適用於多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法

2023-12-03 01:40:46

適用於多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法
【專利摘要】本發明公開了適用於多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法，所述方法包括前處理、不定芽的誘導、繼代培養、不定芽的伸長、生根培養、煉苗和移栽步驟。在前處理過程中，所用植物生長調節劑為濃度為1-5mg/L的6-BA；在不定芽的誘導過程中，所用植物生長調節劑為6-BA和KT，6-BA的濃度為1-4mg/L，KT的濃度為0.1-1.0mg/L；在不定芽的伸長過程中，所用植物生長調節劑為6-BA和IBA，6-BA的濃度為1.0mg/L，IBA的濃度為0.1-0.3mg/L。本發明不僅適應於多基因型苦瓜的再生培養，而且具有誘導率高、不定芽誘導數目多、不定芽長以及實施條件不苛刻的優點，具有良好的推廣前景。
【專利說明】適用於多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及適用於多基因型的苦瓜高效再生體系的建立 方法。

【背景技術】
[0002] 苦瓜是我國南方地區一種重要的藥食兼用蔬菜，有"君子菜"的別稱。隨著其降血 糖、抗腫瘤、抗病毒、抗愛滋等功效的發現，苦瓜現已受到消費者的廣泛青睞，種植面積也在 逐年增加。由於對苦瓜需求的不斷增加，苦瓜的育種目標也趨向於多元化的發展。但是傳 統的遺傳育種存在種質資源匱乏，育種周期太長，後代表現出的遺傳性狀不穩定等不足，這 些都嚴重的制約了苦瓜優良品種的選育；而植物基因工程技術則為優質、高產、高抗的苦瓜 新品種的選育開闢了一條新的途徑。
[0003] 植物遺傳轉化即轉基因技術是近四十年來發展起來的一項生物技術，利用該技術 可以在保持植物原有較好遺傳背景的前提下定向改變某些性狀，且能大大縮短育種時間， 目前轉基因技術已成為植物遺傳育種的主要研究領域。然而轉基因技術極大的依賴於外植 體能夠高效穩定再生成完整植株的技術，建立高效穩定的遺傳轉化受體系統是轉基因育種 的基礎。而目前對苦瓜離體培養的研究較少，多是通過莖尖或帶芽莖段進行快速繁殖獲得 再生植株，也有學者利用苦瓜的子葉和胚軸等外植體進行離體培養並獲得再生植株，但是 總的看來苦瓜外植體在離體培養過程易於形成愈傷組織而不定芽再生困難，不定芽誘導率 和不定芽長度都不理想；另外就是苦瓜再生能力存在基因型依賴性，不同基因型之間再生 能力存在顯著差異，至今還沒有建立一個適合多個基因型的苦瓜再生體系。因此，系統深 入研究離體培養誘導苦瓜植株再生的方法，建立針對多個基因型苦瓜的高效穩定的再生體 系，具有重要意義，可為苦瓜轉基因育種工作提供理論基礎和實驗依據，同時將有效推進苦 瓜生物技術育種進程。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種適用於多基因型的苦瓜高效再 生體系的建立方法。構建方法包括以下步驟： 1) 前處理：將苦瓜種子剝去種皮後進行滅菌，然後放入含6-BA的MS培養基進行培養， 培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的 濃度為l_5mg/L ; 2) 不定芽的誘導：切取帶一個子葉的子葉節，然後放入含6-BA和KT的MS培養基進 行培養，培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 6-BA 的濃度為 2-4mg/L，KT 的濃度為 0? 1-L Omg/L ; 3) 繼代培養：將步驟2)所得物的不定芽的腋芽切下，棄掉，然後將剩餘物接種於含 6-BA和KT的MS培養基進行培養，培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為2-4mg/L，KT的濃度為0. 1-1. Omg/L ; 4) 不定芽的伸長：將步驟3)所得物放入含6-BA和IBA的MS培養基進行培養，培養時 間為14天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為 1. Omg/L，IBA 的濃度為 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培養：將步驟4)所得物的不定芽切下，接種在含生根培養基的培養瓶中培養， 培養時間為14天，培養溫度為保持在23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 所述生根培養基為1/2 MS培養基添加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5. 8 ; 6) 煉苗：選取經步驟5)培養後的根長為4-5 cm的健壯小苗，將培養瓶的蓋子先擰松 放置2天，再半開2天，然後再全開2 d，半開和全開蓋子期間需要不斷補充水分； 7)移栽：將煉苗完成後的植株拔起，用水洗淨根部培養基，移栽到裝有泥炭土、珍珠 巖、草木灰和腐葉土基質的營養缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置於人工氣候箱中保溼培 養2 d，1-2周後再移到室外進行培養。
[0005] 所述的滅菌過程為：剝去苦瓜種子的種皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用 0. 1%升萊浸泡消毒5min,最後用無菌水衝洗5次。
[0006] 在切取帶一個子葉的子葉節時，節點距上胚軸1 mm,距下胚軸5 mm。
[0007] 所述營養缽中泥炭土、珍珠巖、草木灰和腐葉土基質的質量比為1:1:1:1。
[0008] 優選的，步驟1)中的MS培養基中6-BA的濃度為4mg/L。當步驟1)中的6-BA的濃 度為4mg/L時，不定芽的誘導率為98. 37%，不定芽數量、不定芽長度、主芽數量、主芽長度、 叢芽數量和叢芽長度的情況均為最優。
[0009] 優選的，步驟2)中的6-BA的濃度為3. Omg/L，KT的濃度為0. 5mg/L，當6-BA濃度 為3. Omg/L，KT濃度為0. 5 mg/L時，不定芽數量和不定芽芽長的綜合情況最優。
[0010] 優選的，步驟4)中的MS培養基中，6-BA的濃度為1. Omg/L，IBA的濃度為0. 2mg/ L。當6-BA的濃度為1. Omg/L，IBA的濃度為0. 2mg/L時，對不定芽長度和主芽長度誘導效 果最好。
[0011] 本發明具有如下有益效果： 1、 適用於多個基因型，有較大推廣前景； 2、 不定芽誘導率高，不定芽誘導數多，生長良好的不定芽有利於之後遺傳轉化體系的 建立； 3、 實施步驟簡單，實施條件不苛刻。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 :帶一個子葉的子葉節； 圖2 :不定芽誘導情況； 圖3 :不定芽生根情況； 圖4 :再生植株生長情況。

【具體實施方式】
[0013] 下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 於對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據上述
【發明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。
[0014] 實施例1 選取大小均勻、飽滿的苦瓜種子，在超淨工作檯上剝去苦瓜種皮，先用75%的酒精浸泡 消毒lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，然後用無菌水衝洗5次，然後置於培養皿內的無 菌濾紙上，用消毒後的鑷子將種子接種在培養基上，每瓶接種10粒種子。
[0015] 將苦瓜種子放入含6-BA的MS培養基進行培養，設不含6-BA的MS培養基為空白 組，培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA 的濃度為l_5mg/L。再於含6-BA和KT的MS培養基進行培養，培養時間為7天，培養溫度為 23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，設三組實驗組，第一組中6-BA的濃度 為2. Omg/，KT的濃度為0? lmg/L ;第二組中6-BA的濃度為4. Omg/L，KT的濃度為1. Omg/L ; 第三組中6-BA的濃度為3. 0mg/L，KT的濃度為0. 5mg/L ;實驗結果取三組實驗結果平均值。
[0016] 6-BA前處理對不定芽誘導的影響見表1。
[0017]表 1

【權利要求】
1. 適用於多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法，其特徵在於：包括如下步驟： 1) 前處理：將苦瓜種子剝去種皮後進行滅菌，然後放入含6-BA的MS培養基進行培養， 培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的 濃度為l_5mg/L ; 2) 不定芽的誘導：切取帶一個子葉的子葉節，然後放入含6-BA和KT的MS培養基進 行培養，培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 6-BA 的濃度為 2-4mg/L，KT 的濃度為 0? 1-L Omg/L ; 3) 繼代培養：將步驟2)所得物的不定芽的腋芽切下，棄掉，然後將剩餘物接種於含 6-BA和KT的MS培養基進行培養，培養時間為7天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為2-4mg/L，KT的濃度為0. 1-1. Omg/L ; 4) 不定芽的伸長：將步驟3)所得物放入含6-BA和IBA的MS培養基進行培養，培養時 間為14天，培養溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為 1. Omg/L，IBA 的濃度為 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培養：將步驟4)所得物的不定芽切下，接種在含生根培養基的培養瓶中培養， 培養時間為14天，培養溫度為保持在23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 所述生根培養基為1/2 MS培養基添加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5. 8 ; 6) 煉苗：選取經步驟5)培養後的根長為4-5 cm的健壯小苗，將培養瓶的蓋子先擰松 放置2天，再半開2天，然後再全開2 d，半開和全開蓋子期間需要不斷補充水分； 7) 移栽：將煉苗完成後的植株拔起，用水洗淨根部培養基，移栽到裝有泥炭土、珍珠巖、 草木灰和腐葉土基質的營養缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置於人工氣候箱中保溼培養2 d，1-2周後再移到室外進行培養。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟1)所述的滅菌過程為：剝去苦瓜種 子的種皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，最後用無菌水衝 洗5次。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟2)中，在切取帶一個子葉的子葉節 時，節點距上胚軸1 mm，距下胚軸5 mm。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟7)所述營養缽中泥炭土、珍珠巖、草 木灰和腐葉土基質的質量比為1:1:1:1。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟1)中的MS培養基中6-BA的濃度為 4mg/L ;步驟2)中的MS培養基中6-BA的濃度為3. 0mg/L，KT的濃度為0. 5mg/L ;步驟4)中 的MS培養基中，6-BA的濃度為1. Omg/L，IBA的濃度為0. 2mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK104429945SQ201410621708
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月7日 優先權日:2014年11月7日
【發明者】唐懿, 李煥秀, 孫國超, 汪志輝, 姜建業, 謝永東, 嚴澤生, 賴雲松, 夏惠, 王迅, 餘雪娜 申請人:四川農業大學