人肺腺癌幹細胞的分離鑑定方法

2023-12-04 18:47:36 1

專利名稱：：人肺腺癌幹細胞的分離鑑定方法
技術領域：
：本發明屬於細胞生物學領域，更具體地，本發明涉及肺腺癌幹細胞(群)的分離鑑定方法。
背景技術：
：肺腺癌是肺癌最常見組織類型之一，其發病率約佔肺癌總數的3040%。肺腺癌在外周氣道、尤其是細支氣管和肺泡多發，其癌前期病變稱為不典型性腺瘤樣增生(Atypicadenomatoushyperplasia,AAH)，表現為異常增生細胞沿肺泡壁排列，形態類似非纖毛柱狀(Clara)細胞或II型肺泡(AT2)細胞。但此類早期腺癌的細胞起源尚不清楚。美國研究者Kim等通過實驗研究，首次揭示肺腺癌是一種幹細胞疾病，其起源細胞(Originatingcells)是位於小鼠肺臟氣道末段細支氣管-肺泡導管連接處(BADJ)的細支氣管肺泡幹細胞(BranchioaveolarStemCells,BASC)。BASC經惡性轉化後成為肺腺癌幹細胞，其特徵是同時表達細支氣管非纖毛柱狀上皮(Clara細胞)標誌(即Clara細胞分泌蛋白，CCSP)和II型肺泡細胞標誌(即C型肺泡活性蛋白，SP-C)。而加拿大研究者Ho等則報導，人體肺癌(包括肺腺癌)幹細胞主要富集在側群(Sidepopulation,SP)細胞組分中。最近，義大利研究者Eramo等發現人體肺癌(包括肺腺癌)幹細胞屬於CD133陽性細胞。鑑於目前關於肺腺癌幹細胞(LungAdenocarcinomaStemCells,LASC)的特性和起源不盡清楚，各家說法不同，因而分離與鑑定肺腺癌幹細胞仍然是本領域迫切需要研究的問題。
發明內容本發明的目的在於提供肺腺癌幹細胞(群)的分離鑑定方法。本發明的另一目的在於提供可用於分離鑑定肺腺癌幹細胞(群)的試劑或試劑盒。在本發明的第一方面，提供一種從肺腺癌細胞群中分離肺腺癌幹細胞(群)的方法，所述方法包括從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R(胰島素樣生長因子-1受體)的細胞(群)，該細胞(群)是肺腺癌幹細胞(群)。在另一優選例中，所述的CD24和IGF-1R表達在細胞的表面。在另一優選例中，所述的肺腺癌幹細胞是人肺腺癌幹細胞。在另一優選例中，所述的肺腺癌幹細胞表達胚胎幹細胞標誌0CT4和Bmi-1;且表達肺幹細胞標誌CCSP(Clara細胞分泌蛋白)，SP-C(C型肺泡活性蛋白)，TTF-l(甲狀腺轉錄因子)和Gremlin。在另一優選例中，所述的從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞(群)的方法是(1)先利用CD24的特異性抗體從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24的細胞(群)，然後利用IGF-1R的特異性抗體從所獲得的表達CD24的細胞(群)中分離出同時還表達IGF-1R的細胞(群)；或者(2)先利用IGF-1R的特異性抗體分離出表達IGF-1R的細胞(群)；然後利用CD24的特異性抗體從所獲得的表達IGF-1R的細胞(群)中分離出同時還表達CD24的細胞(群)。在另一優選例中，所述的從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞(群)的方法是(a)將肺腺癌細胞群與表面攜帶第一抗體的固相載體孵育，從而形成"肺腺癌細胞-第一抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第一抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體；(b)從步驟(a)獲得的複合物上去除"第一抗體-固相載體"，從而獲得經處理的肺腺癌細胞群；(c)將步驟(b)獲得的肺腺癌細胞群與表面攜帶第二抗體的固相載體孵育，從而形成"肺腺癌細胞-第二抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第二抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同；(d)從步驟(iii)獲得的複合物上去除"第二抗體-固相載體"，從而獲得表達CD24和IGF-1R的細胞(群)。或者，所述的從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞(群)的方法是(i)將第一抗體加入肺腺癌細胞群，孵育後加入表面攜帶抗第一抗體的抗體的固相載體，從而形成"肺腺癌細胞-第一抗體-抗第一抗體的抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第一抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體；(ii)從步驟(i)獲得的複合物上去除"第一抗體-抗第一抗體的抗體-固相載體"，從而獲得經處理的肺腺癌細胞群；(iii)將第二抗體加入步驟(ii)獲得的肺腺癌細胞群，孵育後加入表面攜帶抗第二抗體的抗體的固相載體，從而形成"肺腺癌細胞-第二抗體-抗第二抗體的抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第二抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同；(iv)從步驟(iii)獲得的複合物上去除"第二抗體-抗第二抗體的抗體-固相載體"，從而獲得表達CD24和IGF-1R的細胞(群)。在另一優選例中，所述的固相載體是免疫磁珠。優選的，所述免疫磁珠的直徑為10nm-lmm;更優選的直徑為50nm-500um。在本發明的第二方面，提供一種CD24和IGF-1R或它們的特異性抗體的用途，用於從肺腺癌細胞群中分離肺腺癌幹細胞(群)；或者用於體外(非治療性地)檢測待測肺腺癌細胞(群)是否是肺腺癌幹細胞(群)；或者用於製備分離肺腺癌幹細胞(群)的試劑或試劑盒；或者用於製備體外(非治療性地)檢測待測肺腺癌細胞(群)是否是肺腺癌幹細胞(群)的檢測試劑或試劑盒；或者用於製備選擇性殺滅肺腺癌幹細胞(群)或誘導肺腺癌幹細胞(群)分化的藥物。在本發明的第三方面，提供一種體外(非治療性地)檢測待測肺腺癌細胞(群)是否是肺腺癌幹細胞(群)的方法，所述方法包括體外檢測待測肺腺癌細胞(群)是否表達CD24和IGF-1R，如果待測肺腺癌細胞(群)同時表達CD24和IGF-1R，則該細胞(群)是肺腺癌幹細胞(群)。在另一優選例中，所述檢測待測肺腺癌細胞(群)是否表達CD24和IGF-1R的方法選自(但不限於)聚合酶鏈反應(PCR)法，抗體特異性結合法，或流式7細胞術。在本發明的第四方面，提供一種試劑盒，所述的試劑盒含有特異性抗CD24的抗體，和特異性抗IGF-1R的抗體。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖l顯示了幹細胞標誌表達分析的結果。A，用RT-PCR檢測A549禾口SPC-A1肺腺癌細胞系中CD133禾BABCG2mRNA的表達。B，利用流式細胞分析驗證CD133和ABCG2在A549和SPC-A1肺腺癌細胞系表面的表達。圖2顯示了SP細胞及其表面標誌分析的結果。SPC-A1肺腺癌細胞用Hoechst33342染色，SP(藍色區域)和non-SP(紅色區域)部分分別被圈出，SP部分能夠被Reserpin(ABCG2轉運抑制劑)部分阻滯，然後使用螢光標記的特異性抗體分析兩個部分中ABCG2，CD24，IGF-1R和EGFR的表達。圖3顯示了細胞亞群的幹細胞基因表達分析的結果。通過MACS從A549肺腺癌細胞中分選相應的標記，用PCR檢測幹細胞相關基因。其中，泳道1為18srRNA,泳道2為OCT4;泳道3為Bmi-l，泳道4為SP-C，泳道5為CCSP，泳道6為Gremlin,泳道7為TTF-1。圖4顯示了肺腺癌細胞中CD24+IGF-1R+亞群的含量及其與SP的關係。A，A549和SPC-A1細胞分別用抗CD24(PE標記)和IGF-1R(FITC標記)抗體染色，CD24+IGF-lR+亞型用流式細胞分析。B，SPC-A1細胞用Hoechst33342染色，SP和non-SP部分分別被圈出以判斷CD24和IGF-1R的表達。圖5顯示了致瘤性分析的結果。Al，分選自A549細胞系的CD241GF-lR-細胞分別以1X105(上)或1X104(下)細胞被注射到NOD-SCID小鼠體內，在4周後檢測腫瘤的生長情況。分選自A549(A2)或SPC-A1(A3)細胞系的CD24+IGF-lR+細胞分別以1X103(上)或1X102(下)細胞被注射到NOD-SCID小鼠體內，在4周後檢測腫瘤的生長情況。Bl，SPC-A1母細胞以1X10"上)或1X14(下)注射到N0D-SCID小鼠體內，在4周後檢測腫瘤的生長情況。B2，分選自SPC-A1細胞系的ABCG2+(上)或ABCG2—(下)細胞以5X103細胞注射到NOD-SCID小鼠體內，在4周後檢測腫瘤的生長情況。B3，分選自SPC-A1細胞系的EGFR+或EGFR;細胞以5X103細胞注射到同一NOD-SCID小鼠體內(注射點分別位於雙側腹壁)，在4周後檢測腫瘤的生長情況。B3下圖為代表性的腺癌病理切片圖。圖6顯示了自主生長機理分析A，分選自A549細胞系的CD24+IGF-lR+細胞在無血清條件下培養2周後的情況。B，利用RT-PCR分別檢測分選自A549和SPC-A1細胞系的CD24+IGF-1R+中IGF-1，IGF-2，和EGFR配基二性調節素(Amphiregulin，AR)的表達情況。C，利用抗IGF-1R或EGFR的封閉抗體來評估CD24+IGF-lR+細胞的生長影響。D，評估重組人IGF-1或EGF對CD24+IGF-lR+細胞生長的影響。圖7顯示了體外培養的。024+10—111+細胞的特性分析。CD24+IGFlR+在無血清條件下培養3個月後進行細胞的特性分析。A，用流式細胞術分析分選自A549細胞系的CD24+IGF1R+細胞上表面標記的表達。B，通過Matrigel侵襲試驗評估分選自A549和SPC-A1細胞系的CD24+IGFlR+細胞的侵襲性分析。C，以圖中所示劑量(單位個細胞)將分選自A549細胞系的CD24+IGF—1R+細胞皮下注射入NOD-SCID小鼠體內，以親代細胞A549為對照。9具體實施例方式本發明人經過長期而廣泛的研究，首次揭示一種致瘤性和/或侵襲性高的細胞，該種細胞具有特別的標誌物CD24和IGF-1R(即其表型表現為CD24+IGF-lR+)。所述標誌可用於從常規肺腺癌細胞群中分離出致瘤性和/或侵襲性高的細胞(群)，以及用於致瘤性和/或侵襲性高的細胞(群)的鑑定。並且，本發明人還發現，所述的致瘤性和/或侵襲性高的細胞(群)表達多種胚胎及肺幹細胞標誌。在此基礎上完成本發明。如本發明所用，所述的"致瘤性和/或侵襲性高的細胞"是指一類CD24+IGF-1R+的肺腺癌細胞，其與CD24—IGF-1R—的細胞相比，致瘤性高10倍以上，優選的高100倍以上，更優選的高1000倍或更高；或者，與CD24—IGF-1R—的細胞相比，其侵襲性高2倍以上，優選的高5倍以上，更優選的高10倍或更高；本發明中，該致瘤性和/或侵襲性高的細胞即有腫瘤幹細胞的特性，因此也可被稱為"肺腺癌幹細胞"。如本發明所用，所述的親代肺腺癌細胞是指未經過特定的標誌物篩選的肺腺癌細胞。CD24和IGF-1R的用途本發明人首次發現CD24和IGF-1R是肺腺癌幹細胞的特定標誌，從而可基於此對肺腺癌幹細胞進行分離鑑定。具體地，本發明人經過反覆研究，從肺腺癌細胞群中分離鑑定了一個高致瘤性的細胞亞群，此類癌細胞的表型特徵為CD24+IGF-1R+，具有高侵襲性和高致瘤性，在免疫缺陷小鼠中僅需移植少量細胞即可形成腫瘤，其致瘤能力是上述CD24—IGF-lR—細胞的IO倍以上(優選的IOO倍以上，更優選的1000倍以上)。本發明人還從基因表達水平上驗證了CD24+IGF-1R+細胞具有幹細胞特徵，發現CD24+IGF-1R+細胞是唯一表達CCSP、SP-C及TTF-1的細胞亞群。此外，CD24+IGF-lR+細胞還表達0CT4、Bmi-1和GRM等幹細胞標誌。其中，所述的0CT4和Bmi-l是胚胎幹細胞標誌；所述的CCSP，SP-C，TTF-1和Gremlin是肺幹細胞標誌。因此，本發明提供了一種CD24和IGF-1R或它們的抗體的用途，用於從肺腺癌細胞(群)中分離肺腺癌幹細胞(群)；或者用於體外(優選非治療性地)檢測待測肺腺癌細胞(群)是否是肺腺癌幹細胞(群)。應用本發明提供的CD24和IGF-1R標誌分離或鑑定肺腺癌幹細胞(群)後，這類細胞(群)既可以用於製備體外檢測肺腺癌幹細胞(群)的特異性檢測試劑或試劑盒，也可以用於研製(或篩選)選擇性地殺滅肺腺癌幹細胞(群)或誘導肺腺癌幹細胞(群)分化的治療性藥物。此外，CD24和IGF-1R或它們的抗體還可用於製備分離肺腺癌幹細胞(群)的試劑或試劑盒；或者用於製備體外(優選非治療性地)檢測待測肺腺癌細胞(群)是否是肺腺癌幹細胞(群)的檢測試劑或試劑盒。此外，CD24和IGF-1R或它們的抗體還可用於製備選擇性殺滅肺腺癌幹細胞(群)或誘導肺腺癌幹細胞(群)分化的藥物。本發明所述的肺腺癌細胞(群)優選的是人肺腺癌細胞(群)；所述的肺腺癌幹細胞(群)優選的是人肺腺癌幹細胞(群)。肺腺癌幹細胞的分離基於CD24和IGF-1R可作為肺腺癌幹細胞標誌物的特點，本發明提供了一種從肺腺癌細胞(群)中分離出肺腺癌幹細胞(群)方法，所述方法包括從肺腺癌細胞(群)中分離出表達(優選表面表達)CD24和IGF-1R的細胞(群)，該細胞(群)即為肺腺癌幹細胞(群)。本發明對於分離表達CD24和IGF-1R的肺腺癌細胞(群)的方法沒有特別的限制，可以採用本領域已知的各種分離方法。較為經典的方法如流式細胞分選法或磁性細胞分選法，也即利用抗CD24的抗體和抗IGF-1R的抗體從肺腺癌細胞(群)中分離表達CD24和IGF-1R的細胞(群)。優選的方法是磁性細胞分選法，即先用其中一種標誌物的特異性抗體分離表達該標誌物的細胞(群)，然後用另一種標誌物的特異性抗體分離同時還表達該另一種標誌物的細胞(群)，其優點是毋須昂貴的流式細胞儀，適合各實驗室使用。作為本發明的優選方式，所述的從肺腺癌細胞(群)中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞(群)的方法是(a)將肺腺癌細胞群與表面攜帶第一抗體的固相載體孵育，從而形成"肺腺癌細胞-第一抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第一抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體；(b)從步驟(a)獲得的複合物上去除"第一抗體-固相載體"，從而獲得經處理的肺腺癌細胞群；(c)將步驟(b)獲得的肺腺癌細胞群與表面攜帶第二抗體的固相載體孵育，從而形成"肺腺癌細胞-第二抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第二抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同；(d)從步驟(iii)獲得的複合物上去除"第二抗體-固相載體"，從而獲得表達CD24和IGF-1R的細胞(群)。另一種可選擇的分離方法是(i)將第一抗體加入肺腺癌細胞(群)，孵育後加入表面攜帶抗第一抗體的抗體的固相載體，從而形成"肺腺癌細胞-第一抗體-抗第一抗體的抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第一抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體；(ii)從步驟(i)獲得的複合物上去除"第一抗體-抗第一抗體的抗體-固相載體"，從而獲得經處理的肺腺癌細胞(群)；(iii)將第二抗體加入步驟(ii)獲得的肺腺癌細胞(群)，孵育後加入表面攜帶抗第二抗體的抗體的固相載體，從而形成"肺腺癌細胞-第二抗體-抗第二抗體的抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第二抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同；(iv)從步驟(iii)獲得的複合物上去除"第二抗體-抗第二抗體的抗體-固相載體"，從而獲得表達CD24和IGF-1R的細胞(群)。抗體和抗抗體的選擇是本領域人員已知的。例如，當所述的第一抗體是鼠抗人CD24抗體時，所述的抗第一抗體的抗體可以是抗鼠IgG的抗體；當所述的第二抗體是鼠抗人IGF-1R抗體時，所述的抗第二抗體的抗體可以是抗鼠IgG的抗體。所述的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠被用於與第一抗體或抗第一抗體的抗體相偶聯(連接)並且可通過適當的方式被識別和分離。優選地，所述的固相載體是免疫磁珠，所述免疫磁珠的直徑通常為lOnm-lmm;更優選的直徑為50mn-500um。將抗體或抗抗體偶聯(連接)於固相載體的方法是本領域已知的技術。12從肺腺癌細胞(群)h去除抗體和/或固相載體的方法也是本領域已知的。例如，可以採用一類能特異性水解抗體的蛋白酶進行水解。所述的酶例如靡蛋白酶。作為本發明的優選實施例，採用磁性細胞分選(MACS)技術進行分離，所述的方法如下(al)將鼠抗人CD24抗體加入肺腺癌細胞(群)，孵育後加入抗鼠IgG免疫磁珠，用MiniMACS分離柱分離，獲得表達CD24的細胞(群)；(bl)用靡蛋白酶水解步驟(al)獲得的細胞表面結合的抗體，獲得經處理的表達CD24的細胞(群)；(cl)將鼠抗人IGF-lR抗體加入步驟(bl)獲得的細胞(群)中，孵育後加入吸附有抗鼠IgG的免疫磁珠，用MiniMACS分離柱分離，獲得表達CD24和IGF-1R的細胞(群)；或者，所述方法是(a2)將鼠抗人IGF-1R抗體加入肺腺癌細胞(群)，孵育後加入吸附有抗鼠IgG的免疫磁珠，用MiniMACS分離柱分離，獲得表達IGF-1R的細胞(群)；(b2)用靡蛋白酶水解步驟(a2)獲得的細胞表面結合的抗體，獲得經處理的表達IGF-1R的細胞(群)；(c2)將鼠抗人CD24抗體加入步驟(b2)獲得的細胞(群)中，孵育後加入抗鼠IgG免疫磁珠，用MiniMACS分離柱分離，獲得表達CD24和IGF-1R的細胞(群)。本發明所述的(抗)CD24的抗體或(抗)IGF-1R的抗體可以是對於CD24或IGF-1R具有特異性的單克隆抗體。"特異性"是指抗體能結合於CD24或IGF-1R基因產物或片段。較佳地，指那些能與CD24或IGF-1R基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。所述的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的CD24或IGF-1R基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達CD24或IGF-1R蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。肺腺癌幹細胞的檢測本發明還提供了一種檢測待測肺腺癌細胞(群)是否是肺腺癌幹細胞(群)的方法，所述方法包括檢測待測肺腺癌細胞(群)是否表達CD24和IGF-1R，如果待測肺腺癌細胞(群)同時表達CD24和IGF-1R，則該細胞(群)是肺腺癌幹細胞(群)。所述檢測待測肺腺癌細胞(群)是否表達CD24和IGF-1R的方法沒有特別的限制，所述方法例如可選自(但不限於)PCR法，抗體特異性結合法，或流式細胞術。基於所述的檢測肺癌幹細胞(群)的方法，還可以(i)進行肺腺癌的分型、鑑別、和/或診斷；(ii)評估肺腺癌惡性程度或發生轉移的風險度，待測肺腺癌細胞(群)中肺腺癌幹細胞的比例越高，則惡性程度越高且越易於發生轉移；(ii)評估相關人群的肺腺癌治療藥物、藥物療效、預後，以及選擇合適的治療方法，從而避免盲目給藥或盲目治療。作為本發明的優選方式，還可進一步分析鑑定待測肺腺癌細胞(群)的幹細胞標誌基因，例如選自下組的標誌基因0CT4、Bmi-1、CCSP、SP-C、TTF-1、Gremlin。試劑盒本發明還提供一種試劑盒，所述的試劑盒是檢測試劑盒或分離試劑盒。所述的試劑盒中含有檢測待測肺腺癌細胞(群)是否表達CD24和IGF-1R的試劑；或含有可從肺腺癌中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞(群)的試劑。作為本發明的優選方式，所述的試劑盒含有抗CD24的抗體，和抗IGF-1R的抗體。作為本發明的優選方式，所述的試劑盒還可含有特異性擴增胚胎幹細胞基因(如OCT4和Bmi-l)、或轉錄本的引物，和特異性擴增肺幹細胞基因(如CCSP、SP-C、TTF-1和Gremlin)、或轉錄本的引物；或者特異性結合胚胎幹細14胞基因的探針，和特異性結合肺幹細胞基因的探針。此外，所述的試劑盒還可含有其它鑑定或分離用的試劑，如(但不限於)(A)各種PCR反應用試劑，例如但不限於PCR緩衝液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各種提取細胞DNA(即製備PCR反應模板)所需的試劑，例如但不限於酚、氯仿等；(C)進行瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑，例如但不限於瓊脂糖粉、電泳緩衝液、溴化乙啶等；或(D)特異性水解抗體的蛋白酶。此外，所述的試劑盒中還可含有指示鑑定或分離方法的使用說明書，從而指導技術人員正確使用所述試劑盒。所述的試劑盒可實現快速檢測、批量分離或檢測的目的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。I.材料與方法一1.腫瘤細胞人肺腺癌細胞株A549和SPOAl購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，腫瘤細胞在常規的10y。胎牛血清-DMEM培養基(為Hyclone公司產品)中傳代培養，取活躍增殖期細胞進行實驗。2.流式細胞檢測將細胞調整至1X107個/ml，取lOOul細胞分別加入lug螢光素標記的鼠抗人CD133、EGFR、IGF-1R、CD24或ABCG2單抗(BectonDickinson公司產15品)，對照組加入同型鼠IgG(BectonDickinson公司產品，同型是指與上述特異性抗體屬於相同的免疫球蛋白亞型，如IgGl等)，室溫放置30分鐘後用PBS離心洗滌2次，重懸細胞於500u1PBS中，在FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson公司產品)上檢測CD133、EGFR、IGF-1R、CD24或ABCG2各標誌的陽性率。3.SP細胞檢測將細胞調整至1X107ml，加入5ug/mlHoechst33342(Sigma公司)，37。C溫育90分鐘後用PBS離心洗滌2次，重懸細胞於100"1PBS中，分別加入1yg特異性抗體後4'C放置20分鐘，PBS離心洗滌2次，重懸細胞於500U1PBS中，置冰浴中待測。SP細胞及其表面標誌陽性細胞檢測參照文獻Ho麗等，Sidepopulationinhumanlungcancercelllinesandtumorsisenrichedwithstem-likecancercells[J].C雄ervas，2007，67(10):4827-4833中所描述的，在BeckmanCoulterAltra流式細胞儀上進行。4.磁性細胞分選(MACS)細胞在EDTA消化液(含2.5raMEDTA及1%胎牛血清的PBS，pH7.27.4)中4"C溫育30分鐘，收集細胞後調整至1X107ml，按2ug抗體/106細胞標準分別加入鼠抗人EGFR、IGF-1R和CD24(BectonDickinson公司產品)單抗，4。C溫育10分鐘後用1%血清-DF12離心洗滌1次，然後加入抗鼠IgG免疫磁珠(Miltany公司產品)，按照生產商提供的操作指南用MiniMACS分離柱分選細胞；並根據操作指南的方法將細胞與抗體和磁珠分離。雙陽性細胞分選系在第一標誌陽性細胞分選後，用糜蛋白酶水解細胞表面結合的抗體，然後以同樣方法標記分選第二標誌陽性細胞。5.RT-PCR分析細胞收集後採用TriZol試劑(Invitrogen公司產品)提取總RNA，取gRNA逆轉錄成cDNA(釆用Fermemtas公司RevertAicTM首鏈cDNA合成試劑盒)後進行PCR擴增。PCR引物採用美國ABIPrismPrimerExpress軟體設計，其序列見表1。PCR擴增選用TakaraExTaqTM試劑(大連寶生物工程有限公司)，反應液內含IOX緩衝液2.5ul，2.5mmol/LdNTP2ul，上下遊引物(2016Umol/L)各1U1，Taq酶(5U/u1)0.2u1，cDNA2u1,用DEPC-H20補足至25ul。反應條件為95°C5分鐘變性；然後95。C45s,57°C45s，72°C60s，45個循環；72'C延伸7分鐘。擴增產物經1.6%瓊脂糖凝膠電泳100V30分鐘後EB染色攝片。表1PCR引物tableseeoriginaldocumentpage176.致瘤性分析812周齡N0D-SCID免疫缺陷小鼠由上海市腫瘤研究所實驗動物中心提供(也可購自中科院上海實驗動物中心)，性別不限。細胞收集後調整至所需濃度，按1:1比例與Matrigel(BectonDickinson公司產品)混合，於腹壁皮下注射lOOul。每周1次觀察腫瘤生長狀況，至腫瘤直徑》lcm或者觀察期達4周時將小鼠斷頸處死，攝片後摘取皮下腫瘤。7.細胞增殖試驗細胞收集後用1%血清-DF12培養基(DMEM/F12，Hyclone公司)調整至1X107ml，96孔板內每孔加入100u1，然後分別加入100nl不同濃度的重組人IGF-l(胰島素樣生長因子-l)或EGF(表皮生長因子)(均為Serotec公司產品)，對照組加入等量1%血清-DF12。37。C培養96h後每孔加入25ulMTT(5mg/ml)作用4h，經二甲基亞碸顯色後在570nm波長測定光密度。抗體阻斷試驗在相同實驗條件下加入10ug/ml的IGF-1R阻斷抗體(BectonDickinson公司，克隆1H7)或EGFR阻斷抗體(Upstate公司，克隆LA1)，對照組加入等量小鼠同型IgG(Upstate公司)。8.Transwell侵襲試驗8um孔徑Transwell小室(Corning公司產品)包被30u1經稀釋的Matrigel，37'C溫育30分鐘使膠固化。24孔板(Corning公司產品)小孔內加750u1含10%血清和100ng/ml重組人IGF-1(Serotec公司產品)的DF12培養基後將小室放入備用。待測細胞用1%血清-DF12培養基調整至3X10Vml，在小室中加入500"1細胞懸液，37'C溫育48小時後撤去小室，穿越Matrigel生物膠落入小孔的細胞經甲醇固定後結晶紫染色攝片，然後加入lml3%乙酸溶解細胞，在570nm波長測定光密度。II.實施例實施例1肺腺癌細胞中幹細胞標誌的表達分析CD133和ABCG2在多種實體腫瘤的癌幹細胞表面表達，是一類廣譜的幹細胞標誌。因而本發明人通過RT-PCR法和流式細胞法檢測了CD133和ABCG2在A549和SPC-Al肺腺癌細胞中的表達。圖1A結果顯示，A549和SPC-A1細胞均表達ABCG2特異性mRNA，但不表達CD133。採用流式細胞術進一步檢測其蛋白表達，證實A549和SPC-Al細胞群中ABCG2+細胞比例分別為6%和10%，而CD133抗體染色未檢測到陽性細胞，見圖1B。實施例2ABCG2及相關標誌表達與SP的關係肺臟中ABCG2+細胞分屬末端氣道(Distalairways)和肺泡上皮細胞，前者不具有SP特徵，而後者則是具有SP特徵的肺幹細胞(SummerR等，SidepopulationcellsandBcrplexpressioninlung[J].力歷/戶力75v;WZw《#o72003，285(1):L97-L104)。為了確定肺腺癌細胞中的ABCG2+細胞屬於何種類型，本發明人對SPC-Al細胞進行了Hoechst染色和ABCG2抗體標記。圖2結果顯示，SPC-A1中SP細胞範圍為3.27.4%，平均為5%，並且SP和非SP(non-SP)組分中ABCG2+細胞比例分別為3.1%和2.2%，即ABCG2主要表達在non-SP細胞表面。已知癌細胞表面ABCG2表達受生長因子受體酪氨酸激酶的調控，因而本發明人分別檢測了SP和non-SP細胞表面表皮生長因子受體(Epidermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)和胰島素樣生長因子-1受體(Insulin-likegrowthfactor-lrec印tor，IGF-1R)表達。同時根據Ho等(HoMM等，Sidepopulationinhumanlungcancercelllinesandtumorsisenrichedwithstem-likecancercells[J]C露e"es，2007，67(10):4827-4833)報導，本發明人也分析了幹細胞標誌CD24在SP和non-SP組分中的分布。圖2結果顯示，上述蛋白在SP和non-SP細胞中的陽性表達率基本相同，因而均非SP細胞特異性標誌。實施例3CD24+IGF-1R+細胞亞群的幹細胞基因表達分析為了尋找肺腺癌細胞中的LASC，本發明人釆用MACS技術將A549細胞分成ABCG2+、EGFR+、CD24+和IGF-lR+細胞亞群，然後採用RT-PCR技術檢測了一組幹細胞基因的表達，這類基因涉及自我更新(0CT4和Bmi-l)，分化調控(TTF-1和GRM)以及BASC標誌(CCSP和SP-C)。圖3結果顯示，未經分選的A549親代細胞(Parent)表達SP-C和Bmi-1，而所有標誌陽性細胞均表達Bmi-1、SP-C和Gremlin(GRM)。此外，CD24+細胞還表達0CT4，IGF-lR+細胞還表達CCSP和TTF-1。進一步從CD24+細胞亞群中分離IGF-1R+細胞，所得的CD24+IGF-1R+細胞表達全部幹細胞基因，尤其是CCSP和SP-C同時表達提示這類細胞與Kim等報導的小鼠肺臟BASC相似。實施例4CD24+IGF-1R+細胞含量及其與SP的關係本發明人還利用流式細胞分析法檢測了肺腺癌細胞A549和SPC-Al中CD24+IGF-1K+亞群的含量及其與SP的關係。圖4A顯示，A549和SPC-A1細胞中CD24+IGF-1R+細胞亞群比例分別為2.76%和10.14%。進一步分析SPC-Al細胞中該亞群與SP的關係，結果見圖4B，發現在SP和non-SP組分中均存在CD24+IGF-lR+細胞，但SP組分的CD24+IGF-lR+細胞比例(5.7%)高於non-SP組分(3.4%)。實施例5CD24+IGF-1R+細胞具有顯著致瘤特性本發明人還測試了各種細胞在免疫缺陷小鼠體內的致瘤性情況。致瘤性分析結果顯示，在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下接種100個CD24+IGF-lR+細胞，9/9小鼠均形成腫瘤(圖5A2-3)，而在相同實驗條件下接種1X105個CD24-IGF-1R—細胞，僅2/5隻小鼠形成腫瘤(圖5A1)，並且腫瘤體積顯著小於上述標誌陽性細胞。可見CD24+IGF-1R+細胞的致瘤性是CD24—IGF-1R—細胞的1000倍以上。此外，本發明人也分析了ABCG2和EGFR表達與致瘤性的關係，發現ABCG2+和ABCG2—細胞的致瘤能力無明顯差異(圖5B2)，EGFR+和EGFR—細胞的致瘤性也基本相同(圖5B3)，上述細胞亞群的致瘤性與未分選的親代細胞差異不顯著(圖5B1)。實施例6CD24+IGF-1R+細胞的自主生長特性分析癌幹細胞的一個顯著特徵是能夠自主生長(Self-sufficiencyforgrowthsignaling),其機理可能是通過生長因子受體自分泌環獲得增殖信號，因而可以在無血清、無生長因子條件下生長。據此本發明人將CD24+IGF-lR+細胞和CD24—IGF-IR—細胞分別培養在無血清和10%血清DF-12培養基中，發現二種細胞在10%血清中均活躍生長，但在無血清條件下，CD24—IGF-1R—細胞不能存活，而CD24+IGF-1R+細胞不僅能夠存活，而且還能增殖，見圖6A,經培養2周後，細胞數量從O.1X16增加至1..4X106。為了剖析CD24+IGF-lR+細胞的自主生長機理，本發明人採用RT-PCR分析了2組受體-配基的mRNA表達，圖6B顯示，SPC-Al和A549的CD24+IGF-1R+細胞均表達IGF-1R及其配基IGF-1、IGF-2(僅A549來源細胞)，以及EGFR配基二性調節素(Amphiregulin，AR)。20功能分析揭示，應用特異性抗體阻斷上述受體與配基的相互作用顯著抑制細胞增殖(圖6C)，而加入IGF-1或EGF，均可以刺激細胞生長(圖6D)，由此證實CD24+IGF-1R+細胞通過IGF-1R及EGFR自分泌調節環，實現自主生長。實施例7CD24+IGF-1R+細胞的體外傳代培養幹細胞的增殖與分化是一對矛盾，如何在維持癌幹細胞生長的同時，避免或延緩其分化，仍是一個有待探索的問題。本發明人經過比較分析，發現採用1%血清DF12培養基，可以使CD24+IGF-lR+細胞在增殖的同時保持表型相對穩定，目前已對此類細胞連續傳代培養了6個月。在體外培養3個月時進行流式細胞檢測，顯示CD24+IGF-1R+細胞表面IGF-1R、EGFR、CD24和ABCG2陽性率分別為89.82%,22.61%，67.0%和7.75%(圖7A)。Transwell侵襲試驗顯示(圖7B)，未經分選的親代細胞在10%血清和100ng/mlIGF-1刺激下穿越Matrigel生物膠的細胞甚少，而CD24+IGF-1R+細胞經過長期培養後仍具有高侵襲性，尤其是A549來源的細胞在相同條件下落入下層小孔內的細胞數量為親代細胞的io倍以上。致瘤性分析顯示，親代細胞需接種1X104才能形成腫瘤(4/5小鼠)，而培養的CD24+IGF-1R+細胞僅需接種500細胞/鼠就能形成腫瘤(圖7C)，說明這類細胞仍保留高致瘤性。綜上所述，本發明人發現人體肺腺癌中存在CCSP+SP-C+的BASC樣幹細胞，這些細胞以CD24+IGF-lR+為標誌，表達多種胚胎幹細胞相關基因，能夠自主生長，具有高侵襲性和高致瘤性，按照目前公認的癌幹細胞鑑定標準(MimeaultM等，Recentadvancesincancerstem/progenitorcellresearch:therapeuticimplicationsforovercomingresistancetothemostaggressivecancers[J]./#W#eA2007，11(5):981-1011)，此類肺腺癌細胞屬於迄今尚未報導的肺腺癌幹細胞。實施例8試劑盒製備一種試劑盒，該試劑盒含有鼠抗人CD24抗體，鼠抗人IGF-1R抗體，吸附有抗鼠IgG的免疫磁珠和靡蛋白酶。21討論肺臟中存在多種成體幹細胞(Somaticstemcells)，如(1)基底細胞(Basalcells),位於氣管支氣管的黏膜下腺體導管開口及軟骨間上皮基底層，可分化形成纖毛柱狀細胞和Clara細胞等呼吸道上皮細胞；(2)Clara變異細胞(vCE)，位於細支氣管上皮的神經表皮小體(Neuro印ithelialbodies,NEB),主要分化形成Clara細胞和肺神經內分泌細胞；(3)細支氣管肺泡幹細胞(BASC)，位於終末細支氣管-肺泡導管連接處(BADJ),可分化形成Clara細胞和肺泡上皮細胞。其中BASC被認為是肺腺癌的癌變前體細胞。BASC的典型特徵是同時表達CCSP和SP-C，此類細胞還具有造血幹細胞表面標誌如CD34等。轉基因實驗證明，在CCSP或SP-C基因的啟動子控制下，定向表達突變型K-ras癌基因、突變型EGFR基因或人IGF-1基因均能誘發肺腺癌及其癌前期病變，說明生長因子受體酪氨酸激酶信號途徑在BASC惡性轉化過程中起關鍵作用。然而，在人體肺腺癌組織或建株的肺腺癌細胞中至今尚未發現CCSP+SP-C+的BASC樣幹細胞，也沒有關於肺腺癌幹細胞表達造血幹細胞表面標誌CD34+或CD133+的報導。因而加拿大研究者Ho等採用SP作為人肺癌幹細胞的標誌，發現非小細胞肺癌的癌幹細胞主要富集在SP細胞組分中。這類肺癌SP細胞具有較高的侵襲性和致瘤性，在NOD-SCID小鼠中約5X13SP細胞能夠形成腫瘤，其致瘤能力約為non-SP細胞的10倍。但作者報導，肺癌SP細胞並不特異性表達幹細胞表面標誌如CD24、CD34和CD44等。小鼠肺臟也存在SP細胞，此類細胞表達CCSP，但不表達CD34、SP-C及其轉錄因子TTF-1，其主要特徵是高表達ABCG2，後者是DNA染料Hoechst33342的主要跨膜轉運蛋白。然而，小鼠肺SP細胞被認為來自骨髓，其主要作用是作為肺血管的前體細胞。但在急性肺損傷時，肺SP細胞也可以分化成為呼吸道上皮細胞，參與肺損傷的修復。因此，關於肺腺癌的起源細胞，各家說法不一。本發明人從2株人肺腺癌細胞中分離鑑定了一個高致瘤性的細胞亞群，此類癌細胞的表型特徵為CD24+IGF-lR+，具有高侵襲性和高致瘤性，在NOD-SCID小鼠中僅需移植100細胞即可形成腫瘤，其致瘤能力是上述標誌陰性細胞的1000倍。CD24+IGF-1R+細胞分別佔A549和SPC-Al細胞總數的2.76%和10.14%，這類細胞不屬於SP組;，但其在SP組分中的含量高於non-SP組分，這種分布差異可以解釋HO等報導的結果。除了高致瘤特性外，從基因表達水平分析CD24+IGF-1R+細胞具有幹細胞特徵。通過陽性細胞分選，本發明人發現CD24+IGF-lR+細胞是唯一表達CCSP、SP-C及TTF-1的細胞亞群，揭示該群細胞屬於人體BASC樣細胞。此外，CD24+10「-11^+細胞還表達0(^4、Bmi-1和GRM等幹細胞標誌，提示其具有自我更新能力。0CT4是公認的原始幹細胞標誌，在胚胎幹細胞中，0CT4與Sox2等形成轉錄因子複合物調控1000餘種基因表達，功能涉及染色質構象、DNA修復、細胞增殖和凋亡等，是胚胎幹細胞維持自我更新的主要凋控因子之一(BoyerLA，等,Coretranscriptionalregulatorycircuitryinhumanembryonicstemcells[J].Ce仏2005，122(6):947-956)。Bmi-1也是原始幹細胞的標誌之一，該基因可能通過調控端粒酶逆轉錄酶(TERT)和P16皿4等抑癌基因表達賦予幹細胞無限增殖能力(ParkIK等，Bmil，stemcells,andsenescenceregulation[J]./C7i/2004，113(2):175-179)。GRM(Gremlin)屬於骨形態建成蛋白-4(BMP4)的特異性抑制物，是幹細胞"巢"(Niches)基質細胞分泌的一類分化抑制蛋白，其機理是GRM與14-3-3eta結合，阻斷多種蛋白激酶的信號轉導、抑制細胞分化(NamkoongH等，ThebonemorphogeneticproteinantagonistgremlinIisoverexpressedinhumancancersandinteractswithYWHANprotein[J].AJCCs/7cer,20066:74-86)。癌幹細胞同時表達上述自我更新所必需的基因，這就不難理解為何癌細胞建株後經過長期傳代培養仍能保留其幹細胞組分。現有證據顯示，成體幹細胞獲得自主生長特性是其惡性轉化的前提條件之一，其中生長因子受體酪氨酸激酶信號轉導途徑異常在肺腺癌發生發展中具有重要作用。IGF-1R是肺腺癌的一種多功能生長因子受體，IGF-1R與特異性配體如IGF-1等結合併活化後，主要通過PI3K-Akt等信號途經引起BAD磷酸化並失活，賦予細胞抗凋亡能力。曾有報導，一些肺腺癌細胞能夠自發地分泌IGF-1和AR，這些生長因子通過自分泌機制刺激IGF-lR+細胞增殖，因而可以在無血清培養條件下生長。此外，IGF-1R活化還上調多種基質金屬蛋白酶(如腿P2和MMP9)表達，促使癌細胞侵襲轉移。在肺癌細胞中，IGF-1R表達上調可以顯著增強其侵襲轉移能力。本發明結果也證實，CD24+IGF-lR+細胞具有自主生長特性，這類細胞表達IGF-1和AR，可以在無血清培養基中生長，加入IGF-1或EGF明顯促進細胞增殖，而應用特異性抗體阻斷IGF-1R或EGFR信號轉導，23均顯著抑制細胞生長。這類細胞在無血清條件下培養3個月後仍具有高致瘤能力，體外侵襲試驗證明其在IGF-1刺激下具有高侵襲性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。權利要求1.一種從肺腺癌細胞群中分離肺腺癌幹細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞，該細胞是肺腺癌幹細胞。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的CD24和IGF-1R表達在細胞的表面。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的肺腺癌幹細胞是人肺腺癌幹細胞。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的肺腺癌幹細胞表達胚胎幹細胞標誌0CT4和Brai-1;且表達肺幹細胞標誌CCSP，SP-C，TTF-1和Gremlin。5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞的方法是(1)先利用CD24的特異性抗體從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24的細胞，然後利用IGF-1R的特異性抗體從所獲得的表達CD24的細胞中分離出同時還表達IGF-1R的細胞；或者(2)先利用IGF-1R的特異性抗體分離出表達IGF-1R的細胞；然後利用CD24的特異性抗體從所獲得的表達IGF-1R的細胞中分離出同時還表達CD24的細胞。6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞的方法是(a)將肺腺癌細胞群與表面攜帶第一抗體的固相載體孵育，從而形成"肺腺癌細胞-第一抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第一抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體；(b)從步驟(a)獲得的複合物上去除"第一抗體-固相載體"，從而獲得經處理的肺腺癌細胞群；(C)將步驟(b)獲得的肺腺癌細胞群與表面攜帶第二抗體的固相載體孵育，從而形成"肺腺癌細胞-第二抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第二抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同；(d)從步驟(iii)獲得的複合物上去除"第二抗體-固相載體"，從而獲得表達CD24和IGF-1R的細胞。或者，所述的從肺腺癌細胞群中分離出表達CD24和IGF-1R的細胞的方法是(i)將第一抗體加入肺腺癌細胞群，孵育後加入表面攜帶抗第一抗體的抗體的固相載體，從而形成"肺腺癌細胞-第一抗體-抗第一抗體的抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第一抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體；(ii)從步驟(i)獲得的複合物上去除"第一抗體-抗第一抗體的抗體-固相載體"，從而獲得經處理的肺腺癌細胞群；(iii)將第二抗體加入步驟(ii)獲得的肺腺癌細胞群，孵育後加入表面攜帶抗第二抗體的抗體的固相載體，從而形成"肺腺癌細胞-第二抗體-抗第二抗體的抗體-固相載體"複合物，分離出該複合物；其中所述的第二抗體選自抗CD24的抗體，或抗IGF-1R的抗體，且所述的第二抗體與第一抗體不同；(iv)從步驟(iii)獲得的複合物上去除"第二抗體-抗第二抗體的抗體-固相載體"，從而獲得表達CD24和IGF-1R的細胞。7.—種CD24和IGF-1R或它們的特異性抗體的用途，其特徵在於，用於從肺腺癌細胞群中分離肺腺癌幹細胞；或者用於體外檢測待測肺腺癌細胞是否是肺腺癌幹細胞；或者用於製備分離肺腺癌幹細胞的試劑或試劑盒；或者用於製備體外檢測待測肺腺癌細胞是否是肺腺癌幹細胞的檢測試劑或試劑盒；或者用於製備選擇性殺滅肺腺癌幹細胞或誘導肺腺癌幹細胞分化的藥物。8.—種體外檢測待測肺腺癌細胞是否是肺腺癌幹細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括體外檢測待測肺腺癌細胞是否表達CD24和IGF-1R，如果待測肺腺癌細胞同時表達CD24和IGF-1R，則該細胞是肺腺癌幹細胞。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述檢測待測肺腺癌細胞是否表達CD24和IGF-1R的方法選自聚合酶鏈反應法，抗體特異性結合法，或流式細胞術。10.—種試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒含有特異性抗CD24的抗體，和特異性抗IGF-1R的抗體。全文摘要本發明屬於細胞生物學領域，公開了從肺腺癌細胞(群)中分離或鑑定肺腺癌幹細胞(群)的方法，本發明還公開了分離或鑑定肺腺癌幹細胞(群)的試劑和試劑盒。本發明首次揭示肺腺癌幹細胞具有特別的標誌物CD24和胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)，為肺腺癌幹細胞(群)的分離或鑑定提供了有效途徑。文檔編號C12N5/08GK101463342SQ20071017278公開日2009年6月24日申請日期2007年12月21日優先權日2007年12月21日發明者董強剛申請人:上海市腫瘤研究所