低氧誘導因子(HIF)α的穩定化的製作方法

2023-11-03 22:13:07 1

專利名稱：低氧誘導因子(HIF)α的穩定化的製作方法
技術領域：
本發明涉及低氧誘導因子(HIF)的α亞基的穩定化方法，還涉及可用於這些方法的化合物。
背景技術：
組織低氧的早期反應是產生低氧誘導因子(HIF)，所述HIF是一種鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)PAS(Per/Arnt/Sim)轉錄激活因子，它能針對細胞中氧濃度的變化緩衝基因表達的變化。HIF是包含調節氧的α亞基(HIFα)和表達結構的β亞基(HIFβ)的雜二聚體，也稱作芳烴受體核轉運子(ARNT)。在常氧(含氧量正常的)細胞中，HIFα亞基在一種機制的作用下快速降解，該機制涉及von Hippel-Lindau腫瘤抑制劑(pVHL)E3連接酶絡合物的泛素化(ubiquitination)。在低氧條件下，HIFα是不被降解的，活性HIFα/β絡合物富集在細胞核中，激發包括糖酵解酶、葡萄糖轉運子(GLUT)-1、紅細胞生成素(EPO)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)在內的數種基因的表達。(Jiang等(1996)J.Biol.Chem.27117771-17778；Iliopoulus等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9310595-10599；Maxwell等(1999)Nature 399271-275；Sutter等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974748-4753；Cockman等(2000)J.Biol.Chem.27525733-25741；Tanimoto等(2000)EMBO J 194298-4309。)在多數細胞中，HIFα蛋白的含量會因低氧而升高，如果動物貧血或低氧，其體內就會產生HIFα。一旦低氧，HIFα含量在數小時內就會上升，在持續低氧條件下將恢復到基線。在無數細胞活動和發育過程中涉及HIF，包括細胞增殖、血管新生和細胞周期終止。心肌嚴重缺血和早期梗死、動脈高血壓及炎症也與HIFα相關。雖然已經有人將HIFα與腫瘤生長和轉移聯繫起來，但沒有充分證據表明HIF直接與腫瘤發生有關。研究表明，使目標組織短期低氧的低氧預調理方法能保護心肌和大腦免受低氧-缺血傷害。HIFα的穩定化與缺血密切相關，可通過預調理方法產生。(Wang和Semenza(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904304-4308；Stroka等(2001)FASEB J 152445-2453；Semenza等(1997)Kidney Int 51553-555；Carmeliet等(1998)Nature 394485-490；Zhong等(1999)Cancer Res.595830-5835；Lee等(2000)N Engl J Med 343148-149；Sharp等(2000)J Cereb Blood Flow Metab201011-1032；Semenza等(2000)Adv Exp Med Biol 475123-130；Thornton等(2000)Biochem J 350307-312；Deindl和Schaper(1998)Mol Cell Biochem 18643-51；Bergeron等(2000)Ann Neurol 48285-296)一些研究人員研究了HIFα與pVHL之間的作用機理。最初認為HIF-1α中從殘基401到603之間的依氧降解域(ODD)足以將依氧不穩定性傳遞給蛋白質嵌合體結構。研究發現，依賴於pVHL的降解需涉及從526到652之間的部分ODD區域。此外，在HIFα同源蛋白中的保留區域裡(HIF-1α中的殘基556-574)，P564YI突變為天門冬氨酸或者K532突變為精氨酸使整段HIFα蛋白在常氧條件下具有穩定性，並能抵抗pVHL調節的降解。(Huang等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 957987-7992；Tanimoto等(2000)EMBO J194298-4309)HIFα含量在許多類似於低氧的因素作用下可升高，包括鐵嵌合體如去鐵敏(DFO)和二價金屬鹽如CoCl2。血管緊縮素II、凝血酶和血小板生長因子在常氧條件下通過涉及活性氧物種的機理提高HIFα的含量。還有報導提出，HIFα由磷酸化作用調節，該途徑涉及受氧化氮激活的磷脂醯肌醇3』-激酶(PI3K)、肝細胞生長因子或受分裂素激活的蛋白激酶。肝糖合酶激酶是PI3K的下遊靶，直接使HIFαODD域發生磷酸化。(Richard等(2000)J Biol Chem 27526765-26771；Sandau等(2000)Biochem Biophys Res Commun 278263-267；tacchini等(2001)Carcinogenesis221363-1371；Sodhi等(2001)Biochem Biophys Res Commun 287292-300)當肺功能受損或血流量下降時，就會出現低氧現象——一種供氧量減少的狀態。與血流量下降相應的缺血現象可由動脈或靜脈阻塞引起，如血凝塊(血栓)或外來循環物質(栓塞物)，或血管異常，如動脈硬化。血流量下降可突然發作並且持續時間短(急性缺血)，也可能緩慢發作並持續較長時間或反覆發作(慢性缺血)。急性缺血通常與局部不可逆組織壞死(梗阻)有關，而慢性缺血通常與短暫低氧組織損傷有關。但是，如果灌注下降持續時間太長或太厲害，慢性缺血也可能與梗阻有關。梗阻常常出現在脾、腎、肺、腦和心臟中，產生諸如腸梗阻、肺部梗阻、缺血中風和心肌梗阻等疾病。
缺血異常的病理變化取決於缺血持續的時間和嚴重程度以及患者存活時間的長短。在發生梗阻的最初24小時內就會出現組織壞死，在靠近梗阻部位的可見組織中會發生嚴重的炎症反應，同時白細胞會遷移到壞死組織區域。在隨後幾天裡，嗜菌作用會逐漸分解並消除梗阻部位的細胞，代以膠原或膠質痂。
一個器官中的低灌注狀態或梗阻往往會波及其他器官。例如，由肺栓塞等引起的肺部缺血不僅影響肺，而且使心臟和其他器官(如腦)處於低氧應激反應下。心肌梗阻常常涉及血栓引起的冠狀動脈阻塞、冠狀動脈壁痙攣或心臟病毒感染，會引起充血性心力衰竭和系統性低血壓。如果心臟因持續低血壓而長時間停止正常工作，則會引發第二併發症，如完全性缺血腦病。大腦缺血最普遍的情況是由因動脈硬化而發生的血管梗阻引起的，它的嚴重程度可以輕到暫時性腦缺血(TIA)，重到腦梗阻或中風。雖然TIA的症狀是暫時的，並且是可以恢復的，但TIA容易復發，而且常常導致中風。
梗阻性動脈疾病包括冠狀動脈疾病，可引起心肌梗阻和周邊動脈疾病，會影響腹部大動脈、其主要支動脈和腿動脈。周邊動脈疾病包括Buerger疾病、Raynaud疾病和手足發紺。雖然周邊動脈疾病通常由動脈硬化引起，其他起因還包括糖尿病等。周邊動脈疾病的併發症包括嚴重腿部痙攣、絞痛、心律不齊、心力衰竭、心臟病、中風和腎衰竭。
缺血和低氧問題是影響患病率和死亡率的重要因素。心血管疾病每年至少導致1500萬人死亡，佔全球死亡人數的30％。在各種心血管疾病中，缺血性心臟病和腦血管疾病導致死亡的人數約佔總數的17％。每年見諸報告的非致命性嚴重心肌梗阻病例有130萬，大約10萬人中有600人患此類疾病。此外，每年估計有500萬美國人受到靜脈血栓困擾，其中約60萬人最終患有肺栓塞。約1/3肺栓塞患者最終死亡，使肺栓塞成為美國引起死亡的第三大主因。
目前，對缺血性和低氧性疾病的治療集中在緩解症狀和治療誘因疾病上。例如對心肌梗阻的治療包括使用硝化甘油和止痛藥控制病痛，緩解心臟負荷。同時用其他藥物來穩定病情，如地高辛、利尿劑、氨力農、β-阻斷劑、降脂劑和血管緊縮素轉化酶抑制劑，但沒有一種治療方法是直接針對缺血和低氧引起的組織損傷的。
由於當前治療方法存在缺陷，仍然需要能有效治療缺血和低氧引起的疾病的方法，如梗阻性動脈疾病、心絞痛、腸梗阻、肺梗阻、腦缺血和心肌梗阻。另外，還需要能有效預防缺血引起組織損傷的方法，舉例來說，所述缺血的起因有動脈硬化、糖尿病和肺部疾病，如肺栓塞等。總而言之，本領域需要能用來穩定HIF、治療和預防HIF疾病，包括缺血、低氧引起的疾病的方法和化合物。
發明概述這裡介紹的是穩定低氧誘導因子的α亞基(HIFα)的方法。這些方法可用於生物體內或體外。
本發明總體上涉及穩定低氧誘導因子(HIF)的α亞基的方法。在一種實施方式中，穩定HIF的α亞基(HIFα)的方法包括給治療對象提供一種能抑制HIFα發生羥基化反應的化合物。在本發明的某些實施方式中，HIFα選自HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α和它們的任何片段。在另一個實施方式中，所述方法包括給治療對象提供一種能抑制2-酮戊二酸雙加氧酶活性的化合物。在各種實施方式中，所述2-酮戊二酸雙加氧酶選自EGLN1、EGLN2、EGLN3、原膠原脯氨醯4-羥基酶、原膠原脯氨醯3-羥基酶、原膠原賴氨醯羥基酶、PHD4、FIH-1，它們的任何片段或亞基。
本發明穩定HIFα的一些特定方法包括抑制HIF脯氨醯羥化酶活性。在其他實施方式中，HIF脯氨醯羥化酶選自EGLN1、EGLN2、EGLN3和它們的任何片段或亞基。
本發明一方面提供了穩定內生HIFα的方法。因此，在一個特定實施方式中，HIFα是內生於治療對象上的。本發明的實施方式包括這樣一種穩定HIFα的方法，即在治療對象體內提供穩定HIFα的化合物。治療對象包括動物，宜為哺乳動物，更宜為人。這也預期了體外給藥的方法。在這種方法中，治療對象可以是細胞、組織或器官等。在某些實施方式中，治療對象可以是諸如腎臟、心臟、肝臟、肺、造血系統、腸胃、神經系統或骨骼肌肉系統等系統內的細胞、組織或器官。
本發明還提供了治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法。特別地，本發明提供了一種治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法，該方法包括穩定HIFα。具體說來，本發明針對患者與HIF有關的疾病，提供了一種治療、預防或預治療/預調理方法，該方法包括穩定HIFα。分而論之，與HIF相關的疾病包括與缺血或低氧有關的疾病。本發明的一個優選方面包括給治療對象服用能穩定HIFα的化合物。
在各種實施方式中，所述化合物選自雜環羧醯胺、菲咯啉、異羥肟酸和生理活性鹽以及由它們製成的前體藥物。在特定實施方式中，該化合物是雜環羧醯胺，選自吡啶羧醯胺、喹啉羧醯胺、異喹啉羧醯胺、肉啉羧醯胺和β-咔啉羧醯胺。在本發明的一個優選實施方式中，所述化合物以口服劑的形式提供。在另一個優選實施方式中，所述化合物以皮透藥劑的方式提供。
在本發明穩定HIFα的一種方法中，所述化合物通過專門抑制HIFα中至少一個胺基酸殘基發生羥基化來穩定HIFα。另一方面，胺基酸殘基選自脯氨酸和天冬醯胺。
提供治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法，所述方法包括抑制2-酮戊二酸雙加氧酶活性，本發明還包括其中所述HIF疾病與缺血或低氧有關的方法。本發明一方面提供了一種治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法，該方法包括給治療對象提供能抑制2-酮戊二酸雙加氧酶活性的化合物。
在一個優選實施方式中，本發明針對患者與HIF有關的疾病，提供了一種治療、預防或預治療/預調理方法，該方法包括抑制HIF脯氨醯羥化酶的活性。同樣，所述與HIF有關的疾病包括與低氧或缺血等有關的疾病。在一個特定實施方式中，所述方法包括給治療對象提供能抑制HIF脯氨醯羥化酶活性的化合物。
在另一個實施方式中，該方法還包括服用第二種化合物。在特定實施方式中，所述第二種化合物能抑制2-酮戊二酸雙加氧酶的活性，或者前述化合物和第二種化合物能抑制不同2-酮戊二酸雙加氧酶的活性，或者第二種化合物選自ACE抑制劑(ACEI)、血管緊縮素II受體阻斷劑(ARB)、利尿劑、地高辛、抑胃酶氨酸或肉鹼等。
在
具體實施例方式
中，與HIF有關的疾病包括肺部疾病(例如肺栓塞等)、心臟病(例如心肌梗塞、充血性心力衰竭等)、神經疾病等。因此本發明明確提出能用來治療、預防或預治療/預調理與HIF有關的缺血性疾病的方法，無論是急性或暫時性或慢性疾病。急性缺血情況包括與外科手術、器官移植、梗阻(例如腦梗阻、腸梗阻、心肌梗塞、肺梗阻等)、外傷、損傷或創傷等有關的情況。慢性缺血情況包括高血壓、糖尿病、閉合動脈疾病、慢性靜脈功能不足、肢端動脈痙攣症(Raynaud′sdisease)、硬化、充血性心力衰竭、系統性硬化症等。
本發明特別考慮了預調理或預治療的方法。在一種實施方式中，本發明提供了在與HIF疾病相關的情況如缺血等出現之前，或者與HIF相關的疾病惡化之前，通過穩定HIFα來進行預治療或預調理的方法。缺血可由急性事件引發，如外科手術(例如血管成形、器官移植等)和相關治療過程如實施麻醉等。此外，在慢性情況下，預治療或預調理的方法適用於治療對象患有可預知惡化趨勢的HIF疾病的情形，例如短時間缺血或心絞痛、早期中風和心肌梗塞等，目的是防止HIF疾病的惡化或減輕HIF疾病的惡化程度。在一個特定實施方式中，可給治療對象提供一種化合物，以增加缺血預調理因子，如EPO等。
這裡特別提出了增加各種HIF相關因子的表達的方法。一方面，本發明提供了一種增加患者血管生成因子的表達的方法，該方法包括穩定HIFα。另一方面，本發明提供了一種增加患者糖酵解因子的表達的方法，該方法包括穩定HIFα。再一方面，本發明提供了增加患者與氧化應激反應有關的因子的表達的方法，該方法包括穩定HIFα。本發明還提出了一種治療患者與缺血再灌注損傷有關的疾病，該方法包括穩定HIFα。
這裡還提供了鑑別能穩定HIFα的化合物的方法。例如，本發明提供了一種這樣一種鑑別能穩定HIFα的化合物的方法，它包括(a)為患者或來自患者的樣本提供目標化合物；(b)測定患者或樣本中的HIFα含量；(c)比較患者或樣本中的HIFα含量和標準含量，如果患者或樣本中HIFα含量增加，表明該化合物能穩定HIFα。
另一方面，可用本發明方法預防由HIF相關疾病引起的組織損傷，包括(但不限於)缺血和低氧疾病。在一種實施方式中，治療取決於預先診斷的病情，例如高血壓、糖尿病、閉合動脈疾病、慢性靜脈功能不足、肢端動脈痙攣症、硬化、充血性心力衰竭、系統性硬化症等。
另一方面，本發明方法可作為預治療方法，用來降低或預防由HIF疾病引起的組織損傷，包括(但不限於)缺血和低氧疾病。在一種實施方式中，是否需要預治療取決於患者病史中缺血疾病，如心肌梗塞或暫時性缺血的復發周期，或者患者有持續缺血的症狀，例如心肌絞痛等。在另一個實施方式中，是否需要預治療取決於表示可能缺血或低氧的物理參數，例如個體經過普通麻醉或臨時在高緯度工作的情況中。在又一個實施方式中，本發明方法可用在器官移植中，用來對器官捐獻者進行預處理，並在器官從體內移出但移植到接受者之前保護器官。
另一方面，本發明提供了穩定HIFα的化合物和用所述化合物預防、預治療或質量如上所述HIF疾病。在一種實施方式中，有效量的化合物或其藥用鹽可單獨或與藥用賦形劑一道施與患有HIF疾病的治療對象。在一個具體實施方式
中，一旦診斷出嚴重缺血，就應立即施用所述化合物。在另一個具體實施方式
中，化合物在患慢性缺血疾病的過程中施與患者。在又一個具體實施方式
中，缺血是由暫時或嚴重外傷、損傷或創傷引起的，例如脊髓受傷。在一個具體實施方式
中，在病人診斷出肺部疾病如COPD等之後，根據需要將所述化合物施與患者。
所述化合物一方面可針對易患疾病如慢性病施與患者，或者作為預治療藥物用來降低或預防HIF疾病引起的組織損傷。具體說來，所述化合物可施與有缺血疾病，例如心肌梗塞或暫時性缺血的復發病史的患者，或者患有持續缺血的症狀，例如心肌絞痛等的患者。在另一個具體實施方式
中，所述化合物的施用取決於表示可能缺血或低氧的物理參數，例如個體經過普通麻醉或臨時在高緯度工作的情況中。在又一個實施方式中，所述化合物可用在器官移植中，用來對器官捐獻者進行預處理，並在器官從體內移出但移植到接受者之前保護器官。
一方面，本發明化合物通過具體抑制HIFα蛋白中胺基酸殘基發生羥基化反應來穩定HIFα。在一種實施方式中，所述試劑抑制HIFα脯氨酸殘基的羥基化反應。在一個具體實施方式
中，所述試劑抑制HIF-1αP564殘基或另一個HIFα異構體中的同族脯氨酸的羥基化反應。在另一個具體實施方式
中，所述試劑抑制HIF-1αP402殘基或另一個HIFα異構體中的同族脯氨酸的羥基化反應。在又一個實施方式中，所述化合物可額外抑制HIFα天冬醯胺殘基的羥基化反應。在一個具體實施方式
中，所述試劑抑制HIF-1αN803殘基或另一個HIFα異構體中的同族天冬醯胺殘基的羥基化反應。
在特定實施方式中，本發明方法所用化合物選自式(I)所示化合物 其中，A是1，2-亞芳基、1，3-亞芳基、1，4-亞芳基；或(C1-C4)-亞烴基(任選為一個或多個滷原子、氰基、硝基、三氟甲基取代)、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-羥烷基、(C1-C6)-烷氧基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-滷素g、(C1-C6)-氟代烷氧基、(C1-C8)-氟代亞烴氧基、(C1-C8)-氟代亞烯氧基、-OCF2Cl，-O-CF2-CHFCl；(C1-C6)-烷基巰基、(C1-C6)-烷基亞硫醯基、(C1-C6)-烷基硫醯基、(C1-C6)-烷基羰基、(C1-C6)-烷氧基羰基、氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C6)-烷基羰氧基、(C3-C8)-環烷基、苯基、苄基、苯氧基、苯氧基、苯胺基、N-甲基苯胺基、苯基巰基、苯基硫醯基、苯基亞硫醯基、氨磺醯基、N-(C1-C4)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨磺醯基取代；或者為(C6-C12)-芳氧基、(C7-C11)-芳烷氧基、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基(在芳基部分中具有1-5個相同或不同取代基，所述取代基選自滷素、氰基、硝基、三氟甲基)、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-滷素g、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C6)-烷基巰基、(C1-C6)-烷基亞硫醯基、(C1-C6)-烷基硫醯基、(C1-C6)-烷基羰基、氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C6)-烷基羰基氧基、(C3-C8)-環烷基、氨磺醯基、N-(C1-C4)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨磺醯基取代；或者A為CR5R6，R5和R6各自獨立選自氫、(C1-C6)-烷基、(C3-C7)-環烷基、芳基，或者α胺基酸的α碳原子的取代基，其中胺基酸是天然L胺基酸或其D型異構體。
B是-COH2、-NH2、-NHSO2CF3、四唑基、咪唑基、3-羥異唑基、-CONHCOR，-CONHSOR，其中R是芳基、雜芳基、(C3-C7)-環烷基、(C1-C4)-烷基、任選的被(C1-C4)-硫代烷基、(C1-C4)-亞硫醯基、(C1-C4)-硫醯基、CF3、Cl、Br、F、I、NO2、-COOH、(C2-C5)-烷氧基羰基、NH2、單-(C1-C4-烷基)-氨基、二-(C1-C4-烷基)-氨基或(C1-C4)-全氟代烷基取代；或者B是CO2-G羧基，其中G是醇G-OH中的基團，G選自(C1-C20)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C2-C20)-烯基、(C3-C8)-環烯基、視黃基、(C2-C20)-炔基、(C4-C20)-鏈多烯基(alkenynyl)，其中烯基、環烯基、炔基和鏈多烯基包含一個或多個多鍵；(C6-C16)-碳環芳基、(C7-C16)-芳烷基、雜芳基或雜芳烷基，其中雜芳烷基中的雜芳基或雜芳部分包含5-6個環原子；G所定義的基團可為一個或多個其他基團取代，這些基團包括羥基、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C5-C8)-環鏈烯基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C2-C12)-烯基、(C2-C12)-炔基、(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C1-C8)-羥烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、肉桂醯、(C2-C12)-烯基羰基、(C2-C12)-炔基羰基、(C1-C12)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰基、(C2-C12)-烯氧基羰基、(C2-C12)-炔氧基羰基、醯氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基、(C7-C12)-芳基硫醯基、氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、(C3-C8)-環烷基氨磺醯基、N-(C6-C12)-烷基氨磺醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、N-((C1-C10)-烷基)-(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基或N-((C1-C10)-烷基)-(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基；其中芳基或含芳基基團中的芳基可為1-5個相同或不同的基團取代，它們包括羥基、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C1-C8)-羥烷基、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、(C1-C12)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、(C1-C12)-烷基羰氧基、(C3-C8)-環烷基羰氧基、(C6-C12)-芳基羰氧基、(C7-C16)-芳烷基羰氧基、肉桂醯氧基、(C2-C12)-烯基羰氧基、(C2-C12)-炔基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基或(C7-C12)-芳基硫醯基；X是O或S；Q是O、S、NR』或化學鍵；其中，如果Q是化學鍵，則R4是滷素、腈或三氟甲基；或者，如果Q是O、S、NR』，則R4是氫、(C1-C10)-烷基、(C2-C10)-烯基、(C2-C10)-炔基，其中烯基或炔基包含一個或多個C-C多鍵；具有化學式-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg的未取代氟烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C4)-烷基、芳基、雜芳基、(C7-C11)-芳烷基或具有式(Z)所示化學式的基團-[CH2]v-[O]w-[CH2]t-E (Z)其中，E是雜芳基、(C3-C8)-環烷基或具有式F所示化學式的苯基 v是0-6，w是0或1，t是0-3，且R7、R8、R9、R10和R11可以相同或不同，可以是氫、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C1-C6)-芳烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C6)-烷基巰基、(C1-C6)-羥基烷基、(C1-C6)-烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷基亞硫醯基、(C1-C6)-烷基硫醯基、(C1-C6)-烷基羰基、(C1-C8)-烷氧基羰基、氨基甲醯基、N-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基或(C7-C11)-芳基烷基氨基甲醯基，任選為以下基團所取代，即氟、氯、溴、三氟甲基、(C1-C6)-烷氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C6)-烷基羰氧基、苯基、苄基、苯氧基、苄氧基、NRYRZ，其中RY和RZ獨立選自氫、(C1-C12)-烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C3-C10)-環烷基、(C3-C12)-烯基、(C3-C12)-炔基、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基、(C1-C12)-烷氧基、(C7-C12)-芳氧基、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基；或者RY和RZ都是-[CH2]h，其中CH2可為O、S、N-(C1-C4)-烷基羰基亞氨基或N-(C1-C4)-烷氧基羰基亞氨基；苯基巰基、苯硫醯基、苯亞硫醯基、苯氨磺醯基、N-(C1-C8)-烷基氨磺醯基或N，N-二-(C1-C8)-烷基氨磺醯基；或者R7和R8、R8和R9、R9和R10或R10和R11均是選自-[CH2]n或-CH＝CH-CH＝CH-的鏈，其中CH2任選為O、S、SO、SO2或NRY取代；n是3、4或5；如果E是雜芳基，則所述基團可含1-3個為R7-R11所定義的取代基，或者如果E是環烷基，則所述基團可含一個為R7-R11所定義的取代基；或者當Q是NR』時，R4是R」，其中R』和R」可以相同或不同，具體可以是氫、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基、(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C1-C10)-烷基羰基，任選取代的(C7-C16)-芳烷基羰基或任選取代的(C6-C12)-芳基羰基；或者R』和R」均為-[CH2]h，其中CH2為O、S、N-醯亞氨基或N-(C1-C10)-烷氧基羰基亞氨基，h是3-7。
Y是N或CR3；R1、R2和R3可以相同或不同，具體為氫、羥基、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C20)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C12)-烷氧基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C8)-烷基-(C1-C6)-烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C7-C16)-芳烯基、(C7-C16)-芳炔基、(C2-C20)-烯基、(C2-C20)-炔基、(C1-C20)-烷氧基、(C2-C20)-烯氧基、(C2-C20)-炔氧基、視黃氧基、(C1-C20)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C1-C16)-羥烷基、(C6-C16)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C2-C20)-烯氧基-(C1-C6)-烷基、(C2-C20)-炔氧基-(C1-C6)-烷基、視黃氧基-(C1-C6)-烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C20)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、肉桂醯基、(C2-C20)-烯基羰基、(C2-C20)-炔基羰基、(C1-C20)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰基、(C2-C20)-烯氧基羰基、視黃氧基羰基、(C2-C20)-炔氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷基羰氧基、(C3-C8)-環烷基羰氧基、(C6-C12)-芳基羰氧基、(C7-C16)-芳烷基羰氧基、肉桂醯氧基、(C2-C12)-烯基羰氧基、(C2-C12)-炔基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N，N-二環-(C3-C8)-烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-((C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C6)-烷基-N-((C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷基)氨基甲醯基、N-(+)-脫氫樅基氨基甲醯基、N-(C1-C6)-烷基-N-(+)-脫氫樅基氨基甲醯基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基；CON(CH2)h，其中CH2可為O、S、N-(C1-C8)-烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基亞氨基、N-(C6-C12)-芳基亞氨基、N-(C7-C12)-芳烷基亞氨基、N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亞氨基取代，h是3-7；具有化學式R的氨基甲醯氧基
其中，Rx和Rv各自獨立地選自氫、(C1-C6)-烷基、(C3-C7)-環烷基、芳基或α胺基酸的α碳原子的取代基，其中胺基酸是天然L胺基酸或其D型異構體，s是1-5，T是OH或NR*R**，R*、R**和R***可以相同或不同，選自氫、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基、(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(+)-脫氫樅基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C1-C10)-烷醯基、任選取代(C7-C16)-芳烷醯基、任選取代(C6-C12)-芳醯基；或者R*和R**均為CH2，其中CH2可為O、S、SO、SO2、N-醯氨基、N-(C1-C10)-烷氧基羰基亞氨基、N-(C1-C8)-烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基亞氨基、N-(C6-C12)-芳基亞氨基、N-(C7-C16)-芳烷基亞氨基、N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亞氨基，h是3-7；氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基、(C7-C12)-芳基硫醯基、氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、(C3-C8)-環烷基氨磺醯基、N-(C6-C12)-烷基氨磺醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、N-((C1-C10)-烷基)-(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基或N-((C1-C10)-烷基)-(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基；其中芳基或含芳基基團中的芳基可為1-5個相同或不同的基團取代，它們包括羥基、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C1-C8)-羥烷基、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、(C1-C12)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、(C1-C12)-烷基羰氧基、(C3-C8)-環烷基羰氧基、(C6-C12)-芳基羰氧基、(C7-C16)-芳烷基羰氧基、肉桂醯氧基、(C2-C12)-烯基羰氧基、(C2-C12)-炔基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基或(C7-C16)-芳基硫醯基；或者R1與R2或R2與R3形成鏈[CH2]o，可以是飽和鏈，也可以是含C＝C雙鍵的不飽和鏈，其中1或2個CH2任選為O、S、SO、SO2或NR』取代，其中R』是氫、(C6-C12)-芳基、(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C1-C10)-烷醯基、任選取代(C7-C16)-芳烷醯基、任選取代(C6-C12)-芳醯基；o是3、4或5；或者R1與R2或R2與R3同包含它們的吡啶或噠嗪形成5，6，7，8-四氫異喹啉環、5，6，7，8-四氫喹啉環或5，6，7，8-四氫肉啉環；或者R1與R2或R2與R3形成5元或6元芳碳環或芳雜環；或者R1與R2或R2與R3同包含它們的吡啶或噠嗪形成任選取代的雜環體系，所述體系可選自噻吩並吡啶、呋喃並吡啶、吡啶並吡啶、嘧啶並吡啶、咪唑並吡啶、噻唑並吡啶、噁唑並吡啶、喹啉、異喹啉和肉啉；其中，喹啉、異喹啉和肉啉宜滿足式Ia、Ib和Ic
其中R12-R23各自獨立，定義同R1、R2和R3；或者基團R1與R2同包含它們的吡啶形成式Id所示化合物 其中V是S、O或NRk，其中Rk選自氫、(C1-C6)-烷基、芳基或苄基；其中芳基可如上所述為1-5個取代基取代；且R24、R25、R26和R27各自獨立，定義同R1、R2和R3；f是1-8；g是0或1到(2f+1)；x是0-3；h是3-7；包括上述化合物的生理活性鹽和前體藥物。
在某些實施方式中，以上式(I)所示化合物包括(但不限於)[(3-甲氧基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸；鹽酸3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((十六烷氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((1-辛氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((己氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((丁氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；外消旋酒石酸3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((2-壬氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((庚氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-苯氧基吡啶-2-羧酸N-(((辛氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-苯甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((丁氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；5-(((3-(1-丁氧基)-丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-((苯甲氧基羰基)-甲基)-醯胺；5-(((3-(1-丁氧基)-丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((1-丁氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；5-(((3-十二烷氧基丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-((苯甲氧基羰基)-甲基)-醯胺；[(3-羥基-吡啶-2-羰基)-氨基]乙酸；[(3-甲氧基-吡啶-2-羰基)-氨基)]乙酸。在另一些實施方式中，以上式(Ia)所示化合物包括(但不限於)N-((3-羥基-6-異丙氧基-喹啉-2-羰基)-氨基)乙酸、N-((6-(1-丁氧基)-3-羥基喹啉-2-基)-羰基)氨基乙酸、[(3-羥基-6-三氟甲氧基-喹啉-2-羰基)氨基]乙酸、N-((6-氯-3-羥基喹啉-2-基)-羰基)氨基乙酸、N-((7-氯-3-羥基喹啉-2-基)-羰基)氨基乙酸和[(6-氯-3-羥基-喹啉-2-羰基)氨基]乙酸。在其他一些實施方式中，以上式(Ib)所示化合物包括(但不限於)N-((1-氯-4-羥基-7-(2-丙氧基)異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((1-氯-4-羥基-6-(2-丙氧基)異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((1-氯-4-羥基-異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸、N-((1-氯-4-羥基-7-甲氧基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((1-氯-4-羥基-6-甲氧基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((7-丁氧基)-1-氯-4-羥基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((6-苯甲氧基-1-氯-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸、((7-苯甲氧基-1-氯-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸甲酯、N-((7-苯甲氧基-1-氯-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸、N-((8-氯-4-羥基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((7-丁氧基-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸。
在其他實施方式中，用於本發明方法的化合物選自具有化學式(II)的化合物 其中，R28是氫、硝基、氨基、氰基、滷素、(C1-C4)-烷基、羧基或它們的易代謝酯衍生物；(C1-C4)-烷基氨基、二-(C1-C4)-烷基氨基、(C1-C6)-烷氧基羰基、(C2-C4)-烷醯基、羥基-(C1-C4)-烷基、氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C4)-烷硫基、(C1-C4)-烷基亞硫醯基、(C1-C4)-烷基硫醯基、苯硫基、苯基亞硫醯基、苯基硫醯基，所述苯基可任選為1-4個相同或不同滷素取代、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、氰基、羥基、三氟甲基、氟代-(C1-C4)-烷硫基、氟代-(C1-C4)-烷基亞硫醯基、氟代-(C1-C4)-烷基硫醯基、(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基羰基、N，N-二-[(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基-(C1-C4)-烷氧基羰基、(C1-C4)-烷基氨基-(C2-C4)-烷氧基羰基、二-(C1-C4)-烷基氨基-(C2-C4)-烷氧基羰基、(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基羰基、(C2-C4)-烷醯氧基-(C1-C4)-烷基或N-[氨基-(C2-C8)-烷基]-氨基甲醯基；R29是氫、羥基、氨基、氰基、滷素、(C1-C4)-烷基、羧基或它們的易代謝酯衍生物；(C1-C4)-烷基氨基、二-(C1-C4)-烷基氨基、(C1-C6)-烷氧基羰基、(C2-C4)-烷醯基、(C1-C4)-烷氧基、羧基-(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷氧基羰基-(C2-C4)-烷氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基、N-[氨基-(C2-C8)-烷基]氨基甲醯基、N-[(C1-C4)-烷基氨基-(C1-C8)-烷基]氨基甲醯基、N-[二-(C1-C4)-烷基氨基-(C1-C8)-烷基]氨基甲醯基、N-環己基氨基甲醯基、N-環戊基氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基環己基氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基環戊基氨基甲醯基、N-苯基氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基-N-苯基氨基甲醯基、N，N-二苯基氨基甲醯基、N-[苯基-(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基-N-[苯基-(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基、或N，N-二[苯基-(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基，所述苯基可任選為1-4個相同或不同滷素取代、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、氰基、羥基、三氟甲基、N-[(C2-C4)-烷醯基]氨基甲醯基、N-[(C1-C4)-烷氧基羰基]氨基甲醯基、N-[氟-(C2-C6)-烷基]氨基甲醯基、N，N-[氟-(C2-C6)-烷基]-N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、N，N-[二氟-(C2-C6)-烷基]氨基甲醯基、1-吡咯基-羰基、哌啶基羰基、1-哌嗪基-羰基、嗎啉基羰基，其中雜環基團任選為1-4個以下基團取代(C1-C4)-烷基、苄基、1，2，3，4-四氫異喹啉-2-基-羰基、N，N-[二-(C1-C4)-烷基]硫代氨基甲醯基、N-(C2-C4)-烷醯基氨基或N-[(C1-C4)-烷氧基羰基]氨基；R30是氫、(C1-C4)-烷基、(C2-C4)-烷氧基、滷素、硝基、羥基、氟-(1-4C)烷基或吡啶基；R31是氫、(C1-C4)-烷基、(C2-C4)-烷氧基、滷素、硝基、羥基、氟-(C1-C4)烷基、吡啶基或甲氧基；R32是氫、羥基、氨基、(C1-C4)-烷基氨基、二(C1-C4)-烷基氨基、滷素、(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基、氟-(C1-C6)-烷氧基、吡咯-1-基、哌啶基、哌嗪-1-基或嗎啉基，其中雜環基任選為1-4個相同或不同的(C1-C4)-烷基或苯基取代；R33和R34各自單獨選自氫、(C1-C4)-烷基和(C1-C4)-烷氧基；還包括它們的藥用鹽和前體藥物。
在某些實施方式中，化學式(II)所示化合物包括(但不限於)4-氧-1，4-二氫-[1，10]菲咯啉-3-羧酸、3-羧基-5-羥基-4-氧-3，4-二氫-1，10-菲咯啉、3-羧基-5-甲氧基-4-氧-3，4-二氫-1，10-菲咯啉、5-甲氧基-4-氧-1，4-二氫[1，10]菲咯啉-3-羧酸乙酯、5-甲氧基-4-氧-1，4-二氫[1，10]菲咯啉-3-羧酸和3-羧基-8-羥基-4-氧-3，4-二氫-1，10-菲咯啉。
所述化合物可單獨施用，也可結合其他各種治療手段施用。在一種實施方式中，所述化合物與另一種2-酮戊二酸雙加氧酶抑制劑一起施用，對於單獨的2-酮戊二酸雙加氧酶族成員來說，這兩種化合物具有不同的特異性。這兩種化合物可以一定比例同時施用，也可在治療過程中依次施用，例如用於心肌梗塞。在一個具體實施方式
中，一種化合物專門抑制HIF脯氨醯羥化酶的活性，另一種化合物專門抑制膠原脯氨醯4-羥化酶的活性。在另一個實施方式中，所述化合物與另一個具有不同作用模式的醫療試劑一起使用，例如ACE抑制劑(ACEI)、血管緊縮素-II受體阻斷劑(ARB)、利尿劑和/或地高辛。在另一個實施方式中，所述化合物與肉鹼一起施用。
一方面，本發明化合物能抑制一種或多種2-酮戊二酸雙加氧酶。在一種實施方式中，所述化合物能抑制至少兩種2-酮戊二酸雙加氧酶族成員，例如HIF脯氨醯羥化酶和膠原脯氨醯4-羥化酶，它們的特異性可相同或不同。在另一個實施方式中，所述化合物可對一個2-酮戊二酸雙加氧酶具有特異性，例如HIF脯氨醯羥化酶，並對其他族成員顯示很小特異性或沒有特異性。
本發明的優選實施方式包含利用口腔送藥或透皮送藥機制的方法。因此，本發明還提供了一種包含本發明化合物的口服藥劑。在另一個優選實施方式中，本發明方法涉及通過透皮機制施用本發明化合物。因此，本發明還提供了包含本發明化合物的透皮用藥膏。
根據這裡的介紹，本領域技術人員很容易理解本發明的上述及其他實施方式所有這些實施方式都是專門設計的。
附圖簡介

圖1A和1B所示為用本發明化合物處理的細胞中HIF-1α的穩定化。圖1A所示為用本發明各種化合物處理的人包皮纖維原細胞(HFF)中HIF-1α的穩定和富集。圖1B所示為用本發明化合物處理的不同人細胞中HIF-1α穩定和富集的劑量應答應答。圖中所示細胞線包括HFF、人類微血管內皮細胞(HMEC)、靜脈內皮細胞(AG7)、人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)、鱗狀上皮癌細胞(SCC)、人肺纖維原細胞(HLF)、乳腺上皮癌細胞(MCF7)、變性胎兒腎細胞(293A)和子宮頸癌細胞(HeLa)。
圖2A和2B所示為用本發明化合物處理的人細胞中HIF-1α的穩定和富集。圖2A所示為用本發明各種化合物處理的293A和人類肝癌細胞(Hep3B)。圖2B所示為用本發明示例性化合物處理的Hep3B細胞中HIF-1α穩定化的劑量應答。
圖3A和3B所示為用本發明化合物處理的人體細胞中的耗氧量和細胞存活能力。圖3A所示為用本發明各種化合物處理的細胞中的單劑量和劑量應答耗氧量。圖3B所示為用圖3A中選定的化合物處理的細胞中的細胞增殖和存活能力，測定的是WST-1四唑鹽的分裂情況(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis IN)。
圖4A和4B所示為用本發明化合物處理的人體細胞在HIF-反應基因的表達上得到提高。圖4A所示為用本發明化合物處理之後，人體細胞培養介質中血管內皮細胞生長因子(VEGF)的水平，其中所述因子是血管形成過程中的關鍵基因。圖中所示細胞線為293A、Hep3B和HFF。圖4B所示為用本發明化合物處理過的細胞中醛縮酶隨時間增加的過程，其中醛縮酶是糖酵解通路中的關鍵酶。
圖5A和5B所示為用本發明化合物處理後，動物肺部血管生長蛋白的表達得到提高。圖5A所示為血管生長基因表達的綜合圖。圖中所示基因包括血管內皮細胞生長因子(VEGF)-C、Flt-1/VEGF受體-1、腎臟髓質素、內皮質素-1、血漿酶原激活因子抑制劑(PAI)-1和Cyr61。圖5B所示為從圖5A中選擇的內皮質素-1和腎臟髓質素在編碼過程中的基因表達。
圖6A和6B所示為體內HIF反應基因的表達得到提高。圖6A所示為用本發明化合物處理後，大鼠的肝和腎中的VEGF在編碼過程中的轉錄水平得到提高。圖6B所示為與未經處理的對照組相比，用本發明化合物做最終處理之後，大鼠血漿中的VEGF在2小時、5小時和20小時時的水平。
圖7A和7B所示為用本發明化合物處理之後，動物腎臟中糖酵解酶的表達得到提高。圖7A所示為糖酵解基因表達的綜合圖。圖中所示基因包括醛縮酶-A、烯醇酶-1、Glut1、Glut3、GAPDH、己糖激酶-1和-2、乳酸脫氫酶-A、磷酸果糖激酶-L和-C、磷酸甘油酸激酶-1和丙酮酸激酶-M。圖7B所示為從圖7A中選擇的醛縮酶-A和磷酸果糖激酶-L在編碼過程中的基因表達。
圖8所示為誘導心肌梗塞樣本中，用本發明化合物處理的組(n＝34)和未經處理的對照組(n＝34)在不同時間間隔時的存活百分數。
圖9A和9B所示為患心肌梗塞的動物用本發明化合物治療之後，相對於未經處理的對照組，在心臟結構上的改善。圖9A所示為患心肌梗塞的樣本中用本發明化合物處理的組相對於未經處理的對照組，在不同間隔時期左心室收縮末期的直徑(LVESD)的變化。圖9B所示為患心肌梗塞的樣本中用本發明化合物處理的組相對於未經處理的對照組，在不同間隔時期左心室舒張末期的直徑(LVEDD)的變化。
圖10A和10B所示為患心肌梗塞的動物用本發明化合物治療之後，相對於未經處理的對照組，其心臟功能得到改善。圖10A所示為相對於未經治療的對照組，用本發明化合物治療過的誘導心肌梗塞樣本組在不同間隔時期在左心室噴血分數上的變化。圖10B所示為相對於未經治療的對照組，用本發明化合物治療過的心肌梗塞樣本組在不同間隔時期噴血分數減少的情況。
圖11所示為相對於未經處理的對照組，用本發明化合物處理的樣本組4周之後心臟的收縮反應，所述樣本包括受異丙腎上腺素激發和不受其激發的樣本。
圖12A和12B所示為患心肌梗塞的動物用本發明化合物預治療之後，相對於未經處理的對照組，在心臟結構上得到改善。圖12A所示為誘導產生心肌梗塞1周後，經過處理的動物與未經處理的對照動物相比，噴血分數縮短在統計上明顯改善(p＜0.05)。圖12B所示為誘導產生心肌梗塞1周後，經過處理的動物與未經處理的對照動物相比，左心室舒張末期的直徑(LVEDD；p＜0.05)和左心室收縮末期的直徑(LVESD；p＜0.01)在統計上明顯改善。
圖13所示為先對動物進行預治療，然後使之受到腎臟缺血再灌注損傷，隨後用本發明化合物處理，與未經處理和進行假手術的樣本相比，動物的存活率提高。
圖14A和14B所示為先對動物進行預治療，然後使之受到腎臟缺血再灌注損傷，隨後用本發明化合物處理，與未經處理的對照樣本相比，其腎功能得到改善。圖14A所示為受到誘導缺血再灌注損傷3天和7天之後，進行治療的動物與未經治療的動物相比，低血尿中氮的含量。圖14B所示為受到誘導缺血再灌注損傷3天、7天和14天之後，進行治療的動物與未經治療的動物相比，低血膽固醇的含量。
圖15A和15B所示為與未經處理的對照組相比，用本發明處理過的動物在慢性創傷的治療效果上得到改善。圖15A所示為受傷7天和10天之後，經過處理的動物與未經處理的對照組相比，上皮細胞和肉芽組織的生長情況得到改善。圖15B所示為經過處理的動物與未經處理的動物傷疤中峰-峰距離沒有差別。
發明詳述在介紹本發明組合物和方法之前，應當理解本發明不受具體方法、原則、細胞線、化驗和試劑的限制，因為這些都是可以變化的。還應當理解，這裡所用術語也只是為了說明本發明的特定實施方式，決不是限制本發明附屬權利要求中所設定的範圍。
必須指出，說明書和附屬權利要求中所用單數形式「一」包括複數情況，除非文中另外明確指出。因此，舉例來說，「一個片段」包括許多個這樣的片段；「一種抗體」可以指一種或多種抗體，以及本領域技術人員所熟悉的等價抗體；依次類推。
除非另有說明，這裡所用所有技術和科學術語的含義與本領域通常理解的含義相同。儘管類似於或等價於這裡所描述的任何方法和材料都可用於本發明實踐或實驗中，下面仍給出優選方法、裝置和材料。這裡引用的所有文獻都以其整體形式作為參考，目的是介紹這些文獻中與本發明相關的方法、試劑和工具。這決不可誤解為我們承認本發明無權在先前的發明中作類似的介紹。
除非另有說明，本發明在實踐中將採用本技術領域中的常規化學、生物化學、分子生物學、細胞生物學、基因學、免疫學和藥學方法。例如，可參見Gennaro，A.R.編的《Remington藥物學》(Remington『s Pharmaceutical Sciences)(1990)，第18版，Mack出版公司；Hardam，J.G.，Limbird，L.E.和Gilman，A.G.編的《治療方法的藥理基礎》(The Pharmaceutical Basis of Therapeutics)(2001)，第10版，McGraw-Hill公司；Colowick，S.等編《免疫學方法》(Methods In Enzymology)，Academic出版公司；Weir，D.M.和Blackwell，C.C.編《實驗免疫學手冊》(Handbook ofExperimental Immunology)(1986)，Vol.I-IV，Blackwell Scientific出版社；Maniatis，T.等編《分子克隆實驗手冊》(Molecualr CloningA Laboratory Manual)(1989)，第2版，Vols.I-III，Cold Spring Harbor Laboratory出版社；Ausubel，F.M.等編《分子生物學簡明協議》(Short Protocols in Molecular Biology)(1999)，第4版，John WileySons；Ream等編《分子生物技術精編實驗室課程》(Molecualr Biology TechniquesAn Intensive Laboratory Course)(1998)，Academic出版社；Newton，C.R.和Graham，A.編《PCR》(生物技術入門系列)(Introduction to Biotechniques Series)(1997)，第2版，Springer Verlag。
定義術語「局部缺血」指血流量下降。局部缺血使供應給組織的營養物質下降，包括氧氣。在這樣一些情況下會引起局部缺血，如動脈硬化、動脈或靜脈中形成血栓、動脈或靜脈受栓塞物堵塞、其他原因引起的血管封閉，例如由血管痙攣等引起。這些情況會減少血流量，產生對器官或組織的低灌注狀態，或者完全堵塞血流。引起缺血的其他情況包括受傷導致的組織損傷，例如脊髓受傷；毒菌感染，例如，它會引起充血性心力衰竭等。術語「缺血性疾病」和「缺血性失調」包括嚴重缺血性疾病和慢性缺血性疾病，嚴重缺血性疾病包括(但不限於)心肌梗塞、缺血性中風、肺栓塞、圍產低氧、循環系統休克(例如包括失血、敗血、心原缺血等)、高山病、嚴重呼吸衰竭等，慢性缺血性疾病包括動脈硬化、慢性靜脈功能不足、慢性心力衰竭、心臟硬化、糖尿病、斑狀惡化、睡眠呼吸暫停、肢端動脈痙攣症、系統硬化、非細菌性成栓心內膜炎、動脈閉合疾病、心絞痛、TIAs、慢性酒精肝疾病等。當個體置於普通麻醉狀態下時，也會引起缺血性疾病，並引起準備移植的組織損壞。
術語「低氧」和「低氧的」指環境含氧量低於常規水平。在低氧環境中培養細胞可使細胞低氧，或者用模擬低氧的化合物處理細胞。在細胞培養中用來確定低氧狀態的氧含量可用本領域中的技術測定。
術語「低氧性疾病」和「低氧性失調」包括(但不限於)上述缺血性疾病(缺血性低氧)，這裡低氧是由循環量減少引起的；肺部疾病(低氧性低氧)，如COPD、嚴重肺炎、肺水腫、肺部高血壓、透明膜疾病等，這裡低氧是由肺中的氧交換量減少引起的；貧血疾病(貧血性低氧)，如胃潰瘍或十二指腸潰瘍、肝病或腎病、血小板減少或凝血病、癌症或其他慢性疾病，癌症化療和其他治療幹預產生的貧血等，這裡低氧是由血色素或紅細胞濃度下降引起的；高原疾病等。
術語「失調」和「疾病」用來泛指任何偏離常規狀態的疾病。術語「缺血性疾病」和「缺血性失調」指任何與缺血有關的疾病或不適。術語「低氧性疾病」和「低氧性失調」指任何與低氧有關的疾病或不適。這種缺血和低氧疾病包括(但不限於)上述疾病。
術語「HIFα」指低氧誘導因子蛋白的α亞基。HIFα可以是任何人或哺乳動物蛋白或蛋白片段，包括(但不限於)人HIF-1α(基因庫續編號No.Q16665)、HIF-2α(基因庫續編號No.AAB41495)和HIF-3α(基因庫續編號No.AAD22668)；鼠科HIF-1α(基因庫續編號No.Q61221)、HIF-2α(基因庫續編號No.BAA20130和AAB41496)和HIF-3α(基因庫續編號No.AAC72734)；大鼠HIF-1α(基因庫續編號No.CAA70701)、HIF-2α(基因庫續編號No.CAB96612)和HIF-3α(基因庫續編號No.CAB96611)；牛HIF-1α(基因庫續編號No.BAA78675)。HIFα也可以是任何非哺乳動物蛋白或蛋白片段，包括Xenopus laevis HIF-1α(基因庫續編號No.CAB96628)、Drosophila melanogaster HIF-1α(基因庫續編號No.JC4851)和雞HIF-1α(基因庫續編號No.BAA34234)。HIFα基因序列也可通過常規克隆技術獲得，例如用上述全部或部分HIFα基因序列作為探針，測定另一片段中的HIFα序列。
HIFα片段包括人類HIF-1α所規定的區域，包括胺基酸401-603(Huang等，同上)、胺基酸531-575(Jiang等(1997)J Biol Chem 27219253-19260)、胺基酸556-575(Tanimoto等，同上)、胺基酸557-57 1(Srinivas等(1999)Biochem Biophys ResCommun 260557-561)和胺基酸556-575(Ivan和Kaelin(2001)Science 292464-468)。另外，HIFα的片段包含至少出現一次的基序LXXLAP，例如出現在HIF-1α主序列中的L397TLAP和L559EMLAP。此外，HIFα的片段包含任何保留了HIFα的至少一個功能或結構特徵的片段。例如，用於實施例7中篩選化驗的HIF多肽可包含[甲氧基香豆素]-DLDLEALAPYIPADDDFQL-醯胺(SE1 ID NO5)。
術語「HIF脯氨醯羥化酶」和「HIF PH」指任何能使HIF蛋白中的脯氨酸殘基發生羥基化的酶。由HIF PH羥化的脯氨酸殘基包含基序LXXLAP中的脯氨酸，例如出現在HIF-1α主序列中的L397TLAP和L559EMLAP。HIF PH包含Egl-Nine(EGLN)基因族中的成員，如Taylor(2001，Gene 275125-132)所述，Aravind和Koonin(2001，Genome Biol 2RESEARCH0007)、Epstein等(2001，Cell 10743-54)、Bruick和McKnight(2001，Science 2941337-1340)對其進行了表徵。HIF PH酶的例子有人SM-20(EGLN1)(基因庫續編號No.AAG33965；Dupuy等(2000)Genomics 69348-54)、EGLN2異構體1(基因庫續編號No.AAG33965；Taylor，同上)、EGLN2異構體2(基因庫續編號No.NP_060025)和EGLN3(基因庫續編號No.CAC42511；Taylor，同上)；小鼠EGLN1(基因庫續編號No.CAC42515)、EGLN2(基因庫續編號No.CAA42511)和EGLN3(SM-20)(基因庫續編號No.CAC42517)；大鼠SM-20(基因庫續編號No.AAA19321)。此外，HIF PH可包含Caenorhabditis elegans EGL-3(基因庫續編號No.AAD56365)和Drosophilamelanogaster CG1114基因產品(基因庫續編號No.AAF52050)。HIF PH也包含至少保留了前述全長蛋白的一個結構或功能特徵的任何片段，包括具有羥化酶活性的片段。
這裡所用術語「胺基酸序列」或「多肽」指HIFα及其片段，或者HIF PH及其片段，包括低肽、肽或蛋白質序列，或者指它們的片段和天然或合成分子。「片段」可指一個序列中的任何部分，它至少包含了蛋白質的一個結構或功能特徵。免役原片段或抗原片段是多肽片段，宜為長約5-15個胺基酸、保留了至少一種生物或免役活性的片段。用「胺基酸序列」指稱天然蛋白分子的多肽序列時，「胺基酸序列」和類似術語並非將胺基酸序列限定在與所述蛋白分子相關的完全天然序列上。
這裡所用術語「相關蛋白質」指與HIFα脯氨醯羥化酶有關的蛋白質，它包含其他2-酮戊二酸雙加氧酶，特別是那些類似需要Fe2+、2-酮戊二酸和氧來維持羥化酶活性的族成員。這種酶包括(但不限於)膠原賴氨醯羥化酶、膠原脯氨醯4-羥化酶和因子抑制HIF(FIH)，後者是負責調節HIFα交叉激活的天冬醯胺羥化酶。(基因庫續編號No.AAL27308；Mahon等(2001)Genes Dev 152675-2686；Lando等(2002)Science 295858-861；Lando等(2002)Genes Dev 161466-1471。另見Elkins等(2002)J Biol Chem C200644200。)術語「促效藥」指增加或延長特定分子如酶或蛋白，或者特定環境如低氧環境的持續效果的分子。促效藥包括蛋白質、核酸、碳水化合物或其他能調節靶分子的效果的任何分子。
術語「拮抗劑」指降低特定分子的生物或免役活性的效果或持續時間的分子。拮抗劑包括蛋白質、核酸、碳水化合物、抗體或其他任何能降低靶分子效果的分子。
術語「微陣列」指核酸、胺基酸、抗體等在基底上的任何排列方式。基底可以是任何合適的載體，例如珠子、玻璃、紙、硝基纖維、尼龍或任何合適的膜等。基底可以是任何剛性或半剛性載體，包括(但不限於)膜、過濾器、晶片、晶片、載玻片、纖維、珠子(包括磁性或非磁性)珠子、凝膠、管材、板材、聚合物、微粒、毛細管等。所述基底可提供表面進行塗敷操作，且/或具有各種表面形式，如井、針、溝、槽和孔，核酸、胺基酸等可以附著在它們上面。
這裡所用術語「賦形劑」指在藥品或其他片劑的生產中所用的惰性或非活性物質，包括(但不限於)用作粘合劑、崩解劑、塗料、壓縮/囊封助劑、霜劑或洗劑、潤滑劑、注射劑、甜味劑或調味劑、懸浮/凝膠劑、溼法造粒劑的任何物質。粘合劑包括卡波普(carbopol)、聚維酮、黃原膠等；塗料包括纖維素乙酸酯對二苯甲酸酯、乙基纖維素、胞外多糖膠、麥芽糖糊精等；壓縮/囊封助劑包括碳酸鈣、右旋糖、果糖dc、蜂蜜dc、乳糖(無水或一水；任選與阿巴斯甜、纖維素或微晶纖維素組合)、澱粉dc、蔗糖等；崩解劑包括交聯羧甲纖維素鈉、胞外多糖膠、澱粉羥乙酸鈉等；霜劑和洗劑包括麥芽糖糊精、卡拉膠等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、硬脂基富馬酸鈉；用於咀嚼藥片的材料包括右旋糖、果糖dc、乳糖(一水合物，任選與阿巴斯甜或纖維素混合)等；注射劑包括甘露醇、聚維酮等；增塑劑包括癸二酸二丁酯、聚乙烯乙酸鄰二苯甲酸酯等；懸浮/凝膠劑包括卡拉膠、澱粉羥乙酸鈉、黃原膠等；甜味劑包括阿巴斯甜、右旋糖、果糖dc、山梨醇、蔗糖dc等；溼法造粒劑包括碳酸鈣、麥芽糖糊精、微晶纖維素等。
術語「樣本」在這裡使用其廣泛含義。樣本可取自任何來源，例如體液、分泌物、組織、細胞或培養液中的細胞，所述培養液包括(但不限於)唾液、血液、尿液、血清、血漿、玻璃液、滑液、腦髓液、羊水和器官組織(例如活檢組織)；基因組DNA、cDNA、RNA、mRNA等；摘除的細胞或組織，或者這種細胞或組織上的斑點或印記。樣本也可取自這樣一些來源，例如人或人以外的哺乳動物等。樣本也可以是任何疾病的動物模型。樣本可放在溶液中，也可固定或附著在基底上。樣本可指任何材料，只要它適合用來測定HIFα或HIFα片段的存在，或者適合用來篩選黏附在HIFα或HIFα片段上的分子。獲取這種樣本的方法是本領域的技術水平所具備的。
術語「處理對象」在這裡使用其廣泛含義。處理對象可包括分離細胞(原核細胞或真核細胞)或培養液中生長的組織。處理對象宜包括動物，特別是哺乳動物，包括鼠、兔、牛、綿羊、豬、鼠類、馬和靈長類動物，尤其是人。
發明本發明提供了穩定HIFα的方法、用在所述方法中的化合物以及這些方法在預防或治療HIF疾病中的應用，包括(但不限於)上述低氧和/或缺血性疾病。本發明還涉及這樣的發現，即對低氧誘導因子(HIFα)α亞基的穩定是一個有效的治療途徑，當用來治療或預防低氧性和/或缺血性疾病，例如心肌梗塞、中風、閉合動脈疾病、心絞痛、心臟硬化、動脈硬化等時，可獲得意外的好處。
本發明提出了穩定HIF的方法，用以促進血管生長、加強對嚴重低氧的反應和促進對慢性低氧的適應。由於組織缺血是發病和死亡的主要誘因，所以尋找能穩定HIFα的方法將有益於低氧性疾病的治療。此外，使用所述方法對於預調理低氧反應等具有良好效果，它是在發生局部缺血或低氧事件之前在常氧環境中穩定HIFα。所述方法還可用來誘導產生HIFα專有的效果，如下所述，包括治療性血管生長，用以恢復受損組織的血流；神經保護，用以防止神經退化疾病引起的神經元萎縮等；對反應活性物種產生的氧化損傷的保護，所述氧化物種源自缺血或低氧事件中的再灌注。
當用本發明方法治療缺血性和/或低氧性疾病時，所述疾病可以是急性缺血疾病，如肺梗塞、腸梗塞、腦梗塞和/或心肌梗塞，也可以是慢性缺血疾病，如動脈封閉疾病、肝硬化、充血性心力衰竭等。此外，本發明方法可用於治療由於短期或急性受傷引起的缺血，例如脊髓受傷，或者用於治療患有肺部疾病等的病人，如肺栓塞等。
當用本發明方法預防由HIF疾病，包括(但不限於)缺血性和低氧性疾病引起的組織損傷時，治療取決於預診斷的疾病，例如高血壓、糖尿病、動脈閉合疾病、慢性靜脈功能不足、肢端動脈痙攣症、系統硬化、硬化症、充血性心力衰竭等。類似地，本發明方法可用於預治療，以緩解或預防HIF疾病引起的組織損傷，包括(但不限於)缺血性和低氧性疾病。是否需要預治療取決於缺血性疾病的復發史，例如心肌梗塞或臨時性缺血；取決於持續缺血的症狀，例如心絞痛；或者取決於指示可能缺血或低氧的物理參數，如在個體受到普通麻醉或在高緯度地區短期工作的情況下。所述方法還可用於器官移植，對器官捐獻者進行預治療，並在從體內取出後但移植給受捐者之前維護器官。
這裡介紹的發現是，對HIFα的穩定受脯氨酸羥基化的調節，穩定HIFα能有效治療或預防缺血性疾病，防止其續存或發展，所述缺血性疾病如DVT、心絞痛、肺栓塞、中風、心肌梗塞等。特別地，研究表明，與兔子網狀細胞溶解液(RRL)一起預培養且與殘基556-575[HIF(556-575)]對應的HIF-1α和HIF-1α肽可專門結合到von Hippel Lindau蛋白質(pVHL)上，這種結合可引起HIF-1α的泛素化和降解。研究還表明，HIF(556-575)中高度保留的共線性序列M56LAPYIPM在常壓條件下突變成8個連續丙氨酸後能穩定HIF(556-575)。(Srinivas等，同上)對該區域丙氨酸的掃描顯示，全長HIF-1α中或穀胱甘肽S-轉移酶(GST)-HIF-1α氧降解區(ODD)融合蛋白(Gal4-ODD)中P564突變為丙氨酸消除了pVHL結合活性。電噴離子捕獲串列質譜法(MS/MS)和Gal4-HIF(555-575)的薄層色譜法確定P564的變性過程為羥基化過程，其中Gal4-HIF(555-575)是在[H3]脯氨酸存在下用RRL在體內翻譯的。脯氨酸羥基化在功能上的重要性在於，P564羥基化HIFα結合到pVHL上，而包含P564單點突變為丙氨酸的HIF-1α突變因子在COS7細胞中是穩定的，對低氧的仿去鐵敏不敏感。(見Ivan和Kaelin，同上；Jaakkola等(2001)Science292468-472)由於HIFα受到脯氨酸羥基化(一種需要氧氣和Fe2+的反應)的修飾，本發明一方面提出。HIFα羥基化中的酶是2-酮戊二酸雙加氧酶族中的成員。這種酶包括(但不限於)膠原賴氨醯羥化酶、膠原脯氨醯3-羥化酶、膠原脯氨醯4-羥化酶α(I)和α(II)、胸腺嘧啶7-羥化酶、天冬氨酸(天冬醯胺)β羥化酶、ε-N-三甲基賴氨醯羥化酶和γ-丁內銨鹽羥化酶等。這些酶需要氧、Fe2+、2-酮戊二酸和維生素C酸來獲得羥化酶活性。(參見，例如Majamaa等(1985)Biochem J 229127-133；Myllyharju和Kivirikko(1997)EMBO J 161173-1180；Thornburg等(1993)3214023-14033；Jia等(1994)Proc Natl Acad Sci USA 917227-7231)脯氨醯4-羥化酶的若干小分子抑制劑已經得到鑑定。(參見，例如Majamaa等，同上；Kivirikko和Myllyharju(1998)Matrix Biol 16357-368；Bickel等(1998)Hepatology 28404-411；Friedman等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 974736-4741；Franklin等(2001)Biochem J 353333-338；所有文獻在此完整引用)本發明提出在這裡所提供的方法中使用這些化合物。
可用於本發明方法的化合物包括2-酮戊二酸的結構類似物。這些化合物可抑制2-酮戊二酸雙加氧酶族中的目標成員，相對於2-酮戊二酸具有競爭優勢，而相對於鐵則沒有競爭優勢。(Maiamaa等(1984)Eur J Biochem 138239-245；Majamaa等，同上)在某些實施方式中，本發明方法所用化合物選自化學式(I)所示化合物 其中A是1，2-亞芳基、1，3-亞芳基、1，4-亞芳基；或(C1-C4)-亞烴基(任選為一個或多個滷原子、氰基、硝基、三氟甲基取代)、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-羥烷基、(C1-C6)-烷氧基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)滷素g、(C1-C6)-氟代烷氧基、(C1-C8)-氟代亞烴氧基、(C1-C8)-氟代亞烯氧基、-OCF2Cl，-O-CF2-CHFCl；(C1-C6)-烷基巰基、(C1-C6)-烷基亞硫醯基、(C1-C6)-烷基硫醯基、(C1-C6)-烷基羰基、(C1-C6)-烷氧基羰基、氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C6)-烷基羰基氧基、(C3-C8)-環烷基、苯基、苄基、苯氧基、苯甲氧基、苯胺基、N-甲基苯胺基、苯基巰基、苯基硫醯基、苯基亞硫醯基、氨磺醯基、N-(C1-C4)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨磺醯基取代；或者為(C6-C12)-芳氧基、(C7-C11)-芳烷氧基、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基(在芳基部分中具有1-5個相同或不同取代基，所述取代基選自滷素、氰基、硝基、三氟甲基)、(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)滷素g、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C6)-烷基巰基、(C1-C6)-烷基亞硫醯基、(C1-C6)-烷基硫醯基、(C1-C6)-烷基羰基、氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C6)-烷基羰基氧基、(C3-C8)-環烷基、氨磺醯基、N-(C1-C4)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C4)-烷基氨磺醯基取代；或者A為CR5R6，R5和R6各自獨立選自氫、(C1-C6)-烷基、(C3-C7)-環烷基、芳基，或者α胺基酸的α碳原子的取代基，其中胺基酸是天然L胺基酸或其D型異構體。
B是-COH2、-NH12、-NHSO2CF3、四唑基、咪唑基、3-羥異唑基、-CONHCOR，-CONHSOR，其中R是芳基、雜芳基、(C3-C7)-環烷基、(C1-C4)-烷基、任選的被(C1-C4)-硫代烷基、(C1-C4)-亞硫醯基、(C1-C4)-硫醯基、CF3、Cl、Br、F、I、NO2、-COOH、(C2-C5)-烷氧基羰基、NH2、單-(C1-C4-烷基)-氨基、二-(C1-C4-烷基)-氨基或(C1-C4)-全氟代烷基取代；或者B是CO2-G羧基，其中G是醇G-OH中的基團，G選自(C1-C20)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C2-C20)-烯基、(C3-C8)-環烯基、視黃基、(C2-C20)-炔基、(C4-C20)-鏈多烯基，其中烯基、環烯基、炔基和鏈多烯基包含一個或多個多鍵；(C6-C16)-碳環芳基、(C7-C16)-芳烷基、雜芳基或雜芳烷基，其中雜芳烷基中的雜芳基或雜芳部分包含5-6個環原子；G所定義的基團可為一個或多個其他基團取代，這些基團包括羥基、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C5-C8)-環鏈烯基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C2-C12)-烯基、(C2-C12)-炔基、(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C1-C8)-羥烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、肉桂醯、(C2-C12)-烯基羰基、(C2-C12)-炔基羰基、(C1-C12)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰基、(C2-C12)-烯氧基羰基、(C2-C12)-炔氧基羰基、醯氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基、(C7-C12)-芳基硫醯基、氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、(C3-C8)-環烷基氨磺醯基、N-(C6-C12)-烷基氨磺醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、N-((C1-C10)-烷基)-(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基或N-((C1-C10)-烷基)-(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基；其中芳基或含芳基基團中的芳基可為1-5個相同或不同的基團取代，它們包括羥基、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C1-C8)-羥烷基、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、(C1-C12)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、(C1-C12)-烷基羰氧基、(C3-C8)-環烷基羰氧基、(C6-C12)-芳基羰氧基、(C7-C16)-芳烷基羰氧基、肉桂醯氧基、(C2-C12)-烯基羰氧基、(C2-C12)-炔基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基或(C7-C12)-芳基硫醯基；X是O或S；Q是O、S、NR』或化學鍵；其中，如果Q是化學鍵，則R4是滷素、腈或三氟甲基；或者，如果Q是O、S、NR』，則R4是氫、(C1-C10)-烷基、(C2-C10)-烯基、(C2-C10)-炔基，其中烯基或炔基包含-個或多個C-C多鍵；具有化學式-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg的未取代氟烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C4)-烷基、芳基、雜芳基、(C7-C11)-芳烷基或具有式(Z)所示化學式的基團-[CH2]v-[O]w-[CH2]t-E (Z)其中，E是雜芳基、(C3-C8)-環烷基或具有式F所示化學式的苯基 v是0-6，w是0或1，t是0-3，且R7、R8、R9、R10和R11可以相同或不同，可以是氫、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C1-C6)-芳烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C6)-烷基巰基、(C1-C6)-羥基烷基、(C1-C6)-烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷基亞硫醯基、(C1-C6)-烷基硫醯基、(C1-C6)-烷基羰基、(C1-C8)-烷氧基羰基、氨基甲醯基、N-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基或(C7-C11)-芳基烷基氨基甲醯基，任選為以下基團所取代，即氟、氯、溴、三氟甲基、(C1-C6)-烷氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C6)-烷基羰氧基、苯基、苄基、苯氧基、苄氧基、NRYRZ，其中RY和RZ獨立選自氫、(C1-C12)-烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C3-C10)-環烷基、(C3-C12)-烯基、(C3-C12)-炔基、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基、(C1-C12)-烷氧基、(C7-C12)-芳氧基、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基；或者RY和RZ都是-[CH2]h，其中CH2可為O、S、N-(C1-C4)-烷基羰基亞氨基或N-(C1-C4)-烷氧基羰基亞氨基；苯基巰基、苯硫醯基、苯亞硫醯基、苯氨磺醯基、N-(C1-C8)-烷基氨磺醯基或N，N-二-(C1-C8)-烷基氨磺醯基；或者R7和R8、R8和R9、R9和R10或R10和R11均是選自-[CH2]n或-CH＝CH-CH＝CH-的鏈，其中CH2任選為O、S、SO、SO2或NRY取代；n是3、4或5；如果E是雜芳基，則所述基團可含1-3個為R7-R11所定義的取代基，或者如果E是環烷基，則所述基團可含一個為R7-R11所定義的取代基；或者當Q是NR』時，R4是R」，其中R』和R」可以相同或不同，具體可以是氫、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基、(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C1-C10)-烷基羰基，任選取代的(C7-C16)-芳烷基羰基或任選取代的(C6-C12)-芳基羰基；或者R』和R」均為-[CH2]h，其中CH2為O、S、N-醯亞氨基或N-(C1-C10)-烷氧基羰基亞氨基，h是3-7。
Y是N或CR3；R1、R2和R3可以相同或不同，具體為氫、羥基、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C1-C20)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C12)-烷氧基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C8)-烷基-(C1-C6)-烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C7-C16)-芳烯基、(C7-C16)-芳炔基、(C2-C20)-烯基、(C2-C20)-炔基、(C1-C20)-烷氧基、(C2-C20)-烯氧基、(C2-C20)-炔氧基、視黃氧基、(C1-C20)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C1-C16)-羥烷基、(C6-C16)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C2-C20)-烯氧基-(C1-C6)-烷基、(C2-C20)-炔氧基-(C1-C6)-烷基、視黃氧基-(C1-C6)-烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C20)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、肉桂醯基、(C2-C20)-烯基羰基、(C2-C20)-炔基羰基、(C1-C20)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰基、(C2-C20)-烯氧基羰基、視黃氧基羰基、(C2-C20)-炔氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷基羰氧基、(C3-C8)-環烷基羰氧基、(C6-C12)-芳基羰氧基、(C7-C16)-芳烷基羰氧基、肉桂醯氧基、(C2-C12)-烯基羰氧基、(C2-C12)-炔基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N，N-二環-(C3-C8)-烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-((C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C6)-烷基-N-((C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷基)氨基甲醯基、N-(+)-脫氫樅基氨基甲醯基、N-(C1-C6)-烷基-N-(+)-脫氫樅基氨基甲醯基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基；CON(CH2)h，其中CH2可為O、S、N-(C1-C8)-烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基亞氨基、N-(C6-C12)-芳基亞氨基、N-(C7-C12)-芳烷基亞氨基、N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亞氨基取代，h是3-7；具有化學式R的氨基甲醯氧基 其中，Rx和Rv各自獨立地選自氫、(C1-C6)-烷基、(C3-C7)-環烷基、芳基或α胺基酸的α碳原子的取代基，其中胺基酸是天然L胺基酸或其D型異構體，
s是1-5，T是OH或NR*R**，R*、R**和R***可以相同或不同，選自氫、(C6-C12)-芳基、(C7-C11)-芳烷基、(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(+)-脫氫樅基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C1-C10)-烷醯基、任選取代(C7-C16)-芳烷醯基、任選取代(C6-C12)-芳醯基；或者R*和R**均為CH2，其中CH2可為O、S、SO、SO2、N-醯氨基、N-(C1-C10)-烷氧基羰基亞氨基、N-(C1-C8)-烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基亞氨基、N-(C6-C12)-芳基亞氨基、N-(C7-C16)-芳烷基亞氨基、N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亞氨基，h是3-7；氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C7-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)--烷基羰基(alkanoyl)氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C20)-烷基巰基、(C1-C20)-烷基亞硫醯基、(C1-C20)-烷基硫醯基、(C6-C12)-芳基巰基、(C6-C12)-芳基亞硫醯基、(C6-C12)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳烷基亞硫醯基、(C7-C16)-芳烷基硫醯基、(C1-C12)-烷基巰基-(C1-C6)-烷基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基-(C1-C6)-烷基、(C1-C12)-烷基硫醯基-(C1-C6)-烷基、(C6-C12)-芳基巰基-(C1-C6)-烷基、(C6-C12)-芳基亞硫醯基-(C1-C6)-烷基、(C6-C12)-芳基硫醯基-(C1-C6)-烷基、(C7-C16)-芳烷基巰基-(C1-C6)-烷基、(C7-C16)-芳烷基亞硫醯基-(C1-C6)-烷基、(C7-C16)-芳烷基硫醯基-(C1-C6)-烷基、氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、N，N-二-(C1-C10)-烷基氨磺醯基、(C3-C8)-環烷基氨磺醯基、N-(C6-C12)-烷基氨磺醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨磺醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨磺醯基、(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、N-((C1-C10)-烷基)-(C1-C10)-烷基亞磺醯氨基、(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基或N-((C1-C10)-烷基)-(C7-C16)-芳烷基亞磺醯氨基；其中芳基或含芳基基團中的芳基可為1-5個相同或不同的基團取代，它們包括羥基、滷素、氰基、三氟甲基、硝基、羧基、(C2-C16)-烷基、(C3-C8)-環烷基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C12)-烷氧基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C8)-烷基-(C1-C6)-烷氧基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C6-C12)-芳基、(C7-C16)-芳烷基、(C2-C16)-烯基、(C2-C12)-炔基、(C1-C16)-烷氧基、(C1-C16)-烯氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基、(C7-C16)-芳烷氧基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基、(C1-C8)-羥烷基、(C6-C16)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷氧基-(C1-C6)-烷基、-O-[CH2]x-CfH(2f+1-g)-Fg、-OCF2Cl、-O-CF2-CHFCl、(C1-C12)-烷基羰基、(C3-C8)-環烷基羰基、(C6-C12)-芳基羰基、(C7-C16)-芳烷基羰基、(C1-C12)-烷氧基羰基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基羰基、(C2-C12)-烯氧基羰基、(C2-C12)-炔氧基羰基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C3-C8)-環烷氧基-(C1-C6)-烷氧基羰基、(C1-C12)-炔基羰氧基、(C3-C8)-環烷基羰氧基、(C6-C12)-芳基羰氧基、(C7-C16)-芳烷基羰氧基、肉桂醯氧基、(C2-C12)-烯基羰氧基、(C2-C12)-炔基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基羰氧基、(C1-C12)-烷氧基-(C1-C12)-烷基羰氧基、(C6-C12)-芳氧基羰氧基、(C7-C16)-芳烷氧基羰氧基、(C3-C8)-環烷氧基羰氧基、(C2-C12)-烯氧基羰氧基、(C2-C12)-炔氧基羰氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N，N-二環-(C3-C8)-烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯基、N-((C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C6)-烷基-N-((C3-C8)-環烷基-(C1-C6)-烷基)氨基甲醯基、N-(+)-脫氫樅基氨基甲醯基、N-(C1-C6)-烷基-N-(+)-脫氫樅基氨基甲醯基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯基；CON(CH2)h，其中CH2可為O、S、N-(C1-C8)-烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基亞氨基、N-(C3-C8)-環烷基-(C1-C4)-烷基亞氨基、N-(C6-C12)-芳基亞氨基、N-(C7-C12)-芳烷基亞氨基、N-(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基亞氨基取代，h是3-7；氨基甲醯氧基、N-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N，N-二-(C1-C12)-烷基氨基甲醯氧基、N-(C3-C8)-環烷基氨基甲醯氧基、N-(C6-C12)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C6-C16)-芳基氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-(C7-C16)-芳烷基氨基甲醯氧基、N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-((C6-C12)-芳氧基-(C1-C10)烷基)氨基甲醯氧基、N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C1-C10)-烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C6-C16)-芳氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、N-(C1-C10)-烷基-N-((C7-C16)-芳烷氧基-(C1-C10)-烷基)氨基甲醯氧基、氨基、(C1-C12)-烷基氨基、二(C1-C12)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基氨基、(C2-C12)-烯基氨基、(C2-C12)-炔基氨基、N-(C6-C12)-芳基氨基、N-(C7-C11)-芳烷基氨基、N-烷基-芳烷基氨基、N-烷基-芳氨基、(C1-C12)-烷氧基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基、(C6-C12)-芳基羰基氨基、(C7-C16)-芳烷基羰基氨基、(C1-C12)-烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C3-C8)-環烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C6-C12)-芳基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C7-C11)-芳烷基羰基-N-(C1-C10)-烷基氨基、(C1-C12)-烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C3-C8)-環烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷基羰基氨基-(C1-C8)-烷基、氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N.N-二-(C1-C10)-烷基氨基-(C1-C10)-烷基、N-(C3-C8)-環烷基氨基-(C1-C10)-烷基、(C1-C12)-烷基巰基、(C1-C12)-烷基亞硫醯基、(C1-C12)-烷基硫醯基、(C6-C16)-芳基巰基、(C6-C16)-芳基亞硫醯基、(C6-C16)-芳基硫醯基、(C7-C16)-芳烷基巰基、(C7-C16)-芳基亞硫醯基或(C7-C16)-芳基硫醯基；或者R1與R2或R2與R3形成鏈[CH2]o，可以是飽和鏈，也可以是含C＝C雙鍵的不飽和鏈，其中1或2個CH2任選為O、S、SO、SO2或NR』取代，其中R』是氫、(C6-C12)-芳基、(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C7-C12)-芳烷氧基-(C1-C8)-烷基、(C6-C12)-芳氧基-(C1-C8)-烷基、(C1-C10)-烷醯基、任選取代(C7-C16)-芳烷醯基、任選取代(C6-C12)-芳醯基；o是3、4或5；或者R1與R2或R2與R3同包含它們的吡啶或噠嗪形成5，6，7，8-四氫異喹啉環、5，6，7，8-四氫喹啉環或5，6，7，8-四氫肉啉環；或者R1與R2或R2與R3形成5元或6元芳碳環或芳雜環；或者R1與R2或R2與R3同包含它們的吡啶或噠嗪形成任選取代的雜環體系，所述體系可選自噻吩並吡啶、呋喃並吡啶、吡啶並吡啶、嘧啶並吡啶、咪唑並吡啶、噻唑並吡啶、噁唑並吡啶、喹啉、異喹啉和肉啉；其中喹啉、異喹啉和肉啉宜滿足式Ia、Ib和Ic 其中R12-R23各自獨立，定義同R1、R2和R3；或者基團R1與R2同包含它們的吡啶形成式Id所示化合物 其中V是S、O或NRk，其中Rk選自氫、(C1-C6)-烷基、芳基或苄基；其中芳基可如上所述為1-5個取代基取代；且R24、R25、R26和R27各自獨立，定義同R1、R2和R3；
f是1-8；g是0或1到(2f+1)；x是0-3；h是3-7；包括上述化合物的生理活性鹽和前體藥物。
式(I)所示化合物的例子見述於歐洲專利EP065096和EP0650961。EP065096和EP0650961所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。式(I)所示化合物的例子包括(但不限於)[(3-羥基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物G)和[(3-甲氧基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物P)。
此外，式(I)所示化合物的例子見述於美國專利5658933。美國專利5658933所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。式(I)所示化合物的例子包括(但不限於)鹽酸3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((十六烷氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((1-辛氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((己氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((丁氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；外消旋酒石酸3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((2-壬氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((庚氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-苯氧基吡啶-2-羧酸N-(((辛氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；3-苯甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((丁氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；5-(((3-(1-丁氧基)-丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-((苯甲氧基羰基)-甲基)-醯胺；5-(((3-(1-丁氧基)-丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-(((1-丁氧基)-羰基)-甲基)-醯胺；5-(((3-十二烷氧基丙基)-氨基)-羰基)-3-甲氧基吡啶-2-羧酸N-((苯甲氧基羰基)-甲基)-醯胺。
式(I)所示其他化合物有美國專利5620995中所述取代雜環羧基醯胺；美國專利6020350中所述3-羥基吡啶-2-羧基醯胺酯；美國專利5607954中所述磺醯氨基羰基-吡啶-2-羧基醯胺；美國專利5610172和5620996中所述磺醯氨基羰基-吡啶-2-羧基醯胺和磺醯氨基羰基-吡啶-2-羧基醯胺酯。這些專利中所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。
式(Ia)所示化合物的例子見述於美國專利5719164和5726305。前述專利中所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。式(I)所示化合物的例子包括(但不限於)N-((3-羥基-6-異丙氧基-喹啉-2-羰基)-氨基)乙酸(化合物H)、N1-((6-(1-丁氧基)-3-羥基喹啉-2-基)-羰基)氨基乙酸、[(3-羥基-6-三氟甲氧基-喹啉-2-羰基)氨基]乙酸(化合物I)、N-((6-氯-3-羥基喹啉-2-基)-羰基)氨基乙酸、N-((7-氯-3-羥基喹啉-2-基)-羰基)氨基乙酸和[(6-氯-3-羥基-喹啉-2-羰基)氨基]乙酸(化合物O)。
式(Ib)所示化合物的例子見述於美國專利6093730。美國專利6093730中所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。式(Ib)所示化合物的例子包括(但不限於)N-((1-氯-4-羥基-7-(2-丙氧基)異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((1-氯-4-羥基-6-(2-丙氧基)異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((1-氯-4-羥基-異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸(化合物B)、N-((1-氯-4-羥基-7-甲氧基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((1-氯-4-羥基-6-甲氧基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((7-丁氧基)-1-氯-4-羥基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((6-苯甲氧基-1-氯-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸(化合物J)、((7-苯甲氧基-1-氯-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸甲酯(化合物K)、N-((7-苯甲氧基-1-氯-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸(化合物L)、N-((8-氯-4-羥基異喹啉-3-基)羰基)氨基乙酸、N-((7-丁氧基-4-羥基異喹啉-3-羰基)氨基)乙酸(化合物M)。
同樣可用於本發明方法的與式(I)相關的化合物包括(但不限於)6-環己基-1-羥基-4-甲基-1H-吡啶-2-酮(化合物N)、7-(4-甲基-哌嗪-1-甲基)-5-苯基硫烷基甲基-喹啉-8-羥基(化合物D)、4-硝基-喹啉-8-羥基(化合物E)和5-丁氧基甲基-喹啉-8-羥基(化合物F)。此外，本發明提供了其他化合物實例，其中位置A和B可一起形成己酸、氰甲基、2-氨基乙基、苯甲酸、1H-苯並咪唑-2-甲基等。
在其他實施方式中，本發明方法所用化合物選自式(II)所示化合物 其中R28是氫、硝基、氨基、氰基、滷素、(C1-C4)-烷基、羧基或它們的易代謝酯；(C1-C4)-烷基氨基、二-(C1-C4)-烷基氨基、(C1-C6)-烷氧基羰基、(C1-C4)-烷醯基、羥基-(C1-C4)-烷基、氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、(C1-C4)-烷硫基、(C1-C4)-烷基亞硫醯基、(C1-C4)-烷基硫醯基、苯硫基、苯基亞硫醯基、苯基硫醯基，所述苯基可任選為1-4個相同或不同滷素、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、氰基、羥基、三氟甲基、氟代-(C1-C4)-烷硫基、氟代-(C1-C4)-烷基亞硫醯基、氟代-(C1-C4)-烷基硫醯基、(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基羰基、N，N-二-[(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基-(C1-C4)-烷氧基羰基、(C1-C4)-烷基氨基-(C2-C4)-烷氧基羰基、二-(C1-C4)-烷基氨基-(C2-C4)-烷氧基羰基、(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基羰基、(C2-C4)-烷醯氧基-(C1-C4)-烷基或N-[氨基-(C2-C8)-烷基]-氨基甲醯基；R29是氫、羥基、氨基、氰基、滷素、(C1-C4)-烷基、羧基或它們的易代謝酯衍生物；(C1-C4)-烷基氨基、二-(C1-C4)-烷基氨基、(C1-C6)-烷氧基羰基、(C2-C4)-烷醯基、(C1-C4)-烷氧基、羧基-(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷氧基羰基-(C2-C4)-烷氧基、氨基甲醯基、N-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基、N，N-二-(C1-C8)-烷基氨基甲醯基、N-[氨基-(C2-C8)-烷基]氨基甲醯基、N-[(C1-C4)-烷基氨基-(C1-C8)-烷基]氨基甲醯基、N-[二-(C1-C4)-烷基氨基-(C1-C8)-烷基]氨基甲醯基、N-環己基氨基甲醯基、N-環戊基氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基環己基氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基環戊基氨基甲醯基、N-苯基氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基-N-苯基氨基甲醯基、N，N-二苯基氨基甲醯基、N-[苯基-(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基、N-(C1-C4)-烷基-N-[苯基-(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基、或N，N-二[苯基-(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基，所述苯基可任選為1-4個相同或不同滷素、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、氰基、羥基、三氟甲基、N-[(C2-C4)-烷醯基]氨基甲醯基、N-[(C1-C4)-烷氧基羰基]氨基甲醯基、N-[氟-(C2-C6)-烷基]氨基甲醯基、N，N-[氟-(C2-C6)-烷基]-N-(C1-C4)-烷基氨基甲醯基、N，N-[二氟-(C2-C6)-烷基]氨基甲醯基、1-吡咯基-羰基、哌啶基羰基、1-哌嗪基-羰基、嗎啉基羰基，其中雜環基團任選為1-4個以下基團取代，即(C1-C4)-烷基、苄基、1，2，3，4-四氫異喹啉-2-基-羰基、N，N-[二-(C1-C4)-烷基]硫代氨基甲醯基、N-(C2-C4)-烷醯基氨基或N-[(C1-C4)-烷氧基羰基]氨基；R30是氫、(C1-C4)-烷基、(C2-C4)-烷氧基、滷素、硝基、羥基、氟-(1-4C)烷基或吡啶基；R31是氫、(C1-C4)-烷基、(C2-C4)-烷氧基、滷素、硝基、羥基、氟-(C1-C4)烷基、吡啶基或甲氧基；R32是氫、羥基、氨基、(C1-C4)-烷基氨基、二(C1-C4)-烷基氨基、滷素、(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷氧基、氟-(C1-C6)-烷氧基、吡咯-1-基、哌啶基、哌嗪-1-基或嗎啉基，其中雜環基任選為1-4個相同或不同的(C1-C4)-烷基或苯基取代；R33和R34各自獨立地選自氫、(C1-C4)-烷基和(C1-C4)-烷氧基；
還包括它們的藥用鹽和前體藥物。
式(II)所示化合物的例子見述於美國專利5916898和6200974以及國際專利公告WO99/21860。前述專利和公告中所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。式(II)所示化合物的例子包括4-氧-1，4-二氫-[1，10]菲咯啉-3-羧酸(化合物A)(參見，例如Seki等(1974)Chem Abstracts 81424，No.21)、3-羧基-5-羥基-4-氧-3，4-二氫-1，10-菲咯啉、3-羧基-5-甲氧基-4-氧-3，4-二氫-1，10-菲咯啉、5-甲氧基-4-氧-1，4-二氫[1，10]菲咯啉-3-羧酸乙酯、5-甲氧基-4-氧-1，4-二氫[1，10]菲咯啉-3-羧酸(化合物Q)和3-羧基-8-羥基-4-氧-3，4-二氫-1，10-菲咯啉。
在其他實施方式中，用於本發明方法的化合物選自式(III)所示化合物或它們的藥用鹽 其中a是1-4之間的整數；b是0-4之間的整數；c是0-4之間的整數；Z選自(C3-C10)環烷基、被一個或多個Y1獨立取代的(C3-C10)環烷基、3-10元雜環烷基和被一個或多個Y1獨立取代的3-10元雜環烷基；(C5-C20)芳基、被一個或多個Y1獨立取代的(C5-C20)芳基、5-20元雜芳基和被一個或多個Y1獨立取代的5-20元雜芳基；Ar1選自(C5-C20)芳基、被一個或多個Y2獨立取代的(C5-C20)芳基、5-20元雜芳基和被一個或多個Y2獨立取代的5-20元雜芳基；每個Y1獨立選自親脂功能基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷基芳基、5-20元雜芳基和6-26元烷基雜芳級；每個Y2獨立選自-R』、-OR』、-OR」、-SR』、-SR」、-NR』R』、-NO2、-CN、-滷素、-三滷代甲基、-三滷代甲氧基、-C(O)R』、-C(O)OR』、-C(O)NR』R』、-C(O)NR』OR』、-C(NR』R』)＝NOR』、-NR』-C(O)R』、-SO2R』、-SO2R」、-NR』-SO2-R』-、-NR』-C(O)-NR』R』、四唑-5-基-、-NR』-C(O)-OR』、-C(NR』R』)＝NR』、-S(O)-R』、-S(O)-R」和-NR』-C(S)NR』R』；
每個R』獨立選自-H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基和(C2-C8)炔基；每個R」獨立選自(C5-C20)芳基和被一個或多個-OR』、-SR』、-NR』R』、-NO2、-CN、-滷素、-三滷代甲基獨立取代的(C5-C20)芳基；或其中c是0，Ar1是N』取代脲-芳基，所述化合物具有式(IIIa)所示結構 或者其藥用鹽；式中，a、b和Z定義同上；R35和R36各自獨立地選自氫、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C3-C10)環烷基、(C5-C20)芳基、(C5-C20)取代芳基、(C6-C26)烷基芳基、(C6-C26)取代烷基芳基、5-20元雜芳基、5-20元取代雜芳基、6-26元烷基雜芳基和6-26元取代烷基雜芳基；R37各自獨立地選自氫、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基和(C2-C8)炔基。
式(III)所示化合物的例子見述於國際專利公告WO00/50390。WO00/50390中所列所有化合物，特別是化合物權利要求部分和工作實例的最終產品中所列化合物在本發明申請中引為參考。式(III)所示化合物的例子包括3-{[4-(3，3-二苄基-脲基)-苯硫醯基]-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羥基-丙醯胺(化合物C)、3-{{4-[3-(4-氯-苯基)-脲基]-苯硫醯基}-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羥基-丙醯胺和3-{{4-[3-(1，2-二苯基乙基)-脲基]-苯硫醯基}-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-氨基}-N-羥基-丙醯胺。
基於2-酮戊二酸雙加氧酶族成員的一般作用機理，如活性對Fe2+和2-酮戊二酸的依賴性，本發明在某些方面涉及用化合物，包括上述化合物來抑制HIFα羥基化，從而以不依賴於氧的方式穩定HIFα。此外，本發明的實施例和數據表明，利用這些化合物可穩定HIFα，從而在體內和體外產生HIF調節基因產品。在具體實施方式
中，這些化合物在預防和治療缺血性和低氧性疾病方面具有獨特好處。
本發明方法在穩定常氧環境中生長的細胞中的HIFα時，對劑量有依賴性。雖然在本發明化合物存在下，不同類型的細胞顯示不同水平的HIFα，但測定的細胞線都顯示出某種水平的HIFα穩定作用。未經處理的細胞中HIFα的水平一般很低，無法檢測。
HIFα的穩定導致的是HIF依賴性基因在體內和體外的表達，包括基因編碼血管生長因子，如VEGF、Flt-1、EG-VEGF、PAI-1、腎臟髓質素和Cyr61。因此，在誘導血管生長和防止缺血和低氧引起的組織損傷方面，穩定HIFα的能力具有潛在的好處。例如，在上皮中表達結構活性HIF-1α的轉基因鼠對每個VEGF異構體的表達得到加強，表皮毛細管顯著增加。不像單個VEGF異構體過分表達後那樣，HIFα誘導產生的超級血管質沒有出現浮腫、炎症或血管破裂。(見Elson等(2001)Genes Dev 152520-2532；Detmar等(1998)J Invest Derm 1111-6；Larcher等(1998)Oneogene 17303-311；Thurston等(1999)Science 2862511-2514)因此，在某些方面，本發明方法可用來誘導產生醫療性血管生長，它涉及旁系血管的發育，使缺血組織重新形成血管。
此外，本發明方法使細胞中的耗氧量根據劑量降低，而不會對細胞存活力產生任何影響。穩定的HIF絡合物能激活與葡萄糖的吸收和利用有關的蛋白質的表達，如葡萄糖轉運子(GluT)-1和GluT-3；醛縮酶-A、烯醇酶-1、己糖激酶-1和-2、磷酸果糖激酶-L和-C。HIFα穩定後，耗氧量可能減少，因為細胞代謝從依氧能量生成轉向厭氧能量生成。因此，本發明方法可用來在低氧條件下產生能量，這有利於缺血性和低氧性疾病，如周邊動脈疾病、DVT、心絞痛、肺栓塞、中風和心肌梗塞。本發明還提供了增加體細胞吸收和利用葡萄糖的方法，通常可用於質量其他疾病。
本發明還提供了提高輸氧能力的方法，例如誘導產生紅血球、促進鐵的運輸和利用。具體說來，本發明方法促進了紅細胞生成素(EPO)的表達，它是天然存在的荷爾蒙，能激發紅細胞的產生。(參見，例如共同擁有的待審美國專利申請＿＿＿，題目是「增加內生紅細胞生成素(EPO)的方法」，同日登記，在此全文引用。)增強酶和蛋白表達的方法具體涉及鐵的吸收、運輸和加工。這些酶和蛋白包括(但不限於)鐵傳遞蛋白和鐵傳遞蛋白受體，它們一起促進鐵運輸到紅細胞組織和血漿銅藍蛋白中，並被其吸收；血漿銅藍蛋白是將亞鐵離子氧化為鐵離子所需要的鐵氧化酶。由於鐵傳遞蛋白只能結合併運輸鐵離子，血漿銅藍蛋白在向組織提供鐵的過程中具有重要作用。本發明方法能增加內生紅細胞生成素同時促進鐵的運輸和利用，它對於在常氧和低氧環境中輸送氧具有特別的好處。
本發明一方面提供了保護神經的方法，例如通過穩定HIFα。例如，VEGF和EPO都能保護神經。(參見，例如Jin等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 9710242-10247；Bocker-Meffert等(2002)Invest Ophthalmol Vis Sci 432021-2026；Buemi等(2002)Clin Sci(Lond)103275-282；Siren等(2001)Proc Natl Acad Sci USA984044-4049)。如果在局部缺血事件發生前引入EPO，它還能加快脊髓損傷的恢復，並能保護神經。(參見，例如Gorio等(2002)Proc Natl Acad Sci USA 999450-9455；Dawson(2002)Lancet 35996-97)由於本發明方法能促進神經保護因子，如VEGF和EPO的表達，所述方法能提供神經保護，因而能用於治療、預治療活預防各種疾病，例如包括糖尿病性神經病、中風、神經退化疾病、受傷(例如震蕩、脊髓受損等)，或者用於手術前，因為手術有可能導致腦缺血再灌注損傷等。
低氧預調理對於保護嚴重缺血損傷具有良好效果。由於低氧的初期反應是HIFα的穩定化及隨後對HIF調節基因的活化，本發明方法將在常氧環境中模擬缺血預調理。例如，所述方法可在手術之前應用，因為手術中的缺血再灌注損傷有可能對患者產生有害結果。這種預防性治療在局部缺血事件發生之前應用，而且可在局部缺血事件發生之前的任何時刻應用，可以應用一個療程，也可以應用多個療程。
本發明方法還能協同調節氧化應急和血管品質中涉及的基因。這些基因包括誘導氧化一氮合成酶(iNOS)和亞鐵血紅素氧化激酶1。在幾個動物樣本中，產生iNOS也是低氧預調理帶來的有益效果。(參見，例如Serracino-Inglott等(2002)BMCGastroenterol 222-27；Kuntscher等(2002)Br J Plast Surg 55430-433)特別地，阻斷iNOS的活性可降低但不能消除預調理帶來的有益效果，但非特異性阻斷蛋白質的產生卻能完全消除預調理帶來的好處。(Wang等(2002)Cardiovasc Res 5633-42)這表明，iNOS是預調理產生的生理反應的重要組成部分，但不是唯一因素。由於本發明方法可協同調節各種因子，包括低氧反應中涉及的iNOS，本發明方法能更準確地再現低氧預調理所具有的益處。
使用本發明化合物的方法本發明提供了抑制HIFα羥化的方法，由此穩定HIF並激活HIF調節基因的表達。所述方法可用於預防、預治療或治療HIF疾病，包括缺血性和低氧性疾病。舉例來說，這些疾病包括心肌梗塞、肝缺血、腎缺血和中風；周邊血管疾病、潰瘍、灼傷和慢性創傷；肺栓塞；缺血再灌注損傷，例如手術和器官移植中發生的缺血再灌注損傷。在一種少數方式中，本發明提供了在缺血或低氧發生之前、當中或之後穩定HIFα的方法，特別是與心肌梗塞、中風或腎缺血再灌注損傷有關的缺血或低氧。
本發明一方面提供了治療各種缺血性和低氧性疾病的方法，特別是用上述化合物進行治療的方法。在一種實施方式中，本發明方法在缺血或低氧發生後應用能帶來較好的治療效果。例如，本發明方法用於心肌梗塞時，能顯著降低發病率和死亡率，並能顯著提高心臟結構和機能。此外，對肝中毒缺血損傷應用本發明方法，可改善肝功能。低氧是肝病的重要表現，特別是由肝中毒化合物如乙醇引起的慢性肝病。此外，HIFα，例如氧化一氮合成酶和葡萄糖轉運子-1誘導產生的基因表達在酒精所致肝病中得到加強。(參見，例如Areel等(1997)Hepatology25920-926；Strubelt(1984)Fundam Appl Toxicol 4144-151；Sato(1983)PharmacolBiochem Behav 18(Suppl 1)443-447；Nanji等(1995)Am J Pathol 146329-334；Morio等(2001)Toxicol Appl Pharmacol 17244-51)因此，本發明提供了治療缺血性或低氧性疾病的方法，所述方法包括給治療對象施用有效量的化合物或其藥用鹽，單獨施用或與藥用賦形劑組合施用。在一種實施方式中，化合物在急性缺血性疾病發生之後立即施用，例如心肌梗塞、肺栓塞、腸梗阻、缺血性中風和腎缺血再灌注損傷。在另一個實施方式中，化合物可施用於經診斷患有慢性缺血疾病的病人，例如心臟硬化、斑狀退化、肺栓塞、急性呼吸系統衰竭、新生呼吸壓抑綜合症和充血性心力衰竭。在另一個實施方式中，所述化合物在受傷之後立即施用。
本發明另一方面為缺血性或低氧性疾病的潛在患者提供了用上述化合物進行治療的方法，例如極有可能患動脈硬化的個體。導致動脈硬化的潛在因素包括高血脂、抽菸、高血壓、糖尿病、胰島素過高和腹部肥胖。因此，本發明提供了預防缺血性組織損傷的方法，所述方法包括給治療對象施用有效量的化合物或其藥用鹽，單獨施用或與藥用賦形劑組合施用。在一種實施方式中，所述化合物可根據事先診斷出的疾病施用，例如高血壓、糖尿病、動脈閉合疾病、慢性靜脈功能不足、肢端動脈痙攣症、慢性皮膚潰瘍、硬化症、充血性心力衰竭和系統硬化。
在一個
具體實施例方式
中，所述方法可用來促進受傷組織、創傷和潰瘍中血管和/或肉芽組織的形成。例如，研究表明，本發明化合物在創傷治療中能有效促進肉芽組織的形成。肉芽組織包含新生但仍漏血的血管和血漿蛋白的臨時基質，如纖維蛋白原和血漿粘連蛋白。發炎細胞、血小板和受激內皮中釋放的生長因子能激發纖維原細胞和內皮細胞在肉芽組織中的遷移和增生。如果血管生長或神經激發受損，則會發生潰瘍。本發明方法能有效促進肉芽組織的形成。因此，本發明提供的治療方法可用於治療患者因梗塞等引起的組織損傷、因外傷等引起的創傷或因糖尿病等疾病引起的慢性創傷或潰瘍。所述方法包括根據需要給治療對象施用有效量的化合物或其藥用鹽，單獨施用或與藥用賦形劑組合施用。
本發明另一方面提供了使用所述化合物對患者進行預治療的方法，以緩解或預防缺血性或低氧性組織損傷的惡化。本發明方法在患上缺血性或低氧性疾病之前應用可產生較好的治療效果。例如，從統計結果可以看出，在誘導產生心肌梗塞之前應用本發明方法明顯改善了心臟的結構和功能。此外，本發明方法在缺血性再灌注損傷發生之前和發生過程中立即應用可產生較好的治療效果，明顯降低了與腎衰竭有關的診斷參數。
因此，本發明提供了對患者展開預治療，以緩解或預防缺血性或低氧性組織損傷，所述方法包括給有缺血性病史(例如心肌梗塞)或有慢性缺血症狀(例如心絞痛)的患者施用有效量的化合物或其藥用鹽，單獨施用或與藥用賦形劑組合施用。在另一個實施方式中，根據可能缺血或低氧的指示性物理參數施用所述化合物，例如個體經過普通麻醉或臨時在高緯度工作。在又一個實施方式中，本發明方法可用在器官移植中，用來對器官捐獻者進行預處理，並在器官從體內移出但移植到接受者之前保護器官。
前面的研究表明，用於本發明方法中的某些化合物能有效抑制膠原脯氨醯4-羥化酶。雖然人們認識到從初始梗塞或創傷恢復要在壞死區沉積結締組織，但就形成疤痕而言，本發明在治療上沒有表現出負面影響。因此，鑑於本發明的某些化合物在治療和預防低氧組織損傷和纖維症方面具有的優點，本發明提出了一種「雙療效」方法，用於治療或預防缺血性或低氧性疾病，包括反應性纖維化並發缺血或低氧，例如心肌梗塞和由此導致的充血性心力衰竭。所述方法可用一種化合物抑制一種以上的2-酮戊二酸雙加氧酶，例如HIF脯氨醯羥化酶和膠原脯氨醯4-羥化酶，它們具有相同或不同的特異性。或者，所述方法可組合應用化合物，其中每種化合物專門抑制一種2-酮戊二酸雙加氧酶，例如一種化合物專門抑制HIF脯氨醯羥化酶，而第二種化合物專門抑制膠原脯氨醯4-羥化酶。
本發明化合物一方面能抑制一種或多種2-酮戊二酸雙加氧酶。在一種實施方式中，所述化合物能抑制至少兩個2-酮戊二酸雙加氧酶族成員，例如HIF脯氨醯羥化酶和HIF天冬醯胺羥化酶(FIH-1)，它們的特異性可相同或不同。在另一個實施方式中，所述化合物對一種2-酮戊二酸雙加氧酶有特異性，例如HIF脯氨醯羥化酶，而對其他同族成員具有很少乃至沒有特異性。
所述化合物可結合其他各種治療手段施用。在一種實施方式中，所述化合物可與另一種2-酮戊二酸雙加氧酶抑制劑同時施用，這兩種化合物對單個2-酮戊二酸雙加氧酶族成員具有不同的特異性。這兩種化合物可以一定比例同時施用。指定治療過程或特定患者適用的比例可利用本領域已有技術測定。或者，兩個化合物在治療過程中可依次施用，例如針對心肌梗塞。在一個特定實施方式中，一種化合物專門抑制HIF脯氨醯羥化酶活性，第二種化合物專門抑制膠原脯氨醯4-羥化酶活性。在另一個具體實施方式
中，一種化合物專門抑制HIF脯氨醯羥化酶活性，而第二種化合物專門抑制HIF天冬醯胺羥化酶活性。在另一個實施方式中，所述化合物與另一個具有不同作用模式的治療劑同時施用，例如ACE抑制劑(ACEI)、血管緊縮素-II受體阻斷劑(ARB)、抑制素、利尿劑、地高辛、肉鹼等。
藥物配劑和給藥途徑本發明組合物可直接輸入，也可與合適的載體或賦形劑一起形成藥用組合物，如本領域所已知的。本發明治療方法包括給可能患缺血性疾病，例如充血性心力衰竭、動脈硬化等的患者施用有效量的本發明化合物。在一個優選實施方式中，治療對象是哺乳動物，在多數優選實施方式中，治療對象是人。優選給藥途徑包括口服和透皮輸藥機制。
利用常規實驗方法可方便地確定這種試劑的有效量，還可確定最有效和最方便的給藥途徑以及最合適的配劑。各種配劑和藥物輸入系統都是已知的，對合適配劑的選擇也在本領域技術掌握之內。(參見，例如Gennaro編(1995)《Remington藥學》，同上；Hardman、Limbird和Gilman編(2001)《治療的藥理基礎》，同上。)合適的給藥途徑可包括口服、直腸給藥、透壁、鼻吸或小腸給藥和腸胃外給藥，包括肌肉注射、皮下注射、脊髓內注射，以及膜內注射、直接心室內注射、靜脈注射、腹膜內注射、鼻內注射或眼內注射。所述試劑或組合物可在局部給藥，而不是系統給藥。例如，合適的試劑可通過注射或在目標送藥系統中送入，如緩釋配劑。
本發明的藥用組合物可通過本領域成熟的方法生產，如常規混合、溶解、造粒、製糖丸、粉化、乳化、囊封或幹凍。如上所述，本發明組合物可包含一種或多種生理上可接受的載體，如賦形劑和輔劑，以幫助活性分子製成藥物。
合適的配劑依賴於所選擇的給藥途徑。例如，對於注射方法，組合物可形成水溶液，宜為生理緩衝液，如Hanks溶液、林格氏溶液活生理活性鹽水緩衝液。對於透壁或鼻腔給藥，配劑中可使用適合屏蔽劑滲透的滲透劑。這種滲透劑在本領域通常是已知的。對於口腔給藥，通過使活性化合物與本領域熟知的藥用載體結合，所述化合物可方便地配製而成。這樣的載體可使本發明化合物形成片劑、丸劑、糖丸、膠囊、藥液、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，以便患者口服。所述化合物也可製成直腸組合物，如栓劑或緩釋灌腸劑，它們可包含傳統栓劑基底，如可可油或其他甘油酯。
口服藥劑可以是這樣獲得，在化合物中加入固體賦形劑，任選研磨所得混合物，加工粒狀混合物，如果需要可加入合適的輔劑，然後得到片劑或糖丸核。合適的賦形劑特別包括填充劑，如糖，包括果糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素配劑，如玉米粉、小麥粉、米粉、土豆粉、凝膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入分解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或褐藻酸或它們的鹽，如褐藻鹽。
糖丸核上要包裹合適的包衣。為此，可使用濃縮糖溶液，其中可任選包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦，清漆溶液和有機溶劑或溶劑混合物。可在片劑或糖丸包衣上加入染料或顏料，以作標記或表徵不同的活性化合物劑量組合。
口服藥劑包括由凝膠製成的插接膠囊，由凝膠和增塑劑製成的柔軟密封膠囊，如甘油或山梨醇。插接膠囊可包含活性組分與填充劑如乳糖、粘合劑如澱粉和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂及任選穩定劑組成的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可加入穩定劑。
在一種實施方式中，本發明化合物可透皮給藥(如通過膏藥)或局部給藥。一方面，本發明透皮或局部配劑可另外包含一種或多種滲透促進劑或其他增效劑，包括能促進待送化合物遷移的試劑。在需要定位給藥等場合下，優選透皮或局部給藥。
對於吸入給藥，用於本發明的化合物可以氣溶膠噴霧的形式從壓縮包或噴霧器中方便地輸送，可以藉助合適助推劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他任何合適的氣體。對於壓縮氣溶膠，合適的劑量可通過閥門控制，以實現定量給藥。用於吸藥器或吹藥器中的凝膠可製成膠囊或筒的形式。
用於腸胃外注射，例如造影劑注射或連續灌注的組合物可製成單位劑量的形式，例如裝在安瓿或多劑量容器中，可以加入防腐劑。所述組合物的形式可以是以油或水為媒介的懸浮液、溶液或乳液，可包含配藥試劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。腸胃外注射配劑包括水溶液或其他水溶性組合物形式。
活性化合物的懸浮液也可製成合適的油狀注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介包括脂肪油(如芝麻油)和合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酸酯)，或脂質體。水溶性注射懸浮液可包含能增加懸浮液粘性的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或右旋糖。任選地，懸浮液也可包含合適的穩定劑或試劑，以增加這些化合物的溶解性，從而方便製備高度濃縮的溶液。或者，活性組分可呈粉末形式，以便在使用前與合適的媒介如消毒無熱源質水混合。
如上所述，本發明組合物也可製成儲備藥劑。這種長效配劑可通過植入(例如皮下或肌肉植入)或通過肌肉注射送藥。因此，舉例來說，本發明化合物可與合適的聚合材料或疏水材料配藥(例如在可用油中形成乳液)，或與離子交換樹脂配藥，或者配成微溶衍生物，例如配成微溶鹽。
適合用作本發明疏水分子的載體在本領域是廣為人知的，包括共溶劑體系和水相，前者包括苄基醇、非極性表面活性劑、易溶於水的有機聚合物等。共溶劑體系可以是VPD共溶劑體系。VPD是3％(w/v)苄醇、8％(w/v)非極性表面活性劑聚山梨醇酯80和65％(w/v)聚乙二醇300組成，並用無水乙醇配足體積的溶液。VPD共溶劑體系(VPD5W)中的VPD是在水溶液中用5％右旋糖以1∶1的比例稀釋的。這種共溶劑體系能有效溶解疏水性化合物，在系統給藥過程中產生的毒性低。當然，共溶劑體系的配比可作相當大的改變，只要不破壞其溶解性和毒性特徵。此外，共溶劑組分液可以改變。例如，可用其他低毒非極性表面活性劑代替聚山梨醇酯80，聚乙二醇的比例可以改變，其他生物相容聚合物可代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮，其他糖和多糖可代替右旋糖。
此外，對於疏水性分子，也可採用其他給藥體系。脂質體和乳液可用作疏水性藥物的輸送媒介或載體是廣為人知的例子。脂質體給藥體系在上面已結合基因輸送體系討論過。某些有機溶劑，如二甲基亞碸也可以採用，雖然往往會帶來較大的毒性。此外，所述化合物可用緩釋體系輸送，如固體疏水性聚合物的半透過性基質，所述聚合物包含有效量要輸入的組合物。各種緩釋材料都是已知的，本領域技術人員不難得到。根據它們的化學特性，緩釋膠囊可在數周到100天以上的時間裡釋放化合物。根據醫療試劑的化學性質和生物穩定性，可以採用其他策略增加蛋白質的穩定性。
對於本發明治療方法中所用的任何組合物，一開始可用本領域熟悉的技術測定有療效的劑量。例如，根據細胞培養化驗得到的信息，可以配成一個劑量，在動物樣本中達到包含IC50的循環濃度範圍。類似地可以確定適合於人體的劑量範圍，例如利用細胞培養化驗和其他動物研究中獲得的信息。
一種試劑有療效的劑量指該試劑能緩解症狀或延長治療對象存活時間的量。這種分子的毒性和療效可通過標準藥學程序在培養細胞或實驗動物測定，例如測定LD50(使群體的50％致命的劑量)和ED50(對群體的50％有療效的劑量)。毒性與療效的劑量比是治療指數，可表示為LD50/ED50比。試劑的治療指數越高越好。
劑量宜落在循環濃度範圍之內，該濃度範圍包含ED50但具有很小或沒有毒性。劑量可在此範圍內根據所用藥劑形式和給藥途徑變化。按照本領域已知方法，實際採用的配劑、給藥途徑和劑量要根據患者所患疾病的具體情況選擇。
給藥劑量和間隔可根據個體情況調整，使提供給血漿的活性組分含量足以調節HIFα的穩定化過程和受HIF調節的基因誘導過程，如所希望的那樣獲得最小有效濃度(MEC)。MEC可隨每個化合物而變化，但可從體外數據估計出。達到MEC所需的劑量取決於化合物的個體特徵和給藥途徑。試劑或組合物應當通過一個控制載體輸送，使血漿水平保持高於MEC，在治療期間約為10-90％，宜為約30-90％，最好約為50-90％。在局部給藥或選擇吸收的情況中，藥物的有效局部濃度不一定與血漿濃度相關。
當然，試劑或組合物的給藥量取決於多種因素，包括治療對象的性別、年齡和體重，病痛的嚴重程度，給藥方式和處方醫師的判斷。
如果需要，本發明組合物可裝在藥包或分藥裝置中，可含有一個或多個劑量的含有活性組分的藥物。舉例來說，這種藥包或裝置可包含金屬或塑料箔，如硬質泡沫塑料襯墊包。所述藥包或分藥裝置上可附註用藥說明。在藥用載體中配製的、含本發明化合物的組合物也可裝在合適的容器中，並貼上說明治療指定疾病的標籤。標籤上所指明的相應疾病可包括以缺血或低氧為主的疾病或失調。
化合物的篩選和鑑定本發明還提供了篩選和鑑定能抑制HIFα羥基化或穩定HIFα等的其他化合物。
各種化驗和篩選技術，包括下面將要介紹的，可用來鑑定調節(例如增加或降低)HIFα水平或活性的小分子。化驗通常提供與反應底物的消耗或反應產物的產生相關的可檢測信號。舉例來說，檢測可涉及螢光團、放射性同位素、共軛酶和本領域已知的其他可檢測標記。所得結果可以是定性或定量的。諸如生物素或組氨酸這樣的標記可幫助跟蹤反應產物的分離情況，這種分離可通過沉澱或親合色譜法將一種反應產物從其他反應組分中純化出來。
對HIFα羥基化過程的化驗可涉及HIFα或其片段中羥化脯氨酸或賴氨酸殘基的測定(參見，例如Palmerini等(1985)J Chromatogr 339285-292)，或涉及在酶和HIFα或其片段存在下由2-酮戊二酸形成琥珀酸酯的測定(參見，例如Cunliffe等(1986)Biochem J 240617-619)。測定HIFα羥基化過程的示例性程序見述於Ivan等(同上)和實施例10。測定由2-酮戊二酸形成琥珀酸酯的示例性程序見述於Kaule和Gunzler(1990；Anal Biochem 184291-297。)底物分子可包括HIFα或其片段，例如HIF(556-575)；例如，實施例10所描述的化驗中所採用的示例性底物是[甲氧基香豆素]＝DLDLEALAPYIPADDDFQL-醯胺(SEQ ID NO5)。酶可包括，例如HIFα脯氨醯羥化酶(參見，例如基因庫續編號No.AAG33965等)，可來自任何來源。酶也可存在於粗細胞溶解產物中或以部分純化形式存在。穩定HIFα或抑制HIFα羥化的化合物可通過測定並比較該化合物存在與不存在的情況下酶的活性。
另外，化合物可通過本領域已知的各種篩選技術鑑定，這些技術也可與上述方法組合使用。這些篩選方法可使溶液中不含目標多肽或化合物，也可使它們附著在固體載體上，生成在細胞表面上，或者位於細胞內部。例如，實驗化合物可以類似於本領域現有的陣列方法陣列在表面上，然後分析其活性(參見，例如Shalon等(1995)國際公開專利WO95/35505；Baldeschweiler等(1995)國際公開專利WO95/251116；Brennan等(1995)美國專利5474796；Heller等(1997)美國專利5605662。)本領域普通技術人員在看過本說明書後，不難理解本發明的上述及其他實施方式，這些實施方式經過了專門反覆推敲。
實施例結合以下實施例可更好理解本發明，但這些實施例僅僅是本發明的示例。本發明的範圍不受示例中的實施方式限制，這些實施方式只是說明了本發明的單個側面。任何在作用上等價的方法都包括在本發明範圍之內。根據前面的描述和附圖，本領域的熟練技術人員不難在這裡描述的實施方式之外，對本發明作出各種修改。這些修改也在附屬權利要求範圍之內。
實施例1 體外細胞中HIFα的穩定將來自腺病毒變性胎兒腎上皮細胞(293A)、子宮頸上皮腺癌細胞(HeLa)、肝癌細胞(Hep3B)、包皮纖維原細胞(HFF)、乳腺上皮癌細胞(MCF7)、帶靜脈內皮細胞(HUVEC)、微血管內皮細胞(HMEC-1)、臍鱗狀上皮癌細胞(SCC-25)、肺纖維原細胞(HLF)、靜脈內皮細胞(AG10774B)組織(參見，例如美國模式菌種收集，ManassaVA；Qbiogene，Carlsbad CA)的人體細胞分別在35mm培養皿中下種，在37℃、20％O2、5％CO2環境中培養，介質如下HeLa細胞在經Dulbecco改進的Eagle介質中(DMEM)，2％幼牛血清(FBS)；HFF和HLF細胞在DMEM中，10％FBS；293A細胞在DMEM中，5％FBS；HUVEC和AG10774B細胞在內皮生長介質中(EGM-2；BioWhittaker，Inc.，Walkersville MD)；HMEC-1在RPMI 1640中，10％FBS；Hep3B細胞在Minimal Essential介質中(MEM)，Earle BSS(Mediatech Inc.，HerndonVA)，2mM L-穀氨酸，0.1mM次要胺基酸，1mM丙酮酸鈉，10％FBS。當細胞層匯合後，介質用OPTI-MEM介質替換(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad CA)，細胞層在37℃的20％O2、5％CO2中培養約24小時。然後向現有介質中加入本發明化合物(化合物A-O之一)或DMSO(0.5-1％)，繼續培養過夜。
培養結束，除去介質，離心、保存，以備分析(見下文)。在冷的磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌細胞2次，然後在冰凍情況下讓細胞在1ml 10mM Tris(pH 7.4)、1mMEDTA、150mM NaCl、0.5％IGEPAL(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)和蛋白酶抑制劑混合物(Roche Molecular Biochemcals)中溶解15分鐘。細胞溶解物在4℃下於3000xg下離心5分鐘，收集細胞溶解部分(上清液)。使核(小球)重新懸浮，並在100μl 20mM HEPES(pH＝7.2)、400mM NaCl\1mM EDTA、1mM二硫蘇糖醇和蛋白酶混合物中溶解(Roche Molecular Biochemicals)，在4℃下以13000xg的轉速離心，收集核蛋白部分。
根據蛋白質濃度校正核部分，負載到4-12％TG凝膠中，並在還原條件下分餾。在500mA電流下，在1.5小時內將蛋白質轉移到PVDF膜中(Invitrogen Corp.，CarlsbadCA)。膜在T-TBS、2％牛奶中於室溫下屏蔽1小時，並將大鼠抗人體HIF-1α抗體(BD Bioscience，Bedford MA)培養過夜，所述抗體在T-TBS、2％牛奶中按1∶250的比例稀釋。用SUPERSIGNAL WEST化學發光基底(Pierce，Rockford IL)培育斑點。如圖1A所示，本發明的各種化合物(A-F)在常氧環境中以劑量依賴性方式穩定HIFα。如圖1B所示，當在常氧環境中用本發明化合物處理時，各種細胞類型，包括來自各種來源的纖維原細胞、上皮細胞、內皮細胞和肝細胞，都顯示出HIFα的劑量依賴性穩定作用。
或者，利用QUANTIKINE免役測定裝置(RD Systems，Inc.，MinneapolisMN)，根據商家說明書分析細胞核部分和包液部分的HIF-1α。如圖2A所示，與用媒介處理的對照細胞相比，用本發明各種化合物(化合物B和G-O)處理的上皮細胞(293A)和肝細胞(Hep3B)中的HIFα得到穩定和富集。如圖2B所示，用本發明化合物處理的細胞對HIFα具有依賴於劑量的穩定作用。
實施例2耗氧效果氧傳感細胞培養皿(BD Bioscience，Bedford MA)含有釕絡合物，該絡合物在低氧情況下具有更好的螢光性。因此，如果培養皿中存在耗氧細胞，則螢光讀出信號增強，它使平衡偏向低氧飽和性和高螢光狀態。可以預計，通過抑制羥化穩定HIF的化合物可降低耗氧量，即羥化作用本身的耗氧量降低，且/或使細胞代謝從有氧供能轉向無氧供能。
培養腺病毒變性胎兒腎上皮細胞(293A)或子宮頸上皮腺癌細胞(HeLa)(美國模式菌種收集)，使它們在37℃和10％CO2條件下於介質(高葡萄糖DMEM(Mediatech，Inc.，Herndon VA)，1％青黴素/鏈黴素混合物(Mediatech)，1％幼牛血清)中匯合。收集細胞，並重新懸浮在介質中，密度為500000個細胞/毫升。將懸浮液分發到Oxygen Biosensor 96穴細胞培養皿(BD Bioscience)的每個穴中，每穴0.2ml。以10μl體積將下列處理時試劑加入三穴組中(1)0.5％DMSO；(2)200μM十二烷基硫酸鈉；或(3)1，10或50μM化合物(化合物B、G或化合物V的前體藥物[pV]之一)。
培養液在37℃10％CO2中培養72小時，然後通過FL600螢光儀(BiotekInstruments，Inc.，Winooski VT)在激發波長485nm和發射波長590nm讀取培養皿數據。利用所得數據繪製相對於DMSO參照物或在450nm(WST-1)波長處的吸收率的倍數函數關係(耗O2量)，並用EXCEL軟體(微軟公司，Bellevue WA)進行描述性統計分析。
圖3A所示為用所述化合物處理的細胞相對於參照物在耗氧量上的倍數變化。從圖中可以看出，所有的化合物都在某種程度上降低了耗氧量。此外，耗氧量的降低依賴於劑量(圖3A)，即使在最高劑量下，也很少或沒有檢測到細胞存活率的損失(圖1B)。在各種細胞培養實驗體系中進行的其他實驗(未示出)，包括加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷和全胺基酸，都證實耗氧量的下降與細胞毒性無關。
實施例3體外HIF調節基因的表達利用QUANTIKINE免疫測定裝置(RD)，根據商家說明書對從如實施例1製備的細胞培養液中收集的調理介質分析血管內皮生長因子(VEGF)。如圖4A所示，用本發明各種化合物(化合物A、B、C、H、K、L、Q和化合物V的前體藥物[pV]之一)處理的包皮纖維原細胞(HFF)、腺病毒變性胎兒腎上皮細胞(293A)和肝癌細胞(Hep3B)在VEGF的表達上都有所下降(圖4A)。Y軸上的值代表相對於參照物的誘導倍數的log2值，這樣數值1代表2倍誘導。
或者，在37℃和10％CO2環境下的DMEM、5％FBS、1％青黴素-鏈黴素中培養來自腺病毒變性胎兒腎上皮細胞(293A)的人體細胞。48小時後，收集細胞，匯集在35mm培養皿中，所用介質為常規介質，1天後將介質換成Opti-Mem I。18-24小時後，在介質中加入化合物B，再培養18小時。除去培養皿中的上清液，將培養皿放在冰上，加入細胞溶解緩衝液(LB)-1，刮出細胞。將刮出的細胞收集起來，在冰上培養15分鐘，然後在4℃下以3000xg離心5分鐘。收集代表細胞液的上清液，在變質和減壓條件下用SDS聚丙烯酸醯胺凝膠分離細胞液蛋白質，每條通道負載等量的蛋白質。
在150V電壓下進行2小時凝膠電泳，SDS-PAGE之後，在400mA電流和4℃溫度下，在1.5小時內將蛋白質轉移到PVDF膜上。然後在屏蔽緩衝液中培養膜，用T-TBS洗滌一次，加入在屏蔽緩衝液中稀釋到工作濃度的抗醛縮酮抗體，在4℃下輕輕攪拌過夜，培養斑點。然後用T-TBS洗滌膜4次，然後在室溫下培養1小時，其中屏蔽緩衝液含有標記次級抗體。然後用T-TBS洗滌膜4次。曝光X-射線膜，用ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO或PICO化學螢光基底(Pierce，Rockford IL)按照說明進行顯影，可以看到對原始抗體有專一性的抗原。
圖4B所示為所述化合物在不同時間對醛縮酶表達的增加情況，醛縮酶是醣酵解中涉及的酶。因此，本發明化合物對HIFα的穩定會附帶引起HIF調節基因表達的增加。
實施例4體內細胞中HIFα的穩定從Charles River Laboratories，Inc.(Wilmington MA)或Simonsen，Inc.(Gilroy，CA)等單位獲取瑞士韋伯斯特公鼠(30-32g)，通過餵入2ml/kg體積0.5％羧甲基纖維素(CMC；Sigma-Aldrich)(對照)或5.0％化合物(0.5％CMC)，至少餵一天，每天一次或多次。在最後一個劑量的一個或多個時間點上，例如2-5小時，用異氟烷對動物實施麻醉，抽取0.1ml血，例如從眼竇抽取，放入肝素化試管中。所有時間點都選好後，給動物施以亞致死量的CO2，從腹部靜脈抽血，放入肝素化試管中。所有的血樣品保存在-80℃下。
按照下述方法對從上述經本發明化合物處理過的動物身上分離出來的組織分析HIFα蛋白水平。用POLYTRON PT-1200均化器(Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury NY)在3ml 10mM Tris(pH 7.4)、1mM EDTA、150mM NaCl、0.5％IGEPAL(Sigma-Aldrich)中對所述組織均化15秒鐘。在4℃下對細胞溶解液以3000xg離心5分鐘，收集細胞液(上清液)。使細胞核(小球)再懸浮並溶解在100μl20mM HEPES(pH 7.2)、400mM NaCl、1mM EDTA、1mM二硫蘇糖醇和蛋白酶混合物(Roche Molecular Biochemicals)中，在4℃下對細胞溶解液以3000xg離心5分鐘，收集核蛋白(上清液)。
根據蛋白質濃度對細胞核部分進行歸一化，在減壓條件下負載到4-12％TG凝膠上。在500mA電流下，在1.5小時內將蛋白質轉移到PVDF膜上(Invitrogen LifeTechnologies)。在室溫下的T-TBS，2％牛奶中屏蔽膜1小時，用在T-TBS，2％牛奶中稀釋的抗HIFα抗體培養過夜。用SUPERSIGNAL WEST化學發光基底(Pierce，Rockford IL)培育斑點。
或者，利用QUANTIKINE免役測定裝置(RD Systems，Inc.，MinneapolisMN)，根據商家說明書分析如上製備的細胞核部分和包液部分的HIF-1α。
實施例5體內HIF調節基因的表達實驗I從Charles River Laboratories，Inc.(Wilmington MA)或Simonsen，Inc.(Gilroy，CA)等單位獲取24隻瑞士韋伯斯特公鼠(30-32g)，餵入4ml/kg體積0.5％羧甲基纖維素(CMC；Sigma-Aldrich)(0mg/kg/天)或1.25％化合物A(25mg/ml，在0.5％CMC中)(100mg/kg)。餵入最後一個劑量4、8、16、24、48或72小時後，用異氟烷對動物實施麻醉，從腹部靜脈抽取血樣。將血樣收集到MICROTAINER血清分離試管中(Becton-Dickinson，Franklin Lakes NJ)，在室溫下培養30分鐘，在4℃下以8000rpm的轉速離心10分鐘，將細胞板再懸浮在RNALATER溶液中(Ambion)，儲存在-80℃下。然後殺死這些大鼠，分離腎、肝、腦、肺和心臟中的組織樣本，並在-80℃下保存在RNALATER溶液(Ambion)中。
用下述方法進行RNA分離。從每個器官上切下一塊50mg的組織，加入875μlRLT緩衝液(RNEASY工具箱；Qiagen Inc.，Valencia CA)，用轉子-定子POLYTRON均化器(Kinematica，Inc.，Cincinnati OH)對每塊組織均化約20秒。將勻漿進行3分鐘微離心，使不溶物質成粒，將上清液轉移到新試管中，用RNEASY工具箱(Qiagen)按照說明書分離RNA。將RNA洗提到80μl水中，用RIBOGREEN試劑(MolecularProbes，Eugene OR)測定其量。用DNA-FREE工具箱(Ambion Inc.，Austin TX)按照說明書將基因組DNA從RNA中除去。在260和280nm處測定吸光率，從而確定RNA的純度和濃度。
或者，切下組織樣本後，在TRIZOL試劑(Invitrogen Life Technologies，CarlsbadCA)中用轉子-定子POLYTRON均化器(Kinematica)均化。將勻漿置於室溫下，加入0.2份體積的氯仿，劇烈攪拌樣本。室溫下培養混合物數分鐘，然後在4℃以12000g離心15分鐘。收集水相，加入0.5份體積的異丙醇。混合樣本，室溫下培養10分鐘，在4℃以12000g離心10分鐘。除去上清液，用75％EtOH洗滌細胞板，在4℃以7500g離心5分鐘。然後用DNA-FREE工具箱(Ambion Inc.，Austin TX)按照說明書將基因組DNA從RNA中除去。在260和280nm處測定吸光率，從而確定RNA的純度和濃度。
在-20℃下，在0.3M乙酸鈉(pH5.2)、50ng/ml肝糖和2.5份體積乙醇中沉澱RNA 1小時。離心樣本，用80％冷乙醇洗滌細胞板，乾燥，用水再懸浮。利用T7-(dT)24作為第一股引物(Affymetrix，Inc.，Santa Clara CA)，用SUPERSCRIPTCHOICE系統(Invitrogen)按照使用說明合成雙股cDNA。利用PHASE LOCK GEL插件(Brinkman，Inc.，WestburyNY)，用25∶24∶1苯酚∶氯仿∶異戊醇萃取最後的cDNA。收集水相，用0.5體積的7.5M乙酸銨和2.5體積的乙醇沉澱cDNA。或者，用GENECHIP樣品清潔模塊(Affymetrix)按照使用說明純化cDNA。
利用BIOARRAY High Yield RNA轉錄標記工具箱(Enzo Diagnostices，Inc.，Farmingdale NY)，按照使用說明在體外翻譯(IVT)反應中由cDNA合成標記了生物素的cRNA。用GENECHIP樣品清潔模塊(Affymetrix)按照使用說明對最終標記產品進行純化和分片。
將5μg探測試樣加入100μl 1x雜化緩衝液(100mM MES，1M[Na+]，20mMEDTA，0.01％Tween 20)、100μg/ml青魚精子DNA、500μg/ml乙酸酯化BSA、0.03nM對照低B2(Affymetrix)和1x GENECHIP真核雜化對照(Affymetrix)，由此製備雜化「雞尾酒」。所述雞尾酒依次在99℃培養5分鐘和在45℃培養5分鐘，然後離心5分鐘。將Murine基因組U74AV2陣列(MG-U74AV2；Affymetrix)置於室溫下，然後加入1x雜化緩衝液，在45℃旋轉10分鐘，進行預雜化。然後用80μl雜化雞尾酒取代緩衝液，在45℃下以60rpm的轉速反向旋轉，將該陣列雜化16小時。雜化之後，用6x SSPE，0.1％Tween 20對陣列洗滌一次，然後用R-藻紅蛋白-共軛鏈黴胍(分子探針，Eugene OR)、山羊抗鏈黴胍抗體(Vector Laboratories，Burlingame CA)和GENECHIP Fluidices Station 400儀器(Affymetrix)，按照商家的微-1v1協議(Affymetrix)進行洗滌和沾汙。用GENEARRY掃描儀(Affymetrix)和Microarray Suite軟體(Affymetrix)分析陣列。
Murine Genome U74AV2陣列(Affymetrix)代表Mouse UniGene資料庫74(國家生物技術信息中心，Bethesda MD)中所有序列(～6000)(它們在功能上都已得到表徵)和約6000個未標註表達序列標籤(EST)簇。
從圖5A可以看出，以肺為代表器官，用本發明化合物處理之後，給血管生長蛋白質編碼的基因表達以同等方式增加。圖中所示轉錄方式包括VEGF-C、Flt-1/VEGF受體-1、腎臟髓質素、內皮質素-1、血漿酶原活化抑制劑(PAI)-1和Cyr61。隨著時間的變化，mRNA離開峰較早，24小時後恢復到對照水平。圖5B所示為兩個基因的具體表達-時間關係，這兩個基因是內皮質素-1和腎臟髓質素，代表圖5A中的基因簇。在類似實驗中，其他HIF調節基因的表達也能看到明顯增加，這些基因包括磷酸果糖激酶、烯醇酶1、乳酸脫氫酶、葡萄糖轉運子1、醯基CoA硫代酯酶、亞鐵血紅素氧化酶、鐵傳遞蛋白受體、IGFBP-1、nip3、nix和cyclin G3。
從圖7A中可以看出，以腎為代表器官，用本發明化合物處理之後，給糖酵解酶編碼的基因表達以同等方式增加。圖中所示轉錄方式包括醛縮酶A、烯醇酶1、葡萄糖轉運子(GluT)-1和-3、GAPDH、己糖激酶-1和-2、乳酸脫氫酶A、磷酸果糖激酶-L和-C、磷酸甘油酸酯激酶-1和丙酮酸酯激酶-M。隨著時間的變化，mRNA離開峰較早，24小時後恢復到對照水平。圖7B所示為兩個基因的具體具體表達-時間關係，這兩個基因是醛縮酶和磷酸果糖激酶，代表圖7A中的基因簇。
實驗II從Simonsen，Inc.獲取12隻瑞士韋伯斯特公鼠(30-32g)，餵入4ml/kg體積0.5％羧甲基纖維素(CMC；Sigma-Aldrich)(0mg/kg/天)或2.5％化合物B或E(25mg/ml，在0.5％CMC中)(200mg/kg)，每天2次，共餵2.5天(5個劑量)。餵入最後一個劑量4後，用異氟烷對動物實施麻醉，從腹部靜脈抽取血樣。將血樣收集到MICROTAINER血清分離試管中(Becton-Dickinson)，在室溫下培養30分鐘，在4℃下以8000rpm的轉速離心10分鐘，利用QUANTIKINE免役測定裝置(RDSystems)，根據商家說明書處理並分析血清部分的血管內皮生長因子(VEGF)的表達。然後殺死這些大鼠，分離約150mg肝和腎，並在-20℃下保存在RNALATER溶液(Ambion)中。
用下述方法進行RNA分離。將組織切片切成小塊，加入1.75ml RLT緩衝液(RNEASY工具箱；Qiagen)，用轉子-定子POLYTRON均化器(Kinematica，Inc.，Cincinnati OH)對每塊組織均化約20秒。對350μl勻漿進行3分鐘微離心，使不溶物質成粒，將上清液轉移到新試管中，用RNEASY工具箱(Qiagen)按照說明書分離RNA。將RNA洗提到80μl水中，用RIBOGREEN試劑(Molecular Probes，EugeneOR)測定其量。用DNA-FREE工具箱(Ambion)按照說明書將基因組DNA從RNA中除去。在260和280nm處測定吸光率，從而確定RNA的純度和濃度。
用1μM無規六聚引物、1μg全RNA和OMNISCRIPT逆向轉錄酶(Qiagen)按照說明書合成cDNA。所得cDNA用四倍的水稀釋，使最終體積為100μl。用FASTSTART DNA MASTER SYBR GREENI工具箱(Roche Molecular Biochemicals)和VEGF特異性引物，利用LIGHTCYCLE系統(Roche Molecular Biochemicals)按照使用說明通過定量PCR分析血管內皮生長因子(VEGF)基因表達的相對水平。在6分鐘內將樣本加熱到94，然後在15秒內轉到95，在5秒內轉到60，在10秒內轉到72，總共循環42次。VEGF特異性引物如下m-VEGF-F1 GTTGCAAGGCGAGGCAGCTT(SEQ ID NO1)m-VEGF-R1 TGACGATGATGGCATGGTGGT (SEQ ID NO2)測定18S核醣體RNA基因表達的相對水平，作為對照。利用QUANTITECTSYBR GREEN PCR工具箱(Qiagen)和18S rRNA特異性引物，用LIGHTCYCLER系統(Roche Molecular Biochemicals)按照使用說明定量測定PCR。在6分鐘內將樣本加熱到94，然後在15秒內轉到95，在5秒內轉到60，在10秒內轉到72，總共循環42次。核醣體RNA特異性引物如下18S-大鼠-2BTAGGCACGGCGACTACCATCGA(SEQ ID NO3)18S-大鼠-2ACGGCGGCTTTGGTGACTCTAGAT (SEQ ID NO4)每一輪PCR都包括一個標準曲線和水空白。此外，每輪PCR完成之後，測定熔融曲線，以評價擴大的專一性。VEGF基因表達根據該樣本的18S核糖體RNA的表達水平校正。
圖6A所示為用化合物E增強的腎中VEGF表達和肝與腎中化合物B增強的VEGF表達。從圖6B中可以看出，相對於未經處理的對照動物，施用最後一個劑量之後的2、5和20小時，用所述化合物處理的動物血漿中VEGF水平明顯增加。
實施例6心臟局部缺血實驗INwogu等(2001；Circulation 1042216-2221)曾報導用本發明化合物治療心肌梗塞。雖然作者從所述化合物影響纖維症的角度解釋了他們的結果，但本發明清楚顯示，對心臟功能帶來主要好處的是HIFα的穩定。實驗方法如Nwogu等所述(同上)，下面也將具體介紹。
對70隻成年Wistar雄鼠(200-250g)實施麻醉，使它們的左冠狀動脈閉合，從而產生急性心肌梗塞(AMI)。對9隻動物進行相同的手術，但不綑紮冠狀動脈。術後24-48小時，將心電圖儀(ECG)的電極接到爪子上，使15MHz直線探針(AcusonCorp.，Mountain View CA)接觸胸部，在中部乳突附近獲得短軸胸腔心回聲圖像(2DE)。將探針向頭部或尾部移動，並改變角度，直到能清晰地檢測到左心室的心內圖像。圖像用Sequoia超聲系統(Acuson)獲得。2DE上分級縮短小於20％和局部壁動異常的動物用化合物A(n＝14)或媒介(n＝12)隨機處理。對照假樣本也用化合物A(n＝4)或媒介(n＝5)隨機處理。
在實驗期間，每天給動物單獨餵2次化合物A(50mg/kg)或媒介。周期測定藥物的血清水平，以確定在療動物持續接受了足夠量的藥物，測定出來的水平足以抑制脯氨醯4-羥基酶，代表是2-酮戊二酸雙加氧酶。
每周收集系列2DE圖像。捕捉並保存三個短軸2DE數字夾，該數字夾包含5個或更多心臟收縮和舒張圖像。兩個不熟悉治療方法的觀察者進行離線測定。測量時，放慢數字圖像，並在收縮和舒張端部定格。測定三個數字夾中每個數字夾的兩張收縮和舒張圖像，直到獲得一致結果，然後求平均。收縮前壁(AWS)和舒張前壁(AWD)、收縮後壁(PWS)和舒張後壁(PWD)，以及左心室收縮端(LVESD)和舒張端(LVEDD)根據美國心回聲學學會(ASE)的引邊方法測定。為了保持連貫，測定在左心室從前中點到後中點之間進行，隨機重複，以確保可重複性(複製率約為96％)。
治療4周之後，通過股靜脈灌注(1分鐘內0.2m1)107M異丙腎上腺素之前和之後，在體內進行血液動力測定。接著如下所述鍛鍊並稱量心臟。
或者，對140隻成年Wistar雄鼠(200-250g)實施麻醉，使它們的左冠狀動脈閉合，從而產生急性心肌梗塞(AMI)。術後48小時得到2DE圖像，有顯著梗塞區域的動物隨機用化合物A(n＝34)或媒介(n＝34)。
在實驗期間，每天給動物單獨餵2次化合物A(50mg/kg)或媒介。周期測定藥物的血清水平，以確定在療動物持續接受了足夠量的藥物，測定出來的水平足以抑制脯氨醯4-羥基酶。
對每組中的一半動物測定中部乳突肌肉和頂部四室的2DE數字圖像，隔周一次，測滿8周。由兩個不熟悉治療方法的觀察者進行離線測定。測量時，放慢數字圖像，並在收縮和舒張端部定格。在短軸和四個心室方向跟蹤兩三個心臟內部表面，求平均值。測定左心室收縮和舒張時的面積、噴血分數比例、各部分面積的變化、壁厚、二尖瓣峰E波速、大動脈峰速和栓塞尺寸。
治療10周後，在體內進行血液動力測試，心臟如下所述進行鍛鍊和稱重。
為了收集體內血液動力測試數據，對動物實施麻醉，從周圍組織上切下右頸動脈，用SPR-671超微壓力變換器(Millar Instruments，Inc.，Houston TX)做成中空的結構。然後將導液管插入左心室。建立平衡態後，記錄基準心跳速率(HR)、產生的壓力(DP)、收縮指數(CI)、左心室收縮壓(SBP)、末期舒張壓(LVEDP)和壓力升降(分別是+dP/dt和-dP/dt)的最大速率。
在血液動力測定中，鍛鍊並稱量心臟。將遠離栓塞部位的結痂心肌、右心室和左心室肌肉切出小片，稱重。用Palmerini等(1985，J Chromatogr 339285-92)的方法測定羥化脯氨酸和脯氨酸，不同的是用L-吖丁啶-2-羧酸(Sigma-Aldrich)代替3，4-脫氫脯氨酸作為內標。
如果將本發明化合物施用在心肌梗塞患者身上，則可以看到死亡率立即下降。從圖8可以看出，心臟受傷後經過治療的組中沒有馬上看到病例死亡，而且8周之後治療組仍有超過90％的的病例存活。形成對照的是，未治療組中只有約60％的病例在此期間存活。從統計上看，與未經治療的組相比，治療組在2-8周之內的存活率明顯提高(P＜0.05)，死亡率相對下降77％。
與未治療組相比，治療組的心臟參數也得到改善。表1表明，治療組的左心室舒張末期的直徑(LVEDD)沒有增加，而未治療組同期測定的LVEDD和左心室收縮末期的直徑(LVESD)增加。治療1周之後，治療組和未治療組的心臟擴大統計結果明顯不同。
表1左心室舒張末期的直徑的變化

表中數值表示平均值±標準偏差。
表2左心室收縮末期的直徑的變化

表中數值表示平均值±標準偏差。
圖9A和9B所示為LVESD和LVEDD各自隨時間變化的圖線。三組中左心室舒張末期的和收縮直徑在任意時刻都相近。在圖10A中，在第2周到第8周，經過治療的動物與未經治療對照組相比，左心室噴血分數(LVEF)在統計結果上明顯提高。在任意時刻，兩個組的LVEF均為33％。在第4周到第6周，未治療對照組的LVEF明顯提高，這反映出該組成員的死亡率高。
治療組在心肌收縮過程中的部分縮短也得到改善。表3從統計上表明，在1-4周之內，治療組與未治療組相比，部分縮短明顯改善。
表3部分縮短的變化

表中數值表示平均值±標準偏差。
此外，從圖10B中可以看出，治療組的部分縮短從起點的10％增加到第2周時的20％，相對於起點增加了79％。未治療組和偽處理對照組在4周時間裡保持不變。
因心臟缺血引起損傷後，治療組的心臟收縮和舒張能力也提高。表4A從統計上顯示，治療4周之後，治療組與未治療組相比，壓力隨時間的負變化(-dP/dt)有明顯差異，其中-dP/dt衡量的是心臟收縮之後的舒張能力。如表4A和圖11所示，治療組與未治療組相比，受異丙腎上腺素刺激後，心臟的壓力隨時間的正變化(+dP/dt)在統計上存在明顯差異，其中+dP/dt衡量的是心臟收縮的能力。
表4A患MI四周後血液動力學數據

表中數值表示平均值±標準偏差。
表4B從統計上表明，治療10周後，治療組與未治療組相比，+dP/dt和-dP/dt都存在明顯差異。
表4B患MI四周後血液動力學數據

表中數值表示平均值±標準偏差。
治療組與未治療組相比，在第10周的改進壓力和收縮壓力也有明顯改善。
雖然人們認識到從初始梗塞或創傷恢復要在壞死區沉積結締組織，但就形成疤痕而言，本發明在治療上沒有表現出負面影響。相反，從表5A中統計結果可以看出，4周後疤痕和無梗死組織中的膠原質沉積沒有明顯改變，這表明頭四周裡心臟功能的改善與膠原質的沉積無關。
圖5A患MI四周後心臟中的膠原質含量

表中數值表示平均值±標準偏差。
但是，從表5B中可以看出，治療組與未治療組在10周之後相比，無梗塞心肌和疤痕組織中郊原質含量在統計上有明顯的絕對下降，這表明本發明方法的確能在更長的時間裡減少活性心肌的纖維化。
圖5B患MI 10周後心臟中的膠原質含量

表中數值表示平均值±標準偏差。
實驗II對4-5周大的Wistar雄鼠(100-110g)進行常規餵養，將其置於12小時晝-夜周期中。如下將這些動物隨機分成三個治療組(1)假手術動物(n＝12)，(2)心肌梗塞對照組(n＝25)和(3)用化合物B治療心肌梗塞的組(n＝25)。在進行手術之前，對動物治療兩天，手術後繼續治療一周。治療過程中，每天給動物餵服2次0.5％CMC(Sigma-Aldrich)(對照)或50mg/kg溶於0.5％CMC中的化合物B。動物切開喉管後，在人工供氧下對左前下行冠狀動脈進行綑紮。術後1周殺死動物，做心臟回聲測試。客觀地測定部分縮短、舒張末期的直徑和收縮末期的直徑。
從圖12A可以看出，部分縮短從假手術動物的51％下降到未治療MI參照組的29％。用化合物治療後的統計結果顯示，與未治療對照組相比，部分縮短有明顯提高(p＜0.05；單向ANOVA/Turey實驗)，達到41％。類似地，圖12B從統計上顯示，經過治療的動物與未治療MI的對照組相比，左心室舒張末期的(LVEDD)和收縮末期的(LVESD)直徑有明顯改善(p分別小於0.005和0.001；單向ANOVA/Turey實驗)。與做過假手術的動物相比，用化合物治療的動物在左心室收縮末期的直徑沒有增加，而舒張末期的直徑增加18％。但是，未經治療的對照組的LVESD和LVEDD分別增加15％和65％。
實施例7肝局部缺血Bickel等(1998；Hepatology 28404-411)曾報導用本發明化合物治療肝中毒性缺血損傷。儘管作者從化合物對纖維化的效果這個角度解釋了他們的結果，但他們承認，對肝功能指標，包括膽紅素的血清水平、膽酸和鹼性磷酸酶的良好效果不能直接歸因於纖維化的減少。
Bickel等(同上)描述了中毒性低氧肝損傷的模型。簡單說，Wistar雄鼠(212-320g)要麼通過餵服接受1ml/kg溶於橄欖油的四氯化碳(CCl4)(1∶1)，每周兩次，總共9周(n＝140)，要麼不接受治療(對照；n＝10)。此外，一組接受CCl4(n＝60)的動物同時接受化合物P。所述化合物通過腹膜注射施用，每天2次，劑量為60mg化合物/2ml鹽水/kg體重。9周後，殺死動物，稱肝的重量。用商用工具箱測定血清中的膽紅素、丙氨酸轉氨酶、鹼性磷酸酶、清蛋白和總膽酸。
從表6可以看出(Bickel等，同上，表2)，肝受損後體重(BW)明顯下降，但肝本身重量沒有明顯變化(未示出)。
表6治療9周後肝功能的血清參數

表中數值表示平均值±標準偏差。
從統計上看，肝損傷也對使肝功能明顯下降，這從以下指標的測定可以看出來膽紅素中的血清水平(BR)、總膽酸(tBA)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和鹼性磷酸酶(AP)，分別增加117％、856％、201％和72％。但是，用本發明化合物(CPD)治療從統計上看可明顯改善肝功能。治療組與未治療組相比，血清水平BR、tBA、ALT和AP分別下降64％、65％、43％和65％。肝功能的改善可歸因於本發明方法對HIFα的穩定作用。
實施例8腎缺血再灌注損傷
Nemoto等描述了缺血性急性腎衰竭的模型(2001，Kidney Int 59246-251)。簡單說來，通過餵服0.5％羧甲基纖維素(CMC；Sigma-Aldrich)或1.5％懸浮在CMC中的化合物B對Sprague-Dawley雄鼠(200-250g)進行治療，劑量為4ml/kg/d。先對大鼠進行4天連續預治療(第-3天至第0天)。在第0天進行第4次，也就是最後一個劑量的餵服後數小時，進行腎缺血再灌注損傷(IRI)實驗。
將動物分成四組(1)用媒介預處理並進行模擬手術；(2)用化合物B預治療並進行模擬手術；(3)用媒介預處理並進行IRI手術；(4)用化合物B預治療並進行IRI手術。用異氟烷對動物實施麻醉，在腹部中線切一道口子，直接切割腎蒂。用血管夾將右腎蒂夾住45分鐘，同時切除左腎。每次閉合後，將夾子鬆開45分鐘，通過腎顏色的變化可以看出再灌注。溫度維持恆定，含有Buprenex止痛劑的溫鹽水(0.5％體重)直接灌入腹部，然後縫合切口。
監測動物體重和死亡率。從尾部靜脈抽取血樣，血清化學組成和CBC送IDEXX獸醫服務處(West Sacramento CA)測定。數據記錄為平均值±SE，括號內數字為動物數。用單向偏差分析(ANOVA，SIGMASTAT)和Student-Newman-Keuls方法比較四組樣本在每個時間點上的數據。P＜0.05表示相差顯著。
如圖13所示，用化合物處理可預防缺血再灌注損傷引起的早期死亡。此外，在第3天和第7天，腎IRI顯著提高了血清脲氮(BUN)，而用化合物治療則使IRI引起的BUN增加程度明顯下降，其中BUN是腎功能好壞的一個量度(圖14A)。此外，在第3、7和14天，腎IRI能顯著提高血清膽固醇，而用化合物治療則完全制止了IRI引起的血清膽固醇的增加(圖14B)。儘管原因尚在探索之中，腎膽固醇上升是腎缺血再灌注損傷的自然反映。(Zager等(2001)Am J Pathol 159743-752；Appel(1991)Kidney Int 39169-183；Abdel-Gayoum等(1999)Hum Exp Toxicol18454-459)實施例9對慢性創傷中肉芽組織形成的促進治療慢性創傷的能力採用Morris等(1997，Plast Reconstr Surg 100674-681)和Marcus等(2000，Plast Reconstr Surg 1051591-1599)介紹的兔子皮質增生結疤模型研究。簡單說來，對雌性紐西蘭白兔(n＝12；3-6個月大)實施麻醉，通過除去軟骨膜，在每隻耳朵的腹側表面造成4個7mm長的皮膚潰瘍創傷。治療創傷，並用TEGADERM半封閉聚氨酯紗布(3M Health Care，St.Paul MN)包紮。第1周，局部塗敷0.5％或1％(w/v)混合在0.5％(w/v)CARBOPOL 971 PNF水溶膠(pH6.5；NoveonInc.，Cleveland OH)中的化合物V前體藥物[pV]，以治療創傷，每天一次。進行體外測試時，發現凝膠在2小時內釋放50％的藥物，在4小時內釋放95％的藥物。在治療的耳朵要麼接受低劑量治理(0.5％化合物)，要麼接受高劑量治療(1％化合物)，而對照耳朵只接受凝膠。在受傷時包紮的紗布上開一個洞，治療用的藥物從洞中送入，避免每天揭紗布引起傷口周圍區域感染。然後在洞上蓋一小塊紗布，防止傷口乾燥。太幹或受感染的傷口要排除在研究之外。
受傷7天和12天後，打開並切開傷口，用蘇木精薯紅沾染，以測定肉芽組織的形成和傷口長皮的情況。不熟悉治療方法的觀察者藉助帶刻度的目鏡十字線收集創傷治療定量參數。用Student的t-實驗分析數據，比較治療和未治療樣本。P＜0.05表示相差顯著。
對創傷測定了肉芽組織的形成和傷口長皮的情況；測定了對缺血和低氧敏感的創傷治療參數(Corral等(1999)Arch Surg 134200-205；Ahn和Mustoe(1990)AnnPlast Surg 2417-23)。如圖15A所示，經過治療的創傷與未經治療的創傷相比，可以觀察到肉芽組織區域的增加。從圖15B中可以看出，經過治療與未經過治療的動物中，峰-峰距離沒有區別。峰-峰值是肉芽組織覆蓋傷口的指標。因此，可用本發明方法增加傷口中血管和肉芽組織的形成，如慢性創傷和潰瘍。
實施例10篩選實驗能抑制HIF專一性脯氨醯羥化酶活性，從而穩定HIFα的化合物可利用下述實驗方法鑑定和表徵。從包含4mg/ml BSA、0.1M Tris HCl(pH7.2)、2mM抗壞血酸鹽、80μM硫酸亞鐵、0.2mM 2-酮戊二酸、600單位/ml過氧化氫酶以及任選100μMHIFα肽的反應混合物中取出50μl等分液，與50μl HeLa細胞萃取物或純化HIF脯氨醯羥化酶混合，在37℃培養1.5小時。然後加入50μl鏈黴胍珠，在4℃和攪拌下培養所得混合物1小時。將混合物轉移到試管中，低速離心，使珠子形成小球。用0.5-1ml 20mM Tris HCl(pH 7.2)洗滌珠子3次。用5μl溶於20mM Tris HCl(pH7.2)中的2mM生物素將肽從珠子中洗提出來。離心試管，使樹脂形成小球，除去40-50μl上清液，加入等量乙醯腈。或者，使肽附著到甲氧基香豆素上，它是對pH不敏感的螢光團。所述螢光團可提供靈敏度和專一性，從而促進對粗細胞液的檢測。用於篩選實驗的示例性HIF肽可包含[甲氧基香豆素]-DLDLEALAPYIPADDDFQL-醯胺(SEQ ID NO5)。然後用反相HPLC通過C18色譜柱分離非羥基化和羥基化肽，並用214nmUV檢測。
本領域技術人員從前面的介紹中不難理解，除了這裡所描述的實施方式外，可以對本發明作各種修改。這些修改包含在本發明附屬權利要求範圍之內。
這裡引用的所有文獻都以其整體內容作為參考。
序列表110V.古恩澤勒-普卡爾(Guenzler-Pukall，Volkmar)T.B.尼夫(Neff，Thomas B.)Q.王(Wang，Qingjian)M.阿蘭德(Arend，Michael)L.A.弗利平(Flippin，Lee A.)A.梅萊克霍夫(Melekhov，Alexey)120低氧誘導因子(HIF)α的穩定化130FP0600 PCT140PCT/US02/388671412002-12-06150US 60/337,0821512001-12-06150US 60/359,6831512002-02-25150US 60/349,6591512002-01-16150US 60/386,4881512002-06-051605170PatentIn version 3.2210121120212DNA213小鼠(Mus musculus)4001gttgcaaggc gaggcagctt20210221121212DNA
213小鼠(Mus musculus)4002tgacgatgat ggcatggtgg t21210321122212DNA213大鼠(Rattus norvegicus)4003taggcacggc gactaccatc ga 22210421123212DNA213大鼠(Rattus norvegicus)4004cggcggcttt ggtgactcta gat 23210521119212PRT213人工的220
223合成肽4005Asp Leu Asp Leu Glu Ala Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Ala Asp Asp Asp1 5 10 15Phe Gln Leu
權利要求
1.一種穩定治療對象的低氧誘導因子的α亞基(HIFα)的方法，該方法包括施用一種能抑制HIFα發生羥基化反應的化合物。
2.一種穩定治療對象的低氧誘導因子的α亞基(HIFα)的方法，該方法包括施用一種能抑制2-酮戊二酸雙加氧酶活性的化合物。
3.一種穩定治療對象的低氧誘導因子的α亞基(HIFα)的方法，該方法包括給治療對象施用一種能抑制HIF脯氨醯羥化酶活性的化合物。
4.權利要求1所述方法，其特徵在於HIFα選自HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α和它們的任何片段。
5.權利要求1所述方法，其特徵在於HIFα內生於治療對象上。
6.權利要求2所述方法，其特徵在於所述2-酮戊二酸雙加氧酶選自EGLN1、EGLN2、EGLN3、原膠原脯氨醯4-羥基酶、原膠原脯氨醯3-羥基酶、原膠原賴氨醯羥基酶、PHD4、FIH-1，它們的任何片段或亞基。
7.權利要求3所述方法，其特徵在於所述HIF脯氨醯羥化酶選自EGLN1、EGLN2、EGLN3和它們的任何片段或亞基。
8.權利要求1所述方法，其特徵在於給藥發生在活體內。
9.權利要求8所述方法，其特徵在於所述治療對象是動物。
10.權利要求8所述方法，其特徵在於所述治療對象是哺乳動物。
11.權利要求8所述方法，其特徵在於所述治療對象是人。
12.權利要求1所述方法，其特徵在於給藥發生在活體外。
13.權利要求12所述方法，其特徵在於所述治療對象選自細胞、組織和器官。
14.權利要求13所述方法，其特徵在於所述細胞、組織或器官來自腎臟、心臟、肝臟、肺、造血系統、腸胃、神經系統或骨骼肌肉系統。
15.一種治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法，該方法包括穩定HIFα。
16.權利要求15所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與低氧有關。
17.權利要求15所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與局部缺血有關。
18.一種治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法，該方法包括抑制2-酮戊二酸雙加氧酶的活性。
19.權利要求18所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與低氧有關。
20.權利要求18所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與局部缺血有關。
21.一種治療、預防或預治療與HIF有關的疾病的方法，該方法包括抑制HIF脯氨醯羥化酶的活性。
22.權利要求21所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與低氧有關。
23.權利要求21所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與局部缺血有關。
24.權利要求15所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病是肺部疾病。
25.權利要求15所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病是心臟病。
26.權利要求15所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病是神經疾病。
27.權利要求15所述方法，其特徵在於所述與HIF有關的疾病與局部缺血事件有關。
28.權利要求27所述方法，其特徵在於所述局部缺血事件是急性的。
29.權利要求28所述方法，其特徵在於所述局部缺血事件與手術、器官移植、梗塞、創傷或損傷有關。
30.權利要求27所述方法，其特徵在於所述局部缺血事件是慢性的。
31.權利要求30所述方法，其特徵在於所述局部缺血事件和選自高血壓、糖尿病、閉合動脈疾病、慢性靜脈功能不足、肢端動脈痙攣症、硬化、充血性心力衰竭和系統硬化症的病症有關。
32.權利要求15所述方法，其特徵在於所述方法包括給治療對象施用能穩定HIFα的化合物。
33.權利要求18所述方法，其特徵在於所述方法包括給治療對象施用能抑制2-酮戊二酸雙加氧酶活性的化合物。
34.權利要求21所述方法，其特徵在於所述方法包括給治療對象施用能抑制HIF脯氨醯羥化酶活性的化合物。
35.權利要求15所述方法，其特徵在於所述方法還包括給治療對象施用第二種化合物。
36.權利要求35所述方法，其特徵在於所述第二種化合物能抑制2-酮戊二酸雙加氧酶活性。
37.權利要求35所述方法，其特徵在於所述化合物能抑制第一種2-酮戊二酸雙加氧酶的活性，而第二種化合物能抑制第二種2-酮戊二酸雙加氧酶活性。
38.權利要求35所述方法，其特徵在於所述第二種化合物選自ACE抑制劑(ACEI)、血管緊縮素II受體阻斷劑(ARB)、利尿劑、地高辛、抑胃酶氨酸或肉鹼。
39.權利要求32所述方法，其特徵在於所述化合物能通過專門抑制HIFα中至少一種胺基酸殘基發生羥基化反應來穩定HIFα。
40.權利要求39所述方法，其特徵在於所述胺基酸殘基選自脯氨酸和天冬醯胺。
41.一種增加患者血管生成因子的表達的方法，該方法包括穩定HIFα。
42.一種增加患者糖酵解因子的表達的方法，該方法包括穩定HIFα。
43.一種增加患者與氧化應激反應有關的因子的表達的方法，該方法包括穩定HIFα。
44.一種治療患者與缺血再灌注損傷有關的疾病，該方法包括穩定HIFα。
45.權利要求1所述方法，其特徵在於所述化合物選自雜環羧醯胺、菲咯啉、異羥肟酸和生理活性鹽以及由它們製成的前體藥物。
46.權利要求45所述方法，其特徵在於所述雜環羧醯胺選自吡啶羧醯胺、喹啉羧醯胺、異喹啉羧醯胺、肉啉羧醯胺和β咔啉羧醯胺。
47.權利要求1所述方法，其特徵在於所述化合物以口服劑的形式提供。
48.權利要求1所述方法，其特徵在於所述化合物以皮透藥劑的方式提供。
49.鑑定能穩定HIFα的化合物的方法，所述方法包括(a)給治療對象或來自治療對象的樣本施用目標化合物；(b)測定治療對象或樣本中的HIFα水平；(c)將治療對象或樣本中的HIFα水平與標準水平比較；其中，治療對象或樣本中HIFα水平的提高表明該化合物能穩定HIFα。
全文摘要
本發明涉及低氧誘導因子(HIF)的α亞基的穩定化方法。本發明還涉及預防、預治療或治療與HIF有關的疾病的方法，包括缺血性和低氧性疾病。還提供了用於這些方法的化合物。
文檔編號A61P17/02GK1599618SQ02824098
公開日2005年3月23日 申請日期2002年12月6日 優先權日2001年12月6日
發明者V·古恩澤勒-普卡爾, T·B·尼夫, Q·王, M·P·阿蘭德, L·A·弗利平 申請人:法布羅根股份有限公司