莫拉氏菌屬的疫苗抗原的製作方法

2023-12-08 23:29:46 2

專利名稱：莫拉氏菌屬的疫苗抗原的製作方法
技術領域：
本發明涉及莫拉氏菌屬、特別是牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)的抗原、編碼這些抗原的核酸序列和用於提高抗莫拉氏菌屬的免疫應答的製劑。
背景技術：
傳染性牛角膜結膜炎(IBK)是一種經濟上重要的牛疾病，是由革蘭氏陰性球桿菌牛莫拉氏菌所導致的。IBK更普遍地稱為紅眼病，是一種接觸傳染性高的眼部感染，可以從輕微結膜炎發展為嚴重潰瘍、角膜穿孔和失明。在控制IBK中治療性與預防性措施僅取得有限成功，需要預防該疾病的疫苗。引起生物毒力的因素有很多，迄今得到認定的兩種最重要的屬性是菌毛的表達和產生溶血素的能力。根據菌毛的類型，在澳大利亞、英國和美國分離的七種不同的牛莫拉氏菌菌株血清群已經得到鑑別(1)。有效的菌毛類疫苗必須含有來自所有七種血清型的足量菌毛，以成為完全保護性的，因為兩種血清型之間缺乏交叉保護(2，3)。尚未實現所有七種菌毛血清型的表達水平之高足以可用於商品疫苗製備。
理想的疫苗候選者刺激對抗牛莫拉氏菌的保護作用，它將是這樣一種分子，在該菌種所有菌株中是非常保守的。可能的候選者是由牛莫拉氏菌產生的溶血素、蛋白酶、脂肪酶和/或磷脂酶(4)。例如，來自牛莫拉氏菌的一種溶血性菌株的部分純化的無細胞上清液已經顯示帶來對抗異種的野生型攻擊的顯著保護作用(5)。溶血素在牛莫拉氏菌的所有七種血清型中保守的可能性使它成為對抗IBK的潛在疫苗候選者。不過，研究人員迄今既不能克隆編碼溶血素的基因，也不能純化該蛋白質達到同源性。雖然如此，任意或所有這些分子單獨或組合都能夠證實可用於產生對抗IBK有效的疫苗。
發明概述在第一方面，本發明在於多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.1胺基酸37至1114所述胺基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
在優選的實施方式中，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1所示序列的同一性為至少70％的序列，更優選為至少80％，最優選為至少90％。
在本發明第一方面進一步優選的實施方式中，該多肽具有蛋白酶活性。
在第二方面，本發明在於核酸分子，該核酸分子編碼本發明第一方面的多肽。
在第三方面，本發明在於核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.2所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴格條件下與之雜交的序列。
在優選的實施方式中，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少70％的序列，更優選為至少80％，最優選為至少90％。
在第四方面，本發明在於用於提高動物免疫應答的組合物，該組合物包含本發明第一方面的多肽或本發明第二方面的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
在第五方面，本發明在於多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.3胺基酸26至616所述胺基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
在優選的實施方式中，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3胺基酸26至616所示序列的同一性為至少70％的序列，更優選為至少80％，最優選為至少90％。
在第五方面進一步優選的實施方式中，該多肽具有脂肪酶活性。
在第六方面，本發明在於核酸分子，該核酸分子編碼本發明第五方面的多肽。
在第七方面，本發明在於核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.4所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴格條件下與之雜交的序列。
在優選的實施方式中，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少70％的序列，更優選為至少80％，最優選為至少90％。
在第八方面，本發明在於用於提高動物免疫應答的組合物，該組合物包含本發明第五方面的多肽或本發明第六方面的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
在第九方面，本發明在於多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.5所述胺基酸序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或其功能片段。
在優選的實施方式中，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少70％的序列，更優選為至少80％，最優選為至少90％。
在第九方面進一步優選的實施方式中，該多肽具有溶血素活性。
在第十方面，本發明在於核酸分子，該核酸分子編碼本發明第九方面的多肽。
在第十一方面，本發明在於核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.6所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴格條件下與之雜交的序列。
在優選的實施方式中，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少70％的序列，更優選為至少80％，最優選為至少90％。
在第十二方面，本發明在於用於提高動物免疫應答的組合物，該組合物包含本發明第九方面的多肽或本發明第十方面的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
本文所用的術語「功能片段」打算覆蓋保留完全多肽至少10％生物活性的多肽片段。該術語特別用於涵蓋顯示與完整多肽的免疫交叉反應性的片段，例如與片段反應也與完全多肽反應的配體。
在第十三方面，本發明在於用於提高動物針對莫拉氏菌屬的免疫應答的組合物，該組合物包含至少一種多肽，選自由本發明第一、第五和第九方面的多肽組成的組，可選地還包括佐劑或載體。
在優選的實施方式中，該組合物包括本發明第九方面的多肽和本發明第一與第五方面的多肽之一，或優選地二者皆是。
在優選的實施方式中，該莫拉氏菌是牛莫拉氏菌或黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)，最優選為牛莫拉氏菌。
在第十四方面，本發明在於針對多肽而產生的抗體，該多肽選自由第一、第五和第九方面的多肽組成的組。
正如將為本領域技術人員所易於領會的，本發明的多肽與抗體和從核苷酸序列衍生的探針作為診斷試劑，能夠用於測定莫拉氏菌屬、特別是牛莫拉氏菌感染。例如，多肽和抗體能夠用在ELISA類測定法中，而探針能夠用在PCR類測定法中。探針的長度將提供所需的特異性水平，通常將是至少18個核苷酸。
遍及本說明書的詞語「包含」或類似表達將被理解為意味著包括所述要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟組在內，但不排除任意其他要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟組。
附圖的簡要說明

圖1來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的蛋白酶的核苷酸與胺基酸序列。推定的啟動子序列僅有下劃線。推定的核糖體結合部位以粗體和下劃線表示。推定的起始密碼子以粗體表示。推定的轉錄終止子序列用倒置的箭頭指出。核苷酸與胺基酸序列的編號都表示在左手側。
圖2來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的脂肪酶的核苷酸與胺基酸序列。推定的啟動子序列僅有下劃線。推定的核糖體結合部位以粗體和下劃線表示。推定的起始密碼子以粗體表示。推定的轉錄終止子序列用倒置的箭頭指出。核苷酸與胺基酸序列的編號都表示在左手側。
圖3來自牛莫拉氏菌的脂肪酶在其重組形式(pMB1/MC1061)中被表達時的熱穩定性(在90℃下進行加熱)。
圖4(i)天然形式與(ii)重組形式牛莫拉氏菌的生長速率和脂肪酶的表達水平比較。生長速率以實心條表示，脂肪酶表達水平以空心菱形表示。
圖5來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的RTX毒素A亞單位的核苷酸與胺基酸序列。推定的核糖體結合部位以粗體和下劃線表示。推定的起始密碼子以粗體表示。A亞單位可譯框架的上遊是C亞單位編碼區的一部分(核苷酸1至195)(對應的胺基酸序列以SEQ ID NO8表示)，A亞單位的下遊是B亞單位編碼區的一小部分(核苷酸3080至3250)(對應的胺基酸序列以SEQ ID NO9表示)。核苷酸與胺基酸序列的編號都表示在左手側。
發明的詳細說明為了更清楚地理解本發明的本性，現在根據下列非限制性實施例描述其優選方式。
通用分子生物學除非另有指示，用在本發明中的重組DNA技術是本領域技術人員熟知的標準程序。這類技術在文獻來源中有所描述和解釋，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆實踐指南)，JohnWiley和Sons(1984)；J.Sambrook等，Molecualr CloningALaboratory Manual(分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(編者)，Essential MolecularBiologyA Practical Approach(基本分子生物學實踐方法)，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(編者)，DNA CloningA Practical Approach(DNA克隆實踐方法)，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)；F.M.Ausubel等(編者)，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物學方法)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括迄今所有更新)，引用在此作為參考文獻。
蛋白質變體向DNA引入適當的核苷酸變化，或者體外合成所需的多肽，可以製備胺基酸序列變體。這類變體例如包括胺基酸序列內殘基的缺失、插入或取代。可以進行缺失、插入和取代的組合，以得到最終的構建體，只要最終的蛋白質產物具有所需特徵即可。胺基酸變化還可以改變翻譯後過程，例如改變膜錨著特徵，通過插入、缺失或影響天生蛋白質的跨膜序列改變細胞內定位，或者修飾它對蛋白水解裂解作用的易感性。
在設計胺基酸序列變體時，突變部位的定位和突變的本性將取決於所要修飾的特徵。可以單獨或連續修飾突變部位，例如通過(1)首先用保守性胺基酸選擇取代，然後用更自由的選擇取代，這取決於所達到的結果，(2)缺失靶殘基，或者(3)在與所定位的部位相鄰處插入其他配體的殘基。
可用於鑑別進行誘變的殘基或區域的方法稱為「丙氨酸掃描誘變」，如Cunningham和Wells所述(Science(科學)(1989)2441081-1085)。這裡，鑑別一個殘基或靶殘基組(例如帶電殘基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)並用中性或帶負電胺基酸(最優選為丙氨酸或多丙氨酸)代替，以影響胺基酸與細胞內或外周圍水性環境的相互作用。然後通過引入進一步的或其他變體精製證明對取代的功能敏感性的那些結構域。因而，儘管用於引入胺基酸序列變異的部位是預定的，不過突變本身的本性不必是預定的。例如，為了優化給定部位上的突變性能，可以在靶密碼子或區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，篩選被表達變體關於所需活性的最佳組合。
在胺基酸序列變體的構建中存在兩個主要變量突變部位的定位和突變的本性。它們可以代表天然存在的等位基因或預定的突變體形式，後者是通過使DNA突變為等位基因或自然界不存在的變體而製成的。一般來說，突變的定位和本性的選擇將取決於所要修飾的特徵。
胺基酸序列的缺失一般從約1至30個殘基，更優選為約1至10個殘基，通常為約1至5個毗鄰殘基。
胺基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端融合，長度從一個殘基至含有一百個或以上殘基的多肽，以及單或多胺基酸殘基的序列內插入。其他插入變體包括蛋白質的N-或C-末端與免疫原性多肽的融合，後者例如細菌多肽，如β內醯胺酶或被大腸桿菌trp部位所編碼的酶，或酵母蛋白、牛血清白蛋白和趨化性多肽。包括C-末端與半衰期長的蛋白質的融合，後者例如免疫球蛋白恆定區(或其他免疫球蛋白區域)、白蛋白或鐵蛋白。
另一組變體是胺基酸取代變體。這些變體除去蛋白質分子中的至少一個胺基酸殘基，並在其位置插入不同的殘基。最相關的取代誘變部位包括被鑑別為活性部位的部位。其他有關部位是其中得自各種物種的特定殘基是同一的那些。這些位置對生物活性來說可能是重要的。這些部位、尤其是屬於至少其他三個同樣保守的部位序列的那些以相對保守性方式被取代。這類保守性取代如表1「優選的取代」下所示。如果這類取代導致生物活性的變化，那麼引入更實質性的變化，在表1中命名為示範的取代，或者進一步描述在關於胺基酸類的下文中；並且篩選產物。
表1
突變體、變體和同源性——蛋白質突變體多肽將具有一種或多種突變，它們是胺基酸殘基的缺失、插入或取代。突變體既可以是天然存在的(也就是說，是從天然來源純化或分離的)，也可以是合成的(例如，對編碼性DNA進行部位定向的誘變)。因而顯然，本發明的多肽既可以是天然存在的，也可以是重組的(也就是說，是利用重組DNA技術製備的)。
等位基因變體將是在單獨生物體內天然存在的變體。
如果蛋白質序列與來自共同祖先的趨異有關，那麼它們是同源的。所以，蛋白質的一種物種同系物將是天然存在於另一物種中的等價蛋白質。在任意一種物種內，同系物可以以大量等位基因變體的形式存在，它們將被視為蛋白質的同系物。通過本領域技術人員已知的下列標準技術可以得到等位基因變體和物種同系物。優選的物種同系物包括得自同門代表性物種的那些，更優選為同綱，進而更優選為同目。
正如本領域技術人員熟知的方法(例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)Ad.Appl.Math.(應用數學進展)，2482-489或Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)，48443-453所述方法)所測定的，本發明包括與本發明的同一性至少50％的蛋白質，與本發明蛋白質的同一性優選為至少70％或80％，更優選為至少90％。這一般將是至少20個、優選為至少30個毗鄰胺基酸的區域。
突變體、變體和同源性——核酸突變體多核苷酸將具有一種或多種突變，它們是核苷酸殘基的缺失、插入或取代。突變體既可以是天然存在的(也就是說，是從天然來源分離的)，也可以是合成的(例如，對DNA進行部位定向的誘變)。因而顯然，本發明的多核苷酸既可以是天然存在的，也可以是重組的(也就是說，是利用重組DNA技術製備的)。
等位基因變體將是在單獨生物體內天然存在的變體。
如果核苷酸序列與來自共同祖先的趨異有關，那麼它們是同源的。所以，多核苷酸的一種物種同系物將是天然存在於另一物種中的等價多核苷酸。在任意一種物種內，同系物可以以大量等位基因變體的形式存在，它們將被視為多核苷酸的同系物。通過本領域技術人員已知的下列標準技術可以得到等位基因變體和物種同系物。優選的物種同系物包括得自同門代表性物種的那些，更優選為同綱，進而更優選為同目。
正如本領域技術人員熟知的方法(例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)Ad.Appl.Math.(應用數學進展)，2482-489或Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)，48443-453所述方法)所測定的，本發明包括與本發明的同一性至少70％的多核苷酸，與本發明多核苷酸的同一性優選為至少80％或90％，更優選為至少95％。這一般將是至少60個、優選為至少90個毗鄰核苷酸殘基的區域。
抗體的產生術語「抗體」應當被解釋為覆蓋任意特異性結合物質，具有結合結構域和所需特異性。因而，該術語覆蓋抗體片段、抗體的衍生物、功能等價物和同系物，包括任何包括免疫球蛋白結合結構域的多肽，天然或合成的均可。因此包括與另一種多肽融合的嵌合分子或等價物，其中包括免疫球蛋白結合結構域。
本領域技術人員利用標準技術可以生產對本發明的蛋白質來說是特異性的多克隆或單克隆抗體，例如但不限於Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual(抗體實驗室手冊)，Cold Springs HarborLaboratory Press(1988)和D.Catty(編者)，AntibodiesA PracticalApproach(抗體實用方法)，IRL Press(1988)所述的那些。
各種本領域已知程序可以用於生產抗蛋白質表位的多克隆抗體。關於多克隆抗體的生產，大量宿主動物都是抗體產生可接受的，利用多肽製備物的一次或多次注射致免疫，包括但不限於兔、小鼠、大鼠等。各種佐劑可以用於增加宿主動物的免疫應答，取決於宿主的種類，包括但不限於弗羅因德氏佐劑(完全的與不完全的)，礦物凝膠、例如氫氧化鋁，表面活性物質、例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、油乳劑、鑰孔戚血藍蛋白、二硝基苯酚，和潛在有用的人佐劑、例如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
抗蛋白質表位的單克隆抗體可以利用任何為抗體分子的產生而在培養物中提供連續細胞系的技術加以製備。這些技術包括但不限於雜交瘤技術，最初由Kohler和Milstein(1975，Nature(自然)256，493-497)所描述，和最近的人B-細胞雜交瘤技術(Kesber等，1983，ImmunologyToday(今日免疫學)472)和EBV-雜交瘤技術(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(單克隆抗體與癌症療法)，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。另外，可以使用為生產「嵌合抗體」而開發的技術，剪接具有適當抗原特異性的抗體分子基因以及具有適當生物活性的人抗體分子基因(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國國家科學院院報)，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature(自然)312604-608；Takeda等，1985，Nature(自然)31452-454)。或者，所述用於生產單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)經過修改，能夠生產4-特異性單鏈抗體。
重組人或人源化版本的單克隆抗體是人治療應用的優選實施方式。人源化抗體可以按照文獻程序加以製備(例如Jones等，1986，Nature(自然)321522-25；Reichman等，1988，Nature(自然)332323-27；Verhoeyen等，1988，Science(科學)2391534-36)。最近所述用於生產人源化單克隆抗體的「基因轉化誘變」策略也可以用於生產人源化抗體(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國國家科學院院報)，894285-89)。或者，用於產生重區與輕區隨機組合的重組噬菌體文庫的技術可以用於製備重組抗體(例如Huse等，1989 Science(科學)2461275-81)。
通過已知技術可以產生含有分子獨特型、例如Fu F(ab1)和F(ab2)的抗體片段。例如，這類片段包括但不限於F(ab)E2片段，它可以通過完整抗體分子的胃蛋白酶消化而生產；Fab1片段，它可以通過還原F(ab1)2片段的二硫橋而產生；和兩種Fab片段，它們可以通過將抗體分子用木瓜蛋白酶和還原劑處理而產生。或者，可以構建Fab表達文庫(Huse等，1989，Science(科學)2461275-1281)，以便迅速和容易克隆具有所需特異性的單克隆Fab片段，得到蛋白質。
佐劑和載體藥學上可接受的載體或稀釋劑包括用在組合物中的那些，該組合物適合於口服、直腸、鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內、皮內、鞘內和硬膜外)給藥。它們在所用劑量和濃度下對受者是無毒的。藥學上可接受的載體或稀釋劑的代表性實例包括但不限於水；等滲溶液，它們優選地被緩衝為生理pH(例如磷酸鹽緩衝鹽水或Tris緩衝鹽水)，還可以含有一種或多種甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、乙醇或多肽(例如人血清白蛋白)。組合物適宜為單位劑型，可以通過藥學領域熟知的任意方法加以製備。
如上所述，組合物可以包括佐劑。正如將被理解的，「佐劑」表示由一種或多種物質組成的組合物，它增強疫苗組合物的致免疫性和功效。適合的佐劑的非限制性實例包括角鯊烷和角鯊烯(或其他動物來源的油)；嵌段共聚物；洗滌劑，例如Tween-80、QuilA；礦物油，例如Drakeol或Marcol；植物油，例如花生油；從棒狀桿菌屬(Corynebacterium)衍生的佐劑，例如小棒狀桿菌；從丙酸桿菌屬(Propionibacterium)衍生的佐劑，例如痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acne)；牛結核分支桿菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；白介素，例如白介素2和白介素12；單核因子，例如白介素1；腫瘤壞死因子；幹擾素，例如γ幹擾素；組合，例如皂甙-氫氧化鋁或Quil A-氫氧化鋁；脂質體；ISCOM佐劑；分支桿菌細胞壁提取物；合成的糖肽，例如胞壁醯二肽或其他衍生物；阿夫立定；脂質A衍生物；葡聚糖硫酸酯；DEAE-葡聚糖或含有磷酸鋁；羧聚乙烯，例如Carbopol』EMA；丙烯酸共聚物乳劑，例如NeocrylA640(例如美國專利No.5,047,238)；牛痘或動物痘病毒蛋白；亞病毒粒子佐劑，例如霍亂毒素，或它們的混合物。
基因/DNA分離編碼蛋白質的DNA可以得自任意cDNA文庫，該文庫是從據信以可檢出水平表達基因mRNA的組織製備的。DNA也可以得自基因組文庫。
用設計用來鑑別有關基因或被其編碼的蛋白質的探針或分析工具篩選文庫。關於cDNA表達文庫，適合的探針包括識別並特異性結合蛋白質的單克隆或多克隆抗體；長約20-80個鹼基的寡核苷酸，編碼相同或不同物種cDNA的已知或可疑部分；和/或互補性或同源性cDNA或其片段，編碼相同或雜交基因。適合於篩選基因組DNA文庫的探針包括但不限於寡核苷酸；cDNA或其片段，編碼包括被表達序列標記等的相同或雜交DNA；和/或同源性基因組DNA或其片段。用所選擇的探針篩選cDNA或基因組文庫可以利用標準程序進行，如Sambrook等第10-12章所述。
分離編碼有關蛋白質的基因的替代手段是利用聚合酶鏈反應(PCR)方法學，如Sambrook等第14節所述。該方法要求使用與基因雜交的寡核苷酸探針。
選擇作為探針的寡核苷酸序列應當是足夠長的和足夠明確的，假陽性是最小化的。實際的核苷酸序列通常基於基因的保守性或高同源性核苷酸序列或區域。寡核苷酸可以在一個或多個位置是簡併性的。若篩選其中優先密碼子在該物種中的用途已知的物種文庫，簡併性寡核苷酸的使用可能是特別重要的。寡核苷酸必須被標記，以便它在與所篩選的文庫中的DNA雜交後能夠被檢出。優選的標記方法是使用(α-32P)-dATP與多核苷酸激酶，這是本領域熟知的，以放射性標記寡核苷酸。不過，其他方法也可以用於標記寡核苷酸，包括但不限於生物素基化作用或酶標記。
涵蓋所有蛋白質編碼序列的DNA是這樣獲得的，篩選所選擇的cDNA或基因組文庫，如果必要的話，利用如Sambrook等第7.79節所述常規的引物延長程序，以檢測可能沒有被逆轉錄到cDNA中的mRNA的前體和加工中間體。
用於獲得有關基因的另一種替代方法是利用Fingels等所述方法之一化學合成之(Agnew Chem.Int.Ed.Engl.(應用化學國際英文版)28716-734，1989)。這些方法包括三酯、亞磷酸鹽、亞磷醯胺與H-膦酸酯法、PCR與其他自動引物(autoprimer)法、和固體載體上的寡核苷酸合成。如果基因的全部核酸序列是已知的，或者與編碼鏈互補的核酸序列是可利用的，那麼可以使用這些方法，或者如果靶胺基酸序列是已知的，那麼人們可以利用關於每種胺基酸殘基已知的和優選的編碼殘基推斷可能的核酸序列。
基本上純化的「基本上純化的」表示已經從脂質、核酸、其他多肽和其他汙染分子中分離的多肽。
雜交本發明的多核苷酸序列可以在高嚴格條件下與SEQ ID NOS 2、4或6所述各序列雜交。本文所用的嚴格條件是(i)採用低離子強度和高溫進行雜交後的洗滌，例如0.1×SSC與0.1％(w/v)SDS、50℃；(ii)在雜交期間採用這樣的條件，雜交溫度比雜交中的多核苷酸的雙螺旋熔化溫度低25℃，例如1.5×SSPE、10％(w/v)聚乙二醇6000、7％(w/v)SDS、0.25mg/ml片段化鯡魚精子DNA、65℃；或(iii)例如0.5M磷酸鈉，pH 7.2、5mM EDTA、7％(w/v)SDS和0.5％(w/v)BLOTTO、70℃；或(iv)在雜交期間採用變性劑，例如甲醯胺，例如50％(v/v)甲醯胺，與5×SSC、50mM磷酸鈉(pH 6.5)和5×Denhardt溶液(32)、42℃；或(v)例如採用50％(v/v)甲醯胺、5×SSC、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1％(w/v)焦磷酸鈉、5×Denhardt溶液、超聲處理過的鮭魚精子DNA(50μg/ml)和10％葡聚糖硫酸酯、42℃。
實施例1本實施例描述來自牛莫拉氏菌的蛋白酶的克隆和鑑定。
細菌和基因組文庫的構建牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是從牛眼收集的場分離物，通過CSIROAnimal Health，Parkville，Australia鑑定(6)。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α以前已有描述(7，8)。
所有酶均購自Promega(Madison，WI，USA)，另有註解除外。
一般的克隆和DNA技術如文獻所述(9)，另有註解除外。
基因組文庫是這樣構建的，利用下述CTAB法在從牛莫拉氏菌Dalton2d菌株提取的基因組DNA上進行部分Sau3A消化。將這種DNA用NaCl梯度進行尺寸分級(10)，與預先已用BamHI消化的粘粒克隆載體pHC79形成配合物(11)。利用Packagene Lambda DNA包裝系統(Promega，Madison，WI，USA)將這種DNA包裝在λ噬菌體頭內，用於轉導大腸桿菌菌株DH5α。將文庫貯存在96孔託盤(50％甘油/luria肉湯/氨苄西林(50μg/ml))和-70℃下。
牛莫拉氏菌的CTAB基因組DNA提取在5ml腦心浸劑(BHI)(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)肉湯中接種取自馬血瓊脂上的新鮮過夜培養基的Dalton 2d菌落，在37℃下搖動培養6小時。該培養物用於接種50ml BHI肉湯，在37℃下搖動生長過夜。將40ml培養物轉移至SS34試管，在3000xg下離心10分鐘使細胞形成粒狀沉澱。將粒狀沉澱再次懸浮在9.5ml含25％蔗糖的TE緩衝液(10mM Tris，1mM EDTA(pH8))中後，加入500μl 10％SDS、50μl20mg/ml蛋白酶K和20μl 10mg/ml RNA酶A，將該混合物在37℃軌道搖瓶內培養1小時。向該混合物中加入1.8ml 5M NaCl和1.5ml CTAB(N-鯨蠟基-N，N，N-三甲基-溴化銨)/NaCl溶液，繼續在65℃下培養20分鐘。使用苯酚/氯仿提取DNA，用0.6體積異丙醇沉澱。將所得DNA用70％乙醇洗滌，乾燥，再次懸浮在2ml TE緩衝液中。
篩選基因組文庫的酶活性為篩選顯示蛋白酶活性的克隆體的存在，在37℃下在脫脂乳瓊脂(雙強度哥倫比亞瓊脂培養基(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)/10％脫脂乳)上培養基因組文庫達24小時，然後在4℃下冷藏一至兩天。
檢測到來自基因組文庫的單一克隆體具有抗脫脂乳瓊脂活性。DNA分析確認該克隆體含有牛莫拉氏菌Dalton 2d基因組DNA，大小為大約4萬個鹼基。該構建體被稱為pJF1。
牛莫拉氏菌蛋白酶克隆體pJF1的核苷酸序列分別利用Wizard Plus SV Minipreps DNA純化系統(Promega，Madison，WI，USA)和Qiagen Plasmid Midi試劑盒(Qiagen Pty.Ltd.，Clifton Hill，Vic，Australia)提取質粒和粘粒DNA，用於自動測序。
利用「引物步行」過程測定插入片段DNA的核苷酸序列(12)。這是利用合成寡核苷酸(Bresatec/Geneworks，Thebarton，SA，Australia)和染劑終止子循環測序備用反應(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT，USA)來實現的。在Applied Biosystems 373A DNA序列分析儀上分析所得序列。
自動測序揭示3345bp可譯框架能夠編碼1115個胺基酸的蛋白質。按5』至3』方向書寫序列，如圖1所示，其中還有預期編碼分子量為120kDa的蛋白質的相應胺基酸序列。胺基酸序列如SEQ ID NO 1所示，DNA序列如SEQ ID NO 2所示。
通過可能的上遊核糖體結合部位的存在鑑別關於成熟蛋白酶蛋白的公認起始密碼子。通過與大腸桿菌RBS共有序列的相似性鑑別這種RBS，以前用於鑑別牛莫拉氏菌菌毛蛋白基因(AGGAG)(27)。
由於蛋白酶的秘密本性，假定它在其N-末端序列中含有用於蛋白質分泌的信號肽。利用可從Expasy網站(http//www.expasy.ch/tools/)得到的預測程序(SignalP)進行這種分析，可鑑別原核生物的信號肽，預測可能的裂解部位。這種分析僅利用伴隨蛋白質/DNA序列所示起始密碼子鑑別信號肽。
序列對比利用可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov得到的BlastX與BlastP程序進行所推導的胺基酸序列與資料庫中的序列的對比。
在胺基酸水平上，從Dalton 2d克隆的蛋白酶顯示下列與所列蛋白質的相似性和同一性。生物體 蛋白質 相似性 同一性粘質沙雷氏菌 ssp-h2-絲氨酸蛋白酶39％ 23％(Serratia marcescens)自動轉運蛋白粘質沙雷氏菌 ssp-h1-絲氨酸蛋白酶37％ 22％自動轉運蛋白螢光假單胞菌 絲氨酸蛋白酶同系物 34％ 20％(Pseudomonas fluorescens)託拉假單胞菌 絲氨酸蛋白酶 35％ 21％(Pseudomonas tolaasii)更一般地，牛莫拉氏菌蛋白酶的5』結構域顯示與枯草桿菌蛋白酶(絲氨酸蛋白酶)家族的同源性，而3』區域類似於大量外膜蛋白。
發現牛莫拉氏菌序列含有富集大量脯氨酸的區域，這區別於所有其他與之密切相關的蛋白質。
被pJF1編碼的蛋白酶類型為了鑑別被pJF1編碼的蛋白酶活性類型，檢查了一定範圍特異性蛋白酶抑制劑對牛莫拉氏菌蛋白酶表達的作用。
利用Bourgeau等(1992)(14)的方法測定抑制劑活性，並作下列修改。將來自新鮮過夜肉湯培養物的100μl無細胞上清液與650μl 100mMTris(pH 7.2)和適合體積的抑制劑(PMSF(苯甲磺醯氟)5mM；EDTA 5mM；亮肽素100μg/ml；胃酶抑素50μg/ml)混合。用蒸餾水加至體積達1ml。將混合物在37℃下培養30分鐘，然後加入10mg azocoll(Calbiochem，Alexandria，NSW，Australia)。將懸液在37℃下培養16小時，讀取520nm下的光密度。
按照這種方法確認了可歸因於被pJF1編碼的蛋白酶的活性是絲氨酸蛋白酶的活性，因為PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)減少Dalton 2d和pJF1的蛋白酶活性至零。
牛莫拉氏菌中的蛋白酶保守利用蛋白酶編碼區的內部片段作為探針進行DNA雜交，以調查蛋白酶是否存在於代表已知牛莫拉氏菌菌毛血清型的菌株中。
將從牛莫拉氏菌的代表性菌株提取的基因組DNA(15)用XbaI和EcoRI消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分離。利用文獻所述方法將DNA轉移至Hybond N+濾器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)(9)。用於DNA雜交的探針是經過PCR擴增的片段，它位於蛋白酶編碼區的內部。利用Megaprime標記系統(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照廠商指導將該片段用α32P-dATP標記。使用高嚴格條件(雜交溫度68℃；在室溫下用2×SSC/0.1％ SDS洗滌2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％ SDS洗滌1次)，使所得濾器暴露於放射自顯影膜(Kodak，Rochester，New York，USA)達5至24小時，然後顯影。
結果顯示在pJF1中克隆的蛋白酶基因存在於所有所檢查的牛莫拉氏菌菌株中。
實施例2本例描述來自牛莫拉氏菌的脂肪酶的克隆和鑑定。
細菌和質粒文庫的構建牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是從牛眼收集的場分離物(fieldisolate)，通過CSIRO Animal Health，Parkville，Australia鑑定(6)。大腸桿菌菌株MC1061以前已有描述(16)。
所有酶均購自Promega(Madison，WI，USA)，另有註解除外。一般的克隆和DNA技術如文獻所述(9)，另有註解除外。
質粒文庫是在克隆載體pBR322中構建的(17)。它是這樣進行的，在1至2kb範圍內最大化DNA的量的條件下，用Sau3A部分消化(利用實施例1所述CTAR法)從Dalton 2d提取的基因組DNA。使該DNA與預先已用BamHI消化的pBR322連接。將連接後的DNA電穿孔(2.5kV、200Ω和200μF，理論時間常數為4.7)到電反應潛能大腸桿菌MC1061細胞內。
篩選質粒文庫的脂肪酶表達連接後的DNA向MC1061細胞的電穿孔之後，在含有Tween 80的培養基[10ml Tween 80(Sigma，St Louis，MO，USA)，5g NaCl，3g瓊脂No.1(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)，10g腖，0.1gCaCl2.H2O/升]上，在37℃下培養文庫達24小時，檢測顯示脂肪酶活性的重組克隆體。
在所篩選的24,000個克隆體中，發現有二十八個顯示脂肪酶活性。DNA分析確認所有這些克隆體都含有一個5.4kb片段的共有DNA。選擇一個克隆體繼續實驗，將其命名為pMB1。
在有些實驗中(見下)，利用對-硝基苯基棕櫚酸酯作為底物進行細胞外脂肪酶活性的光度測定(18，19)。使大腸桿菌和/或牛莫拉氏菌在37℃下生長所需時間。將不含細胞的培養物上清液(100μl)與2.4ml酶緩衝液混合(19)，以測定所分泌的脂肪酶活性。在37℃下培養30分鐘後，測定410nm下的光密度。一個酶單位被定義為每分鐘從每ml對-硝基苯基棕櫚酸酯釋放1nmol對-硝基苯基的酶量。在Stuer等所述條件下(18)，0.041的410nm下光密度等於1個酶單位。
牛莫拉氏菌脂肪酶克隆體pMB1的核苷酸序列利用實施例1所述方法，對質粒pMB1進行自動DNA測序。
該分析揭示1851bp的可譯框架能夠編碼617個胺基酸。按5』至3』方向書寫序列，如圖2所示，其中還有預期編碼分子量為65.8kDa的蛋白質的相應胺基酸序列。胺基酸序列如SEQ ID NO 3所示，DNA序列如SEQ ID NO 4所示。
利用上述關於蛋白酶的技術鑑別脂肪酶蛋白的潛在起始密碼子。
序列對比利用實施例1所述方法進行序列對比。
在胺基酸水平上，從牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的脂肪酶顯示下列與所列蛋白質的相似性和同一性。生物體蛋白質相似性 同一性發光致病桿菌 三醯甘油脂肪酶36％ 24％(Xenorhabdus luminescens)惡臭假單胞菌 假定的蛋白質 36％ 24％(Pseudomonas putida)鼠傷寒沙門氏菌外膜酯酶 35％ 23％(Salmonella typhimurium)銅綠假單胞菌 脂肪酶/酯酶 36％ 23％(Pseudomonas aeruginosa)牛莫拉氏菌被鑑別為可能是GDSL家族(20)脂解酶的新成員。
對脂肪酶成熟蛋白進行N-末端測序在500ml luria肉湯中，在37℃下搖動培養所需大腸桿菌菌株過夜。在5,000rpm下離心15分鐘，使細胞形成粒狀沉澱，通過0.45μm濾器過濾上清液。向上清液中加入固體硫酸銨至60％飽和度(180g/500ml)，在4℃下攪拌30分鐘使溶解。將該混合物置於4℃下過夜，在7,000rpm下離心30分鐘使所沉澱的蛋白質形成粒狀沉澱。將蛋白質再次懸浮在3ml重蒸餾水中，使溶解的蛋白質對重蒸餾水透析過夜，以除去所有的鹽。通過0.45μm濾器過濾所得混合物，貯存在-20℃下。
用SDS-PAGE分離蛋白質後，將蛋白質轉移至PVDF膜上，切除。對蛋白質進行自動(埃德曼降解)序列分析(28)，在自動序列分析儀(470A型，Applied Biosystems)(Applied Biosystems Division，Foster City，CA，USA)中發生臨界試劑的蒸汽相傳遞(29)，該儀器連接有PTH胺基酸分離系統(120A型PTH分析器，Applied Biosystems)。
利用這種技術，鑑別了具有兩個裂隙的17個胺基酸KEFSQVIIFGDSLXDXG(SEQ ID NO7)，它精確對應於隨附序列所示第26至42個胺基酸。這種結果還表明該蛋白質最有可能包括參與蛋白質分泌的氨基末端信號肽。該氨基末端對應於隨附序列的第1至25個胺基酸。
升高兔脂肪酶抗體通過注射被硫酸銨沉澱過的大腸桿菌MC1061/pMB4上清液，升高兔重組脂肪酶抗體。在疫苗接種之前，將脂肪酶製備物加熱至90℃達90分鐘進行滅活。注射30μg該蛋白質，以2周為間隔，注射4周。將原代接種物用弗羅因德完全佐劑乳化，隨後用弗羅因德不完全佐劑進行疫苗接種。
牛莫拉氏菌脂肪酶的熱穩定性發現從牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的重組脂肪酶是非常熱穩定的，因為使活性減少97％需要在90℃下加熱105分鐘。圖3闡述了這種現象，酶活性以根據細胞外脂肪酶測定法測定的「脂肪酶單位」表示。
天然對重組脂肪酶的相對表達水平進行實驗以描繪脂肪酶產生的生長速率，比較MC1061pMB1產生重組脂肪酶與牛莫拉氏菌Dalton 2d產生天然形式的脂肪酶。圖4闡述了兩種菌株的生長速率大約相等，但是它們沒有達到相等的細胞密度，9小時後Dalton 2d基本上低於MC1061pMB1。與牛莫拉氏菌Dalton 2d的天然脂肪酶表達相比，大腸桿菌pMB1構建體的脂肪酶表達水平最高。
將來自大腸桿菌克隆體或牛莫拉氏菌Dalton 2d的無細胞上清液的蛋白質用硫酸銨沉澱，用SDS-PAGE分析，利用重組熱滅活脂肪酶抗血清進行蛋白質印跡分析，進一步證實了該結果。
分別在500ml Luria肉湯或腦心浸劑肉湯中，在37℃下搖動培養大腸桿菌或牛莫拉氏菌過夜，製備硫酸銨沉澱過的上清液。在5000xg下離心15分鐘，使細胞形成粒狀沉澱，通過0.45μm濾器過濾上清液。向上清液中加入固體硫酸銨至60％飽和度(180g/500ml)，在4℃下攪拌30分鐘使溶解。將該混合物置於4℃下過夜，在7000xg下離心30分鐘使所沉澱的蛋白質形成粒狀沉澱。將蛋白質再次懸浮在3ml重蒸餾水中，使溶解的蛋白質對重蒸餾水透析過夜，以除去所有的鹽。通過0.45μm濾器過濾所得混合物，貯存在-20℃下。
將蛋白質再次懸浮在100μl 2x樣本緩衝液(5ml 0.5M Tris(pH6.8)，8ml 10％ SDS，4ml甘油，0.8ml β-巰基乙醇，1ml重蒸餾H2O，溴酚藍)中，加熱至100℃達5分鐘，製備SDS-PAGE用蛋白質樣本(100μl)。利用Laemlli的緩衝系統(21)，在12.5％聚丙烯醯胺凝膠上分離蛋白質。
按照Towbin等的方法(22)進行蛋白質印跡，用SDS-PAGE分離蛋白質後，利用Bio-Rad微型電池(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)轉移系統轉移至硝基纖維素。用已被MC1061細胞吸附的重組脂肪酶抗血清(濃度為1/100)對濾器進行免疫印跡分析。抗已被滅活(90℃下1小時45分鐘)的硫酸銨沉澱過的重組脂肪酶的抗血清被升高了，用於以4周間隔接種兔子(三次各50μg)。在致免疫之前和每次疫苗接種之時從耳緣靜脈採集血樣。
結果顯示重組脂肪酶陽性構建體MC1061/pMB1存在顯著的譜帶，在牛莫拉氏菌Dalton 2d製備物中可檢測到相對微小的量。用抗血清檢出的蛋白質的大小大約等於牛莫拉氏菌脂肪酶的預測分子量大小(65.8kDa)。
被pMB1編碼的脂肪酶類型利用薄層色譜法(TLC)測定牛莫拉氏菌Dalton 2d的脂肪酶是否顯示磷脂酶活性。磷脂酶類型的特徵鑑別本質上遵循前人所述方法(23)，但是在100℃下用10％磷鉬酸的乙醇溶液展開後，用肉眼觀察矽膠60板上的分離結果。所用試劑全部購自Sigma(Sigma，St Louis，MO，USA)。
TLC測定了當使用溶血磷脂醯膽鹼和磷脂醯膽鹼作為底物時，牛莫拉氏菌脂肪酶顯示與商業上可得到的磷脂酶B相同的酶特異性(數據未顯示)。
牛莫拉氏菌中脂肪酶的保守利用Dalton 2d脂肪酶編碼區的內部片段進行DNA印跡分析，以調查脂肪酶基因是否存在於代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株中。
將從代表每種已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株提取的基因組DNA(15)用HindIII消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分離。利用前人所述方法(9)將DNA轉移至Hybond N+濾器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。用於DNA雜交的探針是含有脂肪酶編碼區內部序列的HindIII片段。利用Megaprime標記系統(Amersham，LittleChalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照廠商指導將該片段用α32P-dATP標記。使用高嚴格條件(雜交溫度68℃；在室溫下用2×SSC/0.1％ SDS洗滌2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌1次)，使所得濾器暴露於放射自顯影膜(Kodak，Rochester，New Yor k，USA)達5至24小時，然後顯影。
結果顯示脂肪酶存在於所有所檢查的牛莫拉氏菌菌株中。
為了確認脂肪酶基因是否在每種血清型代表性菌株內被表達，所升高的抗重組體熱滅活脂肪酶抗血清用於全細胞製備物的蛋白質印跡分析。結果顯示脂肪酶的確被所有這些牛莫拉氏菌菌株所表達。
實施例3細菌和溶血素克隆體的構建牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是從牛眼收集的場分離物，通過CSIROAnimal Health，Parkville，Australia鑑定(6)。
所有代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株表達溶血活性，在馬血瓊脂上檢測。
大腸桿菌degP4∷Tn5菌株具有滲漏外膜，有蛋白水解缺陷，前人已有描述(24)。所有酶均購自Promega(Madison，WI，USA)，另有註解除外。
一般的克隆和DNA技術如文獻所述(9)，另有註解除外。
採用能夠鑑別輸出蛋白質的phoA融合技術(25)，並作一定修改。將來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的基因組DNA(利用實施例1所述CTAB法製備)用Sau3A部分消化。使限制性DNA與一系列載體連接，以便與三種不同閱讀框架內的鹼性磷酸酶基因融合。使連接後的DNA電穿孔至大腸桿菌degP4∷Tn5內，在含有氨苄西林(50μg/ml)和X-P(200μg/ml)(5-溴-3-氯-吲哚基磷酸酯)的luria瓊脂上篩選所得克隆體。克隆體的選擇依賴於觀察結果，也就是如果片段被克隆並且含有輸出序列，那麼所得菌落將呈藍色。滲漏大腸桿菌菌株允許與外膜結合的蛋白質和所分泌的蛋白質(都與phoA融合)有別於非分泌性融合蛋白。
牛莫拉氏菌溶血素決定子的測序選擇存在所分泌的或外膜蛋白基因序列的克隆體，利用實施例1所述方法進行自動DNA測序。發現這些克隆體之一pMbh1含有200bp的DNA，對其他RTX毒素的A亞單位顯示較高同源性。利用反向PCR和變性寡核苷酸得到完整A亞單位的序列。2784bp的可譯框架能夠編碼928個胺基酸。按5』至3』方向書寫序列，如圖5所示，其中還有預期編碼分子量為98.8kDa的蛋白質的相應胺基酸序列。胺基酸序列如SEQ ID NO 5所示，DNA序列如SEQ ID NO 6所示。
利用上述RBS技術鑑別推定的起始密碼子。沒有進行信號肽分析，因為A亞單位不被主動分泌。不過由於這些蛋白質(RTX)的蛋白序列是非常保守的，該起始密碼子是對單獨的胺基酸同源性的選擇之一。
序列同源性在胺基酸水平上，牛莫拉氏菌Dalton 2d溶血素基因產物顯示與若干RTX的A亞單位和其他溶血素具有驚人的相似性，如下表所示。生物體 蛋白質 相似性同一性溶血性巴斯德氏菌 LktA蛋白68％ 50％(Pasteurella haemolytica)(白細胞毒素)大葉性肺炎放線桿菌 RTX毒素決定子 68％ 48％(Actinobacillus pleuropneumoniae)大腸桿菌 溶血素-質粒 58％ 43％大腸桿菌 溶血素-染色體 58％ 43％牛莫拉氏菌溶血素的功能互補得到表達大腸桿菌攜帶染色體的溶血素的構建體(pLG900；通過聯合兩個質粒pLG575(26)和pLG816而生成(克隆到pBluescriptSK內的hlyC和hlyA))。pLG900包含克隆到pBluescriptSK內的四種RTX操縱子基因hlyC、hlyA、hlyB、hlyD，能夠賦予以前是非溶血性的大腸桿菌細胞以溶血性表型。使這種構建體的A亞單位(hlyA)變異，以便它不再能夠被表達，但是參與操縱子的其他基因(hlyB、hlyC和hlyD)保持完整。含有該構建體的大腸桿菌菌株(pLG900/hlyA陰性)不再是溶血性的。不過，通過在轉運中提供從牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的溶血素亞單位基因可以恢復溶血性表型。因而確認了所克隆的牛莫拉氏菌溶血素基因編碼最有可能是RTX家族溶血酶成員的結構亞單位。
進一步的序列分析已經確立，象其他家族成員一樣，牛莫拉氏菌RTXA亞單位基因旁側是能夠編碼RTX B、C和D蛋白的DNA序列。
RTX A亞單位在牛莫拉氏菌中的保守性為了確定RTX A亞單位基因是否存在於代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株中，使用RTX A亞單位的編碼區作為探針進行DNA雜交分析。
將從牛莫拉氏菌的七種血清型菌株提取的基因組DNA(15)用EcoRV消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分離。利用前人所述方法(9)將DNA轉移至Hybond N+濾器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。所用探針是含有來自牛莫拉氏菌RTX溶血素A亞單位的所有編碼區的PCR擴增產物。利用Megaprime標記系統(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照廠商指導將該片段用α32P-dATP標記。使用高嚴格條件(雜交溫度68℃；在室溫下用2×SSC/0.1％ SDS洗滌2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％ SDS洗滌1次)，使所得濾器暴露於放射自顯影膜(Kodak，Rochester，New York，USA)達5至24小時，然後顯影。
結果顯示編碼RTX A溶血素亞單位的基因在所檢查的全部七種代表性牛莫拉氏菌菌株中是保守的。有趣的是，已知這些菌株每種都在馬血瓊脂上顯示溶血性表型。相反，非溶血性牛莫拉氏菌菌株Gordon 26L3沒有與RTX A基因探針雜交，可能提示牛莫拉氏菌僅含有負責在馬血瓊脂上檢出的溶血性表型的單一結構基因。
本領域技術人員將領會到，可以對如具體實施方式
所示發明進行大量改變和/或修改，而不背離如廣泛描述的發明精神或範圍。因此，這些實施方式被視為說明性的而非限制性的。
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序列表110The University of MelbourneCommonwealth Scientific and Industrial Research Organisation120莫拉氏菌屬的疫苗抗原1609170PatentIn Ver.2.121012111114212PRT213牛莫拉氏菌4001Met Ser Leu Gln Thr Gln Pro Ala Lys Arg Gly Phe Tyr Val Lys Pro1 5 10 15Leu Ser Met Ala Cys Met Leu Val Ile Ser Ala Ser Ser Thr Val Ser20 25 30Tyr Ala Asn Ser Ala Pro Met Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asn Ser Ser35 40 45Lys Tyr Ser Phe Tyr Asp Tyr Tyr Leu Asp Phe Leu Lys Arg Phe Arg50 55 60Pro Thr Pro Thr Pro Val Pro Ser Pro Val Arg Pro Ala Pro Glu Leu65 70 75 80Val Arg Pro Thr Pro Ala Pro Ile Pro Ala Pro Thr Pro Val Pro Thr85 90 95Pro Ala Pro Ile Ser Gly Gly Ile Ser Gly Ser Tyr Ile Ala Pro Val100 105 110Ser Pro Ser Glu Val Arg Gln Pro Asp Tyr Thr Arg Arg Val Gln Ala115 120 125Asn Leu Lys Arg Asn Gln Pro Ala Pro Ser Ala Gly Thr Arg Thr Gly130 135 140Tyr Ser Val Met Asp Thr Ser Asn Asn Ser Asn Leu Thr Ser Lys Phe145 150 155 160Tyr Gly Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ala Glu Arg Leu Asp Asn Leu Lys165 170 175Asn Thr Ile Asp Thr Arg Gln Ala Lys 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103010351040Ala His Ala Val Ser Arg Asp Thr Asn Leu Asp Thr Arg Tyr Val Gly104510501055Thr Ala Thr Asp Val Gln Tyr Gly Thr Trp Asp Thr Asp Lys Thr Lys106010651070Trp Ser Ala Lys Val Gly Ala Asn Tyr Asn Val Thr Pro Asn Ser Gln107510801085Val Gly Leu Asn Tyr Ser Tyr Thr Gly Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ser109010951100Gln Val Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe1105 111021022114384212DNA213牛莫拉氏菌4002ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360cacacccgtc ctgtggatca ataattaatg aacatatata ctctatttaa tatttcttat 420ttattcgtaa tattgccata aaaataatac attatttcta tattaactaa actgttaata 480tttgtaaata ataaacattt gtttatctaa aaaaataaat aatataaatc 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attacggctc ttattacact gacaatcagg gtaatttcta 2280tgttcctggc aatgtcaatt gggaaaaccg tcgaattgtc gctaatcata acggcaagaa 2340cattacatgg gaagatggtt ggggtttgtt agatccagaa gcggccgcta aaggttatgg 2400tggtttctat tgggataatg tggaattaga cactaaaggc acgcctttat ctgtattcta 2460caatgaccta aaaggtgata aaggctttac caaaaaaggt gaaggtaaac ttgtctttac 2520tggtaataat agctataaag gcgactctgt catcgagggt ggttcactag aagtaaatgg 2580taacaacggt ggttcaacca tggttgttaa aggtggtgaa ctaacaggtt atggtaatgt 2640agctaatgtt cgtcaaacag gtggttgggt taacaacgaa ggtaacctaa acatcagagg 2700tgactacaac atcaacactc aacgtggcgt ggatgctggt ctaaaagctc aatttggcaa 2760catgcttacc gtggacggta aggccaaact aggtggtaca ctaaatctaa ctggtgagac 2820caaagatggt atcatcagca aatcaggtag ccgtagcact gtacttcgtg ctaagcgtgg 2880tcttgaaggt caatttgaca attatcgttc aagcaaccca ttatttgaag taacaaatgt 2940tgaatatacg ccagaagtag acagaaatgg cagagtggta ggtggttcac gcacgaacaa 3000tgacgtgcaa gtaactgcca aacgtctaag tgcaggcaat gttgtttatg gcatcagcat 3060gaatgacagt ggtagccgtg ttgcacaaaa 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525Pro Ala Leu Thr Leu Thr Gly Gly Ile Ala His Ala His Glu Phe Asn530 535 540Asp Asp Glu Arg Thr Ile Asn Ala Thr Leu Thr Ser Ile Arg Glu Tyr545 550 555 560Thr Lys Gly Phe Asn Thr Ser Val Ser Thr Asp Lys Ser His Ala Thr565 570 575Thr Ala His Leu Gly Val Gln Gly Gln Leu Gly Lys Ala Asn Ile His580 585 590Ala Gly Val His Ala Thr His Gln Asp Ser Asp Thr Asp Val Gly Gly595 600 605Ser Leu Gly Val Arg Leu Met Phe610 61521042112110212DNA213牛莫拉氏菌4004tgacaaataa ttgggcattg ggcagataac ccatcaaaga cccaaagcaa cccataaatc 60aaaaaaacac ttgtaatttt tgtaatatct tgttacactt tacaagtgtt tttactttga 120aagcaactca gagagtaata atgaaaaaat ccgcctttgc caaatactca gcacttgccc 180taatggttgg gatgtgcctg cacaccgctt acgccaagga gtttagccaa gtcatcattt 240ttggggacag cttgtccgat acaggtcgcc taaaagatat ggtcgcccga aaagatggca 300cccttggcaa caccttacag ccatctttta ccaccaaccc cgaccctgta tggtcaagct 360tatttgccca aagttatggc aaaaccgcca gtgccaacac gccctacaat cccactggca 420ctaactatgc cgtgggcgga gctcgctctg gctcggaggt caattggaat ggttttgtga 480atgtaccctc caccaaaacg caaatcaccg accatttgac cgccacaggt ggcaaagccg 540accctaatac cctgtatgcc atttggattg gctctaatga cttaatttca gcttctcaag 600ccaccacaac agccgaagcc caaaacgcca ttaaaggtgc ggtaactcgc accgtgatag 660acatcgaaac actcaatcaa gcaggggcga caaccatttt ggtgccaaat gtgcctgatt 720tgagcctcac gccccgagcc atctatggcg aaagcctcat ggcaggcgtg caagacaaag 780ccaaactcgc ctcaagtctg tataatagcg gtctgtttga agcattaaat caatccaccg 840ccaacatcat ccctgccaac acctttgccc tactccaaga agcgaccaca aataaagaag 900cctttggttt taaaaacacg caaggcgtgg cgtgtcaaat gcccgctcgt accacagggg 960cggatgatgt ggcttctact tccttggcat gtaccaaagc caatcttata gaaaacgggg 1020caaatgacac ctacgccttt gccgatgaca ttcacccatc gggacgcacg caccgcattt 1080tggcacagta ttaccgttct atcatggacg cccctactca catgggtaaa ctctcaggcg 1140agcttgtcaa aacaggttca gcccacgacc gtcatgttta ccgtcagctt gacaggctta 1200gtggctcaca gcacagcatt tgggcaaacg tccatgccag cgaccgtacc gaccccacca 1260cccaaatcgg cttggacgtg gcaggttcat caagccatac aggggcgtat ctgagccacc 1320aaaaccaaga ttatgtgctg 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Ala Ser Thr Gly Lys225 230 235 240Lys Val Ala Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asn Gln Val Ile Gly Asn Val245 250 255Thr Lys Ala Ile Ser Ser Tyr Val Leu Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly260 265 270Leu Ser Thr Thr Gly Ala Val Ala Ala Leu Ile Thr Ser Ser Ile Met275 280 285Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Met Asn Ala Ala Asp Lys Phe Asn290 295 300His Ala Asn Ala Leu Asp Glu Phe Ala Lys Gln Phe Arg Lys Phe Gly305 310 315 320Tyr Asp Gly Asp His Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Val Gly Thr325 330 335Ile Glu Ala Ser Leu Thr Thr Ile Ser Thr Ala Leu Gly Ala Val Ser340 345 350Ala Gly Val Ser Ala Ala Ala Val Gly Ser Ala Val Gly Thr Pro Ile355 360 365Ala Leu Leu Val Ala Gly Val Thr Gly Leu Ile Ser Gly Ile Leu Glu370 375 380Ala Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu Ser Val Ala Asn Arg Leu Gln Gly385 390 395 400Lys Ile Leu Glu Trp Glu Lys Gln Asn Gly Gly Gln Asn Tyr Phe Asp405 410 415Lys Gly Tyr Asp Ser Arg Tyr Ala Ala Tyr Leu Ala Asn Asn Leu Lys420 425 430Phe Leu Ser Glu Leu Asn Lys Glu Leu Glu Ala Glu Arg Val Ile Ala435 440 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1.多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.1胺基酸37至1114所述胺基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
2.如權利要求1所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1胺基酸37至1114所示序列的同一性為至少70％的序列。
3.如權利要求1所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1胺基酸37至1114所示序列的同一性為至少80％的序列。
4.如權利要求1所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1胺基酸37至1114所示序列的同一性為至少90％的序列。
5.如權利要求1至4任意一項所要求保護的多肽，該多肽具有蛋白酶活性。
6.核酸分子，該核酸分子包含編碼如權利要求1至5任意一項所要求保護的多肽的序列。
7.核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.2所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴格條件下與之雜交的序列。
8.如權利要求7所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少70％的序列。
9.如權利要求7所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少80％的序列。
10.如權利要求7所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少90％的序列。
11.用於提高動物免疫應答的組合物，該組合物包含如權利要求1至5任意一項所要求保護的多肽或如權利要求6所要求保護的的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
12.多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.3胺基酸26至616所述胺基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
13.如權利要求12所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3胺基酸26至616所示序列的同一性為至少70％的序列。
14.如權利要求12所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3胺基酸26至616所示序列的同一性為至少80％的序列。
15.如權利要求12所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3胺基酸26至616所示序列的同一性為至少90％的序列。
16.如權利要求12至15任意一項所要求保護的多肽，該多肽具有脂肪酶活性。
17.核酸分子，該核酸分子包含編碼權利要求12至16任意一項的多肽的序列。
18.核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.4所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴格條件下與之雜交的序列。
19.如權利要求18所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少70％的序列。
20.如權利要求18所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少80％的序列。
21.如權利要求18所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少90％的序列。
22.用於提高動物免疫應答的組合物，該組合物包含如權利要求12至16任意一項所要求保護的多肽或如權利要求17所要求保護的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
23.多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.5所述胺基酸序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或其功能片段。
24.如權利要求23所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少70％的序列。
25.如權利要求23所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少80％的序列。
26.如權利要求23所要求保護的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少90％的序列。
27.如權利要求23至26任意一項所要求保護的多肽，該多肽具有溶血素活性。
28.核酸分子，該核酸分子包含編碼權利要求23至27任意一項的多肽的序列。
29.核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.6所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴格條件下與之雜交的序列。
30.如權利要求29所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少70％的序列。
31.如權利要求29所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少80％的序列。
32.如權利要求29所要求保護的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少90％的序列。
33.用於提高動物免疫應答的組合物，該組合物包含權利要求23至27任意一項的多肽或權利要求28的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
34.用於提高動物針對莫拉氏菌屬的免疫應答的組合物，該組合物包含至少一種多肽，選自由如權利要求1至5任意一項所要求保護的多肽、如權利要求12至16任意一項所要求保護的多肽和如權利要求23至27任意一項所要求保護的多肽組成的組，可選地還包括佐劑或載體。
35.如權利要求34所要求保護的組合物，該組合物包含如 23至27任意一項所要求保護的多肽，以及如權利要求1至5任意一項所要求保護的多肽與如權利要求12至16任意一項所要求保護的多肽二者之一，或優選地二者皆是。
36.如權利要求34或權利要求35所要求保護的組合物，其中該莫拉氏菌是牛莫拉氏菌或黏膜炎莫拉氏菌。
37.如權利要求34或權利要求35所要求保護的組合物，其中該莫拉氏菌是牛莫拉氏菌。
38.針對多肽而產生的抗體，該多肽選自由如權利要求1至5任意一項所要求保護的多肽、如權利要求12至16任意一項所要求保護的多肽和如權利要求23至27任意一項所要求保護的多肽組成的組。
全文摘要
本發明涉及莫拉氏菌屬、特別是牛莫拉氏菌的抗原、編碼這些抗原的核酸序列和用於提高抗莫拉氏菌屬的免疫應答的製劑。
文檔編號A61K39/00GK1377369SQ00813618
公開日2002年10月30日 申請日期2000年8月31日 優先權日1999年8月31日
發明者J·法恩, R·斯圖耐爾, J·坦耐特 申請人:聯邦科學和工業研究組織, 墨爾本大學