夏枯草提取物及製備方法及應用與流程
2023-12-02 13:33:56
本發明屬於藥物製備領域，具體涉及一種夏枯草提取物及製備方法及應用。
背景技術：
阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease)是一種中樞神經系統退行性疾病，是最常見的痴呆類型。對於阿爾茲海默病患者而言，認知功能的減退是疾病的主要標誌。阿爾茲海默病的病理特徵主要有(由β-amyloid形成的)澱粉樣蛋白斑、神經纖維纏結和神經元丟失等。根據國際阿爾茲海默病協會統計，截止2015年，全球估計有4700萬左右的痴呆患者，其中阿爾茲海默病佔約60％-70％，而據估計到2050年這個數字將超過一億。美國於2014年公布的一組統計數字顯示，對於阿爾茨海默病病人的護理費用已經達到6000億美元。痴呆的患病率和巨大耗費給社會帶來嚴峻的政治和經濟挑戰。然而到目前為止，僅有5種藥物獲得FDA批准用於治療阿爾茨海默氏症，但這些藥物只能暫時性地提高認知能力，不能解決阿爾茨海默病認知功能障礙的根源。
傳統中藥歷來用於防治認知功能障礙，近年來，隨著對阿爾茲海默病研究的深入，中藥及其提取物預防和治療阿爾茲海默病的作用也日益受到重視。傳統中藥不僅看重疾病的症狀是否緩解，更關注於恢復和維持體內平衡，且中藥的治療理論正是多靶點、多途徑協同作用，這種策略和現代多靶點治療複雜疾病的原理不謀而合。
夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgarls L.的乾燥成熟果穗或全草，具有清火、明目、散結、消腫之功效，用於目赤腫痛、目珠夜癰、頭痛眩暈、痺病、癌瘤和乳腺腫痛，甲狀腺腫大，淋巴結結核、乳腺增生、高血壓等症。目前市場上夏枯草的單味製劑有夏枯草口服液、夏枯草顆粒等，均為夏枯草的粗提製劑，提取工藝粗糙，質量可控性不強，到目前為止未見有較明確化學成分的夏枯草的有效部位作為新藥申報。夏枯草屬植物中主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、酚酸、揮髮油及糖類等成分。其中以熊果酸、齊墩果酸為主的三萜類成分和以迷迭香酸、咖啡酸為主的酚酸類成分，含量較為豐富，是夏枯草的主要有效成分。文獻報導夏枯草具有降壓、降血脂、抗炎、免疫抑制、抗菌、抗病毒、降糖、抗腫瘤等多種作用，迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗過敏、抗血小板凝集、神經保護等作用，熊果酸具有抗腫瘤、抗肝損傷、抗菌消炎和抗病毒等多種藥理學活性。但目前的研究大多集中在夏枯草抗高血壓的作用上，而對夏枯草抗老年痴呆的活性未見報導。
技術實現要素：
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種夏枯草提取物。
本發明的第二個目的是提供一種夏枯草提取物的製備方法。
本發明的第三個目的是提供一種夏枯草提取物的應用。
本發明的技術方案概述如下：
夏枯草提取物，所述夏枯草提取物中咖啡酸的重量百分比大於等於5％，迷迭香酸的重量百分比大於等於15％。
上述夏枯草提取物的提取方法，包括以下步驟：
(1)將夏枯草藥材粉碎，以甲醇水溶液或乙醇水溶液為溶劑，按固液質量比為1:4～8的比例，採用溶劑回流提取法、超聲提取法、室溫浸提法或滲漉法進行提取，提取1-3次，過濾，得濾液；
(2)濾液濃縮至60-65℃相對密度1.01～1.10，得到濃縮液a；
(3)將濃縮液a加2～5倍體積的蒸餾水得懸浮液，再加入懸浮液體積1～3倍的乙酸乙酯，振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層液體用等體積的乙酸乙酯重複萃取2～5次，合併乙酸乙酯層，減壓濃縮，得夏枯草濃縮液b；乾燥得夏枯草提取物。
所述步驟(1)提取的方法為溶劑回流提取法。
所述甲醇水溶液的體積濃度為30％～95％，所述乙醇水溶液的體積濃度為30％～95％。
所述步驟(2)為：濾液濃縮至65℃相對密度1.08，得到濃縮液a。
所述步驟(3)為：將濃縮液a加3倍體積的蒸餾水得懸浮液，再加入懸浮液體積2倍的乙酸乙酯，振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層液體用等體積的乙酸乙酯重複萃取3次，合併乙酸乙酯層，減壓濃縮，得夏枯草濃縮液b；乾燥得夏枯草提取物。
上述夏枯草提取物在製備治療阿爾茲海默病藥物的應用。
本發明的優點：
本發明的夏枯草提取物中咖啡酸的重量百分比大於等於5％，迷迭香酸的重量百分比大於等於15％。其製備方法簡便實用，易於操作，更適合工業化生產。另外，該提取物對D-半乳糖所致的快速老化模型大鼠的學習記憶具有改善作用，能夠降低快速老化模型大鼠的水迷宮實驗中的逃避潛伏期和穿越平臺次數；免疫組化結果顯示，該提取物可降低快速老化模型大鼠海馬CA1區Caspase-3和大腦皮層GFAP的表達。HE和Nissl染色結果顯示，該提取物能夠改善D-半乳糖所致的神經元損傷。發現夏枯草提取物具有抗阿爾茲海默病的作用，應用於製備抗阿爾茲海默病的藥物，治療老年痴呆。
附圖說明
圖1夏枯草提取物HPLC色譜圖。
圖2水迷宮實驗典型遊泳軌跡.A:Control；B:SCOP；C:DON；D:XKC-L；E:XKC-H。
圖3實施例1所得夏枯草提取物對SCOP所致痴呆小鼠逃避潛伏期的影響。
圖4實施例1所得夏枯草提取物對SCOP所致痴呆小鼠穿越平臺次數的影響。
圖5尼氏染色觀察實施例1所得夏枯草提取物對SCOP所致痴呆小鼠大腦皮質GFAP表達的影響。
圖6尼氏染色觀察實施例1所得夏枯草提取物對SCOP所致小鼠海馬CA1區Caspase-3表達的影響。
圖7尼氏染色觀察實施例1所得夏枯草提取物對SCOP所致痴呆小鼠海馬CA1區的影響。
圖8 HE染色觀察實施例1所得夏枯草提取物對SCOP所致小鼠海馬CA1區的影響。
圖9實施例2所得夏枯草提取物對SCOP所致痴呆小鼠逃避潛伏期的影響。
圖10實施例2所得夏枯草提取物對SCOP所致痴呆小鼠穿越平臺次數的影響。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1
夏枯草提取物的提取方法，包括以下步驟：
(1)將夏枯草藥材粉碎，以體積濃度為70％的乙醇水溶液為溶劑，按固液質量比為1:6的比例，採用溶劑回流提取法進行提取，提取3次，過濾，得濾液；
(2)濾液濃縮至65℃相對密度1.08，得到濃縮液a；
(3)將濃縮液a加3倍體積的蒸餾水得懸浮液，再加入懸浮液體積2倍的乙酸乙酯，振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層液體用等體積的乙酸乙酯重複萃取3次，合併乙酸乙酯層，減壓濃縮，得夏枯草濃縮液b；乾燥得夏枯草提取物。
實施例2
夏枯草提取物的提取方法，包括以下步驟：
(1)將夏枯草藥材粉碎，以體積濃度為70％的甲醇水溶液為溶劑，按固液質量比為1:4的比例，採用超聲提取法，提取3次，過濾，得濾液；
(2)濾液濃縮至60℃相對密度1.01，得到濃縮液a；
(3)將濃縮液a加2倍體積的蒸餾水得懸浮液，再加入懸浮液體積3倍的乙酸乙酯，振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層液體用等體積的乙酸乙酯重複萃取2次，合併乙酸乙酯層，減壓濃縮，得夏枯草濃縮液b；乾燥得夏枯草提取物。
實施例3
夏枯草提取物的提取方法，包括以下步驟：
(1)將夏枯草藥材粉碎，以體積濃度為95％的乙醇水溶液為溶劑，按固液質量比為1:8的比例，採用滲漉法進行提取，提取1次，過濾，得濾液；
(2)濾液濃縮至65℃相對密度1.10，得到濃縮液a；
(3)將濃縮液a加5倍體積的蒸餾水得懸浮液，再加入懸浮液體積1倍的乙酸乙酯，振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層液體用等體積的乙酸乙酯重複萃取5次，合併乙酸乙酯層，減壓濃縮，得夏枯草濃縮液b；乾燥得夏枯草提取物。
用室溫浸提法替代本實施例的滲漉法，其它同本實施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比為5.6％；迷迭香酸的重量百分比15.8％。
用體積濃度為30％的乙醇水溶液替代本實施例的95％的乙醇水溶液，其它同本實施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比為5.9％；迷迭香酸的重量百分比16.4％。
用體積濃度為30％的甲醇水溶液替代本實施例的95％的乙醇水溶液，其它同本實施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比為6.1％；迷迭香酸的重量百分比17.5％。
用體積濃度為95％的甲醇水溶液替代本實施例的95％的乙醇水溶液，其它同本實施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比為6.4％；迷迭香酸的重量百分比16.2％。
實施例4夏枯草提取物的成分分析
1色譜條件
色譜柱：Phenomenex C18。(4.6mm*250mm，5μm)；液相條件：A相：0.1％醋酸水溶液；B相：甲醇；梯度洗脫，0～30min：30％～60％B相；吸收波長為330nm；柱溫箱35℃。
2供試品溶液配製
準確稱取實施例1製備的夏枯草提取物605mg於5mL容量瓶中，加70％乙醇定容，超聲20min後放至室溫，用70％乙醇補足至刻度，0.45μm微孔濾膜過濾後作為製劑供試品溶液。
3結果
採用標準曲線法對夏枯草提取物中的咖啡酸和迷迭香酸的含量進行測定，咖啡酸的標準曲線方程為y＝53032x+39125,R2＝0.999,迷迭香酸的標準曲線方程為y＝57333x+11207,R2＝0.999。
採用標準曲線法對夏枯草提取物中的咖啡酸和迷迭香酸的含量進行測定，咖啡酸的標準曲線方程為y＝53032x+39125,R2＝0.999,迷迭香酸的標準曲線方程為y＝57333x+11207,R2＝0.999。實施例1製備的夏枯草提取物中咖啡酸和迷迭香酸的含量分別為6.4％和20.3％。典型的色譜圖如圖1所示。
用同樣的方法測定：
實施例2製備的夏枯草提取物中咖啡酸和迷迭香酸的重量百分比分別為5.8％和18.5％。。
實施例3製備的夏枯草提取物中咖啡酸和迷迭香酸的重量百分比分別為6.2％和19.7％。。
實施例5夏枯草提取物的活性考察
1體外實驗：微孔高通量篩選法對夏枯草提取物(實施例1提取)AChE抑制作用的體外活性研究
本部分實驗通過微孔高通量篩選技術，採用改良Ellman法，夏枯草提取物的AChE抑制活性。其實驗原理為：碘化硫代乙醯膽鹼(ATCI)在AChE作用下分解，生成硫代膽鹼，硫代膽鹼與顯色劑DTNB(5，5-二硫代雙對硝基苯甲酸)迅速作用，生成在412nm處有光吸收的黃色物質，若樣品對酶有抑制作用，則轉化出的有色物質少，其在紫外下的吸光度值小，可利用吸光度值差異來計算抑制率的大小。
1.1樣品溶液的配製
①實驗樣品的配製：精密稱取夏枯草提取物2.25mg溶於1mL PBS中，分別設3個濃度梯度，依次為2.25、22.50和225.00μg·mL-1。
②陽性藥：精密稱取多奈哌齊1mg，蒸餾水溶解，配製成濃度為50μg·mL-1的溶液。
③AChE儲備液的製備：取健康小鼠大腦，用勻漿器將其研碎。稱取1g小鼠大腦勻漿，加入9mL PBS緩衝溶液，3000r·min-1離心30min，取上清液。吸取1mL上清液，加入13mL PBS緩衝溶液，作為酶儲備液。
④底物和顯色劑的製備：稱取9mg碘化硫代乙醯膽鹼，溶於500mL PBS中，作為底物。稱取50mg DTNB，溶於50mL PBS中，作為顯色劑；稱取1.5g SDS，溶於50mL PBS中，作為酶反應終止劑。
1.2孵育取5mL EP管，先加入608μL PBS，隨後加入32μLAChE。然後實驗組加入160μL樣品溶液；空白對照組加入160μL蒸餾水。混勻，於37℃水浴中孵育20min，讓樣品與酶液充分反應。
1.3顯色從水浴中取出EP管，加入400μL DTNB，然後加入400μL底物，混勻，於37℃水浴中孵育20min，進行顯色。
1.4檢測從水浴中取出EP管，加入400μL SDS，終止反應。然後從中吸取200μL反應液，迅速加到96孔板中，每個樣品設5個復孔。於酶標儀412nm處檢測吸光值。
AChE的相對抑制率＝(1－實驗組平均OD值/空白對照組平均OD值)×100％。
1.5結果
通過微孔高通量篩選技術，採用改良Ellman法，評價實施例1製備的夏枯草提取物AChE抑制活性。結果顯示實施例1製備的夏枯草提取物具有很好的AChE抑制活性，其為225.00μg·mL-1時的抑制率大於陽性藥多奈哌齊的AChE抑制率。而目前FDA批准治療老年痴呆的5個藥物中，其中有4個藥物為AChE抑制劑，提示夏枯草提取物具有很好的抗老年痴呆的作用。
表1不同濃度夏枯草提取物的AChE抑制率
2體內實驗：夏枯草提取物對氫溴酸東莨菪鹼(SCOP)所致痴呆小鼠學習記憶改善作用
2.1實驗材料與方法
2.1.1實驗藥物與試劑
所用夏枯草提取物按實施例1自製。多奈哌齊(DON，國藥準字H20030472，江蘇豪森藥業股份有限公司)；GFAP抗體和Caspase-3抗體(購自武漢博士德生物工程有限公司)。
2.1.2實驗動物
雌性昆明小鼠，體重為18±2g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供；許可證號：SCXK-2010-004，實驗用小鼠於25℃條件下適應性飼養一周以後進行實驗。
2.1.3實驗儀器
水迷宮實驗系統(天津中醫藥大學提供)TopScanLite-TopView行為學分析系統(NoldusInformation Technology,Leesburg,VA,USA)。Molecular Device Flexstation 3酶標儀。
2.1.4分組及給藥
將50隻健康的雌性昆明小鼠隨機分成5組：空白組(Control)、模型組(SCOP)、多奈哌齊組(DON)夏枯草高劑量(XKC-H,800mg/kg)和夏枯草低劑量組(XKC-L,400mg/kg)，每組10隻，連續給藥3周，給藥的後3天，模型組和各個實驗組均腹腔注射SCOP(3mg/kg.d)，空白組注射同等劑量的生理鹽水，連續注射3天。同時，空白組、模型組灌胃5％CMC-Na，各給藥組連續灌胃給藥60天，每天1次。藥物均採用5％的CMC-Na溶解至一定濃度。
2.1.5樣本採集
給藥3周後，於末次給藥後10％水合氯醛麻醉，待麻醉滿意後進行腦灌注。腦於中性福馬林中保存用於病理切片。
2.1.6行為學測定(水迷宮實驗)
Morris水迷宮由一個不鏽鋼噴塑圓柱形水池和自動錄像記錄系統兩部分組成。水池直徑為100cm，高38cm。池壁上標記有4個等距離點，按順時針方向將水池分為4個象限，任選一個象限，於其中央放置平臺(平臺與池壁及圓心距離相等)。平臺黑色，直徑6cm，高15cm，泳池內盛水，水溫保持在25±1℃，自動錄像記錄系統包括攝像頭和錄像系統(計算機、記錄軟體)，攝像頭裝於水池上方約3m處，並與錄像系統相連接，自動錄入並記錄大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數。大鼠於灌胃給藥60天後開始進行Morris水迷宮檢測，先訓練1周，每天上下午各2遍，第7天給藥60min後開始檢測,運用空間探索實驗來檢測動物對平臺空間位置的準確記憶，即記憶保持能力。水迷宮第7天，撤除平臺後，從原實臺象限的對角象限(第3象限)作為入水點將動物面向池壁放入水中。記錄動物在90s內在實臺象限的穿臺次數和目標象限遊泳時間，用於檢測動物對平臺空間位置的準確記憶，即記憶保持能力。數據採集和處理均由該裝置的圖像動監視和處理系統完成。
2.1.7腦海馬形態學觀察及檢測方法
尼氏染色和HE染色後觀察各給藥組大腦海馬CA1區的形態組織變化。
2.1.6統計學處理
利用SPSS20.0統計分析處理軟體，對測量參數進行統計學分析，實驗數據以表示，採用雙側t檢驗進行比較，P<0.05則表示具有顯著性差異。
2.2結果
2.2.1行為學測定
採用水迷宮實驗對其行為學進行評價，代表性的遊泳軌跡如圖2所示。空間探索實驗中的逃避潛伏期和穿越平臺次數分別如圖3和圖4所示，Control組(正常對照組)、DON組(陽性藥給藥組)、XKC-L組(夏枯草低劑量組)和XKC-H(夏枯草高劑量組)組的潛伏期均較SCOP組小，且Control組、XKC-L組和XKC-H具有顯著性差異(P<0.001,P<0.05,P<0.01)。Control組、DON組、XKC-L組和XKC-H組穿過平臺的次數均大於模型組，表明了夏枯草提取物可減少SCOP組(模型組)所致小鼠逃避潛伏期的延長，提高其學習記憶能力。
2.2.2免疫組織化學染色觀察Caspase-3和GFAP表達
免疫組織化學染色結果如圖5和圖6所示。GFAP的陽性表達顆粒主要出現在神經膠質細胞突起處，呈棕黃色深染顆粒。GFAP染色結果顯示，在Control組小鼠大腦皮質內GFAP陽性染色較淡；模型組的神經膠質細胞突起處，可見大量深染的棕黃色顆粒，為GFAP陽性染色細胞，陽性細胞數量明顯高於對照組(見圖5)。與模型組相比，DON組及不同劑量夏枯草提取物處理組的細胞染色相對較淡，陽性細胞數量明顯低於模型組。Caspase-3染色結果顯示，Control組的陽性細胞數量與SCOP組存在有顯著差異。SCOP組小鼠海馬神經元陽性細胞數比正常對照組顯著增加。陽性對照組DON和不同劑量夏枯草提取物幹預組可見海馬陽性反應細胞著色淺，結果見圖6。
2.2.3腦海馬形態學觀察
各組小鼠腦海馬區形態變化如圖7和圖8所示，正常小鼠海馬CA1區結構正常，神經毯排列緊密且整齊，層次清楚，有4-6層細胞，細胞核呈圓形，核仁清晰。SCOP組小鼠海馬CA1區病變嚴重，神經元排列散亂疏鬆，錐體細胞帶不完整，細胞數量明顯減少，核固縮明顯，夏枯草提取物給藥組小鼠海馬CAl區病變較模型組明顯改善，結構清晰，細胞排列較整齊，細胞核固縮不明顯，其病變較模型組明顯減輕，與陽性藥SCOP組相似，幾乎與空白對照沒有差異，顯示夏枯草提取物可明顯改善模型大鼠腦組織的病理變化。
實施例2、3的體內外實驗研究方法與實施例1相同，體外實驗結果證明，實施例2和實施例3所得夏枯草提取物對氫溴酸東莨菪鹼(SCOP)所致痴呆小鼠學習記憶改善作用，其劑量為22.50μg·mL-1時抑制率分別可達63.47±3.29％和65.83±2.91％；體內實驗結果也證實了，實施例2(結果見圖9，10)和實施例3所得夏枯草提取物可減少SCOP所致小鼠逃避潛伏期的延長，提高其學習記憶能力。其劑量為400mg/kg時，小鼠逃避潛伏期分別為20.28±4.53和18.01±3.71；劑量為800mg/kg時，小鼠逃避潛伏前為15.42±4.21和12.50±4.22。