一種預測前列腺癌易感性的試劑盒和方法
2023-12-09 08:52:01 1
專利名稱：一種預測前列腺癌易感性的試劑盒和方法
技術領域：
本發明涉及一種預測前列腺癌易感性的試劑盒和方法，更具體的說是通過測定與前列腺癌相關基因GPRC6A的內含子上rsl606365位點多態性預測受試者對於前列腺癌的易感性，該方法可用於疾病的輔助診斷和新藥開發，屬於生物技術領域。
背景技術：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是發生在男性生殖系統中最常見的惡性腫瘤。美國在對1975-2006癌症發病率進行統計後，估算2010年PCa新發病例為217，730例，位居男性好發腫瘤中第一位，PCa的死亡人數估計為32，050，在男性腫瘤死亡率中位居第二。年齡是PCa的一個重要風險因素，年齡45歲以下的基本很少發病，隨年齡的增長而增加。美國癌症協會統計，40歲以下的男性PCa發病率為1/8499,40-59歲男性中為1/38，60_69歲男性中為1/15，70歲以上男性中則為1/8。隨著我們國家人口老齡化，PCa的發病率在我國正逐年上升，上海標化發病率從1973 1975年的1. 8/10萬上升至1997 1999年的
5.5/10萬，貴州省南部地區部分縣市PCa的發病率已從1994 1998年的1. 72/10萬上升到2004 2008年的4. 28/10萬，成為威脅我國男性健康的公共問題。目前進行PCa遺傳病因研究，多採用大規模全基因組關聯研究和小樣本多人群中的驗證，並且GWAS鑑定的多個PCa易感SNPs已在多個不同人群中被複製確定，證明了 SNPs作為基因組標誌的關聯分析方 法在PCa遺傳研究中的有效性。SNPs是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的頻率需>1%，SNPs是雙等位基因標記，這種單鹼基變化中有70. 1%為同型鹼基之間的轉換如G/A或T/C，29. 1%為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。SNPs包含了已知多態性的80-90%，是最常見的遺傳變異。由於生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總數可達3百萬個。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I個)、代表性強(位於基因內部的SNPs可能直接影響蛋白質結構或表達水平)、遺傳穩定性好(同微衛星多態性比較而言)、易於自動化分析(因SNPs在人群中為雙等位基因標記，可簡單以「+ / 一或1/0」直接分型)等特點成為很好的遺傳標誌。GPRC6A (G 蛋白偶聯受體 C 家族 6 組 A 亞型)(G protein-coupledreceptor, familyC, group6, memberA, GPRC6A)基因是 Wellendorph P 等在 2004 年發現提出的，編碼G蛋白偶聯受體C家族6組A成員，G蛋白偶聯受體(G protein-coupledreceptors, GPCRs)是一類有7次跨膜區域，是人類基因組上由約近千個基因編碼的大的受體家族，在許多生理病理進程包括發育、造血、血管生成、炎症、精神障礙、代謝疾病及病毒感染等中起重要作用。研究表明許多GPCRs和他們的配體參與腫瘤發生發展，如內皮縮血管肽類通過與GPCRs相互作用介導組織分化、發育和細胞增殖，通過增強細胞增殖抑制凋亡和調節基質成分在PCa和其他腫瘤中起重要作用。許多趨化因子受體如CXCR4、CXCR2、CCR7等在許多腫瘤表達上調，在腫瘤生長、侵襲和轉移中起重要作用。許多被稱為內皮分化基因家族的GPCRs是溶血磷脂酸或鞘氨醇-1-磷酸鹽的受體，調節細胞的增殖、遷移和生存。如肺腺癌或肺腺癌3期時許多化學因子受體、神經肽受體、激素受體等PAR2(GPR11)、Edg2 (GPR2)等GPCRs表達上調；乳腺癌或乳腺癌3期時PAR2和CXCR-4表達增加；PCa時CXCR-3、GPR68等在PCa組織表達高於正常前列腺組織，其他腫瘤胃癌、轉移黑色素瘤等的發展中也有多種GPCRs參與。據估計，市場上接近30%的藥物靶標是GPCRs或者與其相關的信號通路，其研發依據部分為許多疾病與GPCRs的變異和多態性關聯，因此研究GPCRs與腫瘤包括GPCRs的多態性與腫瘤的關聯可以為以幹擾GPCRs或其介導的信號通路為基礎的藥物研發提供理論依據。GPRC6A基因的功能已有研究，GPRC6A廣泛表達在腦和外周組織，在睪丸、腎臟、骨骼肌中高表達。GPRC6A敲除的小鼠表現為代謝症候群成骨細胞缺陷介導的骨鈣化，腎臟處理鈣磷異常，脂肪肝，糖耐受和類固醇合成紊亂等性狀。最近的體內體外GPRC6A功能研究也表明其是一個調節PCa生長和腫瘤發展相關的靶分子。再者，GPRC6A是骨-胰腺分泌環中調節骨鈣素應答的基因，骨-胰腺分泌環調節胰島素信號通路，而胰島素受體和胰島素樣生長因子也在許多研究中被證明與PCa相關。從GPRC6A可以調節激素和影響胰島素信號通路這兩方面支持基因上位點的變異可能會影響PCa的易感性。2010年，Takata R等鑑定了位於RFX6基因上的rs339331和PCa風險關聯，此後，此位點在歐洲人群和中國人群中複製驗證。結合以上對GPRC6A功能的分析，我們推測GPRC6A基因為PCa易感基因並且選擇了位於其第一內含子的rsl606365，在273個PCa患者和606個對照人群中分型後進行關聯分析,結果確定了 rsl606365與中國人群PCa關聯。rsl606365在染色體上位置為117，238，735，位於GPRC6A的第一內含子上，該內含子有19202個bp，rsl606365是距離起始端17940的SNP位點，內含子在選擇性剪接扮演重要角色，一個基因可以 因此而產生多種不同的蛋白質。經查詢檢索，截至目前，GPRC6A基因rsl606365與PCa風險還未見有報導。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的方法。本發明的第二個目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列為GPRC6A基因內含子上包含單苷酸多態性位點rsl606365的核苷酸片段。圖1為GPRC6A基因結構及rsl606365多態性變異位點的示意圖，GPRC6A基因包含有5個內含子，rsl606365位點標在GPRC6A基因圖中第I內含子的相應位置。所述單苷酸多態性位點rsl606365的基因型為CG或GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為CC時，前列腺癌易感性較低。一組檢測前列腺癌易感性的引物和探針，能擴增得到GPRC6A基因內含子上包含單苷酸多態性位點rsl606365的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。所述引物和探針的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2、序列表SEQ ID No. 3和序列表SEQ ID No. 4所示。
一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，包括如下步驟(1)抽提樣品的基因組DNA，擴增GPRC6A基因內含子上的包含單苷酸多態性位點rsl606365的核苷酸片段；(2)檢測步驟(I)產物中單苷酸多態性位點rsl606365的基因型，基因型為CG或GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為CC時，前列腺癌易感性較低。所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rsl606365位點位於該核苷酸序列的+501位。所述擴增GPRC6A基因內含子的包含單苷酸多態性位點rsl606365的核苷酸片段，使用的一組引物和探針的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示。本發明提供了一種檢測前列腺癌易感性的診斷試劑盒，其中含有本發明特異性擴增GPRC6A基因內含子rsl606365位點的引物對和用於PCR擴增檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩衝液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。本發明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下一種預測PCa的試劑盒，供10人份檢測應用，由以下試劑組成10 ii LlO X PCR 緩衝液(購自 Pharmacia)，2 U LlOmM dNTP 混合液(購自 Pharmacia),2 u L Taq DNA 聚合酶(2unit/U L)(購自 Takara),0. 2uL Fl引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/U L ；IuL Rl引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/ii L ；I U L P探針，為SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/ii L ;10 u LlOXLC-greenPLUS飽和螢光染料；(購自美國Idaho公司)63. 8 ii L 純水。使用方法I) PCR擴增通過PCR擴增GPRC6A基因的內含子部分片段，製備混合液10XPCR反應緩衝液 I U L，IOmmoI/L dNTPO. 2 u L, TaqDNA 聚合酶 0. 2 y L，IOpmoI/L 上遊引物0. 02 u L, 10pmol/L下遊引物 0.1 u L, 10XLC Green PLUS飽和螢光染料 I y L，探針 0.1 u L,基因組DNAlii L，加去離子水至10iiL。PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s, 24°C 4min。PCR時於每一體系中加入20iil的石蠟油，以防止液體揮發。2)基因型判定將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Light scanner TMHR-196上進行HRM分析,用Light Scanner Call IT軟體對採集後的曲線進行分析,根據熔解曲線的差異判定基因型。使用非標記的但3』端有C3封閉的探針,LCgreenplusDNA結合染料可以結合在探針與配對目的鏈形成的雙鏈中，其中的一條DNA鏈(與探針結合的鏈)是過度擴增使產生過多的目的鏈，如果SNPs是純合型則目的鏈只有一種形式，但野生純合和突變純合與探針結合的緊密程度不同，解鏈時各形成 一個單峰；如果SNPs是雜合的，則擴增的目的鏈有兩種形式，探針結合的兩種形式決定解鏈時形成雙峰，從而把三種不同的基因型區分出來。
GPRC6A基因內含子單苷酸多態性位點rsl606365在製備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。本發明的測定方法測定了來源於人的基因組DNA，樣品沒有限制，如體液(血液、腹水及尿液等)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可製備基因組DNA。調整基因組DNA的濃度，使其儘可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增出含GPRC6A內含子突變位點rsl606365的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含GPRC6A內含子突變點的DNA片段獲得的樣品，特別適於用作測定材料。在進行基因輔助診斷時，本發明優先適用於測定根據GPRC6A內含子rsl606365突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應於用於測定rsl606365基因突變類型的方法。按採用的測定方法來選擇適當的特定試劑，如DNA片段和/或用於PCR擴增步驟的引物。本發明的優點是本發明首次闡明了 GPRC6A內含子rsl606365多態性位點與PCa的相關性，提供了一種預測PCa易感性的方法和試劑盒，該方法可用於PCa的預防、輔助診斷，還可以用於新藥研發。下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步敘述，以便公眾對發明內容有更深入的了解，並非對本發明的限制，凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。
圖1為GPRC6A基因結構及內含子多態性變異位點的示意2為GPRC6A基因內含子rsl606365位點經HRM分型溶解曲線3為GPRC6A基因內含子rsl606365位點的測序圖
具體實施例方式用於下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下10XPCR 緩衝液10mM Tris-HCl (pH=8. 3)，500mM 氯化鉀(KCI )，IOmM 氯化鎂(MgCl2)jO. 01%(W/V)白明膠dNTP :脫氧核苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸二鈉TE IOmM Tris-HCI (pH=7. 5)，ImM EDTA (pH=8. 0)實施例1 :血液樣本收集和基因組DNA的提取(I)PCa患者均經組織病理學診斷，共選取來自北京和天津地區無血緣關係的PCa患者273例(年齡46 - 93歲，平均72. 3歲)，同地區的年齡匹配的對照606例(年齡58 - 94歲，平均70.4歲)，均為男性，無PCa家族史、DRE陰性並且PSA〈4ng/mL。所有受檢者均為漢族且籤署書面知情同意書，這項研究得到衛生部北京醫院，衛生部老年醫學研究所倫理審核委員會的認可，符合世界醫學會赫爾辛基宣言人體醫學研究的倫理原則。(2)根據下列方法，製備人基因組DNA。①首先在已標號的1.5mLEP管中加1000 y L紅細胞裂解液，後加入400 u LEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3_5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；②13000rpm離心30秒後，除去上清液；③在所得沉澱中加480 U I核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻後加入20 ii L蛋白酶K (用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，(期間不時上下混勻，確保無凝塊);④取出後降至室溫，加300 u L蛋白沉澱液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；⑤將上清液移至新EP管中，加入670 y L預冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；⑥棄上清液並確保沉澱留在EP中，加入670 u L70%乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；⑦棄上清，使管內乙醇揮發乾淨；⑧加入TE溶解液(400 u L)，充分溶解，然後對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/U L，放置於4°C備用，剩餘基因組DNA置_20°C冰箱保存。 實施例2SNP的識別鑑定本發明採用PCR-高解析度溶解曲線(HRM)分析法和PCR測序技術同時對GPRC6A的內含子基因區的rsl606365位點(其等位位點為C/G)的基因型進行檢測。I) PCR-HRM弓丨物的確定從Genebank中查取rsl606365附近的DNA喊基序列(SEQ ID NO.1),引物設計在01igo6. 0和primer5. 0軟體下完成。目的片段定位在GPRC6A基因內含子區，全長180bp,確定了正義鏈Fl (+425bp—+446bp)與反義鏈Rl (+583bp—+604bp)，特異性引物序列如下Fl :5，-AGAAGTA AGCCCAGCTCATCAT-3，(SEQ ID NO. 2)Rl :5』 -AGGTGCCTTACTCAAATACTGA-3』 (SEQ ID NO. 3)P :5』 -CCTGTCACTGCCGTTGCCATC-3』 (SEQ ID NO. 4)2 ) PCR-HRM反應體系及條件通過PCR擴增GPRC6A的內含子基因區的rsl606365位點所在片段，PCR反應體系為10XPCR 反應緩衝液 I ii L，10mmol/L dNTPO. 2 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，10pmol/L 上遊引物0. 02 u L, IOpmoI/L下遊引物0.1 u L, 10XLC Green PLUS飽和螢光染料I U L，探針0.1 u L，基因組DNAl u L，加去離子水至IOii L。PCR時於每一體系中加入20 y I的石蠟油，防止液體揮發。PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s,總共45個循環，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。3) HRM判定基因型將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Light scanner TMHR-196上進行HRM分析從45°C開始，以0. 30C /s的斜率採集熔解曲線，到98°C結束，用Light ScannerCall IT軟體對採集後的曲線(圖2)進行分析，判定基因型。4)測序驗證從所得的不同基因型的個體中分別隨機抽取3例樣本進行測序驗證。測序樣本重新進行 PCR 擴增，測序引物序列為F2 :5』-AGAAGTAAGCCCAGCTCATCAT-3』 (SEQ ID No. 5)，R2 :5』-AGGTGCCTTACTCAAATACTGA-3』(SEQ ID No. 6)，擴增片段長 180bp。PCR反應總體系為30 u L,包含基因組 DNA3ii L，10 X PCRBuf fer3ii L，IOmmo 1/L dNTPO. 6 u L, Taq DNA 聚合酶(5~1^)0.61^，上下遊引物(10 11101/1^)各0. 3 ii L，去離子水補充至總體積30ii L。PCR反應條件為95°C預變性5min後進入主循環，95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，35個循環，72°C延伸7min。PCR產物經8%聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察合格後送華大基因測序部進行測序驗證(圖3)。實施例3基因SNP與PCa的相關性統計方法運用Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性。利用SPSS11. 0軟體Pearson卡方檢驗計算GPRC6A基因內含子rsl606365多態性位點的等位基因、基因型在PCa病例組與正常對照組間的分布頻率，logistic回歸評價PCa的患病風險OR值及其95%CI可信區間，以P〈0. 05為差異顯著性標準。結果位於GPRC6A基因內含子的SNP rsl606365多態位點的基因型和等位基因頻率在病例與對照組間的分布及與PCa的關聯分析詳見表2。表1GPRC6A基因內含子SNP rsl606365多態性位點的基因型和等位基因頻率在中國人群中病例對照組間的分布及與PCa的關聯分析
權利要求
1.一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特徵在於為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特徵在於所述核苷酸序列為GPRC6A基因內含子上包含單苷酸多態性位點rsl606365的核苷酸片段。
3.根據權利要求2所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特徵在於所述單苷酸多態性位點rsl606365的基因型為CG或GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為CC時，前列腺癌易感性較低。
4.一組檢測前列腺癌易感性的引物和探針，其特徵在於能擴增得到權利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。
5.根據權利要求4所述的一組檢測前列腺癌易感性的引物和探針，其特徵在於所述引物和探針的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2、序列表SEQ ID No. 3和序列表SEQ IDNo. 4所示。
6.一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)抽提樣品的基因組DNA，擴增GPRC6A基因內含子上的包含單苷酸多態性位點rsl606365的核苷酸片段； (2)檢測步驟(I)產物中單苷酸多態性位點rsl606365的基因型，基因型為CG或GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為CC時，前列腺癌易感性較低。
7.根據權利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特徵在於所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所不的核苷酸序列，rsl606365位點位於該核苷酸序列的+501位。
8.根據權利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特徵在於所述擴增GPRC6A基因內含子的包含單苷酸多態性位點rsl606365的核苷酸片段，使用的一組引物和探針的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
9.一種檢測前列腺癌易感基因的試劑盒，其特徵在於由以下試劑組成IOii LlO X PCR 緩衝液； 2u LlOmM dNTP 混合液；2u L Taq DNA 聚合酶，2unit/ U L ； 0. 2uL Fl引物，為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/u L ； IuL Rl引物，為SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/u L ； IuLP探針，為SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/y L ； 10 u LlOXLC-green PLUS 飽和螢光染料；63. 8 ii L 純水。
10.GPRC6A基因內含子單苷酸多態性位點rsl606365在製備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種預測前列腺癌易感性的試劑盒和方法，屬於生物技術領域。本發明通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的GPRC6A基因第一內含子上rs1606365位點的基因型，預測受試者對前列腺癌的易感性；GPRC6A基因內含子上的rs1606365的基因型為CG或GG時，受試者的易感性最高；rs1606365的基因型為CC時，受試者的易感性較低。本發明的優點是首次闡述了rs1606365基因多態性位點與前列腺癌的相關性，提供了一種預測前列腺癌易感性的方法，該方法可用於前列腺癌的早期預防診斷、輔助診斷，還可以用於新藥研發。
文檔編號C12N15/11GK103060433SQ201210398648
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者楊澤, 趙承孝, 劉銘, 王建業, 史曉紅, 魏東, 朱小泉, 楊帆, 張耀光, 梁思穎, 王飛, 唐雷, 孫亮 申請人:衛生部北京醫院