一種高敏c反應蛋白測定試劑盒的製作方法
2023-12-08 23:29:16
專利名稱：一種高敏c反應蛋白測定試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學免疫學領域，涉及一種免疫檢測試劑，進一步地，本發明涉及一種高敏C反應蛋白測定試劑盒。
背景技術：
C反應蛋白(CRP)是一種能和肺炎鏈球菌的莢膜C多糖結合，由5個相同的亞單位(23KD)以非共價鏈聚集形成的環狀五聚體蛋白，分子量為115KD，是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎性刺激時肝細胞合成的急性時相蛋白。在炎症開始數小時CRP就升高，隨著組織結構和功能的復原其含量恢復正常。因此，CRP的測定對病程監測、治療效果判斷和預後評價有重大意義。
健康人無感染時的CRP水平還可預測將來心肌梗塞及中風的危險性。健康人CRP參考範圍的中位數基本為0.58～1.13mg/L.CRP含量＞2.1mg/L的人，比較CRP含量≤1mg/L者，將來發生心肌梗塞的危險性為後者的2.9倍；發生缺血性中風的危險性為後者的1.9倍；發生外周動脈血管性疾病的危險性為後者的4.1倍。CRP與血脂(總膽固醇，總膽固醇高密度脂蛋白膽固醇的比值)的聯合測定，較其他的危險因子更能預示發生心、腦血管疾病的危險性，是目前進行冠心病危險評估的最佳模型。
高敏CRP(HS-CRP)是基於其測定方法更敏感而命名。臨床常規測定CRP的方法為免疫比濁法，測定範圍一般為3～200mg/L，靈敏度相對較低，無法準確測定3mg/L以下水平的CRP的含量。即無法作為心、腦血管疾病的危險指標，預測將來心、腦血管疾病發生的危險性。
常規的CRP試劑的構成為R-1(緩衝液)和R-2(CRP抗體)。其原理為血清中的C-反應蛋白與抗人C-反應蛋白抗體結合，產生抗原抗體反應，形成凝集。測定此凝集反應在一定波長處的吸光度，對照標準曲線可求出C-反應蛋白的含量。
但是，使用常規的CRP測定方法(如免疫比濁法或普通的膠乳凝集反應法)往往靈敏度低，無法保證低含量範圍測定結果的準確性，雖然可用於對感染性疾病的診斷或療效觀察，但是不適用於對將來心腦血管疾病的預測或預後評估。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種高靈敏度的，準確測定3mg/L以下水平的CRP的含量的高敏C反應蛋白測定試劑盒，所述的試劑盒包含試劑R-1、試劑R-2，所述的試劑R-1為結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為200-240nm，置於適當的緩衝液中；所述的試劑R-2為結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為30-70nm，置於適當的緩衝液中。
進一步的，在本發明所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒中，試劑R-1中結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.05～0.5mg/ml；試劑R-2中結合有羊抗人C-反應蛋白抗血清的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.5～1.0mg/ml。更進一步的，在本發明所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒中，試劑R-1中結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.1mg/ml；試劑R-2中結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.6mg/ml。
在本發明所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒中，還可包含CRP參考血清。進一步的，所述的CRP參考血清中CRP含量為0～300mg/L之間的6個含量。更進一步的，CRP參考血清1為5％蛋白含量的牛血清白蛋白；CRP參考血清2-6為不同CRP含量的人血清。
進一步的，在本發明中，所述的緩衝液包括但不限於磷酸緩衝液或甘氨酸緩衝液，以及其他具有相似性質的緩衝液。
更進一步的，其中還可以包含一種使用說明書。
採用本發明所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒進行測定時，先將樣品與試劑R-1混合，讀取吸光度A-1，之後加入R-2，讀取吸光度A-2，計算反應吸光度，最後獲得C-反應蛋白的含量。更進一步的，採用6點定標的方法，以樣條函數作為計算模式，根據吸光度與參考血清的值作劑量/響應曲線，根據吸光度值在劑量/響應曲線上算出樣品含量。
本發明作出改進的主要目的是提高CRP測定的靈敏度，即保證低含量水平的測定靈敏度。本發明的試劑盒中採用的試劑與同類的現有試劑相比，存在諸多的優點，具體可參見表1所述。
表1
本發明採用膠乳凝集反應法。膠乳凝集反應法是一種間接凝集試驗，其原理是包被了抗原或抗體的膠乳微粒(免疫膠乳)，與標本中相應抗體或抗原發生免疫反應後，形成凝集顆粒，凝集物的形成使反應混合系統形成一定濁度，濁度增加的程度與標本中被檢物濃度成正比關係，在一定波長下進行濁度測定，即可測出標本中被檢物的含量。
在本發明中，血清中的C-反應蛋白與結合在膠乳顆粒表面的羊抗人C-反應蛋白抗體結合，產生抗原抗體反應，使膠乳顆粒形成凝集。測定此凝集反應在570nm波長處的吸光度，對照標準曲線可求出C-反應蛋白的含量。
在本發明中，膠乳凝集反應所使用的是苯乙烯膠乳(日本的UNF公司)，本發明中為了說明的方便起見，在一些地方將「苯乙烯膠乳」簡稱為「膠乳」，本領域人員應明白，在本發明的上下文中所指的「膠乳」均為「苯乙烯膠乳」。
本發明的膠乳凝集反應法既保證了低含量水平的測定靈敏度，可測得的最低含量為0.1mg/L；又保證了高含量水平的測定線性，可測至350mg/L。本測定試劑為液體雙試劑，具有靈敏、準確、特異、抗幹擾性強等優點，適用於自動分析儀測定血清中CRP的含量。
圖1顯示了6種不同含量的CRP參考血清的反應曲線，每條曲線代表了1種含量的參考血清，其中X軸表示測光點；Y軸表示吸光度。
圖2顯示了6種不同含量的CRP參考血清的標準曲線，每個點代表1種含量的參考血清，其中X軸表示CRP的含量；Y軸表示吸光度。
圖3顯示了2種CRP含量不同的人血清經不同倍數稀釋後測得的結果，每條曲線由下至上的10個點分別代表了不同的稀釋倍數，其中X軸表示不同的稀釋倍數；Y軸表示CRP的含量。
圖4是對應表2所作的圖，中間的6個點表示的是6種不同CRP含量的樣品的測定結果均值(MEAN)，點上的豎線的上端為均值+2SD；下端為均值-2SD。
圖5是分別採用本試劑和日本A公司的膠乳凝集反應法在試劑，採用日立7020型自動分析儀對50份人血清進行測定，測定的結果作相關圖。其中X軸表示的是採用日本A公司試劑測得的結果；Y軸表示的是採用本公司試劑測得的結果；相關係數Y＝0.999，回歸方程y＝0.994x+0.136。
圖6是採用本發明一種高敏C反應蛋白試劑盒測定蛋白含量方法的示意圖。
具體實施例方式
實施例1 本發明的測定試劑的製備本發明的試劑盒涉及的試劑的主要原材料如下1.CRP抗體(購自日本UNF公司)。採用免疫電泳法測定，抗體與人CRP之間呈現單一的沉澱弧；採用滴定法測定，效價為5mg抗原/ml抗體以上。
2.膠乳。本發明採用苯乙烯膠乳(購自日本UNF公司)。兩種膠乳的顆粒直徑分別為30-70nm和200-240nm。
3.人血清(購自上海生物製品研究所)。採用經HBsAg、HCV、HIV-1/HIV-2抗體、梅毒血清學檢測為陰性，ALT值在正常範圍內的不同CRP含量的人血清。
本實施例的主要試劑的配製如下試劑R-1用磷酸緩衝液稀釋CRP抗體，加入膠乳(膠乳顆粒直徑200-240nm)並混勻後，離心棄上清，經抗體和膠乳結合確認試驗後，再以磷酸緩衝液調整至含量0.1mg/ml。該試劑為乳白色溶液。
試劑R-2用磷酸緩衝液稀釋CRP抗血清，加入膠乳(膠乳顆粒直徑30-70nm)並混勻後，離心棄上清，經抗體和膠乳結合確認試驗後，再以磷酸緩衝液調整至含量0.6mg/ml。該試劑為乳白色溶液。
C-反應蛋白參考血清1取牛血清白蛋白溶解於純化水中，使蛋白含量為5％，除菌過濾。該參考血清為微黃色澄清液體。
C-反應蛋白參考血清2～6不同CRP含量的人血清，除菌過濾。這些參考血清均為微黃色澄清液體。
C反應蛋白參考血清定值以日本進口的C反應蛋白參考血清為原始標準，採用膠乳凝集反應法，分別對C反應蛋白參考血清2-6進行20次測定，取均值為各含量的定值。
實施例2 高敏C反應蛋白的測定1.本發明的測試方法的一些測試條件以及參數如下試劑空白吸光度採用日立7020型自動分析儀，以生理鹽水或C反應蛋白參考血清中的含量為0mg/L的參考血清為樣品，測定其原始吸光度，測光點第35點處的原始吸光度A0應≤0.600。
試劑測定範圍採用日立7020型自動分析儀，以C反應蛋白參考血清中的含量約為300mg/L的參考血清為樣品，測定其原始吸光度，測光點第35點處的原始吸光度A300mg/L應≥1.200。
精密度批內變異CV≤10.0％；批間變異CV≤15％。
準確性校正品(定值質量控制血清)的實測值應為標示值±20％。
2.高敏C反應蛋白含量測定方法(如圖6所示)分析方法2點終點法；主波長570nm，副波長800nm(可不用)；樣品量6.0ul；R-1300ul；R-2100ul；校準方式樣條函數Spline；反應方向上升；測定溫度37℃樣品與R-1混勻後，於第40秒讀取吸光度A1；於5分鐘時加入R-2，於10分鐘時讀取吸光度A2。反應吸光度的計算為A2與A1的校準差值。
計算方法6點定標，以樣條函數作為計算模式。根據吸光度與參考血清的值作劑量/響應曲線，樣品含量可根據其吸光度值在劑量/響應曲線上算出。
參考範圍血清＜3mg/L；健康人無感染時C-反應蛋白＞1mg/L能預示將來發生心、腦血管疾病的危險性。
通過本發明的方法，獲得的反應曲線見圖1所示，採用日立7020型自動分析儀測得了6種不同含量的CRP參考血清的反應曲線。每條曲線代表1種含量的參考血清。其中X軸表示的是測光點；Y軸表示的是吸光度。
採用日立7020型自動分析儀測得的6種不同含量的CRP參考血清的標準曲線見圖2所示。每個點代表了1種含量的參考血清。其中X軸表示的是CRP的含量；Y軸表示的是吸光度。
圖3表示兩種CRP含量不同的人血清經不同倍數稀釋後測得的結果。每條曲線由下至上的10個點分別代表了不同的稀釋倍數，即0、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10和10/10(即原倍)。其中X軸表示的是不同的稀釋倍數；Y軸表示的是CRP的含量。
實施例3 本發明的檢測試劑的靈敏度、精密度以及幹擾試驗1.靈敏度試驗圖4是根據表2(表2的數據是採用日立7020型自動分析儀測得)所作的圖，顯示了本發明的檢測試劑的靈敏度。中間的6個點表示的是6種不同CRP含量的樣品的測定結果均值(MEAN)，點上的豎線的上端為均值+2SD；下端為均值-2SD。從圖4可見，本發明的檢測試劑對於極低的CRP含量也是非常靈敏的。
表2
2.精密度試驗使用二種CRP含量不同的人血清樣品(從醫院實驗室獲得的人血清樣品)，測定本發明的檢測試劑的精密度(日間變異)。將2份樣品在20天中每天各測定1次，獲得均值、最小值、最大值、標準差和變異係數見表3。同一樣品在不同時間測得的結果是很相近的，表明使用本發明的測定試劑進行測定時的精密度是很高的。
表3
3.幹擾試驗本發明還對所述的檢測試劑進行了幹擾試驗，在同一份樣品(從醫院實驗室獲得的人血清樣品)中分別加入不同含量的幹擾物質後測定。加入幹擾物質後的測定值除以加入幹擾物質前的測定值即為影響率，獲得的結果見表4。加入幹擾物質後，影響率保持在100％附近，可見即使加入幹擾物質，但是對本發明的測定結果影響極小。
表4添加量單位mg/dl；影響率單位％
實施例4 本發明的測定試劑的穩定性試驗在2-8℃貯存條件下，分別在0月(配製後)、6月和14月時採用本試劑R-1和R-2測得的空白吸光度和標準(300mg/L)吸光度(上述吸光度均為日立7020自動分析儀第35測光點的原始吸光度)、定值質量控制血清測定值和標示值之比、根據對定值質量控制血清5次測定結果計算的批內變異。結果見表5，在6月和14月時與0月相比，質控測得值差異很小，可見本發明中使用的試劑在2-8℃貯存條件下可穩定一年。
表5
在37℃貯存條件下，分別在0天(配製後)、3天、5天和7天時採用本試劑測得的空白吸光度和標準(300mg/L)吸光度(上述吸光度均為日立7020自動分析儀第35測光點的原始吸光度)、定值質量控制血清測定值和標示值之比、根據對定值質量控制血清5次測定結果計算的批內變異。結果見表6，在3天、5天和7天時與0天相比，質控測得值差異很小，可見在37℃貯存條件下本發明中的試劑可穩定7天。
表6
試劑開封後，在49天內，10次測定6種不同含量的CRP參考血清所得的吸光度均值、最小值、最大值、標準差和吸光度日間變異見表7，可見本發明中使用的試劑即使在開封後，可穩定一個月以上。
表7
權利要求
1.一種高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，包含試劑R-1、試劑R-2，所述的試劑R-1為結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為200-240nm，置於適當的緩衝液中；所述的試劑R-2為結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為30-70nm，置於適當的緩衝液中。
2.根據權利要求1所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，在試劑R-1中，結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.05～0.5mg/ml；在試劑R-2中，結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.5～1.0mg/ml。
3.根據權利要求2所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，在試劑R-1中，結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.1mg/ml；在試劑R-2中，結合有羊抗人C-反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液的含量為0.6mg/ml。
4.根據權利要求1所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，其中還包含CRP參考血清。
5.根據權利要求4所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，所述的CRP參考血清中，CRP含量為0～300mg/L之間的6個含量。
6.根據權利要求4所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，CRP參考血清1為5％蛋白含量的牛血清白蛋白；CRP參考血清2-6為不同CRP含量的人血清。
7.根據權利要求1所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，所述的緩衝液選自磷酸緩衝液或甘氨酸緩衝液。
8.根據權利要求1所述的高敏C反應蛋白測定試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒中還包含一種使用說明書。
全文摘要
本發明屬於醫學免疫學領域，公開了一種高敏C反應蛋白測定試劑盒，其中包含試劑R－1、試劑R－2，所述的試劑R－1為結合有羊抗人C－反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為200－240nm，置於適當的緩衝液中；所述的試劑R－2為結合有羊抗人C－反應蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為30－70nm，置於適當的緩衝液中。本發明的試劑通過膠乳凝集反應法進行測定，使用本發明的方法保證了低含量水平的測定靈敏度，既可用於對感染性疾病的診斷或療效觀察，又可用於對心腦血管疾病的預測或預後評估。本試劑使用便捷，在規定的貯存條件下可穩定一年。
文檔編號G01N21/75GK1769894SQ20041006768
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月1日 優先權日2004年11月1日
發明者費華, 周玲玲 申請人:上海申索佑福醫學診斷用品有限公司