. 5%，酵母粉0. 5%,NaClO. 5%，pH7. 0搖床轉速120rpm，30°C培養3d。培養結束後，取該培養液IOOOOrpm離心lOmin，收集菌體用於轉化3-氰基吡啶，用高效液相色譜法檢測反應體系中煙酸濃度。得到產量最高的一株菌。(2)惡臭假單胞菌CGMCC3830 O^seudomonas putida)的形態和生理生化特徵P. putida CGMCC3830在LB培養基上菌落呈圓形，乳黃色，表面溼潤，光滑，有光澤，粘稠，中央隆起，邊緣整齊並呈半透明狀，不產生水溶性色素。經顯微鏡觀察，菌很小，呈短杆狀，經透射鏡觀察端生鞭毛。革蘭氏染色呈陰性，在KB培養基上培養至長出菌落後在紫外光照射下觀察到有螢光，葡萄糖氧化實驗中發現其為氧化型，過氧化氫酶試驗陽性、VP 試驗陰性、MR試驗陰性、吲哚試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陽性、明膠液化試驗陰性、澱粉水解試驗陰性、硝酸鹽還原試驗陰性、精氨酸雙水解試驗陽性。根據伯傑細菌手冊，對照生理生化特徵確定該菌的種屬為惡臭假單胞菌。實施例2 惡臭假單胞菌CGMCC3830 O^seudomonas putida)的搖瓶發酵培養分別配製搖瓶發酵培養基A 葡萄糖1%、大豆蛋白腖0. 5%、酵母粉0. 3%、麥芽提取物0. 3%、NaC15%, ρΗ7· 2。B:甘油 1%、胰蛋白腖1%、酵母粉0.5%、恥(10.5%，？!17.2。C:甘油 1%、胰蛋白腖 1%、酵母粉 0. 5%、NaC10. 1%, KH2PO4IO. 1%, pH7. 2 D 甘油 1%、胰蛋白腖 1%、酵母粉 0· 5、NaCl 0. 1 %、KH2PO4IO. 1 %、尿素 1 %， ρΗ6· 0。分別將配置以上培養基進行分裝，每種各三個平行，121°C滅菌20min。將惡臭假單胞菌CGMCC3830 (Pseudomonas putida)接種到各發酵培養基中，30°C、120rpm下培養， 3 結束髮酵。發酵結束後IOOOOrpm離心IOmin收集菌體，菌體用磷酸鹽洗滌兩次。IOml 反應體系中細胞0. 5g/L、3-氰基吡啶50mM、磷酸鹽緩衝液0. 1Μ(ρΗ7. 2)，在30°C搖床反應 lOmin，加入lml2MHCl終止反應，通過HPLC測定反應液中的產物，計算出酶活，得到的結果見表1。表1搖瓶發酵菌體酶活
權利要求
1.一株新菌株惡臭假單胞菌CGMCC3830 O3SeudomonaS putida)及應用該菌株催化生產煙酸、異煙酸的方法。其特徵在於所述的惡臭假單胞菌，是從土壤中篩選獲得的一株可高效轉化3-氰基吡啶為煙酸的菌株；所述的方法，是以3-氰基吡啶、4-氰基吡啶為底物， 以發酵培養獲得的具有高腈水解酶活性的惡臭假單胞菌CGMCC3830 (Pseudomonas putida) 為生物催化劑，於PH6. 0-10. O、10-40°C下進行水解反應，得到所述產物煙酸、異煙酸。
2.根據權利要求1所述的惡臭假單胞菌CGMCC3830O^seudomonas putida)用3-氰基吡啶為唯一氮源的篩選培養基從生產腈類化合物的化工廠廠房周圍的土壤樣品篩選獲得。
3.根據權利要求2所述的一株含有腈水解酶高效轉化3-氰基吡啶產煙酸菌株，為惡臭假單胞菌CGMCC3830 (Pseudomonas putida)，現保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3830，保藏日期2010年5月11日。
4.根據權利1所述的應用，其特徵在於所述的具體方法以3-氰基吡啶、4-氰基吡啶為原料，以發酵培養獲得的具有腈水解酶活性的惡臭假單胞菌CGMCC3830 0^eUdOmonas putida)游離細胞為生物催化劑，在pH6. 0-10.0,0. 1L-1L磷酸鹽緩衝體系中進行水解反應，反應溫度10_40°C。
5.根據權利4所述的方法，其特徵在於通過搖瓶發酵或發酵罐發酵獲得含腈水解酶的惡臭假單胞菌CGMCCSSSOO^eudomonas putida)細胞，所述的含酶細胞的添加量為 0. 5-5g/L (細胞乾重)。
6.根據權利4所述的方法，其特徵在於所述含酶細胞的製備方法惡臭假單胞菌 CGMCC3830 (Pseudomonas putida)由種子培養基中轉接至發酵培養基，在20-35 °C培養 Μ-4 !，培養得到的發酵液經離心洗滌，得到所述含酶細胞。
7.根據權利4所述的方法，其特徵適用於在於惡臭假單胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的發酵培養基組成如下甘油0.5% -2%，胰蛋白腖0.5% -2%，酵母膏 0. 25% _1%，磷酸二氫鉀 0. 05% -2%，氯化鈉 0. 1% _1%，尿素 0. 5% -2%, pH 5. 6-8. 4。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述反應體系中，3-氰基吡啶和4-氰基吡啶的起始濃度為0. 05M-0. 2M，當反應過程中底物濃度低於0. OlM時，繼續補入底物至濃度為0. 05M-0. 2M，於pH6. 0-10. 0、10_4(TC下進行水解反應6h_10h，水解反應結束後，於水解液中得到煙酸、異煙酸。
全文摘要
公開了一株新菌株惡臭假單胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)及應用該菌株催化生產煙酸、異煙酸的方法。本發明以3-氰基吡啶、4-氰基吡啶為原料，以發酵培養獲得的具有高腈水解酶活性的惡臭假單胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)為催化劑進行水解反應，得到產物煙酸、異煙酸。採用流加的方式加入底物於反應器中，反應6-10h，可得到147g/L-221g/L的煙酸或異煙酸。惡臭假單胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)具有生長周期短、生命力強、轉化效率高、轉化周期短等特點，能大大降低了煙酸、異煙酸的生產成本；本工藝具有反應條件溫和、能耗低、產率高、環境友好等特點。
文檔編號C12R1/40GK102337233SQ20111011623
公開日2012年2月1日 申請日期2011年5月6日 優先權日2011年5月6日
發明者史勁松, 朱小燕, 許正宏, 陸震鳴, 龔勁松 申請人:江南大學