一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法
2023-12-02 12:44:06
專利名稱：：一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法
技術領域：
：本發明涉及用稻瘟病菌近等菌株進行抗稻瘟病基因分析的一種方法，屬植物保護領域。
背景技術：
：水稻稻瘟病是一種世界性的病害，多年的實踐證明培育和種植抗病品種是控制這一病害最安全、經濟、有效的防治措施。但水稻稻瘟病菌是一個較易於發生變異的病原群體，常使一個新推廣的品種在種植35年後便喪失抗性。為了穩產高產，育種家不得不利用新的抗病基因或採用基因組合來選育新的抗病品種，因此，準確可靠的抗稻瘟病基因分析對水稻抗病育種具有重要意義。到目前為止，人們大約鑑定了40多個抗稻瘟病基因。然而，這些抗病基因是由不同的實驗室，不同年份、不同地點，採用不同菌株鑑定出來的。由於稻瘟病抗性鑑定對發病條件要求嚴格，只有當接種的苗齡、生長勢、所用菌闢的壞傳背景，接種時的溫度、溼度，所用的孢子尊等等都一致的條件下，所獲得的接種結果才可靠。目前，各個實驗室採用的菌株不同，各菌株的遺傳背景不一致，且在不同的接種條件下接種，所獲得的結果可比性較差。即各實驗室依據水稻分離世代抗性表現而推導出的抗病基因沒有可比性，可能將不同抗病基因定名為相同的基因，將相同的基因定名為不同基因。為了證明各個基因實體間的真正關係，進行抗病基因克隆和功能分析，則需要做大量的測交和等位性分析。這是一件非常繁重的工作，且將不同的抗病基因間的關係都分析清楚是難以實現的。
發明內容本發明的主要目的是克服現有方法的不足，提供了一種準確、高效、簡便、快速的抗稻瘟病基因分析的方法，為稻瘟病抗病育種及抗病基因克隆和功能分析奠定基礎。本方法的技術方案1利用一個對含有30多個抗病基因的水稻近等基因系，包括普遍認為沒有抗病基因的麗江新團黑谷在內的所有品系，均不能致病的菌株CY2，採用農桿菌介導的方法，獲得大量轉化子；2將獲得的轉化子接種到己知抗病基因的水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到近等基因繫上，確認致病性，得到了35個致病性發生了變異的菌株；3在育苗盤中分穴播種待測的水稻品種，並用麗江新團黑谷作為感病對照，用常規方法進行管理，待秧苗長到3葉1心時備用；4分別將35個菌株在燕麥培養基上培養，產孢後製備孢子懸浮液；5將製備好的孢子懸浮液分別接種到待測的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規;6在25-28'C下保溼7天後，按常規方法觀察記載病情，確定抗感反應型，推導待測品種的基因型。水稻稻瘟病菌與水稻是一個基因對基因關係的病害系統。水稻抗病基因與稻瘟病菌無毒基因的鑑定與推導是一種相互依存的關係。即利用稻瘟病菌株的致病類型推導水稻品種的抗病基因組成，利用水稻的抗病基因推導菌株的無毒基因或致病基因組成。基於這一理論基礎，就可人為的構建一套稻瘟病菌近等菌株進行抗性基因推導工作。如果利用一個遺傳背景完全一致的菌株，篩選不同致病性的突變體，構建近等菌株，則可以實現不用做水稻雜交和接種雜交後代抗病性，也不用通過等位性測驗，便可以通過直接利用突變體接種穩定的品種，依據抗病類型，了解品種的抗性基因組成。我們得到的35個致病性發生變芽的菌株有的在一個位點上發生了變異，有的在多個位點上發生了變異，各菌株致病類型構成了一個致病型矩陣。因此，利用這套致病基因近等菌株不僅可用於含單個抗病基因水種品種的抗病基因推導，也可用於含多個抗病基因水稻品種的推導。特別是這套菌株的應用，可改變過去通過水稻雜交、測交分析抗病基因的傳統方法，使鑑定抗病基因的結果更加準確、可靠，所得到的結果具有廣適性，避免不同實驗室接種的結果不一致的情況出現；利用這套菌株還可以發現新的抗病基因。具體實施例方式下面用實施例子來進一歩詳述本發明。品種抗性採用苗瘟鑑定法按常規方式進行。實施例一l採用農桿菌介導的方法，轉化廣泛無致病力的菌株獲CY2，得到大量轉化子；2將獲得的轉化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到近等基因繫上，確認致病性，得到了3個致病性發生了變異的菌株Tl(Vir/^'-ta)，T2(Vir屍/-和T3(Vir/^'-a);3在育苗盤中分穴播種待測的水稻品種和3個相應的已知抗病基因的近等基因系(A，B，C)，並用麗江新團黑谷作為感病對照，用常規方法進行管理，待秧苗長到3葉1心時備用；4分別將3個菌株和野生型菌株CY2在燕麥培養基上培養，產孢後製備孢子懸浮液；5將製備好的孢子懸浮液分別接種到待測的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規;6在25-28'C下保溼7天後，按常規方法觀察記載病情，確定抗感反應型，推導待測品種的基因型。表l接種結果表tableseeoriginaldocumentpage5-從上表的接種結果可以看出，待測品種的基因型為-屍/-"。實施例二l採用農桿菌介導的方法，轉化廣泛無致病力的菌株獲CY2，得到大量轉化子；2將獲得的轉化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到近等基因繫上，確認致病性，得到了4個致病性發生了變異的菌株Tl(Vir/^'-5，屍卜乃，T2(Vir屍y—乃，T3(Vir,卜5,屍卜幼，T4(VirA'—7,戶y-7i)。3在育苗盤中分穴播種待測的水稻品種和4個相應的已知抗病基因的近等基因系，並用麗江新團黑谷作為感病對照，用常規方法進行管理，待秧苗長到3葉1心時備用；4分別將4個菌株和野生型菌株CY2在燕麥培養基上培養，產孢後製備孢子懸浮液；5將製備好的孢子懸浮液分別接種到待測的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規;6在25-28"C下保溼7天後，按常規方法觀察記載病情，確定抗感反應型，推導待測品種的基因型。表2接種結果表tableseeoriginaldocumentpage6從上表的接種結果可以看出，待測品種的基因型和B相同，為Pi-7(r)。實施例三l採用農桿菌介導的方法，轉化廣泛無致病力的菌株獲CY2，得到大量轉化子；2將獲得的轉化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到相應的品繫上，確認致病性，得到了8個致病性發生了變異的菌株formulaseeoriginaldocumentpage63在育苗盤中分穴播種待測的水稻品種和8個相應的已知抗病基因的近等基因系，並用麗江新團黑谷作為感病對照，用常規方法進行管理，待秧苗長到3葉1心時備用；4分別將8個菌辨和野生型菌株CYS在燕麥培養基上培養，產孢後製備孢子懸浮液；5將製備好的孢子懸浮液分別接種到待測的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規；6保溫保溼7天後，按常規方法觀察記載病情，確定抗感反應型，推導待測品種的基因型。表3接種結果表tableseeoriginaldocumentpage6從上表的接種結果可以看出，待測品種的基因型和B相同，為A-厶實施例四l採用農桿菌介導的方法，轉化廣泛無致病力的菌株獲CY2，得到大量轉化子；2將獲得的轉化子接種到己知抗病基因的水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到相應的品繫上，確認致病性，得到了5個致病性發生了變異的菌株Tl(Vir屍i-￡)，T2(VirA-A力，A.-》，T3(Vir屍i-》，T4(Vir/7/-/)，T5(Vir屍/-A'，Vir,i-/)。3在育苗盤中分穴播種待測的水稻品種和5個相應的已知抗病基因的近等基因系，並用麗江新團黑谷作為感病對照，用常規方法進行管理，待秧苗長到3葉1心時備用；4分別將5個菌株和野生型菌株CY2在燕麥培養基上培養，產孢後製備孢子懸浮液；5將製備好的孢子懸浮液分別接種到待測的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規；6保溫保溼7天後，按常規方法觀察記載病情，確定抗感反應型，推導待測品種的基因型。..表4接種結果表品種和抗病基因菌株和致病基因a(/^.-/)bcz)d/)e(屍j'-a')x(待測)原始菌CY2RRRRRRTl(Vir,H')SRRRRRT2(Vir屍y-/,屍i-2)RSSRRST3(Vir屍卜》RRSRRST4(VW-/)RRRSRRT5(Vir/V-屍W)RRRSSR從上表的接種結果可以看出，待測品種的基因型為屍i-Z。權利要求1、一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法，其步驟為1)利用一個對含有30個抗病基因的水稻近等基因系，包括普遍認為沒有抗病基因的麗江新團黑谷在內的所有品系，均不能致病的菌株CY2，採用農桿菌介導的方法，獲得大量轉化子；2)將獲得的轉化子接種到已知抗病基因的水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得單孢菌株，回接到相應的品繫上，確認致病性，得到了35個致病性發生了變異的菌株；3)在育苗盤中分穴播種待測的水稻品種，並用麗江新團黑谷作為感病對照，用常規方法進行管理，待秧苗長到3葉1心時備用；4)分別將35個菌株在燕麥培養基上培養，產孢後製備孢子懸浮液；5)將製備好的孢子懸浮液分別接種到待測的秧苗上，接種濃度，接種方法同常規；6)保溫保溼7天後，按常規方法觀察記載病情，確定抗感反應型，推導待測品種的基因型。全文摘要本發明涉及一種分析水稻抗稻瘟病基因的方法。本發明的技術方案是1)尋找一個性狀穩定，廣泛無致病力的菌株；2)利用農桿菌介導的方法轉化該菌株，將獲得的轉化子接種到水稻近等基因繫上，從感病型病斑上獲得致病性發生變異的單孢菌株；3)回復接種，鑑定並確認該套單孢菌株的致病性，獲得一套近等菌系，用於品種的抗病基因鑑定。本發明的效果用途能構建一套稻瘟病菌近等基因菌株進行抗性基因推導，可以實現不用做水稻雜交和接種雜交後代抗病性，也不用通過等位性測驗，便可以通過直接利用突變體接種穩定的品種，依據抗病類型，了解品種的抗性基因組成；可用於含單個或多個抗病基因水稻品種的抗病基因推導。文檔編號C12Q1/02GK101240346SQ200810058178公開日2008年8月13日申請日期2008年3月13日優先權日2008年3月13日發明者何月秋,吳毅馨,周惠萍申請人:雲南農業大學