一種禽用疫苗抗原純化的方法
2023-12-02 08:25:06
一種禽用疫苗抗原純化的方法
【專利摘要】本發明涉及一種禽用疫苗抗原純化的方法，屬於生物製品製備【技術領域】。該純化方法包括如下步驟：（1）將收穫的動物疫苗抗原離心澄清；（2）將步驟（1）得到的澄清抗原泵入分子量切割過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/2～1/10；（3）用無菌PBS緩衝液將步驟（2）的抗原濃縮液稀釋至原體積；（4）重複所述步驟（2）和步驟（3）2～5次後，收穫純化後的動物疫苗抗原。該方法對於降低禽用疫苗的免疫副反應以及提高疫苗免疫效果具有積極的意義。
【專利說明】一種禽用疫苗抗原純化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物製品【技術領域】，具體地涉及一種禽用疫苗抗原純化的方法。
【背景技術】 [0002]目前，我國絕大多數企業的禽用疫苗抗原經組織培養、細胞培養以及雞胚培養等生產方式得到後，直接用以疫苗的配製。這種生產工藝技術操作簡單，成本低廉，但也使生產的抗原雜質較多，導致疫苗的免疫副反應大，產品穩定性差，影響疫苗免疫效果。近年來也有企業在禽用疫苗抗原下遊加工處理方面進行了研究。專利CN102171334A公開了一種純化流感病毒的製備方法，該方法用表面活性劑處理流感病毒後用羥磷灰石進行吸附，該方法操作複雜，工藝成本較高，不適用於獸用禽流感疫苗的生產。餘祖華在2010年對紅細胞吸附釋放法、PEG-6000沉澱法和超速離心法三種純化新城疫病毒的方法進行了簡單的比較，結果表明這三種方法均不適合實際生產的應用。目前，尚無雞傳染性法氏囊疫苗抗原、雞傳染性支氣管炎疫苗抗原以及減蛋綜合症疫苗抗原在純化技術方面的報導。
【發明內容】
[0003]為克服上述缺陷，本發明的目的是提供禽用疫苗抗原純化的方法。
[0004]為實現上述目的，本發明利用分子量切割的過濾技術對禽用疫苗抗原進行純化，該方法包括如下步驟:
[0005]( I)將收穫的禽用疫苗抗原經離心機離心澄清，收取澄清的抗原液；
[0006](2)將步驟(1)得到的澄清抗原泵入分子量切割過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/2~1/10 ；
[0007](3)用無菌的PBS緩衝液將步驟(2)得到的抗原濃縮液稀釋至原體積；
[0008](4)重複步驟(2)和步驟(3) 2~5次後，收穫純化後的禽用疫苗抗原。
[0009]所述的禽用疫苗抗原為禽流感疫苗抗原、新城疫疫苗抗原、雞傳染性法氏囊疫苗抗原、雞傳染性支氣管炎疫苗抗原和減蛋綜合症疫苗抗原。
[0010]優選的，步驟(1)所述的離心機包括筒式離心機和管式離心機。
[0011]優選的，步驟(2)中分子量切割的過濾系統為切向流超濾系統，具體為密理博、波爾或賽多利斯三者中任選其一均可，膜包的分子量大小為30KD~1000KD。
[0012]優選的，步驟(3)所述PBS溶液為pH值為7.2~7.4，濃度為0.01mol/L。
[0013]優選的，步驟(1)中的筒式離心機離心速率為8000~20000r/min，離心時間為5~30min ;管式離心機離心速率為10000r/min~30000r/min,進液速率為100ml/min~5000ml/mino
[0014]優選的，步驟(1)中收取澄清的抗原的方法為:筒式離心機為收取上清；管式離心機為收取流出的澄清的抗原。優選的，所述步驟(2)中動物疫苗抗原濃縮至原體積的1/2~1/10後，棄去透過液，保留回流液。
[0015]本發明的有益效果:本發明提供了禽用疫苗抗原純化的方法，為提高我國禽用疫苗質量提供新技術。該技術操作簡單，僅需I套簡單的分子量切割過濾設備即可完成抗原純化，純化的疫苗抗原蛋白去除率達到90%以上，抗原回收率在85%以上。在禽用疫苗生產中具有明顯的優勢和巨大的應用價值，對於降低禽用疫苗的免疫副反應以及提高疫苗免疫效果具有積極的意義。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
[0017]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0018]實施例1禽流感疫苗抗原純化
[0019]( 1)將收穫的禽流感疫苗抗原(乾元浩生物股份有限公司生產)使用筒式離心機收取上清，離心速率為15000r/min，離心時間為IOmin ;使用管式離心機(GQLB-N75，遼陽陽光製藥機械有限公司)收取流出的澄清的抗原，離心速率為20000r/min進液速率為500ml/min，收集離心澄清的抗原；
[0020](2)將離心澄清後的抗原泵入分子量大小為1000KD的切向流過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/10，棄去透過液，保留回流液；
[0021](3)用無菌的PBS緩衝溶液將抗原濃縮液稀釋至原體積；所述PBS溶液pH值為7.2，濃度為 0.01mol/L ；
[0022](4)重複步驟(2)和步驟(3)4次，最後I次將抗原濃縮至原體積的1/2，即可收穫純化後的禽流感疫苗抗原。
[0023](5)用1%的雞紅細胞檢測純化前後疫苗抗原HA的大小。純化後的抗原用PBS逐漸稀釋至HA效價與純化前保持一致，記下稀釋後的純化抗原體積，根據純化前後抗原體積的大小計算抗原回收率，結果見表1。
[0024](6)用分光光度計測定純化前後總蛋白含量，計算蛋白去除率，結果見表1。
[0025]實施例2新城疫疫苗抗原純化
[0026]( 1)將收穫的新城疫疫苗抗原(乾元浩生物股份有限公司生產)使用筒式離心機收取上清，離心速率為20000r/min，離心時間為8min ;使用管式離心機(GQLB-N75，遼陽陽光製藥機械有限公司)收取流出的澄清的抗原，離心速率為15000r/min，進液速率為500ml/min，收集離心澄清的抗原；
[0027](2)將離心澄清後的抗原泵入分子量大小為1000KD的切向流過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/10，棄去透過液，保留回流液；
[0028](3)用無菌的PBS緩衝溶液將抗原濃縮液稀釋至原體積；所述PBS溶液pH值為7.2，濃度為 0.01mol/L ；
[0029](4)重複步驟(2)和步驟(3)4次，最後I次將抗原濃縮至原體積的1/2，即可收穫純化後的禽流感疫苗抗原。
[0030](5)用1%的雞紅細胞檢測純化前後疫苗抗原HA的大小。純化後的抗原用PBS逐漸稀釋至HA效價與純化前保持一致，記下稀釋後的純化抗原體積，根據純化前後抗原體積的大小計算抗原回收率，結果見表1。
[0031](6)用分光光度計測定純化前後總蛋白含量，計算蛋白去除率，結果見表1。[0032]實施例3雞傳染性法氏囊疫苗抗原純化
[0033]( I)將收穫的雞傳染性法氏囊疫苗抗原(乾元浩生物股份有限公司生產)使用筒式離心機收取上清，離心速率為8000r/min，離心時間為30min ;使用管式離心機(GQLB-N75，遼陽陽光製藥機械有限公司)收取流出的澄清的抗原，離心速率為30000r/min，進液速率為2000ml/min,收集離心澄清的抗原；
[0034](2)將離心澄清後的抗原泵入分子量大小為1000KD的切向流過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/8棄去透過液，保留回流液；
[0035](3)用無菌的PBS緩衝溶液將抗原濃縮液稀釋至原體積；所述PBS溶液pH值為7.4，濃度為 0.01mol/L ；
[0036](4)重複步驟(2)和步驟(3)4次，收穫純化後的禽流感疫苗抗原，注意保持純化前後抗原體積不變。
[0037](5)將純化前後的抗原進行10倍倍比稀釋，接種SPF雞胚，計算純化前後抗原的ELD5tl，計算抗原回收率，結果見表1。
[0038](6)用分光光度計測定純化前後總蛋白含量，計算蛋白去除率，結果見表1。
[0039]實施例4傳染性支氣管炎疫苗抗原純化
[0040]( I)將收穫的傳染性支氣管炎疫苗抗原(乾元浩生物股份有限公司生產)使用筒式離心機收取上清，離心速率為10000r/min，離心時間為20min ;使用管式離心機(GQLB-N75，遼陽陽光製藥機械有限公司)收取流出的澄清的抗原，離心速率為20000r/min，進液速率為500ml/min,收集離心澄清的抗原；
[0041](2)將離心澄清後的抗原泵入分子量大小為300KD的切向流過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/5棄去透過液，保留回流液；
[0042](3)用無菌的PBS緩衝溶液將抗原濃縮液稀釋至原體積；所述PBS溶液pH值為7.3，濃度為 0.01mol/L ；
[0043](4)重複步驟(2)和步驟(3)4次，收穫純化後的禽流感疫苗抗原，注意保持純化前後抗原體積不變。
[0044](5)將純化前後的抗原進行10倍倍比稀釋，接種SPF雞胚，計算純化前後抗原的EID5tl，計算抗原回收率，結果見表1。
[0045](6)用分光光度計測定純化前後總蛋白含量，計算蛋白去除率，結果見表1。
[0046]實施例5減蛋綜合症疫苗抗原純化
[0047](I)將收穫的減蛋症候群疫苗抗原(乾元浩生物股份有限公司生產)使用筒式離心機收取上清，離心速率為20000r/min，離心時間為15min ;使用管式離心機(GQLB-N75，遼陽陽光製藥機械有限公司)收取流出的澄清的抗原，離心速率為30000r/min，進液速率為1500ml/min,收集離心澄清的抗原；
[0048](2)將離心澄清後的抗原泵入分子量大小為500KD的切向流過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/10棄去透過液，保留回流液；
[0049](3)用無菌的PBS緩衝溶液將抗原濃縮液稀釋至原體積；所述PBS溶液pH值為
7.2，濃度為 0.01mol/L ；
[0050](4)重複步驟(2)和步驟(3)4次，最後I次將抗原濃縮至原體積的1/2，即可收穫純化後的禽流感疫苗抗原。[0051](5)用1%的雞紅細胞檢測純化前後疫苗抗原HA的大小。純化後的抗原用PBS逐漸稀釋至HA效價與純化前保持一致，記下稀釋後的純化抗原體積，根據純化前後抗原體積的大小計算抗原回收率。結果見表1。
[0052](6)用分光光度計測定純化前後總蛋白含量，計算蛋白去除率。結果見表1。
[0053]表1禽用疫苗抗原純化檢測結果
【權利要求】
1.一種禽用疫苗抗原純化的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)將收穫的禽用疫苗抗原經離心機離心澄清，收取澄清的抗原液； (2)將步驟(1)得到的澄清抗原泵入分子量切割過濾系統進行純化，並濃縮至原體積的1/2 ~1/10 ； (3)用無菌的PBS緩衝液將步驟(2)得到的抗原濃縮液稀釋至原體積； (4)重複步驟(2)和步驟(3)2~5次後，收穫純化後的禽用疫苗抗原。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)所述的禽用疫苗抗原為禽流感疫苗抗原、新城疫疫苗抗原、雞傳染性法氏囊疫苗抗原、雞傳染性支氣管炎疫苗抗原或減蛋綜合症疫苗抗原。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)使用筒式離心機收取上清；使用管式離心機收取流出的澄清的抗原。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中筒式離心機離心速率為8000~20000r/min,離心時間為5~30min ;管式離心機離心速率為10000r/min~30000r/min,進液速率為 100ml/min ~5000ml/min。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中分子量切割過濾系統為切向流超濾系統，膜包的分子量大小為30KD~1000KD。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中動物疫苗抗原濃縮至原體積的1/2~1/10後,棄去透過液,保留回流液。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)所述PBS緩衝液pH值為7.2~7.4，濃度為 0.01mol/L。
【文檔編號】C07K14/125GK103601793SQ201310504950
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】黃文強, 王賀民, 劉兆環, 嚴石, 周蕾蕾, 陳秋閣, 李愛君 申請人:乾元浩生物股份有限公司