用於早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統與流程
2023-12-04 19:27:01
本發明屬於生物技術及診斷研究領域，涉及一種用於早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統。
背景技術：
結直腸癌也被稱為大腸癌，發生在結腸(大腸)或直腸中，通常發展緩慢，是中國城鎮第二高發癌症，40歲以上無症狀人群中6％患有早期腸癌。隨著食品結構和生活習慣的改變，以及環境問題的日益突出，導致大腸癌發生率快速增長，據《中國腫瘤登記年報》報導顯示，腸癌是目前中國城市發病率僅次於肺癌的第二大癌症，主要包括結腸癌與直腸癌兩大類。目前我國每年新增結直腸癌確診病例44萬例，每年死亡患者多達23萬人。國家癌症早診早治項目專家委員會2013年研究報告指出，中國40歲以上高危人群患進展期腺瘤和早期腸癌比率為6％。這些癌變病灶不及時切除，90％的情況下將會轉化為惡性腸癌。由於大部分患者在早期並未發現重視並得到及時治療，腸癌死亡率居高不下。對於在早期階段被篩查到的患者，超過90％可以被治癒。
結直腸癌有許多共同特點：大多數腸癌形成之前已經以息肉(異常突起)或腺瘤(腺上皮良性腫瘤)的形式在發病部位緩慢發展多年，在此期間患者無任何不適。腺瘤是一種良性，非癌性腫瘤。隨著時間的推移，部分腺瘤可轉變為癌症。在癌變過程中，腫瘤細胞侵入腸壁，與血管或淋巴管融合，通過吸收患者養分迅速擴增。後期，癌細胞通過淋巴管侵入附近的淋巴結或身體的其它器官，如肝臟等，形成癌擴散。結直腸癌通常發展至晚期才有明顯症狀顯現(如腹痛，便血等)。由於大多數中國患者沒有進行癌症早篩查的意識，發現症狀後才到醫院檢查，至結直腸癌確診時，癌細胞已經擴散，後期療效不明顯，致使中國近半數腸癌患者生存期不超過五年。如果將腸癌早期篩查技術在中國進行普及推廣，預計結直腸癌死亡率可從現有水平降低50％以上。
結直腸癌屬於篩查效果明確的惡性腫瘤，通過篩查早期發現結直腸癌可有效提高患者生存率，降低死亡率；而對癌前腺瘤(直徑≥1釐米)的早期診斷和隨後的摘除手術則可降低結直腸癌的發病率。篩查對象可分為一般危險人群和高危人群。在西方發達國家，結直腸癌篩查是針對一般危險人群開展的普查項目，鼓勵所有年齡大於50歲的人常規性地接受腸鏡和糞便潛血試驗(Fecal Occult Blood Test，FOBT)檢查。而在我國，雖然在高危人群中開展過「伺機性篩查」，但是尚未有一個針對一般危險人群的結直腸癌篩查項目。隨著社會經濟的發展和人們健康意識的提高，我國結直腸癌篩查將會從「伺機性篩查」向系統性篩查過渡。結直腸癌篩查的目的將不僅僅是早期診斷結直腸癌，癌前腺瘤的早期發現也將會受到重視；因為結直腸腺瘤的癌變通常耗時10年左右，所以有足夠的時間通過篩查和隨後的腺瘤摘除手術阻斷其癌變過程，達到預防腸癌的目的。
目前結直腸癌的篩查方法主要是結腸鏡檢查和糞便潛血試驗。
纖維結腸鏡是迄今為止最準確的結直腸癌篩查方法，腸鏡加病理活檢被認為是結直腸癌篩查和診斷的金標準。在美國和歐洲的有些國家，纖維結腸鏡被廣泛地用於結直腸癌的篩查，50歲以上的人每10年被要求做一次腸鏡，但是因為腸鏡的侵入性和腸道準備時的不適感，有超過半數的美國人不願接受腸鏡檢查。在我國，適齡人群接受腸鏡篩查手段的不足10％，致使我國發現腸癌多為中晚期，而發現後5年存活率不足50％，低於美國約20個百分點。另外，最近有研究表明腸鏡對右側結腸內常見的扁平息肉的診斷效果不好，腸鏡篩查並不能降低右側結腸癌的死亡率。另外，在我國還要考慮到是否有足夠的醫療資源來支持採用腸鏡篩查這一龐大的項目。
CT腸鏡是一種新型的結直腸癌篩查方法，有研究表明其診斷敏感性可以接近腸鏡；但是該法也要求患者做腸道整備，且價格昂貴，不適合普及使用。另外，CT腸鏡作為一種篩查手段可能使整個人群受到X線輻射，有導致癌症或血液系統疾病發生的可能。
FOBT檢測是唯一被應用於結直腸癌大系列人群篩查且得到循證醫學證實可有效降低死亡率的方法，其以糞便中血紅蛋白為檢測靶標，相對其他方法，其可以做到無創性，不需要腸道準備，方便取材，以及更好的經濟性。但也FOBT檢測存在很多弊端：其檢測的是腫瘤伴隨症狀—出血，可能出現因暫停出血或腫瘤早期無出血症狀造成的漏診，影響對腫瘤特別是腫瘤早期病變的檢測敏感性，目前主流的FOBT檢測技術對結直腸癌的敏感性為60-87％，而對進展期腫瘤敏感性為20-43％。
技術實現要素：
本發明針對上述缺點，提供了一種用於早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統，通過取病人的糞便樣本，聯合DNA檢測結果和糞便隱血結果，用於早期結直腸癌和癌前腺瘤的篩查，具有更高的靈敏度。
為實現上述目的，本發明採取下述技術方案來實現：
本發明提供一種用於早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，包括核酸分離與純化試劑，DNA亞硫酸鹽轉化試劑，KRAS基因突變檢測試劑，BMP3和NDRG4基因甲基化檢測試劑，糞便潛血檢測試劑；
其中核酸分離與純化試劑用於分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA；
DNA亞硫酸鹽轉化試劑用於將純化的部分人源性DNA進行亞硫酸鹽轉化，用於後續BMP3和NDRG4基因甲基化的檢測。
進一步，所述試劑盒還包括樣本收集試劑，所述樣本收集試劑分為兩種，分別用於供基因檢測的樣本和用於糞便隱血檢測的樣本。
進一步，其中KRAS基因突變檢測試劑中包含1-3mM的MgCl2、0.1-1mM的dNTP、2.5-5U/反應的Taq酶、20-50mM的KCl、1-4mM的Tris、每種KRAS突變型0.4-0.9uM的引物、每種KRAS突變型10uM的的探針。
進一步，BMP3和NDRG4甲基化檢測試劑中包含2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、2U/反應的Taq酶、20mM的Tris-HCl、50Mm的NH4+、每種甲基化突變0.75mM的引物、每種甲基化突變0.25mM的的探針。
本發明還提供一種上述用於早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒的使用方法，所述使用方法包括以下步驟：
樣本收集，分別收集用於基因檢測和糞便隱血檢測的樣本；
樣本的處理與檢測，
核酸的分離與純化，採用核酸分離與純化試劑，通過磁珠法分離核酸，然後通過離心柱法純化核酸；
純化後的核酸，一部分用於檢測KRAS基因突變，採用KRAS基因突變檢測試劑檢測樣本中KRAS基因突變；
另一部分採用DNA亞硫酸鹽轉化試劑經過亞硫酸鹽轉化法對其DNA進行轉化，然後檢測樣本中的BMP3和NDRG4基因甲基化；
糞便潛血檢測，對樣本章的血紅蛋白進行檢測。
進一步，上述使用方法還包括檢測得到的參數關聯計算方法，所述計算方法包括以下步驟：
以糞便為檢測樣本，以KRAS基因突變、BMP3和NDRG4基因甲基化以及血紅蛋白為檢測靶標，4項檢測結果被賦予不同的權重，通過邏輯運算公式進行結果判定；
所述邏輯運算公式為：P＝eK/(1+eK)
K＝a*Ct1+b*Ct2+c*Ct3+d*FOBT+X
上式中，P為結直腸癌綜合指數；e為自然常數；a,b,c,d,X為常數；Ct1為KRAS和內參基因Ct值差值；Ct2為BMP3和內參基因Ct值差值；Ct3為NDRG4和B2M基因Ct值差值；FOBT為血紅蛋白測定值。
進一步，所述a,b,c,d,X通過臨床測試數據分布確定。
進一步，所述P值為檢測綜合指數，根據臨床分布確定的判定閾值，P值≥閾值時檢測結果為陽性，p值＜閾值時為陰性。另外，Ct1，Ct2，Ct3中分別與在測試人群中分布的最高2.5％為閾值做對比，若Ct1，Ct2，Ct3中的一個或多個值位於最高的2.5％內，則得到陽性結果。
本發明還提供一種用於早期結直腸癌的篩查的檢測系統，所述檢測系統包括樣本收集裝置，靶標檢測單元，差值計算單元，數據分析單元和數據輸出單元；其中樣本收集裝置用於收集測試人群的糞便樣本；
其中靶標檢測單元用於檢測測試人群糞便樣本中的KRAS基因突變、BMP3和NDRG4基因甲基化、糞便血紅蛋白；
差值計算單元用於分別計算測試人群的KRAS和內參基因Ct值差值、BMP3和
內參基因Ct值差值；NDRG4和內參基因Ct值差值；
數據分析單元，通過臨床樣本檢測統計分析，以結直腸不同病程及無相關疾病樣本經測定以上3類指標，形成與病理相關的趨勢性分布，從而通過分布數據得出邏輯判定算法，建立檢測數據與病理特徵的關聯公式：
所述邏輯運算公式為：P＝eK/(1+eK)
K＝a*Ct1+b*Ct2+c*Ct3+d*FOBT+X
上式中，P為結直腸癌綜合指數；e為自然常數；a,b,c,d,X為常數；Ct1為KRAS和內參基因Ct值差值；Ct2為BMP3和內參基因Ct值差值；Ct3為NDRG4和B2M基因Ct值差值；FOBT為血紅蛋白測定值；其中a,b,c,d,X通過臨床測試數據分布確定；
數據輸出單元，P值為檢測綜合指數，根據臨床分布確定的判定閾值，P值≥閾值時檢測結果為陽性，p值＜閾值時為陰性。另外，Ct1，Ct2，Ct3中分別與在測試人群中分布的最高2.5％為閾值做對比，若Ct1，Ct2，Ct3中的一個或多個值位於最高的2.5％內，則得到陽性結果。本發明的有益效果：
本發明的試劑盒通過檢測糞便樣本中的基因改變以及糞便潛血，達到篩查結直腸癌和癌前腺瘤的目的，實現了基於糞便的檢測，完全無創，檢測過程非侵入性，無需腸道準備、無症狀人群對該檢測接受度高；有相較於FOBT檢測更高的特異性和敏感性，同時，不僅可以發現結直腸癌，也可以發現癌前腺瘤，為通過摘除癌前腺瘤而預防結直腸癌提供了可能性。相較於纖維腸鏡，可以同時發現左右兩側結腸的腫瘤，全腸道檢測，無檢測盲區。
附圖說明
圖1是本發明試劑盒的檢測步驟圖。
圖2是一個實施例中三個待測目標基因螢光定量PCR擴增曲線。
圖3是一個實施例中BMP3和NDRG4甲基化檢測的螢光定量PCR擴增曲線。
圖4是一個實施例中糞便血紅蛋白ELISA檢測標準曲線。
具體實施方式
由於結直腸癌的生長特性，其首先向腸腔伸張，在其生長過程中，包括癌前腺瘤或癌症早期階段，不斷有大量腫瘤細胞經代謝脫落進入排洩系統隨糞便一同排出，這些細胞中含有腫瘤發生密切相關的基因，反映腫瘤形成過程，通過檢測糞便中的這些基因標記物，就可以發現腫瘤在腸壁上的存在。由於這些基因從腫瘤產生初期就存在，因而能夠反映腫瘤最早期的過程。
本發明中使用的基因靶標為KRAS(v-Ki-ras2，Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突變、BMP3(Bone Morphogenetic Protein 3)和NDRG4(N-Myc Downstream-Regulated Gene 4)基因甲基化。KRAS基因突變表現在超過35％的結直腸癌細胞中，其中2號外顯子中的7種突變在結直腸癌細胞中更是高達98％。KRAS基因突變，在結直腸腫瘤的形成，包括腸癌及癌前病變中都具有較高程度的表現。NDRG4是癌基因N-myc下遊調控基因之一，編碼一種胞漿蛋白，這種蛋白在連續細胞周期中有重要作用，另外還和血管平滑肌細胞的有絲分裂調控有關。BMP3是細胞轉化生長因子超家族的一員。基因啟動子區域DNA序列的甲基化，引起基因表達的變化，BMP3和NDRG4的甲基化與結直腸癌和癌前病變有高度的關聯。
申請人通過大量研究發現，KRAS突變和BMP3，NDRG4的甲基化對腸癌和癌變的標示具有互補性，聯合起來使用可以有助於提高檢測靈敏度。本發明中另一靶標為糞便潛血。因中晚期腸癌會有間斷性腫瘤出血，所以糞便裡檢測到血紅蛋白是對這個階段癌症比較靈敏的標記物。
本發明一個實施例中，試劑盒的主要成分包括下表所述：
表1本發明一個實施例中試劑盒的主要成分
上述試劑中，除非下文中有具體說明的，否則均可以使用本領域常規試劑即可實現。
圖1是本發明試劑盒的檢測步驟圖。如圖1所示，所述試劑盒的使用方法包括：
樣本收集，使用樣本收集試劑收集分別用於基因檢測和糞便潛血的樣本。
樣本處理與檢測，包括：
核酸分離與純化，磁珠法和離心柱法分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA。
KRAS基因突變檢測，螢光定量PCR法測定KRAS突變基因Ct值與內參基因Ct值的差值△Ct1，目標檢測靶點為KRAS第12和13密碼子的7種熱點突變型；具體的，KRAS基因優選的檢測引物和探針，已記載於申請人在先公開的專利申請ZL201510002856.7。
BMP3和NDRG4基因甲基化檢測，經亞硫酸鹽轉化法對DNA進行轉化，以螢光定量PCR法對基因甲基化進行MSP(Mehtylation-Specific PCR)法檢測，分別測定BMP3和NDRG4甲基化Ct值與內參基因Ct值的差值△Ct2、△Ct3，目標檢測靶點為BMP3和NDRG4各自基因啟動子附近的11-13個CpG位點；BMP3和NDRG4甲基化優選的檢測引物和探針，已記載於申請人在先公開的專利申請ZL 201510486088.7。
糞便潛血檢測，ELISA法進行FIT(Fecal Immunochemical Test)檢測，定量檢測糞便血紅蛋白含量。
邏輯運算及結果判定，根據上述測定值，4項檢測結果被賦予不同的權重，通過邏輯運算公式運算，並根據設定臨床閾值(Cut-off)進行結果判定。
所述邏輯運算公式為：P＝eK/(1+eK)
上式中，P為綜合指數，K＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FIT+X，e為自然常數；a,b,c,d,X為臨床常數。
當P值≥Cut-off時檢測結果為陽性，p值＜Cut-off時為陰性。
以上公式中的a,b,c,d,X通過足夠數量的臨床研究數據分布確定，這個研究包括了有腸鏡病理結果的不同病程分布的臨床樣本，包括結直腸癌、進展期腺瘤、非進展期腺瘤、息肉及無症狀人群樣本。對這些樣品進行以上四項檢測後，將單項檢測結果與腸鏡標準結果進行邏輯回歸分析，分析結果給出不同閾值下的聯合檢測靈敏度和特異性。根據這個篩查手段的要求確定最適合的靈敏度和特異性後，就可確定這幾個常數，以及相應的總分閾值。
另外，根據臨床研究結果，上述4個單項檢測中的結果也會和臨床分布中對應的最高的2.5％為閾值進行對比，即當檢測樣本中的△Ct1、△Ct2、△Ct3及FIT中任一個或多個結果高於這個閾值，結果也判定為陽性，以保證單項因子有很高數值時確定為檢測陽性。最終檢測的結果指數綜合了各項因子經回歸係數權重相乘後的得分和單項是否屬於最高2.5％的得分而算出最後指數。
因此本發明提供一種試劑盒，實現定性檢測糞便樣本中的KRAS基因突變、BMP3和NDRG4基因甲基化以及糞便潛血共4個靶標的技術。同時，該試劑盒提供一種聯合檢測的邏輯運算方法，將4個單項檢測的結果進行綜合，得出樣本最後總分以及檢測結果。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明並不僅限於下述實施例。所述實施例中所涉及的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域內常規方法。本實施例所用試劑盒為本發明的所得試劑盒。
糞便樣本的具體檢查流程：
(1)樣本收集，使用樣本收集試劑收集分別用於基因檢測和糞便潛血的樣本。
其中，用於核酸提取的樣本用量為1-5g，用於便潛血檢測的樣本為10mg，樣本收集試劑保證樣本收集和儲存的穩定性。樣本收集試劑中的樣本穩定劑只要能維持樣本成分相對穩定便於檢驗即可，本發明中所述樣本穩定劑可以選用現有的，也可以選用發明人在先專利申請文件CN104073564A中公開的穩定劑。
(2)樣本處理與檢測，包括：
1)核酸分離與純化，磁珠法和離心柱法分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA。
為了獲得最優的分離純化效果，本發明使用兩級分離和純化裝置，樣本裂解後的核酸先使用磁珠法富集分離，再進行離心柱法進一步純化，保證核酸質量。其中，要求使用分光光度計法測定DNA的OD260/280應在1.8-20.之間，濃度應在10-500ng/ul之間。
2)KRAS基因突變檢測，螢光定量PCR法測定KRAS突變基因Ct值與內參基因Ct值的差值△Ct1，目標檢測靶點為KRAS第12和13密碼子的7種熱點突變型。
為了獲得足夠高的檢測靈敏度，本發明使用了突變擴展阻滯系統(amplification refractory mutation system,ARMS)技術，使用的PCR反應體系及反應程序中的各因素經過了優化，通過擬合因素和因變量之間的函數關係，得到最佳的反應體系和反應程序。
為了使本試劑盒的使用更加方便，本發明同時使用了多重PCR技術，7種目標突變型檢測以及內參基因檢測被放入同一反應管，可以實現一次反應完成檢測。
優化之後，KRAS基因突變檢測的具體反應體系為：1-3mM的MgCl2、0.1-1mM的dNTP、2.5-5U/反應的Taq酶、20-50mM的KCl、1-4mM的Tris(Ph8.0)、0.4-0.9uM的引物(每種突變型)、10uM的的探針(每種突變型)。
進一步，具體的反應程序為：95℃，5min；95℃，25sec，64℃，20sec，72℃，20sec，15cycles；93℃，25sec，60℃，35sec，72℃，20sec，45cycles；
圖2是本實施例中KRAS突變檢測的螢光定量PCR擴增曲線。
3)BMP3和NDRG4基因甲基化檢測，經亞硫酸鹽轉化法對DNA進行轉化，以螢光定量PCR法對基因甲基化進行MSP(Mehtylation-Specific PCR)法檢測，分別測定BMP3和NDRG4甲基化Ct值與內參基因Ct值的差值△Ct2、△Ct3，目標檢測靶點為BMP3和NDRG4各自基因啟動子附近的11-13個CpG位點。
本發明提供了一種DNA亞硫酸鹽轉化的試劑，DNA經亞硫酸鹽處理，經過硫化、脫氨基、脫硫化學反應，使沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，該化學反應通過亞硫酸鹽離子親核反應結合到胞嘧啶上，而發生甲基化的胞嘧啶則不會發生轉化，基於此，特異性針對甲基化序列的探針被設計，用於專一性檢測基因甲基化序列。
具體地，優選的，本發明中的亞硫酸鹽轉化液成分包括：NaOH、NaHSO3、(NH4)2SO3.H2O、NH4HSO3。
為了獲得足夠高的檢測靈敏度，本發明使用Taqman螢光探針技術，使用的PCR反應體系及反應程序中的各因素經過了優化，通過擬合因素和因變量之間的函數關係，得到最佳的反應體系和反應程序。
為了使本試劑盒的使用更加方便，本發明同時使用了多重PCR技術，2個目標甲基化基因和內參基因被放入同一反應管，兩個基因被不同的螢光染料區分，可以實現一次反應完成檢測。
優化之後，BMP3和NDRG4甲基化檢測的具體反應體系為：2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、2U/反應的Taq酶、20mM的Tris-HCl(Ph8.0)、50Mm的NH4+、0.75mM的引物(每種突變型)、0.25mM的的探針(每種突變型)。
進一步，具體的反應程序為：95℃，2min；95℃，20sec，60℃，60sec，50cycles。
圖3是本實施例中BMP3和NDRG4甲基化檢測的螢光定量PCR擴增曲線。
4)糞便潛血檢測，ELISA法進行FIT(Fecal Immunochemical Test)檢測，定量檢測糞便血紅蛋白含量。
相較於市場上使用的膠體金定性血紅蛋白檢測法，本發明使用了ELISA雙抗夾心法進行血紅蛋白定量檢測。
本發明中的糞便血紅蛋白檢測靈敏度為10ng/ml。
圖4為本實施例中糞便血紅蛋白ELISA檢測標準曲線。
為了驗證本發明的有益效果，本實施例還進行了臨床驗證試驗，通過本發明的檢測方法和邏輯運算公式及判定方法，以膠體金法FOBT檢測為對照，以檢測靈敏性和特異性為指標進行性能對比。
臨床試驗共選取臨床樣本總計384人份，入選人進行腸鏡檢查之前收集糞便樣品並進行上述指標檢測。
試驗中的病理分類又腸鏡檢查得出，共分為5個類別：
a，結直腸癌(I～IV期)；
b，進展期腺瘤，指滿足以下一項或多項標準的腺瘤：a)直徑＞10mm；b)含有絨毛成分；c)有重度異型增生或高級別上皮內瘤變。
c，非進展期腺瘤(歸為陰性)
d，息肉(歸為陰性)
e，陰性(結腸鏡和病理組織檢查都無症狀)
其中c、d、e類統計為病理陰性，a、b類統計為病理陽性。
數據分析採用了SAS 9.4and JMP 11.1.1(64-bit)軟體(SAS Institute).公式的建立將四個變異數因子△Ct1、△Ct2、△Ct3及FIT檢測結果與病理分類進行了邏輯回歸分析，得到的結果決定了每個因子在公式中的臨床係數。另外，單項結果也與其在測試人群中分布的最高2.5％為閾值做對比。如果單項結果屬於最高的2.5％以內，則足夠以單項結果促成檢測陽性結果。最終檢測的結果指數綜合了各項因子經回歸係數權重相乘後的得分和單項是否屬於最高2.5％的得分而算出最後指數。
所述邏輯運算公式為：P＝eK/(1+eK)
上式中，P為綜合指數，K＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FIT+X，e為自然常數；a,b,c,d,X為臨床常數。
當P值≥Cut-off時檢測結果為陽性，p值＜Cut-off時為陰性。
具體臨床試驗結果如下(見表2)
表2臨床試驗結果對比
註：
靈敏度(也稱真陽性率，sensitivity)＝真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)*100％。
指正確判斷病人的程度，也即實際有病而被正確診斷的百分比。
特異度(也稱真陰性率，specificity)＝真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)*100％。
指正確判斷非病人的程度，也即實際無病而被正確診斷為無病的百分比。
顯而易見的，本發明中的檢測試劑盒及相應檢測方法，作為一種非侵入性檢測方式，可以實現相較於FOBT(膠體金法)更高的檢測靈敏度，特別對於腺瘤的檢出率有顯著提高，特別是對於進展期腺瘤具有更高的檢出率，雖然在特異性參數上有所降低，但對於群體篩查提高敏感性更有實際意義，對於通過摘除癌前腺瘤而預防結直腸癌提供了可能。
本發明雖然已以較佳實施例公開如上，但其並不是用來限定本發明，任何本領域技術人員在不脫離本發明的精神和範圍內，都可以利用上述揭示的方法和技術內容對本發明技術方案做出可能的變動和修改，因此，凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化及修飾，均屬於本發明技術方案的保護範圍。