環杷明在治療基底細胞癌及其它腫瘤中的應用的製作方法
2023-12-02 22:08:41
專利名稱：環杷明在治療基底細胞癌及其它腫瘤中的應用的製作方法
環杷明在治療基底細胞癌及其它腫瘤中的應用本申請是申請日為2001年07月02日、申請號為01823442. 9 (國際申請號為PCT/ TR01/00027)、發明名稱為「環杷明在治療基底細胞癌及其它腫瘤中的應用」的發明申請的
分案申請。本發明涉及環杷明(cyclopamine)在體內治療基底細胞癌(BCC』 s)的應用，通 過誘導腫瘤細胞分化，以及凋亡將這些腫瘤細胞除去從而實現治療作用，而對正常的組織 細胞，包括正常表皮基底層及毛囊的未分化細胞無影響。環杷明通過非基因毒性機制引起 細胞凋亡，因此與放療及當前使用的絕大多數化療藥物通過損傷DNA發揮作用的方法不一 樣。這些先前的癌症化療藥物所不能達到的新效果使環杷明適於癌症治療，適於治療BCC’s 其他腫瘤，所述腫瘤利用hedgehog/smoothened信號轉導通路進行增殖及防止凋亡。基底細胞癌是一種常見的上皮腫瘤。其發病率隨年齡增長而升高。當前對BCC’s 的治療包括將腫瘤及其邊緣正常組織手術切除，當不宜手術或手術不理想時，採取放療或 其它手段破壞腫瘤細胞。儘管具有留下疤痕及毀容的潛在副作用，但將腫瘤細胞清除完全 的手術切除可以將其治癒。放療通過造成大量不可恢復的DNA損傷而起作用，該損傷隨後 引發腫瘤細胞凋亡。放療的這種作用模式，即繼發於DNA損傷的細胞凋亡，與當前癌症治療 中使用的許多化療藥物的作用機理相似。然而，放療及細胞毒性癌症化療藥物也會對腫瘤 細胞以外的正常細胞的DNA造成損傷。因此，它們在癌症治療中的有效性及有用性是非常 有限的。放療及基因毒性癌症化療藥物還存在另一煩擾的兩難局面，即患者的原發癌症即 使被治癒，其患新發癌症的危險明顯地增加，因為在原發癌症的治療中造成了 DNA損傷並 因此產生突變。因此，通過非基因毒性方式選擇性誘導腫瘤細胞凋亡在癌症治療領域最有 前景。BCC，s經常顯示出基因patched的失活性突變，該基因編碼一種為hedgehog蛋 白的受體的跨膜蛋白，這些hedgehog蛋白的首次發現源於其在組織發育模式方面的作用。 當不與hedgehog結合時，patched蛋白質抑制通過另一種跨膜蛋白smoothened的細胞內 信號轉導。Hedgehog與patched蛋白質的結合會解除這種抑制作用。然後，通過解除的 smoothened的細胞內信號轉導啟動一系列細胞活動，最終導致hedgehog目的基因的表達 及細胞行為發生改變。這種hedgehog/smoothen信號轉導通路，首先在果蠅中得到證實， 其一般特徵在從果蠅到人的多種生物體中是保守的。然而，該通路在更高級的生物體中更 加複雜(如人類多個基因與果蠅單一 patched基因具有顯著相似性)。已發現，patched 基因的失活性突變可引起通過hedgehog/smoothened通路的組成型(無配體)信號轉導。 在所有BCC』 s中，都發現了源於patched基因和/或下遊通路元件突變引起的hedgehog/ smoothened通路的過度活躍。痣樣基底細胞癌症候群(NBCCS)源於patched基因的單倍不 足性。NBCCS患者由於在先前所有細胞中都存在突變型patched基因，他們日後會發展為多 發性的BCC，S。環杷明為一種甾類生物鹼，具有以下結構式。
發現環杷明在百合Veratrum califomicum中天然存在，可從其中或其它來源提取 獲得。在雞胚及鼠培養細胞中發現了環杷明對hedgehog/smoothened通路的抑制作用。在局部應用時，可將環杷明溶於乙醇或其它合適的溶劑中，再與合適的鹼性基質 乳膏、軟膏或凝膠混合。也可將環杷明固定於水凝膠上或製成其它劑型以達到控釋，及吸收 到皮膚貼片上。圖IA
圖1D、圖2A 圖2F、圖3A 圖3G及圖4A 圖4D顯示的是乳膏 製劑的效果，該製劑為將環杷明乙醇溶液與基質乳膏混合得到終濃度為18mM的環杷明乳 膏。使用的乳膏基質主要由重石蠟油(10%w/w)、凡士林(10%w/w)、十八烷醇(8%w/w)、 polyoxylsteareth-40 (3% w/w)及水(68%w/w)組成，然而，其它合適地製劑的乳膏基質也 可使用。環杷明製劑的最佳濃度、最佳給藥劑量及應用方案將明顯受具體劑型、包含腫瘤的 皮膚的位置及特點(如表皮的厚度)以及腫瘤的大小等因素影響；然而，這些因素可經下述 已知的發表地優化方法確定。對圖IA(位於鼻唇褶上的BCC，表面積為4X5mm)及圖IC(位 於前額的BCC，表面積為4X4mm)所示的腫瘤的劑量及治療方案如下以鋼刮刀將10 士 2μ 1 乳膏直接施用於BCC' s，每日四次，約從上午9:00開始，用藥間隔3.5小時。夜間使用時， 應避免該方案，由於患者熟睡時，將乳膏易從皮膚流失至被褥上，此時可使用合適的皮膚貼 片。接觸環杷明後對正常表皮及毛囊中未分化細胞的保護，如本發明所述，提供了關於以 其它可能的用藥方式的耐受劑量的信息；如直接向腫瘤內注射其水溶液或水溶液的全身使 用，或將環杷明包封在脂質體中。圖1Α、圖1Β、圖IC及圖ID顯示了暴露於環杷明後BCC' s的快速臨床轉歸。在不 足一周的時間內，不但可見到幾處腫塊的消失，同時，圖IB與圖IA及圖ID與圖IC相比較， BCC' s典型的半透明外觀消失。圖2A 圖2F顯示了在應用環杷明第5及第6天後，與邊緣正常組織一起進行手術 切除的腫塊的顯微外觀，此時BCC' s治療前的絕大部分面積已經消失，仍然有少數區域， 儘管其高度明顯下降，但仍未完全消失，因此，顯微分析仍發現殘留的腫瘤細胞。圖2A及圖2B所示對應於消失腫塊的組織切片上的皮膚區域。經過觀察發現，腫 瘤消失留下大量包含少量物質的囊狀結構，沒檢測到腫瘤細胞。圖2C顯示了體內仍包含可見BCC的皮膚區域的顯微外觀。在這些區域中可觀察 到殘留的BCC' s，其顯示出在腫瘤中心的大量胞囊及位於外圍殘留的BCC細胞中各種大小 的較小囊狀結構。圖2D及圖2E顯示了這些殘留的BCC' s內部及圍護外圍區域的1000倍放大外 觀，也顯示在腫瘤區域的殘留BCC中存在大量的細胞凋亡活動。這些高倍放大的圖片顯示， 細胞凋亡形態BCC細胞及由細胞的凋亡去除形成的囊狀結構的頻率大大增加，由圖2D所示 可以例證，一旦凋亡的隔膜細胞被清除，三個較小的胞囊相連形成一個較大的胞囊。圖2F顯示BCC' s以安慰劑乳膏的治療(即除不含環杷明，與環杷明乳膏製劑相 同的乳膏，用作安慰劑)，與上不同，顯示出典型的BCC細胞且無細胞凋亡活動。
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已知發生凋亡的細胞通過巨噬細胞及正常組織中的鄰近細胞清除，已知基於蘇木 精-伊紅染色切片的形態學標準進行的凋亡活動定量偏低。儘管如此，表1中的定量數據 表明，經過環杷明治療後的殘留BCC細胞中的凋亡活動大大增加。在環杷明治療的BCC' s中的半透明性的消失提高了在環杷明的影響下BCC' s 分化的令人感興趣的可能性。本發明發現該可能性的確存在，可經BCC' s的免疫組化分析 測定。在正常的表皮中，基底層細胞向上層細胞的分化伴隨單克隆抗體Ber-Ep4標記特性 的消失。Ber-Ep4還標記BCC細胞，為這些腫瘤的已知標記物。圖3A、圖3B及表1的定量 數據表明，儘管Ber-Ep4強烈地標記安慰劑對照組BCC' s中所有外圍圍護細胞及90%的 內部細胞，Ber-Ep4卻不標記環杷明治療組BCC' s的任何殘留外圍細胞或內部細胞。在環 杷明的影響下的BCC' s分化，迄今未見其它類似報導，由於其在體內及在所有細胞中按照 免疫組化標準所達到的非同一般的效果，在癌症的治療上具有獨特的價值。另一個分化標記物，1型Ulex Europaeus外源凝集素，正常地不標記BCC' s或正 常表皮的基底層細胞，但標記分化的上層細胞。圖3C顯示了以該外源凝集素對環杷明治療 組BCC' s地殘留細胞的異質性標記，顯示了從Ber-Ep4無法檢測的步驟一直到用ISUlex Europaeus外源凝集素可檢測的步驟的一些BCC細胞的分化。p53是細胞對DNA損傷主要的調節子。已知當細胞暴露於基因毒性藥物後該蛋白 在細胞核中的量將增加。當DNA損傷超過一定閾值時，p53便誘導細胞凋亡。癌症的放療 及當前常用的基因毒性化療藥物，主要通過這種機制起作用，即通過誘導繼發於DNA損傷 的細胞凋亡起作用。單克隆抗體D0-7可與正常的及錯義突變體(即非功能性)形式的p53 結合，且能對暴露於DNA損傷藥物後細胞中p53的增加進行檢測。圖3D、圖3E及表I中的定量數據顯示，與安慰劑處理的BCC' s相比，環杷明治療 組BCC' s中的D0-7的標記強度及標記頻度都顯著降低。因而，環杷明導致經其治療後的 BCC細胞核中的p53降低，而不是升高。已知分化的表皮細胞的p53將降低，因而，環杷明治 療組BCC' s的D0-7標記降低可能繼發於環杷明誘導的BCC細胞的分化。無論如何，儘管 有P53表達的顯著降低，但在環杷明治療的BCC' s細胞中存在的大量的細胞凋亡活動表 明，環杷明誘導的腫瘤細胞的凋亡是通過非基因毒性機制進行的。已知BCC' s增殖的抑制與其自基質中的收縮有關。儘管由於組織的不適當固定 及處理可產生自基質的收縮的假象，但按照公開的技術方案可避免這些假象。如圖3F及 圖3G所示，環杷明處理的，而非安慰劑處理的BCC' s—致性地出現自基質收縮。因而，將 BCC' s暴露於環杷明似乎也與增殖的抑制有關。圖4A 圖4D顯示了環杷明處理的BCC' s或其附近的正常皮膚組織的Bcr_Ep4 標記。圖4A、圖4B及圖4C顯示用環杷明處理的不同表皮區域，以顯示Ber-Ep4標記的正常 模式，即基底層細胞的標記。類似地，圖4D顯示了暴露於環杷明的毛囊的正常Ber-Ep4標 記。因而，儘管正常表皮及毛囊的未分化細胞以BCC' s同樣的方案及劑量暴露於環杷明， 但仍保持原樣。當以不影響未分化的組織細胞的環杷明劑量，在體內高效地誘導腫瘤細胞分化 及誘導腫瘤細胞凋亡，這些成就目前還不為人所知，這些機制及環杷明的非基因毒性作用 模式，支持將環杷明用於BCC』 s及其它一些腫瘤治療中的用途，所述腫瘤利用hedgehog/ smoothened信號轉導通路進行增殖及防止凋亡和/或分化。
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附圖描述圖認、讓、1(、10:顯示了環杷明處理後80' s的快速轉歸，體現在腫塊的消失 (箭頭所示)、距皮膚表面的高度明顯減小及透明的外觀在不足一周內消失。IA 位於左側 鼻唇褶的治療前的BCC。IB 同樣的BCC在環杷明局部治療第五天的情況。IC 位於前額的 BCC治療前的情況。ID 同樣的BCC在環杷明局部治療第六天的情況。圖2A、2B、2C、2D、2E、2F 環杷明處理的及安慰劑處理的BCC' s的顯微外觀，顯示 環杷明誘導的大量細胞凋亡、腫瘤細胞的清除及腫塊的消失、留下不含腫瘤細胞的大量囊 腔。在環杷明預處理的第5及第6天，將對應於處理前BCC' s位置的皮膚區域以及周圍正 常組織，進行手術切除，然後進行常規的固定、切片及蘇木精-伊紅染色作顯微分析。2A 對 應於腫塊消失位置處的真皮中的大胞囊，顯示無殘留的腫瘤細胞。2B:另一處真皮區類似的 胞囊，該區域用環杷明治療前包含BCC，但非治療後不包含。2C:圖ID顯示的BCC區域的低 倍視野，顯示了殘留細胞及這些細胞之間的無數小胞囊相連形成一個大胞囊。2D 圖2C中 同樣的殘留BCC內部區域的高倍視野，顯示凋亡細胞及以及BCC細胞的凋亡清除導致的胞 囊形成和擴大的頻率大大增加。2E 圖2C中同樣的殘留BCC的外圍區域的高倍視野，顯示 凋亡細胞及由BCC細胞的凋亡清除導致的囊狀結構形成頻率大大增加。2F 安慰劑處理的 BCC內部區域的高倍視野，顯示了典型的腫瘤細胞且無細胞凋亡。2A、2B、2C的初始放大倍 數為100X，2D、2E、2F的初始放大倍數為IOOOX0圖3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G 環杷明及安慰劑處理的BCC' s免疫組化分析顯示在 環杷明的影響下所有殘留BCC細胞的分化以及暴露於環杷明後BCC' s中p53表達的降低。 3A及3B 與安慰劑處理的BCC的Ber-Ep4強染色(3B)形成對比，環杷明處理BCC的所有 殘留細胞無單克隆抗體Ber-Ep4染色(3A)，表明所有經環杷明處理的殘留細胞都分化至或 超過可以Ber-Ep4檢測的步驟。Ber_Ep4已知的分化標記物，可以染色BCC細胞以及未分 化的正常表皮基底層細胞及毛囊，但不能標記已分化的正常表皮的上層細胞。3C 以Ulex Europaeus外源凝集素I對環杷明處理的BCC' s中殘留細胞的異質性標記，顯示了一些 BCC細胞一直分化至可由該凝集素檢測到的步驟，該外源凝集素正常地不標記BCC' s或正 常表皮的基底層細胞，但標記分化的上層細胞。3D及3E:與安慰劑處理的BCC' s(3E)相 比，環杷明處理的BCC' s(3D)以單克隆抗體D0-7檢測到p53表達的降低。當上皮基底細 胞或角質化細胞分化時，已知P53表達將降低。眾所周知，當暴露於DNA損傷藥物後，在細 胞中可檢測到用D0-7檢測的p53增加。3F及3G:BCC' s自基質中一致性收縮，據知其為 腫瘤細胞增殖抑制相關聯的特徵，可見於環杷明處理腫瘤(3F，箭頭顯示了收縮區間)，而 在安慰劑處理組(3G)的腫瘤(環杷明及安慰劑處理的BCC' s自基質收縮的差異也可參見 3D、2C與3B、3E)中不可見。3A、3B、3D、3E的初始放大倍數為400 X，3C為1000 X，及3F、3G 為100X。所有的免疫組化標記為過氧化酶偶聯的鏈親和素，該鏈親和素結合生物素化的二 級抗體；標記為棕色。3F及3G所示的切片以高碘酸-希夫反應以及艾西藍染色。圖4A、4B、4C、4D 環杷明處理的正常皮膚的Ber_Ep4標記正常模式，該模式表明， 儘管將正常表皮及毛囊的未分化細胞以與BCC' s同樣的方案及劑量暴露於環杷明，仍保 持原樣。4A 環杷明處理的表皮基底層細胞的Ber-Ep4標記。4B及4C 環杷明處理的表皮 的不同區域的高倍視野，表明基底細胞的Ber-Ep4標記。4D 以環杷明處理的毛囊的高倍視 野，仍然顯示Ber-Ep4的正常標記。4A的初始放大倍數為400X，4B、4C、4D為1000X。免
6疫組化檢測方法同圖3A、3B ；標記顯棕色。表1 環杷明局部處理誘導的基底細胞癌細胞的分化及細胞凋亡 所示的平均值士標準差至少源於16個隨機選擇的每組腫瘤組織切片的高倍 (1000X)視野。對圍護外圍及非圍護的(內部)腫瘤區域、安慰劑與環杷明處理腫瘤的各 項參數，P < 0. 001。第12 頁上的同樣附圖(圖 1A、1B、1C、1D，圖 2A、2B、2C、2D、2E、2F，圖 3A、3B、3C、3D、 3E、3F、3G，圖4A、4B、4C、4D)的彩圖，其頁碼在此增補為12a，基於免疫組化方法的數據及資 料的性質，彩圖比灰圖傳遞信息更佳；我們真誠地希望專利局能夠考慮這些事實將這幾頁 保留作為本專利申請的一部分。然而，若專利局考慮沒有必要，也可從專利申請中去除12a。
權利要求
環杷明或其可藥用鹽在基底細胞癌的局部治療中的用途。
2.環杷明或其可藥用鹽在用於局部治療基底細胞癌的藥學組合物的製備中的用途。
3.環杷明或其可藥用鹽在以非局部途徑包括以腫瘤內注射的途徑用於基底細胞癌的 治療中的用途。
4.環杷明或其可藥用鹽在用於局部治療基底細胞癌的藥學組合物製備中的用途，該治 療以非局部途徑包括腫瘤內注射劑途徑實現。
5.環杷明或其可藥用鹽或其衍生物在局部治療基底細胞癌中的用途。
6.環杷明或其可藥用鹽或其衍生物在用於局部治療基底細胞癌的藥學組合物的製備 中的用途。
7.環杷明或其可藥用鹽或其衍生物在以非局部途徑包括以腫瘤內注射的途徑用於基 底細胞癌的治療中的用途。
8.環杷明或其可藥用鹽或其衍生物在用於局部治療基底細胞癌的藥學組合物製備中 的用途，該治療以非局部途徑包括腫瘤內注射劑途徑實現。
9.環杷明或其可藥用鹽在用於腫瘤治療中的用途，該類腫瘤利用hedgehog/ smoothened信號轉導通路進行增殖和/或防止凋亡或細胞分化。
10.環杷明或其可藥用鹽在用於治療腫瘤的藥學組合物製備中的用途，該類腫瘤利用 hedgehog/smoothened信號轉導通路進行增殖和/或防止凋亡或細胞分化。
11.環杷明或其可藥用鹽或其衍生物在用於腫瘤治療中的用途，該類腫瘤利用 hedgehog/smoothened信號轉導通路進行增殖和/或防止凋亡或細胞分化。
12.環杷明或其可藥用鹽或其衍生物在用於治療腫瘤的藥學組合物製備中的用途，該 類腫瘤利用hedgehog/smoothened信號轉導通路進行增殖和/或防止凋亡或細胞分化。
全文摘要
本發明涉及環杷明在治療基底細胞癌及其它腫瘤中的應用。本發明涉及環杷明在體內治療基底細胞癌的應用，通過引起腫瘤細胞的分化和高效的凋亡以及將這些腫瘤細胞的除去實現治療效果，而對正常的組織細胞，包括正常表皮基底層及毛囊的未分化細胞無影響。環杷明通過非基因毒性機制引起細胞凋亡。這些效果使環杷明在治療基底細胞癌及其它癌症方面非常理想，這些癌症利用hedgehog/smoothened信號轉導通路進行分化並防止凋亡。
文檔編號A61K31/58GK101904852SQ20101014325
公開日2010年12月8日 申請日期2001年7月2日 優先權日2001年7月2日
發明者奧凱·阿夫齊, 辛南·塔斯 申請人:辛南·塔斯