雙鏈dna和雜環低聚物之間複合物的形成的製作方法

2023-12-02 17:19:16

專利名稱：雙鏈dna和雜環低聚物之間複合物的形成的製作方法
根據國家健康研究院提供的資助No.GM26453，27681和47530，美國政府在本發明中享有一定的權利。
相關申請本申請是1997年4月21日遞交的申請號08/837,524的繼續部分申請，後者是1996年2月26日遞交的，1997年2月20日提交為PCT申請US97/03332，的申請號08/607,078，和1996年7月31日遞交的臨時申請60/023,309，1996年8月1日遞交的60/024,374，1996年9月25日遞交的60/026,713，和1997年2月14日遞交的60/038,384的部分繼續申請。
背景隨著核酸的合成，分析和操作技術的發展，已經產生了許多診斷和治療的新技術。在研究工作中，對能夠鑑定與特定的生物體，等位基因，突變體相關的DNA序列一直是人們關注的問題，以便理解特定的遺傳過程，疾病鑑定，法醫鑑定等。同樣，對於許多應用來說，為了鑑定特定基因的功能，基因產物的細胞濃度的各種變化對細胞的功能或其它細胞特徵的影響，人們希望能夠調節特定基因的活性。在治療中，人們希望能夠抑制一些細胞的增殖，如細菌，真菌和衣原體細胞，這些細胞具有致病原的作用。人們也希望抑制病毒的增殖，哺乳動物的增殖，它們的增殖可導致對寄主或其它情況的不利影響。在體內，人們可以提供可逆的或不可逆的失效，從而可從胎兒的發育過程中，收集一個或多個基因產物的水平的降低對生物體的影響這類信息。
在一些胚胎學文獻中，Peter Dervan的研究小組已經證實氮雜環的低聚物可以用於結合雙鏈DNA。已經證實，在G/C與N-甲基咪唑(Im)/N-甲基吡咯(Py)互補，C/G與Py/Im互補，A/T與T/A與Py/Py冗餘性互補中存在特異性。事實上，N-甲基咪唑趨向於結合鳥苷，而N-甲基吡咯結合胞苷，腺苷和胸苷。提供兩條鏈的雜環，作為1個或2個分子，與雙鏈DNA形成2∶1複合物，而低聚物的兩條鏈反平行，其中G/C具有並列的Im/Py，C/G對具有Py/Im，T/A對具有並列的Py/Py。雜環低聚物由醯胺氨甲醯基團連接，其中NH可以參與小溝中的腺苷和胸苷(

圖1)特別是腺苷中的氮和氧未配對電子的氫鍵。雖然這種複合物非常令人感興趣，大部分的結合親和力小於約106M-1。另外，靶DNA序列和參與錯配的序列之間的區別常常不高於二倍。所以，對於許多目的，這些複合物的用途是有限的。
環二聚體顯示出親和力得到改善，其中兩個寡聚體在它們的末端通過γ-氨基丁酸相接，這時親和力被增強至約109M-1。但是，在靶序列之間親和力的不同對於三個不同的單鹼基錯配序列小於3倍。在存在大量天然的雙鏈DNA時，這一低的序列選擇性將嚴重地限制該化合物的應用。
同樣，對於許多應用，人們希望能夠將該序列應用於活細胞。沒有實驗證明這些低聚物能夠跨過細胞膜運輸到核，並且在成功地運輸到核中時，它們能夠結合染色體DNA，其中染色體DNA以核小體存在。
相關文獻Wade等人，美國化學學會雜誌，1992，114，8783-8794；Mrkish等人，美國科學院院刊，1992，89，7856-7590；Mrkish和Dervan，美國化學學會雜誌，1993，115，2572-2576；Wade等人，生物化學，1993，32，11385-11389；Mrkish和Dervan，美國化學學會雜誌115，9892-9899；Dwyer等人，美國化學學會雜誌，1993，115，9900-9906；Mrkish和Dervan，美國化學學會雜誌，1994，116，3663-3664；Mrkish等人，美國化學學會雜誌，1994，116，7983-7988；Mrkish和Dervan美國化學學會雜誌，1995，117-3325-3332；Cho等人，美國科學院院刊，1995，117，3325-3332；Cho等人，美國科學院院刊，1995，92，10389-10392；Geierstanger，自然結構生物學，1996，3，321-324；Parks等人，美國化學學會雜誌，1996，118，6147-6152；Parks等人，美國化學學會雜誌，1996，118，6153-6159；Baird和Devan，美國化學學會雜誌，1996，118，6141-6146；Swalley等人，美國化學學會雜誌，1996，118-8198-8206；Trauger等人，美國化學學會雜誌，1996，118，6160-6166；Szewczyk等人，美國化學學會雜誌，1996，118，6778-6779；Trauger等人，化學和生物，1996，3，369-377；Trauger等人，自然，1996，382，559-561；Kelly等人，美國科學院院刊，1996，93，6981-6985；Szewczyk等人，ANGEW.CHEM.INT.ED.ENGL.，1996，35，1487-1489；Pilch等人，美國科學院院刊，1996，93，8306-8311；White等人，生物化學，1996，35，12532-12537。發明概要本發明提供了用於在雙鏈DNA和有機環基團的低聚物之間在小於等於1納摩爾的濃度下選擇性生成複合物的方法和組合物，其中至少60％的環基團是雜環，至少60％的雜環至少具有一個氮環成員。雜環形成互補對，其中至少兩個核苷酸對優先地與特定的雜環對配對。作為單個低聚物的髮夾迴轉，或兩個低聚物分子的有機環基團之間的互補的結果，在複合物中至少存在三個有機環基團的互補對。通常，一種小脂肪族胺基酸將分散於或分開6個或更多個連續的有機環基團的鏈。為了進一步增強結合，一個末端可以具有至少一個2到6個碳原子的脂肪族胺基酸和/或一個具有靠近烷基鏈的鍵的極性基團的烷基鏈。通過適當選擇靶序列、互補對、未配對的有機環基團、脂肪族胺基酸、和極性取代的烷基鏈，可形成高親和性、低解離常數、和在靶序列和單鹼基錯配之間的親和性顯著不同的複合物。將低聚物進行修飾，以提供特異的特性並且允許存在於沒有明顯幹擾低聚物在小溝中的定位的位點。發現該組合物能夠進入活細胞並且抑制包括靶序列的基因的轉錄，在特定的位點裂解，在特異的位點變成共價結合，指導選擇的分子到靶位點以及進行其它需要的活動。
在複合物形成條件下該低聚物可以與雙鏈DNA結合形成複合物。該複合物的形成可以用於診斷，以便檢測特定的雙鏈DNA序列，其中可使用可檢測標記對該低聚物進行標記，以便在體外或體內的細胞組織學檢測中可逆地或不可逆地「失效」基因，從而抑制原核細胞或真核細胞等的細胞的增殖。
附圖的簡要說明圖1(a)識別DNA小溝的模型。DNA雙螺旋由A，T和G，C鹼基對組成，好像在旋轉的梯上的橫檔。通過在鹼基對邊緣上展示的氫鍵供體和受體的類型可以區別個別序列。A，T鹼基對在小溝中提供兩個對稱放置的氫鍵受體，由環內的點表示的嘌呤N3和嘧啶O2。G，C鹼基對提供這兩個受體，但另外還提供一個氫鍵供體，由含有H的環表示的鳥苷的2-氨基基團。因為氫鍵載體靠近含鳥苷的鏈，GC和CG鹼基對可以在小溝中區別。(b) 在DNA小溝中側對側複合物Py/Im聚醯胺的吡咯-咪唑識別DNA的配對規律，DNA結合序列特異性依賴於側對側的胺基酸對的序列。Im對Py的配對靶擊GC鹼基對，而Py對Im配對靶擊CG鹼基對。Py/Py組合簡併靶擊AT和TA鹼基對。G，C鹼基對的特異性產生於咪唑N3和鳥苷的環外氨基基團之間的推斷的氫鍵的形成。推斷的氫鍵由虛線表示。
圖2描述了(a)在與ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp1(匹配)和ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp2(錯配)形成的複合物中的5』-AGTACT-3』，和(b)在與ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp2(匹配)和ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp1(錯配)形成的複合物中的5』-AGTATT-3』的結合模型。含有點的環代表嘌呤的N3和嘧啶的O2上的單配對，含有H的環代表鳥苷的N2氫。推斷的氫鍵由虛線表示。黑和白的園分別代表咪唑和吡咯環，曲線代表γ氨基丁酸，菱形代表β丙氨酸。標明了單個氫鍵錯配。
圖3(a)(左)5S RNA基因內部控制區(ICR)和九個鋅指蛋白質TFIIIA的模型。(中間)在小溝中的鋅指4識別的ICR序列。(右)靶位點，5』-AGTACT-3』和髮夾聚醯胺ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp1的複合物。含有點的園代表嘌呤的N3和嘧啶O2上的單配對。含有H的園代表鳥苷的N2氫。(b)聚醯胺ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp(1)，ImPyPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp(2)，和ImPyImPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp(3)的結構。(Dp＝二甲基氨基丙醯胺)。(c) 結合模型，實心的和空心的園分別代表咪唑和吡咯環，曲線代表γ氨基丁酸(γ)，菱形代表β-丙氨酸(β)。標明了氫鍵錯配。
特定實施方案描述本發明提供了新低聚物，用於與雙鏈DNA形成高親和力的複合物。該低聚物含有由短接頭連接的有機環基團，這些低聚物與雙鏈DNA的小溝配合，並且在雙鏈DNA靶序列中與特定的核苷酸鹼基對形成互補對。與該有機環化合物相連的是脂肪族胺基酸，特別是具有末端氨基的脂肪族胺基酸。另外，末端最好具有一個極性基團，它可方便地在烷基取代基上進行取代。具有至少三個有機雜環的互補對的連續系列通過互補優先與核苷酸的互補對並列。通過適當選擇互補對、與鹼基對的特定核苷酸並列的非配對有機環化合物、脂肪族胺基酸、和極性基團取代基，可以獲得與單個鹼基錯配相比的高親和力和高特異性。本發明的組合物已顯示能夠跨膜運輸到核，結合染色體DNA，完成各種細胞內功能，包括抑制轉錄。通過提供可檢測標記，本發明的組合物可被修飾以便用於診斷，或可以用於研究或治療，以抑制靶基因的轉錄。另外，可以以其它方式修飾該組合物以便增強特定應用中的性能，如跨細胞壁運輸，結合特異細胞類型，在特定位點裂解核酸，改變化學和物理特徵等。
本發明的低聚物將具有至少6個有機雜環基團，通常至少7個，並且可以有8個或更多，通常不超過30個，優選不超過20個，更優選不超過18個有機環基團，其中至少60％，優選地至少80％，和更優選地至少100％是雜環。雜環通常具有一個到3個，更通常一個到兩個雜原子，其中雜原子是氮，氧和硫，特別是氮。根據氮原子是指向溝的底或表面或指向遠離溝的方向，可以對氮原子進行取代。當氮原子的指向遠離溝的底部時取代基的性質可允許具有較大的自由度。該低聚物的取向相對於它所並列的鏈的5』至3』方向優選為N至C方向。
不論為了何種目的，雜環可在取向遠離溝的底部的雜環的位置上進行取代。所以，利用需要的取代基可以取代氫原子，其中該取代基不會導致空間幹擾小溝的壁，或產生排斥。當取代時，可使用多種取代基，可以是雜原子，1到30，通常1到20個碳原子，特別是1到10個，更優選地1到6個碳原子的烴基，包括脂肪族，脂環的，芳香的，和它們的組合，包括脂肪族飽和和不飽和的，具有不超過10％的碳原子參與脂肪不飽和鍵，雜原子取代的烴基(如前面的定義)，具有1到10，通常1到8個，優選1到6個雜原子，包括脂肪族，脂環的，芳香的，雜環的和它們的組合，其中雜原子的例子有滷素，氮，氧，硫，磷，金屬原子，硼，砷，硒，稀土，等等，其中功能基團的例子有氨基，包括單和二取代氨基，氧，包括羥基和氧醚，硫，包括巰基和硫酯，氧基，包括氧羰基(醛和酮)和非氧基羰基(羧基，包括醯滷，酐，酯和醯胺)，磷，包括膦，磷脂，磷酸酯，亞磷醯胺，等等，硼，包括硼酸酯，硼酸(borinic acid)和硼酸(borinate)，硝基，氰基，偶氮基，氧化偶氮基，肼基，等等。
功能基團可以結合環成員或結合環成員的取代基，例如，羧烷基，甲氧基乙基，甲氧基甲基，氨乙基，二烷基氨丙基，聚氧乙烯，聚氨基乙烯，等等。在許多情況中，對於環氮取代基，通常利用1到3個碳原子的烷基特別是甲基取代它們，並且至少一個相鄰環碳原子未取代。通常，單個取代基為600道爾頓以下，通常約300道爾頓以下，優選地是約150道爾頓以下，結合環成員的總取代基將是約5千道爾頓以下，通常約2千道爾頓以下，優選是1千道爾頓以下，通常約為0到5，優選約為0到3個不同於1到3個碳原子的與環氮結合的烷基的取代基。通常，取代基的總碳原子將不大於約100個，通常不大於約60個，優選不大於約30個，沒有超過30個的雜原子，通常沒有超過20個的雜原子，通常沒有超過10個的雜原子。
通常雜環在2位置和4或5位置，特別是5環成員環的2和4位置連接。
雜環是5到6員環，特別是5個環成員，具有1到3個通常1到2個雜原子，其中兩個雜原子通常是由至少一個插入的碳原子隔開。有機環基團是完全不飽和的。並且將被稱為芳香的，因為該術語將被理解為5到6個環成員的有機環化合物。
環成員的例子包括吡咯，咪唑，三唑，呋喃，噻吩，惡唑，噻唑，吡唑，環戊二烯，吡啶，嘧啶，三嗪，等等，其中，如上所述，環中的NH基團當被取代時，優選是利用一個1到3個碳原子的烷基基團，特別是甲基進行烷基化。優選的有機環化合物是具有1個到2個氮原子的5元環，其中氮原子中的一個是甲基化的。
在有機環基團之間的連接基團通常具有兩個原子的長度，其中至少一些連接基團具有NH，其中NH可以與核苷酸的非共用電子對氫鍵合。連接鏈可以是亞甲氨基，氨甲醯基(-CONH-)，乙烯，硫代氨甲醯基，imidinyl等等，特別是氨甲醯基和它的雜類似物例如，硫基和亞氨基。
除了有機環化合物，還使用了脂肪族胺基酸，特別是ω-氨基脂肪族胺基酸，提供髮夾迴轉以便提供兩個雜環的序列之間的互補，形成環化合物，其中低聚物在兩個末端連接，或提供該有機環化合物相對於靶雙鏈DNA的空間的相對位移。通常，脂肪族胺基酸將具有一個作為核心的2個到6個碳原子，通常2個到4個碳原子，優選具有末端氨基基團，特別是甘氨酸，β-丙氨酸和γ氨基丁酸的鏈，在碳和氮特別是碳上未取代或取代，通常，該脂肪族胺基酸是未取代。取代基已經在前面敘述。當脂肪胺基酸是C末端時，羧基基團通常被功能化為酯或醯胺，其中可以選用醇或胺基酸來提供特異的特性或用於減少羧基基團的電荷。對於後者，醇和氨基基團通常是0到6個碳原子，通常0到3個碳原子。
如上所述，這些胺基酸將起特定的作用。較長的脂肪族胺基酸鏈將起到提供分子內的迴轉的作用，並且關閉分子形成環。利用較短的脂肪族胺基酸鏈提供相對於靶雙鏈DNA位移，並且通過存在於末端有機環基團的近端而提供增強的結合。脂肪族胺基酸可以存在於低聚物的一個或兩個末端。對於位移來說，優選甘氨酸和丙氨酸，β-丙氨酸是優選的。通常，避免6個雜環的連續序列。通常，一個胺基酸特別是β-丙氨酸被導入6個低聚物單元的連續系列，通常由至少一個優選地至少兩個有機環基團特別是雜環界接。下面的表表明沒有在鏈中導入胺基酸的低聚物雜環的伸展的效應。
表1
報告的值是來自至少三個步跡滴定實驗的平均值。在圓括號中的數字表示每個數據系列的標準偏差。該測試在22℃，pH7.0，在存在10毫摩爾/升TrisHCl，10毫摩爾/升KCl，10毫摩爾/升MgCl2和5毫摩爾/升CaCl2時進行的。
~被定義為匹配位點親和力與單個鹼基對錯配位點的親和力的比。在圓括號中的數字表示利用測量的結合親和力的標準偏差計算的不確定性。
代表特異性的下限。
代表結合親和力的上限。
脂肪族胺基酸的脂肪鏈可以作為取代的位點，提供核心結構的脂肪族胺基酸，通常沒有超過2，優選沒有超過1個取代基。這裡也可以利用已經在雜環中敘述的同樣類型的取代基。通常，可以用取代的脂肪族胺基酸進行低聚物的合成，而不是在形成低聚物後修飾胺基酸。或者，在取代基的鏈上可存在一種功能團，如果需要，在合成過程中可適當保護，然後，該功能基團可以用於隨後的修飾。最好選擇性地利用這樣的功能基團，將其用於合成不同的低聚物，以在該位點提供一種取代基，生成具有與特定的應用相關的獨特特性的產物。在不顯著幹擾在溝中的結合的位點進行取代，例如利用單個空間異構體，可給予本發明的化合物一些特性，如水可溶性，親脂性，非共價結合受體，放射活性，螢光性，等等。
一個或兩個末端，優選地是一個末端，具有在烷基基團上取代的極性基團，其中該極性基團和與分子的其餘部分相連的連鍵之間具有2到6個，優選2到4個碳原子。該極性基團可以帶電或不帶電，其中的帶電可以是在使用狀態下質子化的結果。特別優選能夠結合氫的基團，如氨基，特別是叔氨基，羥基，巰基等。特別優選的是氨基，最優選的是烷基化氨基，其中該烷基基團具有1到6，通常1到3，更優選1的碳原子，並且在pH小於約8時，氨基基團帶正電，並且可以與雙鏈DNA氫鍵合。優選在低聚物中不使用兩個帶正電的極性基團，當與雙鏈DNA複合時，該兩個帶正電的極性基團將相互並列。
對於多種用途來說，人們希望具有同位素低聚物，其中可以利用放射性元素的閃爍計數，對於具有磁拒的元素的nmr等，分析它的存在。對於放射性低聚物，可以利用放射性標記，如氚，14C，125I等。根據方便的原則，放射性標記可以是雜環的環成員的取代基或雜環的環成員，或者是碳或者是雜原子，或低聚物的C或N末端的取代基。通過利用放射性標記作為低聚物的部分，人們可以在低聚物的空間構型中避免任何明顯的變化。放射性標記可用於診斷，細胞組織學，放射性治療等多種應用中。
除了在低聚物上存在的其它位點，根據低聚物的用途，低聚物的每個末端可以用於特定的目的。例如，在診斷中，人們可能希望具有除放射性標記以外的可檢測標記，其中也可以發現得到的化合物的其它用途。低聚物可以連接的標記，如螢光素，例如丹醯，螢光素，Texas紅，異硫藍，醚紅，孔雀石綠，等等，化學螢光顆粒，例如磁性顆粒，膠質顆粒，例如金顆粒，光敏感鍵形成化合物，例如補骨脂素，鄰氨基苯甲酸，芘，蒽，和吖啶，螯合化合物，如EDTA，NTA，酒石酸，抗壞血酸，2到8個組氨酸的聚組氨酸，亞烷基聚胺等等，螯合抗生素，如博萊黴素，其中螯合化合物可以螯合金屬原子，如鐵，鈷，鎳，鎝等等，其中金屬原子可以在存在過氧化物時起裂解DNA的作用，嵌入染料，如溴化乙錠，噻唑橙，噻唑藍，TOTO，4』，6-聯脒-2-苯吲哚(DAPI)，等等，酶，如β-半乳糖苷酶，NADH或NADHP脫氫酶，蘋果酸脫氫酶，溶菌酶，過氧化物酶，螢光素酶等等，烷基化試劑如滷化乙醯胺，N乙基nitrosourea，氮和硫芥末，磺酸酯等等，和其它化合物，如烷基硼酸，生育酚，硫辛酸，captothesin等等，膠質顆粒，例如金顆粒，螢光素顆粒，過氧化物，DNA裂解試劑，低聚核苷酸，低聚肽，nmr試劑，穩定的游離自由基，金屬原子等等。低聚物可以結合其它標記，如存在方便的受體的半抗原，例如生物素，可以與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白和地高辛複合，地高辛可以與抗地高辛等等複合。其中受體可與上述各種標記偶聯。低聚物可以與磺化或磷化芳香基團，例如奈酚結合，以便增強對轉錄，特別是病毒的轉錄的抑制(Clanton等人，AntiviralRes(1995)27335-354)。在某些情況下，可以將本發明的低聚物的多個拷貝與聚合物結合，其中本發明的低聚物懸掛於該聚合物。有用的聚合物，特別是水可溶聚合物是纖維素，聚(乙烯醇)，聚(乙烯乙酸酯-乙烯醇)，聚丙烯酸酯等。低聚物的數目可以是1到約1∶5聚合物單體單元。
人們可能希望提高該分子的親脂性，提供各種親脂基團，例如膽固醇，脂肪酸，脂肪醇，鞘磷脂，腦苷脂，其它甘油脂等，其中脂肪基團通常是約8到30個碳原子。或者，人們可能希望提供結合植物凝集素，粘連分子，細菌等的多糖，其中多糖的作用是引導本發明的低聚物到特異的細胞靶。或者，在某些情況下，人們可能希望具有一個或更多的核苷酸，通常是1到30個，更通常是約3到20個，特定地是3到12個，該核苷酸正常情況下與靶序列的鄰近或邊界核酸序列相關，從而附著的核苷酸序列將在大溝中複合核苷酸。
根據末端存在的可利用的功能團，例如伸出的極性取代的烷基基團，例如具有超過6個碳原子的鏈，不同分子可以各種不同的方式與末端結合，從而在末端提供一種與加入的半分子反應的取代基，其中這樣的取代基常規地是氨基，羥基，巰基，羧基，磷酸等等，從而形成醯胺，有機的和無機的，取代的胺(還原胺化)，醚，硫醚，二硫化物，酯，有機的和無機的，焦磷酯，等等。該分子可以作為合成方案中的一部分導入，從合成低聚物的固體支持物上取代低聚物。因為本發明的化合物可以用於各種不同的用途，沒有一種簡單的敘述方式適合於本發明的低聚物結合的各種半分子，也無法描述得到的產物的特定的分子量。
本發明的低聚物可以在支持物上例如晶片上合成，其中通過自動合成技術，在各個位置可以合成不同的低聚物。以這樣的方式，可以合成不同低聚物的排列，然後可以用於鑑定樣品中多種不同的序列的存在。通過了解各個位點低聚物的組成，可以通過各種技術如標記的抗DNA抗體，具有互補限制突出的接頭，其中利用限制酶等等已經消化樣品DNA，在那個位點可以鑑定特異序列的結合。用於製備本發明的排列的技術類似於用於製備低聚肽排列的技術，如Cho等人，科學，1993，261，1303-1305所述。
該複合物通常含有一個或兩個低聚物或一個或兩個低聚物的聯合，其中單個的或成對的低聚物特異地與至少6，通常7和優選的8或更多bp，優選沒有超過40bp，更優選沒有超過30bp，優選地沒有超過20bp的雙鏈DNA序列相互作用。
因為這一工作的絕大部分是利用N-甲基吡咯和N-甲基咪唑，利用甲醯胺基團作為連接鏈，利用脂肪族胺基酸甘氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，以及二甲基氨基丙基作為極性取代的烷基基團進行的，現在將這些化合物作為可以用於本發明的化合物類別的例子進行說明。可以理解的是一個或幾個氮雜環可以用一種不同的有機環基團取代，以及一個或其它的脂肪族胺基酸可以用一種不同的胺基酸取代。另外，如上所述，為了特定的用途核心低聚物可以進一步取代。事實上，存在確定至少雜環的互補對的核心分子，並且包括脂肪族胺基酸和極性基團取代的烷基中的至少一種。這一核心分子是本發明的中心部分，可以作為不幹擾核心分子的基本功能的許多取代基的結合物，雖然結合親和力大於功能所需要的，結合親和力的一些減弱是允許的。所以，在定義本發明的化合物中，應該理解的是允許許多變化，其中保留了基本核心或單位結構，同時利用一個或更多取代基修飾該核心或單位結構以便給予分子需要的特性來發揮所需的功能。
在本發明的化合物中特別重要的是具有至少一個有機環基團，特別是N-甲基咪唑的化合物，它與一個核苷酸具有特異性，它以一個互補對存在。通常，本發明的化合物具有這些互補對中的至少一個，通常具有至少兩個這樣的互補對，並且通常少於75％的互補對具有對單個核苷酸具有特異性的有機環基團。在N-甲基咪唑的情況中，通常將至少有一個Im/Py對，最好不具有超過3個，通常沒有超過2個這樣的連續對，因而通常在一排中沒有超過3個連續的Im。通常存在至少一個脂肪族胺基酸，通常兩個脂肪族胺基酸，並且通常沒有超過8個脂肪族胺基酸，通常沒有超過6個脂肪族胺基酸，更優選沒有超過約4個脂肪族胺基酸。優選地，在低聚物的至少一個末端的臨近存在一個胺基酸。Im/Py對提供了較大的特異性，並且當被適當放置時，至少以與Py/Py相似的方式對與雙鏈DNA的結合親和力起一份作用。所以，通過適當選擇靶序列，可以優化結合親和力和特異性。
發現使用β-丙氨酸，β-丙氨酸結合T-A對並且通常與其自身形成互補對。所以β-丙氨酸可以用於與T或A的並列中，並且作為含有T-A對，含有它本身的互補對。
正如在實驗部分確定的，結合親和力Ka將大於5×108M-1，通常大於109M-1，優選地大於約1010M-1，從而使它們能夠在它們被使用的環境中在亞納摩爾濃度下能夠結合靶序列。含有單個錯配的親和力的差異將至少是3倍，通常至少5倍，優選地至少10倍，並且通常大於20倍，並且可以是100倍或更多。
當本發明的低聚物被用於細胞時，特別是活細胞時，該低聚物的分子量通常低於約5千道爾頓，優選地小於3.5千道爾頓，通常具有的分子量至少約0.6千道爾頓，更通常至少約0.8千道爾頓。
根據是否在低聚物中存在髮夾迴轉，這時僅需要一個低聚物，或者沒有髮夾迴轉，這時為了互補人們需要兩個低聚物，與雙鏈DNA進行複合的本發明的組合物具有一個或兩個低聚物，或它們的聯合。可以利用更多低聚物，這時人們希望靶擊一個以上的雙鏈DNA，例如鄰接或鄰近序列，以便增強總的特異性，或遠側的序列，其中該序列與同一個功能單位相關，例如基因，或不同的功能單位例如同源區。該組合物，不管是單個低聚物或低聚物的聯合將在單個低聚物或低聚物對中提供至少三個互補對。
在許多情況中，為了獲得需要的結合常數，可以提高互補對的數目，和/或具有未配對的有機環基團的區域。通常，我們具有至少一個或兩個第四個互補對，或至少兩個未配對有機環基團，從而具有參與配對形成的四個有機環基團和/或至少兩個未參與配對形成的有機環基團的鏈。發現當我們延長低聚物的長度時，我們沒有以與每個有機環單元的加入相同程度地提高結合親和力，並且，事實上如上所述，我們可能通過不斷地延長逆轉了結合親和性。所以通過適當選擇，正如上面指出，可以限制組合物和單個低聚物的大小以便使結合親和力以及與該低聚物的組合物相關的其它特性的最佳化。
由於N-甲基吡咯和N-甲基咪唑的廣泛的用途，利用這些N-雜環的下面的化合物是本發明的化合物的種類的例子。可根據本文敘述的方法製備這些化合物。在使用中，Py指N-甲基吡咯，Im指N-甲基咪唑。
ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy，PyPyImPy-γ-PyPyPyPy，ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy，PyImPyPy-γ-PyImPyPy，ImPyImPy-γ-PyPyPyPy，ImImPyPy-γ-PyPyPyPy，ImImImPy-γ-PyPyPyPy，ImImPyPy-γ-ImPyPyPy，ImPyPyPy-γ-ImImPyPy，ImImPyPy-γ-ImImPyPy，ImPyImPy-γ-ImPyImPy，ImImImPy-γ-ImPyPyPyPy，ImImImIm-γ-PyPyPyPy，Im-β-PyPy-γ-Im-β-PyPy，Im-β-ImIm-γ-Py-β-PyPy，Im-β-ImPy-γ-Im-β-ImPy，ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy，ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy，ImPyImPyPy-γ-ImPyPyPyPy，ImImPyImIm-γ-PyPyPyPyPy，ImPyPyImPy-γ-ImPyPyImPy，ImPy-β-PyPy-γ-ImPy-β-PyPy，ImIm-β-ImIm-γ-PyPy-β-PyPy，ImPy-β-ImPy-γ-ImPy-β-ImPyImPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy，ImIm-β-PyPyPy-γ-PyPyPy-β-PyPy，ImPy-β-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy，ImIm-β-PyPyPy-γ-ImImPy-β-PyPy，ImPy-β-PyPyPy-γ-PyPyPy-β-ImPy，ImPyPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPyPy，ImPyPy-β-PyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy，ImPyPyPy-β-Py-γ-Im-β-PyPyPyPy，ImImPyPyPyPy-γ-ImImPyPyPyPy，Im-β-PyPyPyPy-γ-Im-β-PyPyPyPy，ImPyPyPy-β-Py-γ-ImPyPyPy-β-Py，ImPyImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPyPy，ImPyPy-β-PyPy-γ-ImPy-β-PyPyPy，ImPyPyPyPy-β-γ-ImPyPyPyPy-β，ImPy-β-ImPyPy-γ-ImPy-β-ImPyPy，Im-β-PyPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Py，Im-β-ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Py，ImPyPy-β-PyPyPy，ImImPy-β-PyPyPy，ImImIm-β-PyPyPy，ImPyPyPyPy-β-PyPyPy，ImPyPyPy-β-PyPyPy，ImPyPy-β-PyPyPyPy，ImPyPyPy-β-PyPyPyPy，ImImPyPy-β-PyPyPyPy，ImImPyPy-β-PyPyPyPy，ImPyPyPy-β-ImPyPyPy，ImImPyPy-β-ImPyPyPy，ImImPyPyPy-β-PyPyPyPyPy，ImImImPyPy-β-PyPyPyPyPy，ImIm-β-PyPy-β-PyPy-β-PyPy，ImImPy-β-PyPyPy-β-PyPyPy，ImImPyPy-β-Py-β-PyPyPy，ImPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy，ImPyPy-γ-PyPyPy-β-PyPyPy，PyImPy-γ-ImPyPy-β-PyyPy，PyImPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy-β-PyPyPy，ImImPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy，ImPyPy-γ-ImPyPy-G-PyPyPy，ImPyPyPy-γ-ImImImPy-β-PyPyPyPy，ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-PyPyPyPy，and ImImPyPy-γ-PyPyPyPy-β-PyPyPyPy，PyPyImIm，ImPy-β-ImPy-β-ImPy，ImPy-β-ImPy-β-ImPy-β-PyPy，ImPy-β-ImPy-β-ImPy-γ-ImPy-β-ImPy-β-ImPy，ImPy-β-PyPy-β-PyPy，ImPy-β-PyPy-β-PyPy-γ-ImPy-β-PyPy-β-PyPy，Im-β-ImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Py，Im-β-ImImImIm-β-Im-γ-Py-β-PyPyPyPy-β-Py，ImIm-β-Im-γ-Py-β-PyPyPyPy-β-Py， Im-β-ImPyPy-γ-ImImPy-β-Py，ImImPy-β-Py-γ-Im-β-ImPyPy，ImIm-β-Im-γ-PyImPyPy.
圖1說明了吡咯和小溝中核苷酸的關係。
當利用兩個低聚物時，低聚物可以完全交迭，或只有部分交迭，即跳格或具有突出。如前文所述，將至少有3個互補吡咯(N-甲基吡咯和咪唑)對。在交迭的構型中，所有吡咯以及任何間隔胺基酸是在互補對中的。在跳格的構型中，至少有一個吡咯環，在至少一個低聚物中是未配對的，通常將有至少兩個吡咯環在兩個低聚物中是未配對的。通常，未配對的吡咯環的數目的範圍是2到30，優選是2到20，更優選是2到12。通常，未配對的吡咯將參與2或更多吡咯環的鏈，優選3或更多吡咯環，如果適當，包括鏈中的脂肪族胺基酸。
可以利用低聚物的各種排列和聯合。可以具有至少3個互補對和未配對吡咯的延伸和突出的單個低聚物，它可以與第二個低聚物整個或部分互補，它與第一個低聚物的未配對成員形成互補對。或者，可以具有兩個「糖果罐」低聚物，它們具有互補對和未配對成員的突出，由γ氨基丁酸將互補對的成員分開。但是，一個低聚物的這些未配對成員的定位可以與其它低聚物的未配對成員的延伸部分或突出形成互補對。可以具有延伸的線性低聚物，其中兩個或更多低聚物與延伸的線性低聚物的吡咯互補。如果需要，可通過使用多個具有不同的互補程度的低聚物將非配對區域和配對的吡咯進行間隔排列。在每種情況下，選擇與需要的親和力，靶的特性，形成複合物的目的等等相關。
本發明的組合物與雙鏈DNA可在各種條件下被放置在一起。該條件可以是在體外，在細胞培養物中，來自體內或體內。為了檢測靶序列的存在，雙鏈DNA可以是細胞外或細胞內的。當在細胞外，雙鏈DNA可在溶液中，在凝膠中，在載玻片上等。雙鏈DNA可以作為整個染色體的一部分，或一個或更多分摩(centiMorgans)的整個染色體的片斷存在。雙鏈DNA可以是附加體元件的部分。雙鏈DNA可以約20，通常至少約50，到百萬鹼基對或更多範圍的較小的片斷存在。雙鏈DNA可以是細胞內的，染色體的，線粒體的，質體，動質體，等，凝膠電泳中分離的溶菌體的部分，染色體電泳物，質粒等等，它們是完整或片斷化的半分子。雙鏈DNA和本發明的化合物之間的複合物的形成可以用於診斷，治療，純化和研究等的目的。因為本發明的化合物的特異性，本發明的化合物可以用於檢測樣品中特異的雙鏈DNA序列而沒有將雙鏈DNA熔化。形成複合物的診斷目的可以是等位基因的檢測，突變的鑑定，特定的寄主，例如細菌菌株或病毒的鑑定，特定的DNA重排的存在的鑑定，特定的基因例如多重抗性基因的存在和法醫等的鑑定。對於致病原，致病原可以是病毒，細菌，真菌，原生動物，衣原體等。對於高等動物，寄主可以是脊椎動物或無脊椎動物，包括昆蟲，魚，鳥，哺乳動物等或植物。
當涉及在體外或來自體內時，雙鏈DNA可以在適當的緩衝介質中與本發明的組合物組合，通常濃度範圍是約0.1納摩爾/升到1毫摩爾/升。可以利用各種緩衝液，如TRIS，HEPES，磷酸鹽，碳酸鹽等，特定的緩衝液不是本發明的關鍵。通常，可使用常規濃度的緩衝液，通常的範圍是約10-200毫摩爾/升。可以常規量存在的其它添加劑包括氯化鈉，通常是約1到250毫摩爾/升，二硫蘇糖醇等等，鹽的量不是本發明的關鍵。pH通常是6.5到9的範圍，特定的pH不是本發明的關鍵。溫度的範圍通常是4℃到45℃，特定的的溫度不是本發明的關鍵。靶雙鏈DNA可以低聚物的摩爾數的0.001到100倍存在。
當用於診斷時，本發明的化合物可以具有如前文所述的各種標記，並且可以利用已用於半抗原和受體(免疫測試)的檢測的許多方案或利用雜交(DNA互補)。因為本發明的化合物不是核酸，它們應用比利用DNA互補的情況更為靈活。如下面所述進行測試，然後根據標記和方案的特性進行序列的存在量的確定。該方案可以在溶液中或與固體相結合的情況下來進行。固體相可以是容器壁，顆粒，纖維，薄膜，紙片等，其中該固體相可以由各種材料組成，包括凝膠，紙，玻璃，塑料，金屬，陶瓷等等。可根據已知的技術，將樣品或本發明的化合物固定在固體相上。通過將本發明的化合物和固體相的進行適當功能化，本發明的化合物可以共價地結合固體相。根據固體相的特性，樣品可以共價地或非共價地結合固體相。固體相允許分離步驟，從而允許在缺乏未結合標記時檢測來自標記的信號。
這些方案的例子包括將細胞裂解物與結合在固體相表面的DNA與酶標記的低聚物組合，在複合物形成條件下溫浴適當長的時間，使低聚物與存在於固體相上的任何靶序列結合，分離液體介質並洗滌，然後利用可檢測底物檢測固體相上酶的存在。
許多方案是基於具有不能直接給出可檢測信號的標記的，但依賴於與受體的非共價結合，該受體結合於一個表面或結合於可直接檢測的標記。在一個測試中，可以具有一個結合於低聚物的半抗原，例如，地高辛。樣品DNA將結合在一個表面上，並在測試過程中保持與表面的結合。加入低聚物並且與任何存在的靶序列結合。在洗滌除去低聚物後，加入酶或螢光標記抗地高辛單克隆抗體，洗滌表面並檢測標記。或者，可以具有與低聚物的一個末端結合的螢光素和生物素或與低聚物的其它的末端或互補的低聚物結合的其它的適當的半抗原。將低聚物在液體相中與DNA組合併溫育。在溫育完成後，將樣品與結合在一個固體表面上的生物素或半抗原的受體，例如抗生蛋白鏈菌素或抗體進行組合。在第二次溫育後，洗滌表面並且確定螢光素的水平。
如果希望避免分離步驟，可以利用通道(channeling)或螢光淬滅。通過安排兩個相互作用的標記，例如兩個酶，其中一個酶的產物是另一個酶的底物，或兩個螢光物質，其中可以在兩個螢光物質之間進行能量轉移，可以確定什麼時候發生複合物的形成，因為兩個標記通過在小溝中形成2∶1複合物而產生並列。使用兩個酶，可以檢測第二個酶的產物，使用兩個螢光物質，可以確定在Stokes轉變的波長的螢光或在較低波長處吸收光的螢光物質的螢光的降低。另一個方案將本發明的組合物結合於固體相，並且將結合的低聚物與溶液中的DNA結合。在必要的溫育和洗滌後，在固體相中可以加入標記的抗DNA，並且確定結合於固體相的標記的量。
為了同時確定許多不同的序列或只是單個序列，可以提供結合於表面的本發明的組合物的排列。以這樣的方式，在排列中的特異位點將結合特異的DNA序列。在該排列中加入含有DNA的樣品並溫浴。含有在特定位點與低聚物互補的序列的DNA將在那個位點結合低聚物。在洗滌後，檢測特定位點DNA的存在，例如利用抗DNA抗體，表明靶序列的存在。通過在存在大量標記接頭時用限制酶裂解DNA，接著失活酶，可以將接頭與DNA片斷的末端連接，並且如上所述進行操作。在排列中特定位點上標記的存在將表明那個位點存在靶序列。
可以利用的方案的數目有許多。在WO95/20591；EPA393,743；WO86/05519；和EPA278,220中有許多這種方案的例子，而在WO96/20218；WO95/06115；WO94/04538；WO92/14490；WO94/01776，EPA537830；WO91/09141；WO91/06857和WO91/05257中可以發現可以從免疫測試中進行修改用於本發明的組合物並用於DNA檢測的方案和標記。
在診斷過程中，如涉及細胞，可能需要除去非特異結合的低聚物。這可以通過將細胞與大量過量的很方便地附著於顆粒上的靶序列進行組合來完成。通過允許非特異結合低聚物移動到細胞外介質中，低聚物將結合於顆粒，然後可以容易地除去。如果需要，可以在按時取細胞樣品並且劃出標記的丟失的變化率相對於時間的曲線。一旦標記的量變得穩定，可以將這一值與靶序列的存在相聯繫。其它技術也可以用於減少假陽性結果。
本發明的組合物也可以用於滴定重複，其中與特定的標示相關的重複的數目存在顯著的變化，增加或減少。重複的數目應該至少增加50％，優選至少2倍，更優選至少3倍。通過確定與雙鏈DNA結合的低聚物的數目，可以確定特定的重複序列的擴增或丟失。
本發明的組合物可以用於分離和/純化含有靶序列的靶DNA。通過利用本發明的低聚物，其中該低聚物結合於固體相，具有靶序列的那些DNA樣品的部分將結合本發明的低聚物，並且從其餘的DNA中分離出來。可以製備低聚物附著的顆粒的柱，並且將樣品通過柱。在洗滌柱後，利用溶劑或高鹽溶液可以釋放特異地結合柱的DNA。或者，可以將結合低聚物的顆粒與樣品混合，然後分離顆粒，例如對磁性顆粒利用磁場，對非磁顆粒利用離心。以這種方式，可以快速分離需要的靶DNA序列，例如含有表達序列標記(EST)的基因，轉錄因子結合的轉錄調節序列，已知一個片斷的基因等等。由於部分序列是由各種不同的技術確定的，本發明的低聚物允許分離限制片斷，這些片斷可以在凝膠上分離，然後測序。以這種方式，可以快速分離基因，確定它的序列。正如下面將討論的，本發明的低聚物可以用於確定基因的功能。
在研究中可以各種方式利用本發明的低聚物。因為可以利用本發明的低聚物抑制轉錄，可以研究抑制轉錄對細胞、細胞組裝部分和整個生物體的影響。例如，本發明的組合物可以與卵細胞，受精卵細胞或胚泡結合使用，以便抑制與胚胎的發育相關的特定基因的轉錄和表達，從而可以鑑定在特定基因的表達降低的影響。當一種基因可以參與許多其它基因的調節時，可以確定這樣的基因的缺乏對胚胎的發育的各種方面的影響。可以將本發明的低聚物設計成與同源區結合，從而可以抑制一個或更多基因的轉錄。另外，可以在在胎盤發育的過程中的各個期間利用本發明的組合物，以便鑑定該基因是否被表達和基因在發育的特定時期有何作用。
使用單細胞生物體，可以確定缺乏特定表達產物對生物體的毒力，生物體的發育，生物體的增殖等的影響。以這種方式，可以確定藥物的靶以便抑制生物體的生長和感染。
在動物模型中，可以通過以各種方式，口服或腸胃外，通過在希望影響轉錄的特定位點，微管內，皮下等注射給藥本發明的組合物，可逆地或不可逆地提供特定基因的表達的抑制。通過抑制轉錄，可以提供可逆的「失效」，其中通過連續的靜脈內給藥，可以大大延長抑制基因轉錄的時期。或者，可以利用本發明的低聚物的藥丸，並且觀察當藥丸分散時對各種生理參數的影響。可以檢測抑制的效果的破壞，獲得效果持續時間的長度，觀察與抑制相關的生理過程和正常生理應答發生的速度。或者，可利用烷基化試劑，光活化結合基團，插入基團等將低聚物與靶位點共價結合。
通過下調其它基因，上調基因也是可能的。在一個產物的表達抑制另一個產物表達的情況下，通過抑制第一個產物的表達可以增強第二個產物的表達。同樣，轉錄因子涉及多個協同因子形成複合體，通過抑制其它轉錄因子的表達，可以相對於另一個轉錄因子提高一個轉錄因子的複合物形成。以這種方式，通過改變細胞調節環境，可以改變表達的蛋白質的特性。
靶序列可以與5』非翻譯區，即轉錄起始區，可以在5』非翻譯區的增強子，編碼序列或內含子，編碼區，包括內含子和外顯子，3』非翻譯區，或基因的遠端相關。
本發明的組合物可以作為脂質體存在，存在於脂質體的腔中，其中脂質體可以與針對表面膜蛋白或基準膜蛋白質的抗體，細胞受體的配體，或其它的位點指向化合物相組合，以便將本發明的組合物固定於特定的的靶。參見，例如，Theresa和Mouse，Adv.Drug DeliveryRev.1993，21，117-133；Huwyler和Partridge，美國科學院院刊，1996，93，11421-11425；Dzau等人，美國科學院院刊，1996，93，11421-11425；和Zhu等人，科學，1993，261，209-211。本發明的組合物可通過導管施用，以便將本發明的組合物固定到寄主中特定的器官或靶位點。通常，在需要的位點的濃度例如在細胞內或在細胞外介質中應該至少是0.1納摩爾/升，優選至少約1納摩爾/升，通常不超過1毫摩爾/升，更優選不超過約100納摩爾/升。為了獲得需要的細胞內濃度，細胞外低聚物的濃度通常將大於需要的細胞內濃度，範圍是約比細胞內濃度高2到1000倍或更高。當然，其中毒性曲線允許比所示的細胞內或細胞外濃度更高，可以利用更高的濃度，同樣，當親和力是足夠高時，較低的濃度也可以獲得效果，可以利用較低的濃度。
由於各種原因，可利用本發明的組合物調節體內的生理過程。在非靈長類動物中，特別是家養動物，在動物畜牧業和育種中，通過控制特定的基因的表達，改變生理過程如脂肪積累，生長，對刺激的應答等來影響動物的發育。同樣可以將本發明的組合物在哺乳動物中用於治療目的。家養動物包括貓，小鼠，犬，兔，小牛，綿羊，犬，豬等等。
可以將本發明的組合物用於治療，抑制特定的靶細胞的增殖，抑制與一種指標相關的一個或多個基因的表達，改變寄主內源或外源的細胞的表現型，其中天然表現型對寄主是有害的。所以，通過結合寄主或細菌或其它致病原的管家基因或其它基因，特別是特異於致病原的基因，可以抑制特定的致病原的增殖。可以利用各種技術增強跨細菌壁的運輸如各種載體或序列，例如聚賴氨酸，聚(E-K)，核定位信號，膽固醇和膽固醇衍生物，脂質體，魚精蛋白，固定於脂的聚乙二醇，磷脂，如二油磷脂乙醇胺(dioleoxyphosphatidylethanolamine)，磷脂醯膽鹼，磷脂醯甘油，α-生育酚，環孢菌素等等。在許多情況中，本發明的組合物可以與載體混合以便形成分散的組合物並且以分散的組合物使用。同樣，當一個基因對於增殖或保護細胞不發生程序死亡是重要的，同時這種細胞發生不期望的增殖，本發明的組合物可以通過抑制該重要的基因的轉錄來抑制增殖。這可應用於如癌症，如肉瘤，癌和白血病，再狹窄，牛皮蘚，淋巴組織生成，粥樣硬化，肺纖維質生成，神經纖維瘤，聲帶神經瘤，結節性硬化，瘢痕疙瘩，成纖維瘤，多輪式卵巢和腎，硬皮病，類風溼關節炎，長合spondilitis，脊髓相位異常，硬變，食管縮緊，slerosingchaolangitis，腹膜後纖維等等的情況中。抑制可以與一個或多個特定的生長因子相關，如血小板起源的生長因子，附加體生長因子，轉化生長因子，神經生長因子，成纖維生長因子，例如鹼性和酸性的，角質細胞成纖維生長因子，腫瘤壞死因子，白細胞介素，特別是白細胞介素1，幹擾素等等的家族。在其它情況中，人們期望抑制特定的與疾病狀態相關，如與癌症相關的突變受體相關的基因，抑制花生四烯酸梯級反應，抑制各種癌症基因包括轉錄因子，如ras，myb，myc，sis，src，yes，fps/fes，erbA，erbB，ski，jun，crk，sea，rel，fms，abl，met，trk，mos，Rb-1，等的表達。可用本發明的組合物治療的其它疾病包括炎症應答，皮膚移植排斥，過敏應答，精神病，睡眠調節，免疫應答，黏膜潰瘍，與終止藥物使用相關的停止服藥的症狀，肝損傷的病理，心血管過程和神經過程。特別是當特定的T細胞受體與自我免疫疾病相關時，如多發性硬化，糖尿病，紅斑狼瘡，重症肌無力，Hashimoto疾病，血細胞減少症，風溼性關節炎等等，可以消除不需要的T細胞受體的表達，從而抑制T細胞的活性。在重新輸血損傷或其它炎症導致的疾病中，可以抑制與各種炎症狀態和/或敗血性休克相關的因子如TNF的生成相關的酶，生成單體氧的酶，如過氧化物酶和超氧化物歧化酶，蛋白酶，如彈性蛋白酶，INFγ，IL-2，誘導肥大細胞\嗜酸性粒細胞、IgG1、IgE、調節T細胞等增殖的因子，或調節白細胞和內皮細胞的粘連分子的表達的因子。
其它利用本發明的組合物的機會包括調節受體的水平，配體的產生，酶的產生，因子的產生，減少特定的細胞群體，改變細胞的表現型和基因型，特別是與特定的器官和組織相關時，改變細胞對藥物或其它刺激的應答，例如增強或去除應答，抑制兩個或更多等位基因，抑制靶基因的表達，特別是與臨床研究相關時，改變行為，改變疾病的敏感性，對刺激的應答，對致病原的應答，對藥物，治療劑或濫用物質等等的應答。
可以利用單個組合物或特異於同樣的雙鏈DNA區，但不同靶序列，鄰近的或遠側的，或不同DNA區的組合物的聯合。根據希望靶擊的基因的數目，該組合物可以具有一個或特異於不同靶位點的多個低聚物或低聚物對。
本發明的組合物可以用作唯一的治療劑或與其它治療劑組合。根據特定的指徵，也可以使用其它藥物，如抗體，抗血清，單克隆抗體，細胞因子，抗炎症藥物等等。本發明的組合物可以用於急性或慢性疾病，其中為治療的病人設計了特定的方案。本發明的組合物可以製備成生理可接受的介質，並且在適於他們的穩定性的條件下儲藏。它們可以被製備成粉末，懸浮液，在液體介質，烷醇，例如乙醇和丙二醇中與各種賦形劑組合。特定的配方將依賴於給藥的方式，需要的濃度，給藥的容易程度，儲藏的穩定性等等。在配方中的濃度將依賴於給藥的劑量的數目，低聚物的活性，作為治療劑量需要的濃度等等。本發明的組合物可以口服，腸胃外，例如，靜脈內，皮下，腹膜內，經皮的等等給藥。本發明的組合物可根據常規方法結合治療方式進行配製。配製之後，本發明的組合物可通過直接導入特定的細胞靶或隨機導入許多不同的細胞類型導入細胞。但是，本發明的組合物將只有在其中轉錄了靶雙鏈DNA，或存在一種機制，同時本發明的組合物的結合可以影響該機制的這些細胞中具有效果。以這樣的方式，可以獲得選擇性，因為唯一的有成效的結果將發生在其中靶雙鏈DNA發生效應的細胞中，本發明的組合物與雙鏈DNA的結合改變了該效果。
通常可利用一種固體支持物來製備，參見，例如Baird和Dervan，美國化學學會雜誌1996，118，6141；PCT申請，US97/03332。為了固相合成，該低聚物在通過一種連接附著於固體相上的固相上生長，這一連接可通過一種單一步驟的方法切除。在低聚物的C-末端的脂肪族胺基酸的加入允許使用可通過商業途徑獲得的適當取代水平的Boc-β-丙氨酸-Pam-樹脂(0.2毫摩爾/克)。可以利用氨解從支持物裂解聚醯胺。在N-甲基4-氨基-2-羧基吡咯和N-甲基4-氨基-2-羧基咪唑的情況中，可以利用活化的酯如N-羥基琥鉑醯，1，2，3-羥基苯並三唑，等，其中的氨基受到Boc或Fmoc的保護，隨後根據常規技術逐個加入單體。對於進一步的細節，參見相關文獻，其內容引入本文作為參考，乙基實施例部分。
下文中的實施例只是為了進一步說明，不限定本發明的範圍。實驗實施例1含有咪唑和吡咯胺基酸的聚醯胺的固體相合成(Baird Dervan，美國化學學會雜誌，1996，118，6141)Boc-β-丙氨酸-(4-醯胺基(carboxamido)甲基)-苄基-酯-共聚(苯乙烯-二乙烯苯)樹脂(Boc-β-丙氨酸-Pam-樹脂)，二環己基碳化二亞胺(DCC)，羥基苯並三唑(HOBt)，2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲陽離子六氟磷酸鹽(HBTU)，Boc-甘氨酸，和Boc-β-丙氨酸是從肽國際公司購買的。N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，N，N-二甲基甲醯胺(DMF)，N-甲基吡咯烷(NMP)，DMSO/NMP是從應用生物系統公司購買的。Boc-γ-氨基丁酸來自NOVA Biochem，二氯甲烷(DCM)和三乙胺(TEA)是來自EM的試劑級，硫苯(PhSH)，二甲基氨基丙胺，三氯乙醯氯，N-甲基吡咯，和N-甲基咪唑來自Aldrich和三氟乙酸(TFA)來自Halocarbon。所有試劑在使用時不需要進一步純化。單體合成4-硝基-2-三氯乙醯-1-甲基吡咯在12升燒瓶中，在1.5升乙醚中的充分攪拌的三氯乙醯氯(1公斤，5.5摩爾)溶液中，在3小時的時期內，逐滴加入1.5升無水乙醚中的N-甲基吡咯(0.45公斤，5.5摩爾)的溶液。將反應混合物再攪拌3小時，通過逐滴加入1.5升水中的400克碳酸鉀的溶液淬滅。分離各層，並且在真空中濃縮醚層產生不需要進一步純化的待使用的黃色結晶固體2-(三氯乙醯)吡咯(1.2公斤，5.1摩爾)。在1小時的時期，維持溫度-40℃，在12升裝備機械攪拌的燒瓶中的醋酐(6升)中的2-(三氯乙醯)吡咯(1.2公斤，5.1摩爾)的冷卻溶液(-40℃)中，加入440毫升濃硝酸。小心地使反應加熱到室溫並且再攪拌4小時。將混合物冷卻到-30℃，加入異丙醇(6升)。在-20℃攪拌溶液30分鐘，在這過程中形成了白色沉澱。將溶液靜置15分鐘，並通過真空過濾收集得到沉澱。甲基4-硝基吡咯-2-羧酸酯在裝備機械攪拌器的4升Erlenmeyer燒瓶中的2.5升甲醇中的4硝基-2-三氯乙醯1-甲基吡咯(800克，2.9摩爾)的溶液中，逐滴加入500毫升甲醇中的NaH(60％油中的分散體系(10克，0.25摩爾)的溶液。在室溫下，將反應物攪拌2小時，通過加入濃縮的硫酸(25毫升)淬滅。然後，將反應物加熱以便回流，慢慢冷卻到室溫。產物結晶成白色針，通過真空過濾收集。甲基4-氨基-1-甲基-吡咯-2-羧酸酯鹽酸鹽在乙酸乙酯(8升)中溶解甲基-4-硝基吡咯-2-羧酸酯4(450克，2.8摩爾)。然後加入800毫升乙酸乙酯中的40克10％Pd/C的漿液，在氫的輕微正壓(大約1.1大氣壓)下攪拌混合物48小時。通過硅藻土過濾除去Pd/C，利用1×50毫升乙酸乙酯洗滌，混合物的體積減少到大約500毫升。加入7升冷乙醚，輕輕吹入HCl氣體。通過真空過濾收集沉澱的胺鹽酸鹽，產生一種白色粉末(380克，81.6％)。4-[(叔-丁氧基羰基)氨基]-1-甲基吡咯-2-羧酸在裝備機械攪拌器的3升的燒瓶中的1升10％碳酸鈉水溶液中溶解甲基4-氨基-1-甲基-吡咯-2-羧酸酯鹽酸鹽(340克，1.8摩爾)，在30分鐘所時期，維持溫度20℃，加入500毫升二惡烷中成漿的二-叔丁基二碳酸酯(400克，2.0毫摩爾)。反應進行3小時，並通過TLC確定反應完全，冷卻到5℃2小時，並通過真空過濾收集得到的白色沉澱。在700毫升MeOH中溶解Boc-酸酐汙染的Boc-吡咯酯，加入700毫升2摩爾/升的NaOH，在60℃加熱溶液6小時。將反應物冷卻到室溫，利用乙醚(4×1000毫升)洗滌，利用10％(v/v)硫酸調節水層的pH，使其降低到約3，利用乙酸乙酯(4×2000毫升)萃取。乾燥(硫酸鈉)合併的乙酸乙酯提取物，並在真空中濃縮得到一種棕褐色的泡沫。在500毫升DCM中溶解泡沫，加入2升石油醚，在真空中濃縮得到的漿液。將反應物進行再溶解和濃縮3次，得到一種細微的白色粉末(320克，78％產量)。1，2，3-苯並三唑-1-基4-[(叔丁氧碳醯)-氨基]-1-甲基吡咯-2-羧酸酯在500毫升DMF中溶解Boc-Py-酸(31克，129毫摩爾)，加入HOBt(17.4克，129毫摩爾)，接著加入DCC(34克，129毫摩爾)。攪拌反應物24小時，然後逐滴過濾進入充分攪拌的5升冰水中。將沉澱在0℃靜置15分鐘，然後通過過濾收集。將得到的溼餅溶解在500毫升DCM中，將該有機層緩慢加入冷石油醚(4℃)的攪拌溶液中。混合物在-20℃靜置4小時，然後通過真空過濾收集，在真空中乾燥，得到精細分裂的白色粉末(39克，85％產率)。乙基1-甲基咪唑-2-羧酸酯在12升的裝備機械攪拌器的燒瓶中將N-甲基咪唑(320克，3.9摩爾)與2升乙腈和1升三乙胺合併，將溶液冷卻到-20℃。攪拌加入氯甲酸乙酯(1000克，9.2摩爾)，維持溫度-20℃和-25℃之間。使反應物慢慢變熱到室溫，並攪拌36小時。通過過濾除去沉澱的三乙胺鹽酸，並在真空中在65℃濃縮溶液。在低壓(2torr，102℃)下，通過蒸餾純化得到的油，產生一種白色固體(360克，82％產率)。乙基1-甲基-4-硝基咪唑-2-羧酸酯在1000毫升冷卻到0℃的濃縮硫酸中小心溶解乙基1-甲基咪唑-2-羧酸酯。慢慢加入90％硝酸(1升)，維持0℃的溫度。然後在通風良好的防護罩中用有效濃縮器(-20℃)回流反應物50分鐘。利用冰浴冷卻反應物，通過注入10升冰淬滅。然後，利用20升DCM提取得到的藍色溶液，將合併的抽提物乾燥(硫酸鈉)並在真空中濃縮，產生一種棕褐色的固體，並將其從22升，21∶1四氯化碳/乙醇中再結晶。通過真空過濾收集白色結晶。乙基4-氨基-1-甲基咪唑-2-羧酸酯鹽酸鹽在5升1∶1乙醇/7酸乙酯中溶解乙基1-甲基-4-硝基咪唑-2-羧酸酯(103克，520毫摩爾)。加入在500毫升乙酸乙酯中漿化的20克10％Pd/C，並且在氫的輕微正壓(約1.1atm)下攪拌混合物48小時。過濾反應混合物，在真空中濃縮到500毫升體積，加入5升冷無水乙醚。加入HCl氣產生白色沉澱。在-20℃冷卻溶液4小時，通過真空過濾收集沉澱，在真空中乾燥，得到一種細微的白色粉末(75克，78％產量)。4-[(叔-丁氧羰基)氨基]-1-甲基咪唑-2-羧酸在200毫升DMF中溶解乙基4-氨基-1-甲基咪唑-2-羧酸酯鹽酸鹽(75克，395毫摩爾)。在加入DIEA(45毫升，491毫摩爾)後，加入二-叔丁基二碳酸酯(99克，491毫摩爾)。在60℃振搖混合物18小時，使其達到室溫，並且在500毫升鹽水，500毫升乙醚之間分配。利用(每次2×200毫升)10％檸檬酸，鹽水，飽和碳酸二氫鈉和鹽水提取醚層，在硫酸鈉中乾燥，在真空中濃縮，被20％Boc-酸酐汙染的Boc-酯，如1H NMR所示。將沒有進一步純化的Boc-酯溶解於200毫升1摩爾/升的NaOH。將反應混合物在60℃靜置3小時，並偶爾攪動。將反應混合物冷卻到0℃，並且小心利用1摩爾/升HCl中和到pH2，這時形成了白色凝膠。通過真空過濾收集凝膠，在乾燥之前冷凍，並且保持冷凍乾燥，產生一種白色粉末。4-[(叔-丁氧羰基)氨基]-1-甲基吡咯-2-(4-醯胺基-甲基咪唑)-2-羧酸如下所述製備化合物(-[(叔-丁氧羰基)氨基]-丁酸-(4-醯胺基-1-甲基-咪唑)-2-羧酸，利用Boc-吡咯酸替代Boc-γ-氨基丁酸(4.1克，91％產率)。(γ-[(叔丁氧碳醯)氨基]-丁酸-(4-醯胺基(carboxamido)-1-甲基咪唑)-2-羧酸在40毫升DMF中的Boc-(-氨基丁酸(10克，49毫摩爾)的溶液中加入1.2當量的HOBt(7.9克，59毫摩爾)，接著加入1.2當量的DCC(11.9克，59毫摩爾)。攪拌溶液24小時，通過過濾除去DCU。另外，在20毫升DMF中的乙基4-硝基-1-甲基咪唑-2-羧酸酯(9.8克，49毫摩爾)的溶液中加入Pd/C催化劑(10％，1克)，並且在Parr彈儀器中(bombapparatus)(500psi H2)氫化混合物2小時。通過硅藻土過濾除去催化劑，並將過濾物立即加入HOBt酯溶液中。然後加入過量的DIEA(15毫升)，在37℃攪拌反應物48小時。然後在攪拌的冰水溶液中逐滴加入反應混合物，並且通過真空過濾收集沉澱，得到粗的乙基4-[[[3-[(叔-丁氧羰基]氨基]丙基]羰氨基]-1-甲基咪唑-2-羧酸酯(5克，14.1毫摩爾)。在溶解於50毫升甲醇中的這種粗酯中加入50毫升1摩爾/升KOH，並且在37℃攪拌得到的混合物6小時。在真空中除去過量的甲醇，通過加入1摩爾/升HCl酸化得到的溶液。通過真空過濾收集產生的沉澱，並且在真空中乾燥，產生一種棕色粉末(4.4克，89％產率)。固體相合成咪唑-2-羧酸，(γ-氨基丁酸，Boc-甘氨酸，和Boc-β-丙氨酸)的活化。將適當的胺基酸或酸(2毫摩爾)溶解於2毫升DMF。加入HBTU(720毫克，1.9毫摩爾)，接著加入DIEA(1毫升)，輕微振搖溶液至少5分鐘。Boc-咪唑酸的活化在2毫升DMF中溶解Boc-咪唑酸(257毫克，1毫摩爾)和HOBt(135毫克，1毫摩爾)，然後加入DCC(202毫克，1毫摩爾)，並將溶液靜置至少5分鐘。Boc-γ-咪唑酸和Boc-吡咯-咪唑酸的活化在2毫升DMF中合併適當的二聚體(1毫摩爾)和HBTU(378毫克，1毫摩爾)。然後加入DIEA(1毫升)，並將反應混合物靜置5分鐘。Boc-吡咯酸的活化(用於與咪唑胺的偶聯)在2毫升二氯甲烷中溶解Boc-吡咯酸(514毫克，2毫摩爾)，加入DCC(420毫克，2毫摩爾)，並將溶液靜置10分鐘，加入DMAP(101毫克，1毫摩爾)，並將溶液靜置1分鐘。乙醯化混合在使用之前立即合併2毫升DMF，DIEA(710微升，4.0毫摩爾)，和乙酸酐(380微升，4.0毫摩爾)。手工合成方案在20毫升玻璃反應容器中放置Boc-β-丙氨酸-Pam-樹脂(1.25克，0.25毫摩爾)，在DMF中振搖5分鐘，並流出反應容器。用DCM(2×30秒鐘)洗滌樹脂，並用80％TFA/DCM/0.5摩爾/升PhSH，1×30秒鐘，1×20分鐘，除去Boc基團。用DCM(2×30秒鐘)接著DMF(1×30秒鐘)洗滌樹脂。取樹脂樣品(5-10毫克)用於分析。完全流幹容器，並且加入活化的單體，如果需要接著加入DIEA。劇烈振搖反應容器以製成漿液。使偶聯反應進行45分鐘，取樹脂樣品。然後用DCM，接著DMF洗滌反應容器。機械輔助方案在一個ABI 430A合成儀上，以0.18毫摩爾的規模(900毫克樹脂；0.2毫摩爾/克)上進行機械輔助合成。胺基酸加入的每個循環包括用大約80％TFA/DCM/0.4摩爾/升PhSH去保護3分鐘，流幹反應容器，然後去保護17分鐘；2次二氯甲烷流洗滌；1次NMP流洗滌；流幹反應容器；利用原位中和偶聯1小時；加入二甲基亞碸(DMSO)/NMP，偶聯30分鐘，加入DIEA，偶聯30分鐘；流幹反應容器；利用DCM洗滌，取樹脂樣品通過HPLC分析評估合成的進程；在DCM中利用乙酸酐/DIEA加帽6分鐘；利用DCM洗滌。當將脂肪族胺基酸與咪唑偶聯時使用雙偶聯循環，其它的偶聯是使用單偶聯循環進行的。
對於NMP-HOBt方案，ABI430A合成儀被置於標準硬體配置。試劑位置1和7是DIEA，試劑位置2是TFA/0.5摩爾/升噻吩，試劑位置3是70％乙醇胺/甲醇，試劑位置4是乙酸酐，試劑位置5是DMSO/NMP，試劑位置6是甲醇，試劑位置8是DMF。寫了新的活化劑功能，一個用於直接轉移藥筒內容物到濃縮器(開關21，25，26，35，37，44)，第二個用於直接轉移試劑位置8到藥筒(開關37，39，45，46)。
在2毫升DMF中溶解Boc-Py-OBt酯(357毫克，1毫摩爾)，過濾進入合成藥筒。活化Boc-Im酸單體(DCC/HOBt)，過濾，和放置於合成藥筒。手動加入咪唑-2-羧酸。在偶聯循環啟動時，合成中斷，打開反應容器的開口，通過樹脂樣品環用注射器將活化的單體直接加入反應容器。當需要手動加入時使用空的合成藥筒。在合成藥筒中放置了脂肪族胺基酸(2毫摩爾)和HBTU(1.9毫摩爾)。使用試劑瓶8的刻度投送環加入3毫升DMF，接著刻度投送來自試劑瓶7的1毫升DIEA，混合藥筒3分鐘。
活化劑循環被寫成通過活化劑容器將活化的單體直接從藥筒轉移到濃縮器容器。在轉移後，利用刻度投送環向藥筒中量入1毫升DIEA，在濃縮器容器中將DIEA溶液與活化單體溶液合併。然後，將在21DMF/DIEA中的活化的酯轉移到反應容器中。在溶液轉移之前和之後所有管道是空的，充滿氬。ImPyPy-γ-PyPyPy-β-丙氨酸-Dp通過機械輔助合成方案製備ImPyPy-γ-PyPyPy-β-丙氨酸-Pam-樹脂。在20毫升玻璃閃爍瓶中放置樹脂樣品(1克，0.17毫摩爾)，加入4毫升二甲基氨基丙胺，在55℃加入溶液18小時。通過一個一次性使用的丙烯過濾器過濾除去樹脂，並加入16毫升水。通過製備性HPLC純化聚醯胺/胺混合物，並冷凍乾燥適當的級分，產生一種白色粉末。逐步HPLC分析在4毫升玻璃測試管中放置樹脂樣品(約4毫克)，加入200微升N，N-二甲基氨基丙胺，在100℃加熱混合物5分鐘。過濾裂解混合物，通過分析性HPLC在254納米分析25微升樣品。實施例2β-丙氨酸和γ-氨基丁酸是迴轉和交迭的特異性「引導」胺基酸，它們可在同一個分子中進行可預測的結合(Tranger等，化學和生物學，1996，3，369-377)。聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp和ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp的合成使用如上所述的固相合成方法製備所有的高純度聚醯胺。以逐步的方法分別將聚醯胺製備在Boc-β-丙氨酸-Pam樹脂和Boc-甘氨酸-Pam-樹脂上。從支持物上利用適當的伯胺裂解聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp，ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp和ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-NH2並且通過逆相HPLC純化，得到10-30毫克聚醯胺。可以提供適於合成後修飾的伯胺基團。利用過量的EDTA二酸酐處理胺修飾的聚醯胺，水解未反應的酸酐，通過逆相HPLC分離EDTA修飾的聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-EDTA。ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-NH2通過機械輔助固相方法製備聚醯胺，一種白色粉末(29毫克，59％回收率)。ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-EDTA通過在55℃加熱5分鐘在1毫升DMSO/NMP溶液和1毫升DIEA中溶解EDTA-二酸酐(50毫克)。在溶解於750微升DMSO中的ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-NH2(9.0毫克，5微摩爾)中加入二酸酐溶液。在55℃加熱混合物25分鐘，利用3毫升0.1摩爾/升NaOH處理，在55℃加熱10分鐘。加入0.1％TFA調節總體積至8毫升，通過逆相HPLC直接純化溶液，得到白色粉末ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-EDTA(3毫克，在HPLC純化後30％回收率)。製備32P標記DNA通過雜交兩套5』磷酸化的互補低聚核苷酸，5』-CCGGGAACGTAGCGTACCGGTCGCAAAAAGACAGGCTCGA-3』和5』-GGCGTCGAGCCTGTCTTITTGCGACCGGTACGCTACGTTC-3』和5』-CGCCGCATATAGACAGGCCCAGCTGCGTCCTAGCTAGCGTCGTAGCGTCTTAAGAG-3』和5』-TCGACTCTTAAGACGCTACGACGCTAGCTAGGACGCAGCTGGGCCTGTCTATATGC-3』製備質粒pJT8，並將得到的雙螺旋與大的pUC19AvaI/SalI限制片斷連接。利用AflII消化質粒製備3』-32P末端標記的AflII/FspI片斷，並且同時使用測序酶填平[』『α-32P]-脫氧腺苷-5』-三磷酸，和[』『α-32P]-胸苷-5』-三磷酸，用FspI消化，通過非變性凝膠電泳分離247bp的片斷。利用標準方法製備5』-32P末端標記的AflII/FspI片斷。如所述(Maxam和Gilbert，酶學方法，1980，65，499-560；Iverson和Dervan，酶學方法，1987，15，7823-7830；Sambrook等人，1989，分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約)進行A和G的測序。使用標準方法進行所有的DNA操作(Sambrook等人，1989，分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約)。親和裂解反應在總體積400毫升中進行所有反應。在含有標記(15,000cpm)的限制片斷的溶液中加入EDTA修飾的聚醯胺的儲備溶液或H2O，使最終的溶液條件為20毫摩爾/升HEPES，200毫摩爾/升NaCl，50微克/毫升糖元，和pH7.3。隨後加入20微升新鮮製備的20毫摩爾/升Fe(NH4)2(SO4)2，使溶液平衡20分鐘。加入40微升50毫摩爾/升二硫蘇糖醇啟動裂解反應，在22C進行12分鐘，然後加入1毫升乙醇終止。沉澱反應物，利用標準方法分離裂解產物。然後，加入10微升含有小牛胸腺DNA的溶液(140微摩爾/升鹼基對)(Pharmacia)和糖原(2.8毫克/毫升)，沉澱DNA。在1×TBE/80％甲醯胺加載緩衝液中再懸浮反應物，在85℃加熱變性10分鐘，放置於冰上。通過在8％聚丙烯醯胺凝膠(5％交聯，7摩爾/升脲)在1×TBE在2000伏下電泳分離反應產物。乾燥凝膠並且暴露於儲藏的磷篩。利用ImageQuant軟體通過單個裂解帶的體積整合確定相對的裂解強度。定量DNase I步跡滴定實驗在總體積400微升中進行所有反應。在含有放射性標記的限制片斷(15,000cpm)的測試緩衝液中加入聚醯胺儲備液或H2O(用作對照帶)，使最終溶液條件是10毫摩爾/升TrisHCl，10毫摩爾/升KCl，10毫摩爾/升MgCl2，5毫摩爾/升CaCl2，pH7.0，和(i)1 pM-10納摩爾/升聚醯胺或(ii)無聚醯胺(用作對照帶)。在22℃平衡溶液(i)12小時對於聚醯胺1或(ii)36小時對於聚醯胺2。通過加入10毫升含有1毫摩爾/升二硫蘇糖醇的DNaseI儲備液(適當濃度給出約55％完整DNA)啟動步跡反應，並在22℃進行反應7分鐘。加入含有2.25摩爾/升NaCl，150毫摩爾/升EDTA，0.6毫克/毫升糖原，和30微摩爾/升鹼基對小牛胸腺DNA的50微升溶液終止反應，乙醇沉澱。在1×TBE/80％甲醯胺加載緩衝液中再懸浮反應物，在85℃加熱變性10分鐘，放置於冰上。通過在8％聚丙烯醯胺凝膠(5％交聯，7摩爾/升脲)，在1×TBE在2000伏電泳分離反應產物。乾燥凝膠，暴露於儲藏的磷酸篩(Molecular Dynamics)。定量和數據分析利用Molecular Dynamic 400S PhosphorImager接著利用ImageQuant軟體定量(Molecular Dynamic)獲得來自步跡滴定凝膠的數據。包括步跡位點和Dnase I反應性在滴定過程中為常量的對照點的矩形的背景校正的體積整合產生了位點強度(I位點)和參考強度(I參考)的值。利用方程(1)計算這些點的表觀部分佔有率(2表觀)
其中I0位點和I0參考分別是來自沒有聚醯胺加入的對照道的位點和參考強度。通過使Q表觀和Q適合之間的差異最小化將([L]總，Q表觀)數據點代入一般的Hill方程(方程2)
其中[L]總是總的聚醯胺濃度，Ka是平衡結合常數，和Q最小和Q最大分別是當位點未佔有和飽和時實驗確定的位點飽和值。利用非線性最少平方代入過程，Ka，Q最大和Q最小作為可調節參數代入數據。對於聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp，5』-AGACA-3』靶位點的結合等溫線充分適合Langmuir等溫線(方程2，n＝1)，與1∶1聚醯胺-DNA複合物的形成一致。對於Im-PyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp，在靶位點5』-AAAAAGACA-3』和5』-ATATAGACA-3』觀察到較陡的結合等溫線(方程2，n＝1.8-2.2)。這些等溫線的陡度可能是由於這些位點的非常高的平衡結合常數。以這種方式的處理的數據不表示對結合機制的模型的嘗試。這些數據是表觀一級結合常數的值的比較，該值代表了位點半飽和的配體的濃度。利用下面方程標準化結合等溫線
在確定每個結合常數時利用了四套數據。本文利用的確定結合常數的方法包括設定[L]總.[L]游離，其中[L]游離是溶液中游離的聚醯胺(未結合)的濃度。對於非常高的結合常數，這一設定值無效，導致低估結合常數。在本文敘述的實驗中，估計DNA濃度是約5皮摩爾。結果，大於約1010摩爾-1的表觀結合常數應被當作低限。DNA結合定向利用在5』-或3』-32P末端標記的247bp pJT4AflII/FspI限制片斷上的ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-DETAFe(II)(2-Fe(II))進行的親和力裂解(Wade等人，美國化學學會雜誌，1992，114，8783-8794；Schultz等人，美國化學學會雜誌，1982，104，6861-6863.)實驗表明這一聚醯胺在亞納摩爾濃度選擇性地結合5』-AAAAAGACA-3』和5』-ATATAGACA-3』靶序列。在每個9bp位點觀察到單個3』-漂移的裂解圖譜，表明聚醯胺在一個定向上用C末端結合5』-AAAAAGACA-3』和5』-ATATAGACA-3』序列的5』末端。DNA結合親和力和特異性首先通過初步的MPEFe(II)步跡實驗(Hertzberg和Dervan，美國化學學會雜誌，1982，104，313-315)確定所有結合位點的正確定位和大小。在3』-32P標記的247bp限制片斷(10毫摩爾/升TrosHCl，10毫摩爾/升KCl，10毫摩爾/升MgCl2，5毫摩爾/升CaCl2，pH7.0，22℃)上的定量DNaseI步跡滴定實驗(Fox和Waring，核酸研究，1984，12，9271-9285；Brenowitz等人，酶學方法，1986，130，132-181；Brenowitz，等人，美國科學院院刊，1986，83，8462-8466)表明ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp特異地結合5』-AAAAAGACA-3』和5』-ATATAGACA-3』，平衡結合常數Ka＝2×1010摩爾/升-1和Ka＝8×109摩爾/升-1。限制片斷上的其它位點在低親和力結合。為了比較，六環髮夾聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp結合5』-aaaaAGACA-3』和5』-atatAGACA-3』，結合常數分別為Ka＝5×107M-1和Ka＝9×107M-1。
相對於六環聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp，九環聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp結合5』-AAAAAGACA-3』和5』-ATATAGACA-3』，分別具有400倍和100倍更高的親和力。最近已有報導不同的系統中同樣的結合增強(Trauger等人，自然，1996，382，559-561)。利用β-丙氨酸接頭的C末端PyPyPy亞基的加入是增強結合鄰近(A，T)4序列的髮夾聚醯胺的DNA結合親和力的有效策略。
聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp以高親和力結合存在於247bp限制片斷上的幾個錯配位點。以相對於最佳匹配位點5』-AAAAAGACA-3』(標明了形式上錯配的鹼基對)至少減少5倍的親和力與兩個最高親和力錯配位點，5』-GAATTCACT-3』(Ka＝4.5×109M-1)和5』-GTTTTCCCA-3』(Ka＝2.5×109M-1)結合，雖然由於最佳匹配位點的非常高的平衡結合常數是不確定的，這一值可能是低限。相比之下，相對於單個鹼基對錯配位點5』-ATTCA-3』和5』-TTACA-3』，六環聚醯胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp與匹配位點5』-AGACA-3』的結合強10倍。實施例3具有單個錯配差異的亞納摩爾配體結合評估兩個八環髮夾聚醯胺ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp(1)和ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp(2)的DNA結合親和力，它們的區別是單個的胺基酸，對兩個6鹼基對(bp)靶位點，5』-AGTACT-3』和5』-AGTATT-3』，它們的區別在於單個鹼基對。根據聚醯胺DNA複合物的配對規律，位點5』-AGTACA-3』和5』-AGTATT-3』分別是聚醯胺1「配對」和「單個鹼基對錯配」位點，和聚醯胺2分別是「單個鹼基對錯配」和「匹配」位點(圖2)。
通過固體相方法合成聚醯胺1和2，通過逆相HPLC純化(Baird和Dervan，美國化學學會雜誌，1996，118，6141-6146)。通過1H NMR，MALDI-TOF MS，和分析HPLC證實聚醯胺的身份和純度。MALDI-TOFMS1，1223.4(計算M+H，1223.3)；2，12223(計算M+H為1222.3)。通過定量DNaseI步跡滴定實驗(Galas和Schmits，核酸研究，1978，5 3157-3170；Fox和Waring，相同雜誌，1984，12，9271-9285；Brenowitz等，酶學方法，1986，130，132-181)(表1)確定在3』-32P標記的229bp限制片斷上含有匹配和錯配的六鹼基對結合位點的1和2的複合物的平衡結合常數。
表1平衡結合常數(M-1)結合位點 1 25』-ttAGTACTtg-3』3.7×1010(0.8)5.0×108(0.5)5』-ttAGTATTtg-3』4.1×108(0.5) 3.5×109(0.8)報導的結合常數是從三個DNaseI步跡滴定實驗獲得的平均值。在圓括號中標明了每個數據組的標準偏差。在存在10毫摩爾/升Tris-HCl，10毫摩爾/升KCl，10毫摩爾/升MgCl2，和5毫摩爾/升CaCl2，在pH7.0和22℃時進行測試。六個鹼基對結合位點是大寫的字母，側接的序列是小寫的字母。
聚醯胺1在0.03納摩爾/升的濃度結合它的匹配位點5』-AGTACT-3』，以接近100倍低的親和力結合它的單個鹼基對錯配位點5』-AGTATT-3』。聚醯胺2在0.3納摩爾/升濃度結合它的指定的匹配位點5』-AGTATT-3』，以接近10倍低的親和力結合它的單個鹼基對錯配位點5』-AGTACT-3』。1和2對它們各自的匹配位點的特異性來自非常小的結構變化。在1中用C-H(如2中)替代單個氮原子降低聚醯胺●5』-AGTACT-3』複合物的親和力約75倍，表示自由能的差異是約2.5千卡(kcal)/摩爾。同樣，在2中利用N替代C-H(正如在1中)降低聚醯胺●5』-AGTATT-3』複合物的親和力約10倍，失去了結合能約13千卡/摩爾。
利用聚醯胺1和2在3』-32P標記的229bp pJT8 AflII/FspI限制片斷上進行定量DNaseI步跡滴定實驗。比較道是A和G序列道；在缺乏聚醯胺時獲得的DNaseI消化產物；分別在存在1皮摩爾/升，2皮摩爾/升，5皮摩爾/升，10皮摩爾/升，15皮摩爾/升，25皮摩爾/升，40皮摩爾/升，65皮摩爾/升，0.1納摩爾/升，0.15納摩爾/升，0.25納摩爾/升，0.4納摩爾/升，0.65納摩爾/升，1納摩爾/升，2納摩爾/升，5納摩爾/升，和10納摩爾/升聚醯胺時得到的消化產物；和完整的DNA。對5』-AGTACT-3』和5』-AGTATT-3』確定聚醯胺結合位點的結合常數。沒有分析的其它位點是5』-TGTAAA-3』，5』-TGTGCT-3』和5』-TAAGTT-3』。在總體積400微升中進行所有反應。在含有放射性限制片斷的測試緩衝液中加入聚醯胺儲備液或H2O，使溶液最終條件是10毫摩爾/升Tris-HCl，10毫摩爾/升KCl，10毫摩爾/升MgCl2，5毫摩爾/升CaCl2，和pH7.0。在步跡反應啟動之前在22℃平衡溶液12-15小時。如其它文獻所述(11 Mrkisch等人，美國化學學會雜誌，1994，116，7983-7988)進行步跡反應，裂解產物的分離，和數據分析。通過雜交兩個5』磷酸互補低聚核苷酸，5』-CCGGTTAGTATTTGGATGGGCCTGGTTAGTACTTGGATGGGAGACCGCCTGGGAATACCAGGTGTCGTATCTTAAGAG-3』和5』-TCGACTCTTAAGATACGACACCTGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCAGGCCCATCCAAATACTAA-3』製備質粒pJT8，將得到的雙螺旋連接到大pUC19 AvalI/SalI限制片斷。實施例4細胞內結合和轉錄抑制方法聚醯胺通過固體相方法(Baird，E.E.，和Dervan，P.B.，美國化學學會雜誌118，6141-6146(1996))合成聚醯胺。通過1H NMR，基質輔助雷射吸收/飛行質量光譜(flight mass spectrometry)的離子化時間(MALEI-TOF-MS)和分析的HPLC證實聚醯胺的身份和純度。MALEI-TOF-MS1，1223.4(計算M+H為1223.3)，2，1222.3(計算M+H為1222.3)；3，1223.1(計算M+H為1223.3)。體外轉錄抑制。如文獻所述(Hartl，P.等人，細胞生物學雜誌，120，613-624(1993))製備從未受精的非洲爪蟾卵提取高速細胞質提取物。用於轉錄的DNA模板包含在質粒pX1s11(Peterson，R.C.等人，細胞20，131-144(1980))(每反應50納克)的體細胞類型5S RNA基因和包含在質粒pTyrD(Stutz，F.等人，Genes Dev.3，1190-1198(1989))中的tyrD tRNA(每個反應100納克質粒DNA)，兩個都來自X.laevis。轉錄反應物(20微升最終體積)含有下面的成分2.5微升提取物，9納克(12納摩爾/升)從成熟卵母細胞(Smith，D.R.等人，細胞37，645-652(1984))分離的TFIIIA，0.6毫摩爾/升ATP，UTP，CTP，0.02毫摩爾/升GTP和10微居裡[α-32P]GTP和最後緩衝液成分12毫摩爾/升HEPES(pH7.5)，60毫摩爾/升KCl，6毫摩爾/升MgCl2，25微摩爾/升ZnCl2，和8％(v/v)甘油。在TFIIIA和其它反應成分加入之前，在同樣的緩衝液中將聚醯胺預與質粒DNA進行溫浴。在變性的6％聚丙烯醯胺凝膠上純化和分析RNA。將裝備ImageQuant軟體的Molecular Dynamics PhosphorImager用於定量聚醯胺對5S和tRNA基因轉錄的影響。體內轉錄抑制在25cm2的培養燒瓶中，在含有10％(v/v)小牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養基中，在環境溫度下生長來自非洲爪蟾腎起源的細胞系的成纖維細胞(P.Labhart，Scripps提供)。在培養基中加入聚醯胺之前將細胞最少傳代3天。在連續溫育不同的時間，通過低滲裂解製備核，並且如文獻所述(Schlissel，M.S.和Brown，D.D.，細胞，37，903-913(1984))將其用作轉錄的模板。通過測量1％(w/v)十二烷基硫酸鈉中分離的核的等分試樣的吸光值確定DNA含量(利用1AU＝50微克/毫升DNA，在260納米的消光係數)。緩衝液成分和標記和未標記的核苷三磷酸與質粒轉錄反應相同。在反應物中添加了從非洲爪蟾卵母細胞(Roeder，R.G.，生物化學雜誌，258，1932-1941(1983))中分離的2微升RNA聚合酶III(大約50微克/毫升)。結果檢測了聚醯胺1(ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp)對TFIIIA與從含有5SRNA基因的質粒分離的限制片斷結合的影響。Zf1-3，一種缺乏指結構的重組TFIIIA類似物，在C-模塊啟動子元件的大溝中結合(參見圖1)。DNaseI步跡證明zf1-3和聚醯胺1可以共同佔據同樣的DNA分子。當5納米/升聚醯胺1與同樣的DNA靶預溫育，9個指結構的TFIIIA的結合抑制了＞90％。zf1-3和全長TFIIIA的不同的抑制提供了指結構4與小溝相互作用或定位在小溝中的證據。聚醯胺1沒有抑制TFIIIA與5S RNA的結合。
在存在逐漸增高濃度的聚醯胺1(10-60納摩爾/升)時檢測體外系統中5S RNA基因的轉錄。在這些實驗中，在加入外源TFIIIA(12納摩爾/升)和起源於未受精非洲爪蟾卵的粗提取物之前，在含有5S RNA基因的質粒中加入聚醯胺1。作為對照，在這些反應中在另一個質粒上包括了酪氨酸tRNA基因。tRNA基因具有1的上遊結合位點，但缺乏預測的蛋白質-聚醯胺相互作用。兩個基因在這一系統中單獨地或在混合的模板反應物中都進行活躍的轉錄。加入60納摩爾/升聚醯胺1抑制了＞80％的5S基因轉錄。在有效抑制5S RNA所需要的聚醯胺1的濃度時觀察到只有小程度的tRNA轉錄的非特異抑制。對靶5S RNA抑制的有效性比對照tRNA基因抑制高約10倍。錯配聚醯胺2(ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp)和3(ImPyImPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp)在直至達到60納摩爾/升的濃度時還沒有抑制5S RNA的轉錄。如果TFIIIA-DNA複合物首先形成，加入30納摩爾/升聚醯胺1，在加入卵提取物之前溫育混合物90分鐘，也觀察到5SRNA轉錄的有效抑制(80％)。較短的溫育時間導致較低的抑制。所需要的90秒溫育時間相似於測量的TFIIIA-DNA複合物的半衰期，並且表明聚醯胺1比TFIIIA與DNA形成更穩定的複合物。
檢測聚醯胺在體內對5S基因轉錄的影響。將非洲爪蟾腎起源的成纖維細胞在培養基中存在逐步提高的濃度的聚醯胺1時生長不同的時間。如果生長被限定在72小時之內，通過細胞密度進行測量的，我們發現聚醯胺的濃度直至達到1微摩爾/升時是沒有毒性的。通過低滲裂解從細胞製備核，將等當量的從對照分離的核和處理細胞分離的核用作利用外源RNA聚合酶III和標記的和未標記的核苷酸三磷酸轉錄的模板。這一實驗檢測具有活躍轉錄複合物的III類基因的佔據率(Schlissel，M.S.，細胞，同上文獻)。因為重複5S基因在變性聚丙烯醯胺凝膠上產生一個明顯的帶，可以容易地評估5SRNA的轉錄。在凝膠上進行放射自顯影，從觀察到的放射自顯影得到如下的結果。
低至100納摩爾/升的聚醯胺1的濃度對5S轉錄具有顯著的和選擇性的效果。在較高的聚醯胺濃度時，觀察到在核轉錄活性的總的下降；但是，在測試的每個濃度中，該聚醯胺的影響對5S RNA轉錄比對tRNA轉錄更大。由於已經觀察到用1微摩爾/升聚醯胺1可以獲得接近最大的5S轉錄的抑制，我們檢測了在存在聚醯胺下細胞生長了不同時間後的核轉錄。在與聚醯胺1在1微摩爾/升濃度下溫浴0時間時沒有觀察到抑制，表明轉錄複合物的離散不是發生在細胞核的分離或操作的過程中或之後。當細胞與聚醯胺1接觸24，48或72小時時，觀察到了統計學上相同水平的5S轉錄。
這些觀察結果支持了聚醯胺1能夠進入細胞，轉移到核並且裂解染色體5S RNA基因上的轉錄複合物這樣的結論。為了排除觀察到的抑制是由於聚醯胺的一些非特異性毒性而不是與5SRNA基因的直接結合這樣一種可能性，檢測了錯配聚醯胺2和3在核轉錄測試中的作用。用1微摩爾/升的培養基中的錯配聚醯胺2或3，24小時時觀察到相對於tRNA合成對5S RNA合成僅具有很小的影響。這一結果表明利用高濃度的聚醯胺1觀察到的總的轉錄的抑制可能是體內5S RNA合成抑制的次級效應，而不是非特異性聚醯胺相互作用的結果。聚醯胺2可以使體外和體內的5SRNA轉錄有很小的上升，表明聚醯胺可在某些情況下能夠上調轉錄。
正如上面的結果表明，本發明提供了新化合物，該化合物是有機環基團特別是吡咯的低聚物，其中該化合物在小溝中與雙鏈DNA配合，並且提供氫鍵結合，極性相互作用，和範德瓦氏相互作用，產生高的親和力和高的結合常數。
本發明的組合物提供了在靶序列和單個錯配序列之間的顯著的差異。通常，在兩個序列之間至少有兩倍的差異，優選至少5倍的差異，和更優選至少10倍或更大的差異。以這樣的方式，可以保證靶序列將受到最大的影響，而對其它序列的影響較小。通常，靶序列將至少為5個核苷酸，通常至少6個核苷酸，優選至少8個核苷酸，不超過約20個核苷酸。通過利用組合物的聯合，其中該聯合物與不同的序列序列結合，這些不同的序列可以是相互鄰近，可以進一步增強特定的基因的抑制。
本發明的組合物顯示以高親和力結合特異的雙鏈DNA序列，和以顯著低的親和力結合單個鹼基錯配序列。以這樣的方式，甚至在雙鏈DNA的複雜組合物中，正如在細胞組合物中可以遇到的的那樣，基本可以保證靶序列將受到影響，而其它序列將受到較小的影響。另外，本發明的組合物能夠跨膜運輸，通過胞質到核。本發明的組合物能夠結合參與核小體的染色體雙鏈DNA，並且抑制與本發明的組合物形成複合物的基因的轉錄。可以利用單個低聚物或低聚物的聯合以便形成所需的複合物。如果在診斷中利用本發明的組合物，不需要熔化DNA得到單鏈DNA。而且，本發明的組合物可以準確地靶擊雙鏈DNA，並避免了現在常規應用中的天然鏈和標記互補鏈之間的熔化和競爭。本發明的組合物可以用於在特定的位點裂解雙鏈DNA，從而分離靶DNA，然後可以利用PCR容易地擴增。通過進一步修飾本發明的組合物，可以進一步擴展它們在鑑定序列，裂解特異序列，研究基因的作用，篩選細胞中序列的存在和抑制細胞的增殖中的應用。
本說明書中敘述的參考文獻全部引入本文作為參考。
現在已經完全敘述了本發明，對本領域的一個技術人員來說，可以對本發明進行很多的變化和改進而不脫離本發明的精神和範圍。
權利要求
1.一種在靶雙鏈DNA和1到2個低聚物在小溝中的位點形成特異的複合物的方法，其中對所述的低聚物進行選擇以提供Ka為至少109M-1的與所述的靶雙鏈DNA的結合，所述的低聚物含有作為核心結構的(1)5到6個環成員的有機環基團，其中至少60％的環是具有1到3個雜原子的雜環，其中雜原子是氮，氧和硫，並且其中至少60％的雜環至少具有一個氮原子，其中所述的低聚物被限定為具有至少6個所述的含有氮的雜環，其中所述的雜環中的至少一個是特異於A，G，C或T的，並且雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的兩個連續的雜環的單元，其中當所述的低聚物與它自身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有形成髮夾迴轉的內部分子，並且當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的兩個低聚物含有一種2到6個碳原子的內部脂肪族胺基酸，其中所述的內部脂肪族胺基酸優先與A和T並列，並且與它自身形成互補對，和有機環基團末尾上的至少一個末端(2)2到6個碳原子的脂肪族胺基酸；和(3)含有一個極性基團的烷基鏈，該極性基團從連接所說的烷基鏈和低聚物的其餘部分的鍵具有2至4個碳原子，所述的雜環通過2個碳原子的鏈連接，該鏈含有NH基團，以便與所述雙鏈DNA的可以得到的氮和氧原子形成氫鍵，先決條件是遠離所述的小溝的表面的氫原子可以利用總數不超過100個碳原子的取代基取代，所述的方法包括在複合物形成條件下將所述的低聚物與雙鏈DNA放置在一起，從而在所述的第一個和第二個低聚物之間在靶雙鏈DNA處形成複合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的核心結構是未取代的。
3.一種在靶雙鏈DNA和1至2個低聚物之間在小溝中形成特異的複合物的方法，其中對低聚物進行選擇以與吡咯(Py)和N-甲基醚唑(Im)結合，其中對所述的N-雜環和所述的低聚物的其它成員進行選擇，以便提供大於約109M-1的Ka，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中與所述的靶雙鏈DNA相關的雜環的順序被限定為Im/Py與G/C並，在Py/Im與C/G並列，和Py/Py與A/T和T/A並列，並且雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的連續的雜環單元，其中當所述的低聚物與它本身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有一個內部γ-氨基丁酸，並且當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的低聚物含有一個內部β-丙氨酸，所述的內部β-丙氨酸與A/T和T/A並列，並與它本身形成互補對，每個低聚物的終端是與一個2至4個碳原子的、含有一個極性基團的烷基鏈連接的甘氨酸或β-丙氨酸胺基酸，所述的雜環通過含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述的雙鏈DNA的可得氮和氧原子形成氫鍵，先決條件是第二γ-氨基丁酸可連接於末端，以限定所述的第一個低聚物的環，並且遠離所述的小溝的表面的氫原子可以利用總共不超過100個碳原子的取代基取代，所述的方法包括在複合物形成的條件下，將所述的第一個或第二個低聚物與雙鏈DNA放置在一起，從而在所述的第一個或第二個低聚物和任何靶雙鏈DNA之間形成複合物。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的核心單元是未取代的。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述的連接基團含有氨基基團。
6.根據權利要求3所述的方法，其中所述的第二個低聚物具有一個分開至少2個N-雜環的單元的β-丙氨酸。
7.根據權利要求5所述的方法，其中不存在超過2個連續的Im。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述的第二個低聚物含有至少8個N-雜環。
9.根據權利要求3所述的方法，其中所述的第二個低聚物中的至少一個含有至少2個未配對的N-雜環。
10.根據權利要求8所述的方法，其中所述的第二個低聚物中的每一個含有3個未配對N-雜環。
11.根據權利要求3所述的方法，其中所述的第一個低聚物含有至少8個N-雜環。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述的第一個低聚物含有至少2個未配對的N-雜環。
11.根據權利要求3的方法，其中所述的核心結構是未取代的。
12.一種在靶雙鏈DNA和由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)組成的N-雜環的低聚物之間在小溝中形成特異的複合物的方法，其中對所述的N-雜環進行選擇，以便提供Ka為至少10-9M-1的在所述的小溝中的結合，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中相對於所述的靶雙鏈DNA雜環的順序被限定為Im/Py與G/C並列，Py/Im與C/G並列，和Py/Py與A/T和T/A並列，並且雜環互補對參照核苷酸互補對，所述的低聚物含有至少兩個與其自身形成互補對的2個連續的雜環的單元，所述的低聚物在所述的兩個單元之間含有一個內部γ-氨基丁酸，和6個N-雜環的單元含有一個內部β-丙氨酸，所述的內部β-丙氨酸與A和T並列，並且與自身形成互補對，所述的低聚物的終端是與含有極性基團的2到4個碳原子的烷基鏈連接的甘氨酸或β-丙氨酸胺基酸，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以與所述的雙鏈DNA的可得氮和氧形成氫鍵，先決條件是遠離所說的小溝的表面的氫原子可被總數不超過30個碳原子的取代基取代，所述的方法包括在複合物形成條件下將所述低聚物與雙鏈DNA放置在一起，從而在所述的低聚物和任何靶雙鏈DNA之間形成複合物。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述的極性基團是叔胺，先決條件是低聚物的僅一個末端含有所述的叔胺。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述的極性基團是羥基基團。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所述的低聚物含有至少4個互補對。
16.根據權利要求12所述的方法，其中利用了兩個低聚物，每個低聚物含有至少一個與另一個低聚物互補的突出部分。
17.一種在靶雙鏈DNA和由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)組成的N-雜環的低聚物對之間在小溝中形成特異的複合物的方法，其中對所述的N-雜環進行選擇，以提供Ka為至少109M-1的在小溝中的結合，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中相對於所述的靶雙鏈DNA雜環的順序被限定為Im/Py與G/C並列，Py/Im與C/G並列，和Py/Py與A/T和T/A並列，並且雜環互補對參照核苷酸互補對，所述的低聚物含有一個內部β-丙氨酸，所述的內部β-丙氨酸與A和T並列，並與其自身形成互補對，每一個低聚物的終端是與含有極性基團的2到4個碳原子的烷基鏈連接的甘氨酸或β-丙氨酸胺基酸，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以與所述的雙鏈DNA的可得氮和氧形成氫鍵，先決條件是遠離所說的小溝的表面的氫原子可被總數不超過30個碳原子的取代基取代，所述的方法包括在複合物形成條件下將所述低聚物與雙鏈DNA放置在一起，從而在所述的低聚物和任何靶雙鏈DNA之間形成複合物。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述的低聚物含有至少兩個β-丙氨酸。
19.根據權利要求17所述的方法，其中所述的低聚物是未取代的。
20.根據權利要求1所述的方法，其中所述的靶雙鏈DNA是染色體的一部分。
21.根據權利要求1所述的方法，其中所述的靶雙鏈DNA是附加體元件的一部分。
22.根據權利要求1所述的方法，其中所述的靶雙鏈DNA是病毒的一部分。
23.一種在一個樣品中檢測靶雙鏈DNA的存在的方法，在小溝中的位點使用一種含有1到2種低聚物的組合物，其中對所述的低聚物進行選擇以提供Ka為至少109M-1的與所述的靶雙鏈DNA的結合，所述的低聚物含有作為核心結構的(1)5到6個環成員的有機環基團，其中至少60％的環是具有1到3個雜原子的雜環，其中雜原子是氮，氧和硫，並且其中至少60％的雜環至少具有一個氮原子，其中所述的低聚物被限定為具有至少6個所述的含有氮的雜環，其中所述的雜環中的至少一個是特異於A，G，C或T的，並且雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的兩個連續的雜環的單元，其中當所述的低聚物與它自身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有形成髮夾迴轉的內部分子，並且當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的兩個低聚物含有一種2到6個碳原子的內部脂肪族胺基酸，其中所述的內部脂肪族胺基酸優先與A和T並列，並且與它自身形成互補對，和有機環基團末尾上的至少一個末端(2)2到6個碳原子的脂肪族胺基酸；和(3)含有一個極性基團的烷基鏈，該極性基團從連接所說的烷基鏈和低聚物的其餘部分的鍵具有2至4個碳原子，所述的雜環通過2個碳原子的鏈連接，該鏈含有NH基團，以便與所述雙鏈DNA的可以得到的氮和氧原子形成氫鍵，先決條件是遠離所述的小溝的表面的氫原子可以利用總數不超過100個碳原子的取代基取代，和(4)用於檢測所述的複合物的半分子，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述的雙鏈DNA的可得氮原子形成氫鍵，所述的方法包括在複合物形成條件下將所述的組合物和所述的樣品進行組合；通過所述的半分子，在所述的樣品中檢測已與所述的低聚物形成複合物的所述靶雙鏈DNA的存在。
24.一種在一個樣品中使用1到2個低聚物檢測靶雙鏈DNA的存在的方法，其中對所述的低聚物進行選擇以提供與所述的靶雙鏈DNA的小溝位點的結合，所述的低聚物含有由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)組成的N-雜環，其中對所述的N-雜環和所述的低聚物中的其它成員進行選擇，以提供至少為109M-1的Ka，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中相對於所述的靶雙鏈DNA雜環的順序被限定為Im/Py與G/C並列，Py/Im與C/G並列，和Py/Py與A/T和T/A並列，並且雜環互補對參照核苷酸互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的兩個連續的雜環的單元，其中當所述的低聚物與它自身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有一個內部γ-氨基丁酸，和當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的兩個低聚物含有一個內部β-丙氨酸，所說的內部β-丙氨酸與A/T和T/A並列，並且與它自身形成互補對，和每個低聚物的末端是與含有一個極性基團的2至4個碳原子的烷基鏈相連的甘氨酸或β-丙氨酸，所述的雜環通過2個碳原子的鏈連接，該鏈含有NH基團，以便與所述雙鏈DNA的可以得到的氮和氧原子形成氫鍵，先決條件是第二個γ-氨基丁酸可與末端連接，以限定一個所說的第一低聚核苷酸的環，並且遠離所述的小溝的表面的氫原子可以利用總數不超過100個碳原子的取代基取代，和至少一個低聚物與一種半分子連接，該半分子用於檢測所說的靶雙鏈DNA和所說的低聚物之間複合物的形成，該方法包括在複合物形成條件下將所述的低聚物和所述的樣品進行組合；通過所述的半分子，在所述的樣品中檢測已與所述的低聚物形成複合物的所述靶雙鏈DNA的存在。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述的半分子是酶，螢光素，化學螢光，固體表面，結合受體的半抗原，或放射性同位素。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述的方法進一步包括在檢測所述的複合物之前將任何複合物從所說的樣品中的任何其它的雙鏈DNA中分離出來。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述的低聚物或所述的雙鏈DNA中的一個被結合於固體表面。
28.根據權利要求24所述的方法，其中所述的半分子是生物素或地高辛。
29.根據權利要求24所述的方法，其中所述的雙鏈DNA是染色體片斷。
30.一種利用含有1到2個成分的組合物從雙鏈DNA混合物中分離靶雙鏈DNA的方法，其中對所說的成分進行選擇，以提供與Kd≤1納摩爾/升的所述靶雙鏈DNA的結合，所述的成分由1到2個低聚物組成，所述的低聚物包括(1)5到6個環成員的有機環基團，其中至少60％的環是具有1到3個雜原子的雜環，其中雜原子是氮，氧和硫，並且其中至少60％的雜環具有至少一個氮原子，其中所述的低聚物被限定為具有至少6個所述含有氮的雜環，其中至少一個所述的雜環特異於A，G，C，或T，雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物至少含有兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的2個連續的雜環的單元，其中，當所說的低聚物與其自身形成所說的互補對時，所述的低聚物含有形成髮夾迴轉的內部分子，並且當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的兩個低聚物含有2到6個碳原子的內部脂肪族胺基酸，其中所述的內部脂肪族胺基酸優先地與A和T並列，並且與它本身形成互補對，和至少一個有機環基團末尾的末端(2)2到6個碳原子的脂肪族胺基酸；和(3)含有一個極性基團的烷基鏈，該極性基團從連接所述烷基鏈的鍵到該組分的其餘部分具有2到6個碳原子，和(4)用於分離所述的複合物的半分子，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述的雙鏈DNA的可得氮原子形成氫鍵，所述的方法包括在複合物形成條件下將含有所述的低聚物的組合物與所述的雙鏈DNA的混合物進行組合；和分離通過所述的半分子形成的複合物。
31.一種利用含有1到2個低聚物的組合物在小溝位點中從雙鏈DNA混合物中分離靶雙鏈DNA的方法，其中對所述的低聚物進行選擇，以提供Ka至少為109M-1的與所述靶雙鏈DNA的結合。所述的低聚物含有作為核心結構的(1)5到6個環成員的有機環基團，其中至少60％的環是具有1到3個雜原子的雜環，其中雜原子時氮，氧，和硫，其中至少60％的雜環至少具有一個氮原子，其中所述的低聚物被限定位具有至少6個所述的含有氮的雜環，其中至少一個所述的雜環特異於A，G，C或T，雜環互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一個低聚物的自身或與作為第二個低聚物的另一個低聚物形成互補對的2個連續的雜環的單元，其中當所述的低聚物與它本身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有形成髮夾迴轉的內部分子，並且當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的兩個低聚物含有一個2到6個碳原子的內部脂肪族胺基酸，其中所述的內部脂肪族胺基酸優先地與A和T並列，並與它本身形成互補對，和至少一個有機環基團末尾的末端(2)2到6個碳原子的脂肪族胺基酸；和(3)含有一個極性基團的烷基鏈，從連接所說的烷基鏈的鍵到低聚物的其餘部分具有2到4個碳原子，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述雙鏈DNA的可得氮和氧原子形成氫鍵，先決條件是遠離所說的小溝的表面的氫原子可以用總共沒有超過100個碳原子的取代基取代，和(4)用於檢測所述的複合物的半分子，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述雙鏈DNA的可得氮原子形成氫鍵，至少一個低聚物連接一種半分子，用於靶雙鏈DNA和所述的低聚物之間形成的複合物的分離，所述的方法包括在複合物形成的條件下將所述的低聚物和所述的樣品進行組合；和分離通過所述的半分子形成的複合物。
32.一種利用1到2個低聚物從雙鏈DNA的混合物分離靶雙鏈DNA的方法，其中對低聚物進行選擇，以便提供與所述的靶雙鏈DNA的小溝位點的結合，所述的低聚物含有由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)組成的N-雜環，其中對所述的N-雜環和所述的低聚物的其它成員進行選擇，以便提供大於109M-1的Ka，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中相對於所述的靶雙鏈DNA的雜環的順序被限定為Im/Py與G/C並列，Py/Im與C/G並列，和Py/Py與A/T和T/A並列，並且雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的連續的雜環的單元，其中當所述的低聚物與它本身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有內部γ-氨基丁酸，和當兩個低聚物形成所述的互補對時，所述的低聚物含有一個內部β-丙氨酸，所述的內部β-丙氨酸與A/T和T/A並列，並且與它本身形成互補對，每個低聚物的終端是與含有極性基團的2到4個碳原子的烷基鏈連接的甘氨酸或β-丙氨酸胺基酸，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述的雙鏈DNA的可得氮和氧原子形成氫鍵，附帶條件是第二個γ-氨基丁酸可以連接該末端，以限定所述的第一個低聚物的環，並且遠離所說的小溝的表面的氫原子可以用總共不超過100個碳原子的取代基取代，和(4)用於檢測所述的複合物的半分子，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述的雙鏈DNA的可得氮原子形成氫鍵，至少一個低聚物連接一種半分子，用於分離所述靶雙鏈DNA和所述的低聚物之間形成的複合物，所述的方法包括在複合物形成的條件下將所述的低聚物和所述的樣品進行組合；和；通過所述的半分子分離形成的複合物。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述的半分子是一種半抗原，所述的分離包括將所述的低聚物和混合物與結合在固體表面上的所述的半抗原的受體進行組合。
34.根據權利要求33的方法，其中所述的固體表面是顆粒或容器壁。
35.一種含有1到2個低聚物的組合物，其中對該低聚物進行選擇，以便提供與所述的靶雙鏈DNA的小溝位點的結合，所述的低聚物含有由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)組成的N-雜環，其中對所述的N-雜環和所述的低聚物的其它成員進行選擇，以便提供大於約109M-1的Ka，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中相對於所述的靶雙鏈DNA的雜環的順序被限定為Im/Py與G/C並列，Py/Im與C/G並列，和Py/Py與A/T和T/A並列，並且雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有至少兩個與作為第一低聚物的自身或與作為第二低聚物的另一個低聚物形成互補對的連續的雜環的單元，其中當所述的低聚物與它本身形成所述的互補對時，所述的低聚物含有內部γ-氨基丁酸，和當兩個低聚物形成所述的互補對，所述的低聚物含有內部β-丙氨酸，所述的內部β-丙氨酸與A/T和T/A並列，並且與它本身形成互補對，每個低聚物的終端是與含有極性基團的2到4個碳原子的烷基鏈連接的β-丙氨酸胺基酸，所述的雜環由含有NH基團的2個原子的鏈連接，以便與所述的雙鏈DNA的可得氮和氧原子形成氫鍵，附帶條件是第二個γ-氨基丁酸可以連接末端，以限定所述的第一個低聚物的環，並且遠離所說的小溝的表面的氫原子可以用總共不超過100個碳原子的取代基取代。
36.根據權利要求35所述的組合物，其中所述的2個原子的連接基團是氨甲醯基團。
37.根據權利要求35所述的組合物，其中所述的組合物含有一個低聚物。
38.根據權利要求37所述的組合物，其中所述的一個低聚物含有至少7個N-雜環。
39.根據權利要求37所述的組合物，其中所述的一個低聚物含有6個連續的N-雜環內部的β-丙氨酸，並且距離所述的γ-氨基丁酸至少2個雜環。
40.根據權利要求35所述的組合物，其中所述的組合物含有2個低聚物，每個低聚物具有至少6個N-雜環的序列，並且包括所述序列的內部的β-丙氨酸。
41.根據權利要求35所述的組合物，其中至少一個所述的低聚物被一個螯合金屬基團取代。
42.根據權利要求35所述的組合物，其中所述的低聚物是未取代的。
43.根據權利要求35所述的組合物，其中所述的取代基的碳原子的總數不超過30個碳原子。
44.一種從含有所述的靶雙鏈DNA的擴展的雙鏈DNA分離靶雙鏈DNA的方法，所述的方法包括將所述的較大的雙鏈DNA的片斷和由N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)組成的N-雜環的低聚物對放置在一起，其中對所述的N-雜環進行選擇，以便提供Ka至少為109M-1的在小溝中的結合，其中所述的低聚物由至少6個所述的雜環組成，其中相對於所述的靶雙鏈DNA的雜環的順序為Im/Py與G/C並列，Py/Im與C/G並列，和A/T和T/A與Py/Py並列，並且雜環的互補對參照核苷酸的互補對，所述的低聚物含有一個內部β-丙氨酸，所述的內部β-丙氨酸與A和T並列，並且與它本身形成互補對，每個低聚物的終端為與含有極性基團的2到4個碳原子的烷基鏈連接的甘氨酸或β-丙氨酸胺基酸，所述的雜環由含有NH基團的2原子的低聚物的鏈連接，以便與所述雙鏈DNA的可得氮和氧原子形成氫鍵，附帶條件是遠離所說的小溝的表面的氫原子可以用總共不超過30個碳原子的取代基取代，並且低聚物的至少一個末端是一種能夠切割雙鏈DNA的功能團，從而在所述的低聚物和所述的擴展的雙鏈DNA之間形成複合物，並且通過所述的功能團切割所述的擴展的雙鏈DNA。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所說的能夠切割雙鏈DNA的功能團存在於兩個低聚物的相同的末端並且是螯合金屬。
46.一種結合小溝的聚醯胺試劑，它以序列特異性的方式結合雙鏈DNA，並具有連接其上的約一個至三個化學半分子，其中，該化學半分子賦予該聚醯胺試劑一種特性，這一特性使該聚醯胺試劑可用於以序列特異性的方式純化雙鏈DNA，或以序列特異性的方式檢測雙鏈DNA。
47.一種通過可逆的固定化以序列特性的方式純化雙鏈DNA的方法，該方法使用了權利要求46的聚醯胺試劑。
48.根據權利要求47的方法，其中連接在聚醯胺試劑上的化學半分子選自烷基硼酸，生物素，由2到8個胺基酸組成的聚組氨酸，抗體結合的半抗原，和固體支持物。
49.一種以序列特異性的方式檢測雙鏈DNA的方法，該方法使用權利要求46的聚醯胺試劑。
50.根據權利要求49的方法，其中連接在聚醯胺試劑上的化學半分子選自發色團，螢光素，金屬離子螯合物，酶，或其它的可通過肉眼、光譜或電子手段檢測的半分子。
51.根據權利要求50所述的方法，其中連接在聚醯胺試劑上的化學半分子由作為能量供體和能量受體對的兩個螢光素組成。
全文摘要
本發明提供了在雙鏈DNA和雜環、脂肪族胺基酸、特別是Ω胺基酸和極性末端基團的低聚物之間形成複合物的方法和組合物。通過適當選擇靶序列和低聚物的組合物,得到具有低解離常數的複合物。該複合物的形成可被用於鑑定特定的雙鏈DNA序列,被用於抑制基因轉錄,並且作為治療劑用於抑制不期望的細胞的增殖或不期望的基因的表達。
文檔編號C07D403/14GK1260006SQ97182276
公開日2000年7月12日 申請日期1997年7月21日 優先權日1997年5月8日
發明者皮特·德萬 申請人:加利福尼亞州技術學院