3,4-二羥基-苯基乳酸在製備治療微循環障礙的藥物中的應用的製作方法

2023-12-02 08:35:01

專利名稱：3,4-二羥基-苯基乳酸在製備治療微循環障礙的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，尤其涉及3,4-二羥基-苯基乳酸在製備治療缺血 /再灌注弓I起的微循環障礙的藥物中的應用。
背景技術：
缺血/再灌注(I/R)引起大量的微循環損傷反應，如增加從上皮細胞 產生的氧自由基產物，增加白細胞上的L-選擇素和內皮細胞上的E-選擇 素的表達，引起白細胞的波動，增加白細胞上的CDllb/CD18和內皮細胞 上的細胞間粘附分子(ICAM-1)的表達。這些分子能使白細胞粘附毛細 血管後細靜脈(postcapillary venules),引起氧自由基的釋放從而引起血管 內皮的損傷。此外，毛細血管後細靜脈也以肥大細胞脫顆粒作用和血管活 性物質釋放響應I/R，其牽涉到增加白細胞粘附到毛細血管後細靜脈和白 蛋白外漏。再灌注後白細胞的粘附、氧自由基的釋放和肥大細胞脫顆粒作 用被認為與微血管損傷的過程密切相關。
據報導，用對抗粘附分子的抗體進行預處理可抑制I/R引起的白細胞 向毛細血管後細靜脈的粘附和I/R-誘導的氧自由基生成。還有報導，以抗 氧化劑或肥大細胞脫顆粒抑制劑進行預處理可減弱I/R-促進的氧自由基生 成、白細胞向毛細血管後細靜脈的粘附和肥大細胞脫顆粒。然而，未見有 關抗氧化劑是否可以恢復I/R引起的粘附到細靜脈壁上的白細胞的報導。
丹參(&/v/a柳7riwr/2/za ， SM)在中國、韓國、日本和其他亞洲國 家被用於治療各種血管疾病。
丹參對缺血再灌注引起的微循環障礙有多靶點治療的作用臨床上丹 參用於治療心腦血管障礙性疾病。在微循環障礙已經發生後丹參仍有較好 的治療作用。為了觀察丹參對缺血再灌注引起的微循環障礙的治療作用，
3已有研究在缺血再灌注10分(即微循環障礙發生之後)之後開始連續給予
丹參。缺血再灌注10分鐘時，微循環障礙已經明顯發生，血管壁DHR熒 光強度增強、白細胞粘附於血管壁、白蛋白外漏等已經出現。超氧化物歧 化酶SOD在缺血再灌注之前給予時，可以預防微循環障礙，但在缺血再 灌注10分鐘時開始再給予SOD時，沒能有效地清除過氧化物、沒能解離 已經粘附在細靜脈內皮細胞上的白細胞、沒能抑制肥大細胞脫顆粒、也未 能維護血管通透性。而丹參在缺血再灌注10分鐘時給予時，可以清除粘 附在細靜脈上的白細胞、清除過氧化物、維護血管通透性、抑制肥大細胞 脫顆粒。可見，丹參在預防性給予時有與SOD相同的預防作用。在微循 環障礙發生之後，丹參有SOD所不具備的清除多種過氧化物、解離已經 與血管粘附的白細胞、抑制肥大細胞脫顆粒等作用。SOD通過歧化超氧陰 離子來預防缺血再灌注引起的微循環障礙，其作用靶點、作用環節單一。 當微循環障礙超出此環節後，SOD的作用就難以表現出來了。而丹參改善 微循環障礙的靶點較多，即使在微循環障礙發生之後也可以發揮治療作 用。
丹參水提取物中主要的化合物包括3,4-二羥基-苯基乳酸(DLA，圖1)， 原兒茶醛(PA1)、原兒茶酸(PA)、咖啡酸(CA,單酚酸)、丹酚酸A-G、丹參 酚酸(lithospermate acid ， LsA，多酚酸)。它們中的DLA是確認的化合 物，其也構成丹酚酸A-G和丹參酚酸(LsA，多酚酸)結構的一部分。據 報導DLA和咖啡酸在口服水溶性總丹酚酸的受試者的血漿中檢出。
在過去十年中，DLA和包含DLA的化合物的生物作用吸引了許多 的關注，並且這些試劑的藥物活性的譜圖也已被揭示出來。體內實驗結果 證明，1/R引起的器官損傷可以從DLA和包含DLA的化合物中獲得改善。 如，SM的水溶性化合物(WSC)據報導可增加存活率、減少梗塞大小與 左心室大小的比率，發現LsB可減少兔缺血心臟的心肌損傷，觀察到SalA 和Sa舊可保護大腦免受損傷。觀察到救心丸(CP，其主要成分是DLA和 SalB)可改善肝損傷，並且LSB和MLB據報導可保護肺免受損傷。
此外，還發現DLA可保護線粒體膜免受I/R引起的損傷和脂質過氧 化作用(LPO)。另一方面，還進行了許多體外研究，以揭示DLA和包含DLA的化合物對由1/R損傷的器官的保護作用的機理，並且大量證據證實 了這些化合物的抗氧化劑活性。如，據報導，DLA可清除由黃嘌呤和黃 嘌呤氧化酶的反應體系產生的超氧負離子(，0"，已發現SalA可在體外抑 制由1/R產生的腦部的LPO並且清除氫氧根(，OH)，發現SalB可潛在清除 1.1-聯苯-2苦基苯肼(DPPH)，抑制LPO和除去在原代大鼠肝細胞和肝臟星 形細胞(HSCs)中的活性氧族(ROS)，抑制由澱粉樣肽A弓l起的ROS在 PCL2細胞中的產生，在體外清除過氧化氫(11202)，並抑制人體主動脈平滑 肌細胞(HASMCs)中腫瘤壞死a因子(TNF-a )引起的ROS產物和NADPH 氧化酶的活性，LsB據報導可清除過氧化亞硝酸鹽(ONOCT)。
此外，體外研究證明包含DLA的SM的WSC可抑制血管粘附分子 的表達。接下來是許多公布的有關例子SM的水溶性提取物(WSE)可 抑制由TNF-a誘導的人體臍靜脈內皮細胞(HUVECs)上的粘附分子 ICAM-1和血管細胞粘附分子l(VCAM-l)的表達，並且抑制TNF-a誘導的 核因子KB(nuclear factor kappa B， NF-KB)從細胞質到細胞核的遷移，並且 減少內皮細胞中的穀胱甘肽(GSH)。
SM中的PA1， Sa舊和WSE抑制TNF-a-誘導的ICAM-1和內皮細胞的 VCAM-1的表達，PA1抑制ICAM-1和VCAM-1以及HUVECs中的 VCAM-1和ICAM-1的mRNA表達，以及以劑量依賴性的方式由TNF-a 誘導的NF-kB和激活蛋白-l (AP-1)DNA的結合活性，SdB減弱VCAM-1 和ICAM-1的表達，抑制NF-kB在由TNF-a引起的內皮細胞中E-選擇素 的表達中的活性，CP抑制TNF-a以劑量依賴性的方式誘導的HUVECs中 的VCAM-1和ICAM-1的表達，抑制血小板源生長因子BB(platelet-derived growth factor BB)誘導的血管平滑肌細胞(VSMCs)中的DNA合成和細 胞增殖。
先前已報導DLA可抑制內毒素誘導的中性粒細胞粘附分子 CDllb/CD18的表達和在白細胞向大鼠腸繫膜細靜脈壁的粘附。此外，包 含DLA化合物的丹參注射液被證明可抑制LPS-引起的氧的過氧化物從大 鼠腸繫膜細靜脈壁生成。例如，據報導，DLA可清除由黃嘌呤和黃嘌呤 氧化酶反應體系產生的超氧負離子('02')， SalA清除'OH， SalB清除過氧化氫並抑制NADPH氧化酶的活性，LsB清除ONOCT。值得注意的是， 所有的SM的水溶性提取物具有共同的結構DLA，它的兩個羥基基團被認 為與消除活性氧族(reactive oxygen species)禾B ONOO'有關。然而，還不 清楚DLA清除體內響應I/R生成的過氧化物的潛力，也不清楚DLA是否 可對已出現的由I/R引起的過氧化物起作用。

發明內容
本發明的一個目的是提供3，4-二羥基-苯基乳酸在製備治療微循環障 礙的藥物中的應用。
其中所述微循環障礙為腸繫膜微循環障礙。
所述微循環障礙由缺血/再灌注引起。
本發明的另外一個目的是提供3，4-二羥基-苯基乳酸在製備防止微循 環障礙引起的白細胞粘附的藥物中的應用。
本發明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在製備恢復微循環 障礙所引起的已粘附的白細胞的藥物中的應用。
本發明還有一個目的是提供3，4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環 障礙引起的白蛋白從細靜脈滲出的藥物中的應用。
本發明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環 障礙弓I起的肥大細胞脫顆粒的藥物中的應用。
本發明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環 障礙引起的中性粒細胞上粘附分子CDllb和CD18表達的藥物中的應用。
本發明還有一個目的是提供3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環 障礙引起的過氧化物生成的藥物中的應用。
為了達到上述發明目的，本發明採用的實驗方案如下，在戊巴比妥鈉 麻醉下，通過具有CCD或SIT照相系統的活體倒置式顯微鏡觀察雄性韋斯 特(Wistar)大鼠的回盲部的腸繫膜微循環，研究DLA對缺血/再灌注(I/R) 引起的大鼠腸繫膜微循環損傷的作用。
6腸繫膜動脈和靜脈結紮10分鐘後，鬆開進行再灌注。測量在缺血前十 分鐘不間斷地注入或不注入DLA(5mg/kg/hr)或超氧化物歧化酶(SOD 12000 units/kg/hr)的細靜脈的直徑、粘附白細胞的量、異硫氰酸螢光素 (FITC)標記白蛋白的滲出、二氫羅丹明123(dihydrorhodamine， DHR)的 螢光和肥大細胞的脫顆粒。在另一組實驗中，在再灌注開始後十分鐘不間 斷地注入DLA或SOD。通過體外實驗測定中性粒細胞粘附分子CDllb和 CD18的表達。
結果顯示採用DLA預處理明顯減少細靜脈壁上過氧化物的生成、白細 胞向細靜脈壁的粘附、肥大細胞脫顆粒作用以及I/R引起的大鼠腸繫膜中白 蛋白的滲出。DLA後處理改善I/R引起的大鼠腸繫膜紊亂，而且通過DLA 的注入使細靜脈壁上過氧化物的生成和白蛋白的滲出率維持不變，附著在 細靜脈壁上的白細胞也通過DLA恢復，除了肥大細胞脫顆粒作用不受DLA 後處理的影響。
CDllb和CD18的螢光強度通過H202的刺激明顯增加，並且這種增加 由DLA以濃度依賴性方式處理明顯地減弱，提高DLA抑制白細胞粘附的能 力可能與其抑制粘附分子表達的潛力相關的可能性。對於大多數測定的參 數，DLA起到的減弱作用通過SOD模擬，意味著DLA的抗氧化劑活性對 1/R引起的大鼠腸繫膜微循環障礙具有潛在的多重改善作用。
本發明中，觀察到I/R導致毛細血管後細靜脈一系列的機能障礙，如白 細胞粘連、過氧化物在細靜脈管壁的生成、白蛋白從細靜脈管壁的滲出和 體內肥大細胞脫顆粒作用。更為突出的，所有觀察的I/R誘導的現象，可通 過DLA處理明顯減少或完全消失，不管該處理是在缺血之前還是之後實施 的，例外的情況是，由I/R誘導的肥大細胞脫顆粒作用的增加只能通過採用 DLA預處理才能抑制。
此外，體外研究表明用H202刺激可增強中性粒細胞的CDllb/CD18的 螢光強度，並且這種增強可被DLA處理明顯減弱。
這很好地證明血管內皮細胞響應I/R，通過黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶爆發 性地生成02-，由於SOD的反應黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶都轉化成H202。所得11202或者通過過氧化氫酶轉化為1120，或者和02'經Haber-Weiss反應生 成羥自由基。 一氧化氮與超氧自由基快速反應的結果是形成過氧亞硝基 (peroxynitrite)， 一種在氧化應激反應中重要的細胞毒性的介質。
此外，粘附到毛細血管後細靜脈的白細胞引起氧自由基的釋放。羥自 由基('OH)和過氧亞硝基(ONOCT)誘發脂質過氧化反應和DNA的損傷， 因而引起上皮細胞和基底膜的損傷。因此，消除過氧化物是改善由I/R引起 的微循環障礙的重要對策。越來越多的體外實驗證據已證明了SM及其衍 生物的抗氧化性潛力。
本發明的研究結果證明DLA可清除大鼠體內腸繫膜細靜脈壁由I/R刺 激引起的過氧化物生成的能力，並表明，不僅是提前給藥，而且試驗後給 藥，DLA都可在該體系內發揮其清除作用。
白細胞恢復是由I/R刺激的關鍵結果，其從促炎症反應介質的釋放以及 通過NF-KB的激活對粘附分子的表達的增強開始。白細胞上的粘附分子 CDllb/CD18結合它們在內皮上的配體ICAM-l，引起白細胞粘附到上皮細 胞，導致產生過氧化物和蛋白酶，因此，損傷上皮細胞和基底膜。
因此，微循環障礙可從白細胞粘附的減弱中得到改善，其中白細胞粘 附的減弱通過白細胞粘附的預防或粘附的白細胞的恢復實現。
本發明的體內動態觀察揭示了DLA預處理可抑制由I/R誘導的白細胞 向大鼠腸繫膜細靜脈管壁的粘附，其效果與採用SOD預處理相似。此外， 體外實驗證明DLA對由H202刺激的白細胞上的CDllb/CD18的表達具有抑 製作用。這些結果結合之前已公布的結果說明DLA可減弱由I/R誘導的白 細胞向大鼠腸繫膜細靜脈管壁的粘附，其通過抑制白細胞上的粘附分子 CDllb/CD18和上皮組織上的ICAM-l的表達來進行。本研究的一個有意義 發現是，如果I/R十分鐘後白細胞的粘附已經發生時給藥，DLA能夠促進 粘附白細胞的恢復。
上述試驗結果與SOD在同種實驗情況下的表現形成鮮明的對比，SOD 可防止白細胞進一步粘附，但是不能恢復已粘附到細靜脈管壁的白細胞。
肥大細胞的脫顆粒是隨I/R發生的特定事件之一，其導致一系列的後果，如促炎症反應介質的釋放，細靜脈和毛細血管的滲透性和白蛋白的滲
出的增加。本研究的另一個有結果是，由I/R引起的血管周圍局部化肥大細 胞的脫顆粒可通過DLA或SOD預處理減弱，而後處理不能減弱。肥大細胞 脫顆粒作用可通過包括氧化應激和IgE的結合的多種刺激來激發。
DLA和SOD預處理減弱肥大細胞脫顆粒作用的相似性說明，DLA的抗 氧化劑活性是這種情況下防止肥大細胞脫顆粒作用的原因。DLA或SOD的 後處理對由I/R引起的大鼠腸繫膜肥大細胞脫顆粒作用無影響，說明肥大細 胞脫顆粒作用在給予DLA或SOD之前己觸發，並且這個過程是不可逆的， 所以該過程一旦開始，通過使用抗氧化劑是不能干擾的。
本發明的研究中選用白蛋白的滲出作為由I/R刺激引起的血管損傷的 一個指標，其是氧化應激的結果，並通過隨後的白細胞粘附和肥大細胞脫 顆粒作用加重。本研究的結果說明DLA和SOD預處理都能明顯減弱由I/R
引起的白蛋白滲出。
採用DLA和SOD後處理也能明顯減弱由1/R引起的白蛋白的滲出，但 是與前處理的方式不同，在DLA和SOD輸注過程中白蛋白滲出不變，表明 可通過該試劑來防止白蛋白滲出的進一步增加。值得注意的是，細靜脈壁 上的氧化劑敏感型螢光探針DHR以相似的方式響應DLA和SOD: 1/R引起 的DHR螢光可通過使用DLA或SOD預處理來抑制，然而在後處理的情況 下，只要出現DLA或SOD，則其保持不變。
響應DLA和SOD後處理的白蛋白滲出動力學和DHR螢光性間的相似 性有力地表明，在該條件下觀察到的血管損傷與氧化應激有緊密聯繫。
總之，本發明的研究證明了DLA預處理明顯減少由I/R誘導的大鼠腸 繫膜過氧化物生成、白細胞向微血管壁的粘附、肥大細胞脫顆粒作用和白 蛋白的漏出率。再灌注10分鐘後開始的DLA後處理也可以改善由I/R誘導 的大鼠腸繫膜障礙，但其以獨特的方式進行，通過DLA的注入使過氧化物 的生成和白蛋白的滲出保持不變，已經粘附到血管壁的白細胞可通過DLA 恢復，且與SOD的效果不同，SOD在這種情況下能防止白細胞進一步粘附， 但不能恢復已經粘附的白細胞，例外的是，肥大細胞脫顆粒作用不受DLA
9或SOD後處理的影響。
體外實驗顯示，H202引起的中性粒細胞CDllb和CD18的螢光強度的 增加可通過濃度依賴方式的DLA處理明顯減弱，提高DLA抑制白細胞的粘 附與其抑制粘附分子表達的潛力相關的可能性。對於大多數測試參數來說 DLA產生的衰減效應與SOD相仿，此事實有力地說明，抗氧活性和DLA對 白細胞上粘附分子CDllb/CD18的抑制是其對I/R誘導的大鼠腸繫膜微循 環障礙的改善作用的基礎。3,4-二羥基-苯基乳酸可以作為製備治療缺血/ 再灌注引起的微循環損傷的理想藥物。
為讓本發明之上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉 較佳實施例，並配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為3， 4-二羥基-苯基乳酸(DLA)的化學結構式。
圖2A和圖2B表示採用DLA或SOD預處理或後處理對由I/R誘導的大 鼠腸繫膜細靜脈壁上白細胞粘附的經時影響。其中圖2A表示採用DLA或 SOD對由I/R誘導的白細胞粘附的預處理。DLA+I/R:DLA預處理組； SOD+I/R:SOD預處理組。圖2B表示採用DLA或SOD對由I/R誘導的白細胞 粘附的後處理。1/R+DLA:DLA後處理組；I/R+SOD: SOD後處理組；數據 為六隻大鼠的平均值士SD。 *P<0.05對基線，#P<0.05對I/R組，卞P0.05 對SOD組。
圖3A和圖3B表示大鼠腸繫膜細靜脈壁上的DHR螢光比率的經時變 化。其中圖3A表示採用DLA或SOD預處理對細靜脈管壁DHR螢光比率的 影響，DLA+I/R: DLA預處理組；SOD+I/R:SOD預處理組。圖3B表示採用 DLA或SOD後處理對細靜脈管壁DHR螢光比率的影響，I/R+DLA: DLA後 處理組；H+SOD:SOD後處理組，數據為六隻大鼠的平均值士SD。 *P<0.05 對基線，弁P0.05對I/R組。
圖4A和圖4B表示大鼠腸繫膜細靜脈壁白蛋白滲出的經時變化。其中 圖4A表示採用DLA或SOD預處理對細靜脈管壁白蛋白滲出的影響，DLA+I/R:DLA預處理組；SOD+I/R:SOD預處理組。圖4B表示採用DLA或 SOD後處理對細靜脈管壁白蛋白滲出的影響，I/R+DLA: DLA後處理組； 1/R+SOD:SOD後處理組，數據為六隻大鼠的平均值士SD。 *P<0.05對基線， #P<0,05對I/R組。
圖5A和圖5B表示DLA和SOD對對照組、1/R組、DLA+I/R組、SOD+I/R 組、1/R+DLA組和1/R+SOD組中由I/R誘導的大鼠腸繫膜細靜脈壁的肥大 細胞脫顆粒作用的影響，數據為六隻大鼠的平均值士SD。 *P<0.05對基線， #P<0.05對I/R組。
圖6表示DLA對H202誘導的大鼠腸繫膜粘附分子CDllb和CD18的表 達的影響。粘附分子的表達在縱坐標上以螢光強度表示。H202:H202 組；H2O2+DLA0.2:H2O2力卩DLA0.2mg/ml組；H2O2+DLA0.5:H2O2加 DLA0.5mg/ml組;H2O2+DLAl .0:H2O2加DLAl .0mg/ml組。數據為六隻大鼠 的平均值士SD。 *P<0.05對對照組，弁P0.05對LPS組。
圖7表示DLA減輕由缺血和再灌注引起的微循環障礙的示意圖。I/R， 表示缺血和再灌注；XO，表示黃嘌呤氧化酶；CDllb/CD18，表示粘附分 子CDllb和CD18; ICAM-1，表示細胞間粘附分子-l;丄，表示抑制。
具體實施方式
實施例一 實驗材料的準備 動物
所有研究都得到批准，所有實驗動物的處理都是根據慶應義塾大學動 物研究委員會的指南進行的。體重200g-250g的雄性韋斯特大鼠(埼玉縣 實驗動物提供有限公司，日本埼玉縣)在試驗前禁食12小時，但允許自由飲水。
試劑
DLA (化學式見圖l)購自中國藥品生物製品檢定所(中國北京)。 超氧化物歧化酶(SOD),甲苯胺藍，螢光標記牛血清白蛋白購自西格瑪 化學試劑公司(Sigma chemical.co )(Missour, USA)， 二氫羅丹明123 (DHR)購自分子探針(Molecular Probes) (Oregon, USA)。結合FITC的小鼠抗 CDllb單克隆抗體(FITC-conjugated mouse anti國rat CDllb monoclonal antibody)，結合FITC的小鼠抗CD18單克隆抗體(FITC-conjugated mouse anti-rat CD 18 monoclonal antibody)，結合FITC的小鼠IgA、 k及結合FITC 的小鼠IgGl， k胸自BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)，溶血素購 自BD Biosciences Immunocytometer Systems (San Jose， CA).
單-聚溶解介質購自大日本製藥株式會社(Dainippon Pharmaceutical Corporation)(日本大阪)。RPMI 1640和胎牛血清購自Hyclone (Logan， UT)，其它所有的化學試劑都採用市售的最高等級。
缺血/再灌注大鼠的製備
大鼠腹膜內注射戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)麻醉。右側頸靜脈用聚 乙烯導管插管。通過20-30mm長的中線切口打開腹部。輕取腸繫膜尾端 20cm的回盲部，固定在專用於大鼠的透明塑料臺上。
通過在37。C在腸繫膜上用K氏緩衝液(Krebs-Ringer bicarbonate buffered solution)連續表面灌流來維持溫度和溼度。通過倒置顯微鏡 (Diaphot TMD-2S, Nikon，日本東京)觀測腸繫膜的微循環的血流動力學。 腸繫膜通過12V100W直流穩定光源透照。安放在顯微鏡上的攝像機將圖像 傳輸到彩色監視器上，並且圖像通過錄影帶錄像機記錄。視頻時間-日期 發生器將時間和計時錶投射在監視器上。選用直徑範圍在25到40pm之間 且長度大於200pm的單獨的無支鏈的細靜脈進行實驗。
對大鼠腸繫膜微脈管系統的基本的血液動力學10分鐘基礎觀察後，通 過由聚乙烯管制成的勒除器同時結紮前腸繫膜動脈的供應分枝和相應的 細靜脈10分鐘，隨後再釋放血流引起I/R。由於在整個缺血過程中血管內的 RBC速度不為0，所以可能會有間接的向觀察區域的灌注。因此，為了促 進缺血，對動脈和靜脈都進行結紮，以阻止血液供給並且誘導細靜脈充血。 早先研究表明，10分鐘的缺血接著再灌注足以誘導腸繫膜微循環障礙，而 腸組織損傷最小。未進行I/R的對照大鼠作為對照。
實施例二實驗方案在I/R組(I/R)，在缺血前10分鐘開始經過頸靜脈導管不斷地注入鹽 溶液(6 ml/kg/hr)，並一直保持到觀察結束。對照組動物(Sham)接受 與I/R組相同的處理。
在DLA預處理組(DLA+I/R)或SOD預處理組(SOD+I/R)，在缺血前 IO分鐘開始經過頸靜脈不斷地注入DLA (5 mg/kg/hr)或SOD (12000 u/kg/hr)，並一直保持到觀察結束。
在DLA後處理組(I/R+DLA)或SOD後處理組(I/R+SOD),在再灌注後 IO分鐘開始經過頸靜脈不斷地注入DLA (5 mg/kg/hr)或SOD (12000 u/kg/hr)，並一直保持到觀察結束。
實施例三實驗參數的測定
細靜脈參數的測量
細靜脈的圖像通過電荷耦合器件(CCD)彩色攝影系統(CC-090, Flovel, 日本東京)獲得。腸繫膜細靜脈的直徑通過視頻測量尺(video measuring gauge ) (IV-560; Hod，日本東京)測量。在錄像帶圖像的回放過程中，離 線測定粘附和移動的白細胞的數量。從回放的錄像圖像中判斷，將附著在 同一位置超過30秒的白細胞確定為粘附到細靜脈壁上的粘附白細胞。
沿著從記錄的錄像帶圖像中隨機選擇的細靜脈(直徑25-40 長度 200 pm)對粘附的白細胞的數量進行計數，並且表示為每200um細靜脈長 度的數量。白細胞的移動表示為環繞細靜脈的每一視野的量。
為了定量白蛋白穿過腸繫膜的細靜脈的滲出，正如之前所描述的，在 每次實驗前10分鐘向受試動物靜脈注射50mg/kg FITC標記的牛血清白蛋 白。螢光強度(激發波長420到490nm，發射波長在520nm)由採用矽強化 靶的照相機(C-2400-08; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu,日本)來測定。 細靜脈壁上的FITC-白蛋白的螢光強度用圖像處理器監控和測定。
在另一組實驗中，如之前所描述的，將氧化劑敏感的螢光探針二氫羅 丹明123 (DHR; Molecular Probes,美國俄勒岡州)加入到腸繫膜的灌流液 (10 pmol/L)中來判斷細靜脈壁中的氧化劑應激反應。觀察細靜脈壁上的 DHR螢光強度，並且通過圖像處理器(13)進行測定。細靜脈壁和室外間質(extravenularinterstitium)的螢光強度通過Image-Pro Plus 5.0軟體來測量。 將I/R以前細靜脈壁和室外間質之間的螢光強度的差異作為基線值，通過一 個時間點的細靜脈管壁和室外間質之間的螢光強度的差異與基線值的比 例，來計算DHR螢光強度的比率。
肥大細胞通過在I/R以後30分鐘在腸繫膜局部應用0.1。/。甲苯胺藍活 體染色(vital staining)法來確認。未脫顆粒的肥大細胞和脫顆粒的肥大細 胞的數量從CCD視頻圖像上進行計量，計算脫顆粒的肥大細胞的數量佔全 部測評肥大細胞的數量的比率，並表示為脫顆粒的肥大細胞的比率。
中性粒細胞上粘附分子CDllb和CD18的表達的測定
血液取自正常大鼠的腹部主動脈並以肝素抗凝。每個實驗組取200 ^tl 整份血漿。在對照組(n=6)，樣品不添加任何添加劑，在11202組(n=6) 樣品中加入H2O2(100mM)。在DLA處理組，樣品中加入H2O2(100mM)和 DLA(0.2 mg/ml， 0.5 mg/ml or 1.0 mg/ml)。
所有的製劑在37t:保持兩小時，隨後用FITC標記的抗-CDllb(5 pg/ml〕 或FITC標記的抗-CD18 (5 pg/ml)的抗體或相應的FITC標記的小鼠同型物 (5 pg/ml)室溫下孵化20分鐘，並且根據廠商說明採用溶血素來使紅細胞溶 解。細胞用PBS衝洗兩遍，並且平均螢光強度採用流式細胞儀(FACS Calibur; BD company,美國)來測評。中性粒細胞按照報導(Sun K， Wang CS， Guo J， Liu YY， Wang F， Liu LY， He JG， Fan JY， and Han JY. Effect of Panax notoginseng saponins on lipopolysaccharide-induced adhesion of leukocytes in rat mesenteric venules. C7/w ^f/emor/zeo/ Af/croc/rc)描述的前-/ 側-散射的特性來分類，並且每個樣品測定5千個中性粒細胞。
實施例四統計分析
通過單因素方差分析(ANOVA)和費歇爾事後檢驗(Fisher's post hoc test)對數據進行分析。所有值用平均數i標準誤差表示，設PO.05有統計 學意義。
實施例五實驗結果的分析 細靜脈直徑變化在整個實驗過程中，1/R組沒有觀察到細靜脈直徑的明顯的改變，並且 無論以DLA或SOD預處理還是後處理，情況都保持不變。(數據未寫出)
粘附到細靜脈壁的白細胞數量的改變
圖2A和圖2B表示以DLA或SOD進行預處理或後處理對I/R誘導的白細 胞向大鼠腸繫膜細靜脈壁粘附的影響。粘附的白細胞數量在再灌注開始時 迅速增加，且數量隨時間進一步增加，直到再灌注30分鐘。用DLA預處理 可減少由I/R誘導的粘附白細胞，其在再灌注開始時明顯減小並在整個再灌 注過程中隨時間進一步減少。用SOD預處理可以以類似的方式減少由I/R 誘導的粘附白細胞數量，但是減少到更小的範圍，其在再灌注10分鐘時減 少明顯(圖2A)。
用SOD後處理抑制白細胞粘附的進一步增加，但是對已粘附的白細胞 無效。相反地，用DLA後處理顯著減少粘附的白細胞的量，表明已粘附在 細靜脈管壁上的白細胞的分離(圖2B)。
細靜脈管壁DHR螢光強度的改變
細靜脈管壁DHR螢光強度比率隨著時間過程的改變示於圖3A和圖 3B。在對照組，細靜脈管壁DHR螢光強度比率在整個觀察過程中沒有明顯 的改變。在I/R組，細靜脈管壁DHR螢光強度明顯線性增加直到再灌注結 束。用DLA前處理明顯減弱由I/R誘導的DHR螢光增強。用SOD前處理也 明顯減弱由I/R誘導的細靜脈管壁DHR螢光比率的增加，與I/R組相比較在 再灌注10和30分鐘時有明顯的不同(圖3A)。
用DLA和SOD後處理以類似的方式抑制I/R誘導的DHR螢光比率增 加，細靜脈壁DHR螢光強度在DLA或SOD輸注期間幾乎保持恆定，並且與 1/R組相比在再灌注30分鐘時達到顯著差異，其主要歸因於I/R組DHR螢光 強度的增加，如圖3B所示。
白蛋白從細靜脈管壁滲出的改變
大鼠腸繫膜細靜脈管壁的白蛋白的滲出在圖4A和圖4B中隨時間定量 化表示。在I/R之前，在所有組中皆未發現白蛋白的滲出，且對照組的整個 觀察中這個情況始終保持。在I/R組， 一旦再灌注開始，則從細靜脈滲出的白蛋白立即增加，並且直到再灌注30分鐘時，滲出進一步增加。用DLA或 SOD預處理明顯減弱由I/R誘導的白蛋白從細靜脈管壁的滲出的增加(圖4 A)。
用DLA或SOD後處理也對I/R誘導的白蛋白從細靜脈管壁的滲出產生 明顯的減弱作用，如圖4B所示。實驗顯示，只要開始輸注DLA或SOD，則 細靜脈管壁白蛋白滲出保持不變，表明採用DLA或SOD處理可防止白蛋白 的滲出進一步增加。
微血管周圍肥大細胞脫顆粒作用
1/R引起肥大細胞脫顆粒作用明顯增加(圖5A和圖5B)。定量分析表 明通過DLA和SOD預處理對I/R誘發的肥大細胞脫顆粒作用增加有明顯的 減弱作用，但通過DLA和SOD後處理無效。
中性粒細胞上的粘附分子CDllb和CD18的螢光強度
進行體外研究測定中性粒細胞上的粘附分子CDllb和CD18的螢光強 度，結果表示在圖6中。與對照組相比，H202刺激明顯增強CDllb和CD18 的螢光強度，並且這種增強可被以濃度依賴性的方式用DLA (0.2 mg/ml， 0.5 mg/ml或1.0 mg/ml)處理明顯減弱。
DLA減輕由缺血和再灌注引起的微循環障礙的示意圖如圖7所示， I/R，表示缺血和再灌注；XO，表示黃嘌呤氧化酶；CDllb/CD18，表示粘 附分子CDllb和CD18; ICAM-1，表示細胞間粘附分子-l;丄，表示抑制。
雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然其並非用以限定本發明，任 何所屬技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些 許的更動與改進，因此本發明的保護範圍當視權利要求所界定者為準。
1權利要求
1. 3，4-二羥基-苯基乳酸在製備治療微循環障礙的藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述微循環障礙為腸繫膜 微循環障礙。
3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述微循環障礙由缺 血/再灌注引起。
4. 3，4-二羥基-苯基乳酸在製備防止微循環障礙引起的白細胞粘附的 藥物中的應用。
5. 3,4-二羥基-苯基乳酸在製備恢復微循環障礙所引起的己粘附的白 細胞的藥物中的應用。
6. 3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環障礙引起的白蛋白從細靜 脈滲出的藥物中的應用。
7. 3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環障礙引起的肥大細胞脫顆 粒的藥物中的應用。
8. 3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環障礙引起的中性粒細胞上 粘附分子CDllb和CD18表達的藥物中的應用。
9. 3,4-二羥基-苯基乳酸在製備抑制微循環障礙引起的過氧化物生成 的藥物中的應用。
全文摘要
丹參(SM)包括在大量的用來治療血管疾病的傳統的中藥中，3，4-二羥基-苯基乳酸(DLA)是丹參的主要活性成分之一。本發明揭示3，4-二羥基-苯基乳酸在製備治療微循環障礙的藥物中的應用。所述微循環障礙為腸繫膜微循環障礙，由缺血/再灌注引起。本發明還揭示3，4-二羥基-苯基乳酸在製備防止微循環障礙引起的白細胞粘附的藥物中、恢復微循環障礙所引起的已粘附的白細胞的藥物中、抑制微循環障礙引起的白蛋白從細靜脈滲出的藥物中、抑制微循環障礙引起的肥大細胞脫顆粒的藥物中、制微循環障礙引起的中性粒細胞上粘附分子CD11b和CD18表達的藥物中、抑制微循環障礙引起的過氧化物生成的藥物中的應用。
文檔編號A61K31/192GK101485648SQ20081000104
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月15日 優先權日2008年1月15日
發明者韓晶巖 申請人:天津天士力製藥股份有限公司