因子XIa抑制劑的製作方法
2023-12-08 23:31:46
因子XIa是參與血液凝固調節的血漿絲氨酸蛋白酶。雖然血液凝固是調節有機體內穩態的必要和重要的部分，但異常凝血也可能具有有害作用。例如，血栓形成是在血管或心腔內形成或存在血塊。這種血塊可以滯留在血管中，從而阻斷循環並誘導心臟病發作或中風。血栓栓塞病症是工業化世界中死亡和殘疾的最大原因。
血液凝固是控制哺乳動物生存所必需的血流的過程。在血管損傷後開始凝固過程及隨後的傷口癒合發生後的凝塊溶解，並且可以分為四個階段。第一階段，血管收縮或血管緊縮，可導致損傷區域的失血量減少。在下一階段，凝血酶導致血小板活化，血小板粘附到血管壁損傷部位並形成血小板聚集體。在第三階段，凝塊複合物的形成導致凝血酶大量形成，其通過裂解兩個小肽將可溶性纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。在第四階段，傷口癒合後，通過內源性纖維蛋白溶解系統的關鍵酶纖維蛋白溶酶的作用溶解血栓。
兩種可替換的途徑可以導致纖維蛋白凝塊的形成，即內在途徑和外在途徑。這些途徑由不同的機制啟動，但在後期階段，它們匯聚得到共同的最終的凝血級聯路徑。在這個最終的凝血路徑中，凝血因子X被活化。活化的因子X負責從在血液中循環的無活性前體凝血酶原形成凝血酶。在沒有傷口的血管壁異常的底部上形成血栓是內在途徑的結果。作為對組織損傷或傷害作出反應的纖維蛋白凝塊形成是外在途徑的結果。兩種途徑都包含相對大量的蛋白質，其被稱為凝血因子。內在途徑需要凝血因子V、VIII、IX、X、XI和XII以及前激肽釋放酶、高分子量激肽原、鈣離子和來自血小板的磷脂。因子XIa的活化是凝固活化的兩個途徑之間的中心交叉點。因子XIa在血液凝固中具有重要作用。
當血液暴露於人工表面(例如，在血液透析期間、「體外循環」心血管手術、血管移植物、細菌性敗血症)、細胞表面上、細胞受體、細胞碎片、DNA、RNA和細胞外基質時，凝血開始。該過程也被稱為接觸活化。因子XII的表面吸收導致因子XII分子的構象變化，從而促進對蛋白水解活性因子XII分子(因子25 XIIa和因子XIIf)的活化。因子XIIa(或XIIf)具有許多靶蛋白，包括血漿前激肽釋放酶和因子XI。活性血漿激肽釋放酶進一步活化因子XII，導致接觸活化的擴大。或者，絲氨酸蛋白酶脯氨醯羧肽酶可以活化在細胞和基質表面上形成的多蛋白複合物中與高分子量激肽原複合的血漿激肽釋放酶(Shariat-Madar等人，Blood，108:192-199 (2006))。接觸活化是部分地負責調節血栓形成和炎症的表面介導的過程，並且至少部分地由纖維蛋白溶解、補體、激肽原/激肽和其他體液和細胞途徑介導(綜述，Coleman，R.，「Contact ActivationPathway」，Hemostasis and Thrombosis，pp. 103-122，Lippincott Williams & Wilkins(2001)；Schmaier，A.H.，「Contact Activation」，Thrombosis and Hemorrhage，pp. 105-128 (1998))。接觸活化系統對5種血栓栓塞性疾病的生物相關性由因子XII缺陷小鼠的表型支持。更具體地，在幾種血栓形成模型以及中風模型中保護因子XII缺陷小鼠免於血栓性血管閉塞，並且XII缺陷小鼠的表型與XI缺陷小鼠相同(Renne等人，J Exp. Med.，202:271-281 (2005)；Kleinschmitz等人，J Exp. Med.，203:513-518 (2006))。因子XI是因子XIIa的下遊，與XII和XI缺陷小鼠的相同表型相結合的事實表明接觸活化系統可在體內XI因子活化中起主要作用。
血漿激肽釋放酶是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的酶原並且存在於血漿中。基因結構類似於因子XI的基因結構。總的來說，血漿激肽釋放酶的胺基酸序列與因子XI具有58%的同源性。通過因子XIIa在內部I 389-R390鍵處的蛋白水解活化產生重鏈(371個胺基酸)和輕鏈(248個胺基酸)。血漿激肽釋放酶的活性位點包含在輕鏈中。血漿激肽釋放酶的輕鏈與15種蛋白酶抑制劑反應，包括α2巨球蛋白和Cl抑制劑。有趣的是，在高分子量激肽原(HMWK)存在下，肝素顯著加速抗凝血酶III對血漿激肽釋放酶的抑制。在血液中，大多數血漿激肽釋放酶與HMWK複合循環。血漿激肽釋放酶裂解HMWK以釋放緩激肽。緩激肽釋放導致血管通透性和血管擴張的增加(綜述，Coleman，R.，「Contact Activation Pathway」，Hemostasis and Thrombosis，pp. 103-122，Lippincott Williams & Wilkins (2001)；Schmaier A.H.，「Contact Activation」，Thrombosis and Hemorrhage，pp. 105-128 (1998))。
在C1酯酶抑制劑上呈現遺傳缺陷的患者患有遺傳性血管水腫(HAE)，其是導致在包括手、腳、臉、咽喉、生殖器和胃腸道在內的整個身體內間歇性腫脹的終身疾病。由急性發作引起的水皰的分析已經顯示含有高水平的血漿激肽釋放酶，並且用基於蛋白質的可逆血漿激肽釋放酶抑制劑Ecallantide(Kalbitor)治療，其已被FDA批准用於治療HAE的急性發作(Schneider，L等人，J.Allergy Clin.Immunol.，120：p.416 (2007))。
此外，血漿激肽釋放酶-激肽系統在診斷為晚期糖尿病性黃斑水腫(DME)的患者中異常豐富。最近的出版物已經顯示血漿激肽釋放酶有助於糖尿病齧齒動物模型中觀察到的視網膜血管滲漏和功能障礙(A. Clermont等人，Diabetes，60:1590 (2011))，並且用小分子血漿激肽釋放酶抑制劑治療改善了觀察到的視網膜血管通透性和其他與視網膜血流量相關的異常。
因子XIa抑制劑化合物描述於WO2014160592、WO2013022814、WO 2013022814、WO 2013022818、WO 2013055984、WO2013056034、WO2013056060、WO2013118805、WO2013093484、WO2002042273、WO2002037937、WO2002060894、WO2003015715、WO2004002405、US20040180855、WO2004080971、WO2004094372、US20050228000、US20050282805、WO2005123680、US20090036438、US20120088758、US20060074103、WO2006062972、WO2006076246、US20060154915、US20090062287、US20060183771、WO2007070818、WO2007070816、WO2007070826、WO2008076805、WO2008157162、WO2009114677、WO2011100402和WO2011100401中
發明概述
本發明涉及式I化合物：
或其藥學上可接受的鹽。式I化合物是選擇性因子XIa抑制劑或因子XIa和血漿激肽釋放酶的雙重抑制劑，因此可用於治療、抑制或改善可受益於因子XIa或血漿激肽釋放酶抑制的一種或多種疾病狀態，包括血栓形成、栓塞、高凝狀態或纖維化變化。本發明化合物可以進一步與其它治療有效的試劑組合使用，包括但不限於可用於治療血栓形成、栓塞、高凝狀態或纖維化變化的其它藥物。本發明還涉及製備式I化合物的方法和包含式I化合物的藥物組合物。
發明詳述
本發明涉及式I化合物：
其中R1為芳基、雜芳基、C3-6環烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4、OR4、(C=O)R4、(C=O)OR4、NR4R5、(C1-3烷基)NR4R5、NH(C=O)R4、NH(C=O)OR4、C(NH)NR4R5、C3-6環烷基和雜芳基(其任選被滷素、氰基、(C=O)NR4R5或R4取代)的取代基取代；
R2為氫、羥基或CH(R2a)(R2b)；
R2a為C1-6烷基、芳基、雜芳基、C3-6環烷基或雜烷基，其中所述烷基任選被1至3個獨立地選自滷素、羥基和氰基的取代基取代，並且其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4和OR4的取代基取代；
R2b為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素、羥基和氰基的取代基取代；
R3為芳基、雜芳基、C3-10環烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4、OR4、(C=O)R4、(C=O)OR4、NR4R5、NH(C=O)R4、NH(C=O)OR4、C(NH)NR4R5和雜芳基的取代基取代；
R4為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素和羥基的基團取代；
R5為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素和羥基的基團取代；
R6為氫、氰基、滷素、R4或OR4；
R7為氫、氰基、滷素、R4或OR4；
或其藥學上可接受的鹽。
本發明的一個實施方案涉及式Ia化合物：
其中R1為芳基、雜芳基、C3-6環烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4、OR4、(C=O)R4、(C=O)OR4、NR4R5、(C1-3烷基)NR4R5、NH(C=O)R4、NH(C=O)OR4、C(NH)NR4R5、C3-6環烷基和雜芳基(其任選被R4取代)的取代基取代；
R2a為C1-6烷基、芳基、雜芳基、C3-6環烷基或雜烷基，其中所述烷基任選被1至3個獨立地選自滷素、羥基和氰基的取代基取代，並且其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4和OR4的取代基取代；
R2b為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素、羥基和氰基的取代基取代；
R3為芳基、雜芳基、C3-10環烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4、OR4、(C=O)R4、(C=O)OR4、NR4R5、NH(C=O)R4、NH(C=O)OR4、C(NH)NR4R5和雜芳基的取代基取代；
R4為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素和羥基的基團取代；
R5為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素和羥基的基團取代；
R6為氫、滷素、R4或OR4；
R7為氫、滷素、R4或OR4；
或其藥學上可接受的鹽。
在本發明的一個實施方案中，R1為芳基，其任選被1至3個獨立地選自滷素、C3-6環烷基和雜芳基(其任選被R4取代)的取代基取代。在一類實施方案中，R1為苯基，其任選被1至3個獨立地選自滷素、C3-6環烷基、四唑基、噁唑基、三唑基、噻唑基、吡啶基、噻二唑基、吡嗪基和吡唑基的取代基取代。在實施方案的一個子類中，R1為苯基，其任選被1至3個獨立地選自氯、氟、C3-6環烷基和四唑基的取代基取代。
在本發明的一個實施方案中，R2為氫。在本發明的另一個實施方案中，R2為CH(R2a)(R2b)。
在本發明的一個實施方案中，R2a為芳基，其任選被1至3個滷素取代。在一類實施方案中，R2a為苯基。在另一類實施方案中，R2a為被滷素取代的苯基。在該實施方案的另一實施方案中，R2a為環丙基。
在本發明的一個實施方案中，R2b為氫。
在本發明的一個實施方案中，R3為芳基或雜芳基，其中所述芳基和雜芳基任選被1至3個獨立地選自滷素、R4和(C=O)OR4的取代基取代。在一類實施方案中，R3為任選被(C=O)OR4取代的芳基。在另一類實施方案中，R3為雜芳基。
本發明還涉及下式化合物：
其中R1為芳基、雜芳基、C3-6環烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4、OR4、(C=O)R4、(C=O)OR4、NR4R5、NH(C=O)R4、NH(C=O)OR4、C(NH)NR4R5、C3-6環烷基和雜芳基的取代基取代，其所述取代基任選被R4取代；
R2為氫或CH(R2a)(R2b)；
R2a為C1-6烷基、芳基、雜芳基、C3-6環烷基或雜烷基，其中所述烷基任選被1至3個獨立地選自滷素、羥基和氰基的取代基取代，並且其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4和OR4的取代基取代；
R2b為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素、羥基和氰基的取代基取代；
R3為芳基、雜芳基、C3-10環烷基或雜烷基，其中所述芳基、雜芳基、環烷基和雜環基任選被1至3個獨立地選自滷素、硝基、氰基、氧代、R4、OR4、(C=O)R4、(C=O)OR4、NR4R5、NH(C=O)R4、NH(C=O)OR4、C(NH)NR4R5和雜芳基的取代基取代；
R4為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素和羥基的基團取代，
R5為氫或C1-6烷基，其任選被1至3個獨立地選自滷素和羥基的基團取代，
或其藥學上可接受的鹽。
除非另有說明，否則提及上述優選類別和子類意味著包括特定和優選基團的所有組合。
本發明的具體實施方案包括但不限於本文中鑑定為實施例1至59的化合物或其藥學上可接受的鹽。
本發明範圍內還包括包含上述式I或式Ia化合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。本發明還意圖涵蓋包含藥學上可接受的載體和本申請中具體公開的任何化合物的藥物組合物。本發明的這些和其它方面將從本文包含的教導中顯而易見。
本發明還包括在哺乳動物中抑制血小板損失、抑制血小板聚集體形成、抑制纖維蛋白形成、抑制血栓形成、抑制栓子形成和治療炎性病症的組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的本發明化合物。這些組合物可任選包括抗凝劑、抗血小板劑和溶栓劑。可以將組合物加入到血液、血液製品或哺乳動物器官中，以便實現所需的抑制。
本發明還包括用於預防或治療哺乳動物的不穩定型心絞痛、難治性心絞痛、心肌梗死、短暫性腦缺血發作、心房顫動、血栓性中風、栓塞性中風、深靜脈血栓形成、彌散性血管內凝血、纖維蛋白的眼部積聚、以及再通血管的再閉塞或再狹窄的組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的本發明化合物。這些組合物可任選包括抗凝劑、抗血小板劑和溶栓劑。
本發明還包括通過將本發明化合物共價或非共價連接到表面來降低哺乳動物表面的血栓形成的方法。
本發明化合物為因子XIa抑制劑，並且可具有例如預防冠狀動脈疾病的治療價值。所述化合物為選擇性因子XIa抑制劑或因子XIa和血漿激肽釋放酶的雙重抑制劑。
本發明化合物可以以藥學上可接受的鹽的形式施用。術語「藥學上可接受的鹽」是指由藥學上可接受的無毒鹼或酸製備的鹽，包括無機或有機鹼和無機或有機酸。包括在術語「藥學上可接受的鹽」中的鹼性化合物的鹽是指本發明化合物的無毒鹽，其通常通過游離鹼與合適的有機或無機酸反應製備。本發明的鹼性化合物的代表性鹽包括但不限於以下：乙酸鹽、抗壞血酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、aspirate、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、右旋樟腦磺酸鹽(camsylate)、碳酸鹽、氯化物、克拉維酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二乙基乙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、二鹽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate)、乙烷磺酸鹽(ethanesulfonate)、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate)、葡庚糖酸鹽(glucoheptanoate)、葡糖酸鹽、穀氨酸鹽、甘油磷酸鹽、對羥乙醯氨基苯胂酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、己基間苯二酚鹽、海巴明鹽(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、羥基萘甲酸鹽、碘化物、異煙酸鹽、異硫代硫酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、甲磺酸鹽、粘酸鹽、2-萘磺酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、煙酸鹽、硝酸鹽、N-甲基葡糖胺銨鹽、油酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽(雙羥萘酸鹽)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、庚二酸鹽、苯丙酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、硫酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、三乙基碘化物、三氟乙酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。此外，當本發明化合物攜帶酸性部分時，其合適的藥學上可接受的鹽包括但不限於衍生自無機鹼的鹽，包括鋁、銨、鈣、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳、亞錳、鉀、鈉、鋅等。特別優選的是銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽和鈉鹽。衍生自藥學上可接受的有機無毒鹼的鹽包括伯胺、仲胺和叔胺、環胺、二環己基胺和鹼性離子交換樹脂，例如精氨酸、甜菜鹼、咖啡因、膽鹼、N,N-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡萄糖胺(glucosamine)、組氨酸、海巴明、異丙胺、賴氨酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可鹼、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。還包括鹼性含氮基團，其可被諸如以下的試劑季銨化：低級烷基滷化物如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如二甲酯、二乙酯、二丁酯；和硫酸二戊基酯；長鏈滷化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基滷化物如苄基和苯乙基溴化物等。
這些鹽可以通過已知的方法獲得，例如，通過將本發明化合物與等量的含有所需的酸、鹼等的溶液混合，然後通過過濾鹽或蒸餾出溶劑來收集所需的鹽。本發明化合物及其鹽可以與溶劑如水、乙醇或甘油形成溶劑合物。本發明化合物可以形成酸加成鹽並根據側鏈的取代基的類型同時與鹼形成鹽。
本發明包括式I和式Ia化合物的所有立體異構體形式。除非另有說明，存在於式I和式Ia化合物中的不對稱中心均可以彼此獨立地具有(R)構型或(S)構型。當與手性碳的鍵在本發明的結構式中表示為直線時，應理解手性碳的(R)和(S)構型以及因此兩種對映異構體及其混合物都包含在該式中。類似地，當記載化合物名稱而沒有手性碳的手性命名時，應理解，手性碳的(R)和(S)構型以及因此單個對映異構體及其混合物都被該名稱包括。在獲得這些立體異構體或混合物的實施例中可以鑑定特定立體異構體或其混合物的製備，但這決不限制所有立體異構體及其混合物包括在本發明的範圍內。
本發明包括所有可能的對映異構體和非對映異構體以及兩種或更多種立體異構體的混合物，例如所有比例的對映異構體和/或非對映異構體的混合物。因此，本發明的主題是左旋和右旋對映體形式的對映異構體純形式、外消旋體形式和所有比例的兩種對映異構體混合物的形式的對映異構體。在順式/反式異構的情況下，本發明包括順式和反式兩種形式以及這些形式的所有比例的混合物。如果需要的話，可以通過常規方法，例如通過色譜或結晶分離混合物，通過使用立體化學均勻的原料用於合成或通過立體選擇性合成來進行單獨的立體異構體的製備。任選地，可以在分離立體異構體之前進行衍生化。立體異構體混合物的分離可以在合成式I或式Ia化合物期間的中間步驟中進行，或者可以在最終的外消旋產物上進行。絕對立體化學可以通過結晶產物或結晶中間體的X射線晶體學確定，如果需要的話，其用含有已知構型的立體中心的試劑衍生化。當本發明化合物能夠互變異構時，所有單獨的互變異構體及其混合物都包括在本發明的範圍內。本發明包括所有這些異構體，以及這些外消旋體、對映異構體、非對映異構體和互變異構體及其混合物的鹽、溶劑合物(包括水合物)和溶劑化鹽。
在本發明化合物中，原子可以顯示出它們的天然同位素豐度，或者可以將一個或多個原子人工富集在具有相同原子序數，但原子量或質量數不同於自然界中主要發現的原子量或質量數的特定同位素中。本發明意在包括具體和一般描述的化合物的所有合適的同位素變體。例如，氫(H)的不同同位素形式包括氕(1H)和氘(2H)。氕是自然界中發現的主要的氫同位素。氘的富集可提供某些治療優點，例如增加體內半衰期或降低劑量需要，或可提供可用作表徵生物樣品的標準的化合物。可以不用過度實驗，通過本領域技術人員熟知的常規技術，或通過與本文的一般方法方案和實施例中描述的方法類似的方法，使用合適的同位素富集的試劑和/或中間體來製備同位素富集的化合物。
當任何變量(例如R4等)在任何成分中出現多於一次時，其在每次出現時的定義獨立於其它每次出現時的定義。此外，取代基和變量的組合是允許的，只要這種組合產生穩定的化合物。從取代基畫到環系中的線表示所示的鍵可以連接到任何可取代的環原子。如果環系統是雙環的，則意味著該鍵連接至雙環部分的任一環上的任何合適的原子。
應理解，本領域普通技術人員可以將一個或多個矽(Si)原子摻入本發明化合物中以代替一個或多個碳原子，以提供化學穩定的化合物，並且其可以容易地通過本領域已知的技術由容易獲得的原料合成。當比較類似的C元素和Si元素鍵時，碳和矽的共價半徑不同導致鍵距離和空間排列的差異。當與碳相比時，這些差異導致含矽化合物的尺寸和形狀的微小變化。本領域普通技術人員將理解，大小和形狀差異可導致效力、溶解性、脫靶活性缺乏、包裝性質等的微小或顯著變化。(Diass，J. O.等人，Organometallics (2006) 5:1188-1198；Showell，G.A.等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2006) 16:2555-2558)。
應理解，本領域普通技術人員可以選擇本發明化合物上的取代基和取代模式，以提供化學穩定的並且可以容易地通過本領域已知的技術以及下述那些方法由容易獲得的原料合成的化合物。如果取代基本身被多於一個基團取代，應理解這些多個基團可以在相同的碳或不同的碳上，只要得到穩定的結構。短語(被一個或多個取代基)「任選取代的」應理解為是指所述基團未被取代或可以被一個或多個取代基取代。
此外，本發明化合物可以以無定形形式和/或一種或多種結晶形式存在，並且因此式I和式Ia化合物的所有無定形和結晶形式及其混合物旨在包括在本發明的範圍內。此外，本發明的一些化合物可與水形成溶劑合物(即水合物)或與普通有機溶劑形成溶劑合物。本發明化合物的這種溶劑合物和水合物，特別是藥學上可接受的溶劑合物和水合物，以及未溶劑化和無水形式，同樣包括在本發明的範圍內。
提及本發明化合物作為具體式或實施方案(例如式I或式Ia)或本文描述或要求保護的任何其它通用結構式或具體化合物的那些化合物，旨在涵蓋落入所述式或實施方案範圍內的具體的一個或多個化合物，包括其鹽，特別是藥學上可接受的鹽，這些化合物的溶劑合物及其溶劑化鹽形式，其中這些形式是可能的，除非另有說明。
此外，在本發明化合物中存在羧酸(-COOH)或醇基的情況下，可以使用羧酸衍生物的藥學上可接受的酯，例如甲基、乙基或新戊醯氧基甲基酯，或醇的醯基衍生物，例如O-乙醯基、O-新戊醯基、O-苯甲醯基和O-氨基醯基。包括本領域已知的用於改變用作緩釋或前藥製劑的溶解性或水解特性的那些酯和醯基。
如果式I或式Ia化合物在分子中同時含有酸性和鹼性基團，除了所提及的鹽形式外，本發明還包括內鹽或內銨鹽(兩性離子)。可以通過本領域技術人員已知的常規方法由式I和式Ia化合物獲得鹽，例如通過在溶劑或分散劑中與有機或無機酸或鹼組合，或通過與其它鹽進行陰離子交換或陽離子交換。本發明還包括式I和式Ia化合物的所有鹽，由於低的生理相容性，它們不直接適用於藥物，而是可例如用作化學反應或製備藥學上可接受的鹽的中間體。
導致體內轉化為本發明範圍內的化合物的本發明化合物的任何藥學上可接受的前藥修飾也在本發明的範圍內。例如，酯可以任選通過可用的羧酸基團的酯化或通過在化合物中可用的羥基上形成酯來製備。類似地，可以製備不穩定的醯胺。可以製備本發明化合物的藥學上可接受的酯或醯胺以作為前藥起作用，其可以水解回到酸(或-COO-，取決於發生轉化時的流體或組織的pH)或羥基形式，特別是在體內，並因此包括在本發明的範圍內。藥學上可接受的前藥修飾的實例包括但不限於-C1-6烷基酯和用苯基酯取代的-C1-6烷基。
因此，本文描述和要求保護的通用結構式、實施方案和具體化合物內的化合物包括其鹽、所有可能的立體異構體和互變異構體、物理形式(例如，無定形和結晶形式)、溶劑合物和水合物形式以及這些形式的任何組合，以及其鹽、其前藥形式和其前藥形式的鹽，其中這些形式是可能的，除非另有指出。
除非本文另有指出，否則術語「烷基」旨在包括具有指定數目碳原子的支鏈和直鏈飽和脂族烴基。在整個說明書中使用烷基的常用縮寫，例如，甲基可以由包括「Me」或CH3的常規縮寫或作為末端基團的延伸鍵的符號例如表示，乙基可以由「Et」或CH2CH3表示，丙基可以由「Pr」或CH2CH2CH3表示，丁基可以由「Bu」或CH2CH2CH2CH3表示等。「C1-4烷基」(或「C1-C4烷基」)例如是指具有指定數目碳原子的直鏈或支鏈烷基，包括所有異構體。例如，結構
和
具有等同含義。C1-4烷基包括正、異、仲和叔丁基，正和異丙基，乙基和甲基。如果沒有指定數目，1-4個碳原子意圖用於直鏈或支鏈烷基。
除非本文另有指出，「烷醇」旨在包括具有指定數目碳原子的脂肪醇，例如甲醇、乙醇、丙醇等，其中-OH基團連接在任何脂族碳上，例如，丙-1-醇、丙-2-醇等。
除非另有指出，術語「環烷基」是指具有指定數目碳原子的單環或雙環飽和脂族烴基，並且可包括橋連和稠合體系。例如，「環烷基」包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、雙環[2.2.2]辛基等。
除非另有指出，術語「滷素(halogen或halo)」是指氟、氯、溴或碘。
除非另有指出，本文所用的術語「雜芳基」表示在每個環中至多10個原子的穩定的單環、雙環或三環，其中至少一個環是芳族的，並且至少一個環含有1至4個選自O、N和S的雜原子。雜芳基可以包括雙環稠環體系，其中至少一個環含有1至4個選自O、N和S的雜原子，並且其中一個環是芳族的並且一個是飽和的。在該定義範圍內的雜芳基包括但不限於：苯並咪唑基、苯並呋喃基、苯並呋咱基、苯並吡唑基、苯並三唑基、苯並噻吩基、苯並噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、吲哚啉基(indolinyl)、吲哚基、吲哚嗪基、吲唑基、異苯並呋喃基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、異噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、異噁唑啉、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶並吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑基、四唑並吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、二氫苯並咪唑基、二氫苯並呋喃基、二氫苯並噻吩基、二氫苯並噁唑基、二氫吲哚基(dihydroindolyl)、二氫喹啉基、亞甲二氧基苯、苯並噻唑基、苯並噻吩基、喹啉基、異喹啉基、噁唑基、四氫喹啉和3-氧代-3,4二氫-2N苯並[b][1,4]噻嗪。如果雜芳基含有氮原子，應理解其相應的N-氧化物也包括在該定義中。
除非另有指出，否則本文所用的術語「雜環」或「雜環基」旨在表示5至10元非芳族環，除非另有說明，含有1至4個選自O、N、S、SO或SO2的雜原子並包括雙環基團。因此，「雜環基」包括但不限於以下：哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、四氫吡喃基、二氫哌啶基、四氫噻吩基等。如果雜環含有氮，應理解其相應的N-氧化物也包括在該定義中。
除非另有指出，術語「芳基」旨在表示在每個環中至多12個原子的任何穩定的單環或雙環碳環，其中至少一個環是芳族的。這種芳基元素的實例包括苯基、萘基、四氫萘基和茚滿基。
「Celite®」(Fluka)硅藻土(diatomite)是硅藻土(diatomaceous earth)，並且可以被稱為「硅藻土(celite)」。
除非本文另有指出，否則含有取代基變量如下面的變量「R」的結構：
其被描繪為不連接至任何一個特定雙環碳原子，表示其中變量可任選連接至任何雙環碳原子的結構。例如，上述結構中所示的變量R可以連接至6個雙環碳原子i、ii、iii、iv、v或vi中的任一個。
除非本文另有指出，雙環系統包括稠環系統，其中兩個環共享兩個原子，以及螺環系統，其中兩個環共享一個原子。
本發明還包括充當前藥和溶劑合物的式I和式Ia化合物的衍生物。在施用於患者之後，前藥通過正常代謝或化學過程，例如通過在血液中水解，在體內轉化為式1或式Ia化合物。這樣的前藥包括顯示增強的生物利用度、組織特異性和/或細胞遞送的那些，以改善式I或式Ia化合物的藥物吸收。這種前藥的作用可以由物理化學性質如親脂性、分子量、電荷和確定藥物滲透性質的其它物理化學性質的改變引起。
由能夠形成鹽的式I和式Ia化合物(包括其立體異構形式)製備藥學上可接受的鹽以本身已知的方式進行。使用鹼性試劑如氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、醇鹽和氨或有機鹼，例如三甲胺或三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺、氨丁三醇或鹼性胺基酸，例如賴氨酸、鳥氨酸或精氨酸，式I和式Ia化合物形成穩定的鹼金屬、鹼土金屬或任選取代的銨鹽。如果式I和式Ia化合物具有鹼性基團，也可以使用強酸製備穩定的酸加成鹽。為此，無機和有機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、半硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、4-溴苯磺酸、環己基氨基磺酸、三氟甲磺酸、2-羥基乙磺酸、乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、甘油磷酸、乳酸、蘋果酸、己二酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸、葡糖酸、葡萄糖醛酸、棕櫚酸或三氟乙酸是合適的。
本發明還涉及含有至少一種式I或式Ia化合物和/或式I或式Ia化合物的藥學上可接受的鹽和/或任選的式I或式Ia化合物的立體異構形式或式I或式Ia化合物的立體異構形式的藥學上可接受的鹽以及藥學上合適的和藥學上可接受的媒介物、添加劑和/或其它活性物質和助劑的藥物。
抗凝治療指示用於治療和預防多種血栓形成病狀，特別是冠狀動脈和腦血管疾病。在這一領域有經驗的人很容易知道需要抗凝治療的情況。本文使用的術語「患者」是指哺乳動物，例如靈長類動物、人、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。
因子XIa或雙重因子XIa/血漿激肽釋放酶抑制不僅可用於具有血栓形成病狀的個體的抗凝治療，而且每當需要抑制血液凝固時是有用的，例如防止儲存的全血凝固和防止在用於測試或儲存的其它生物樣品中凝固。因此，因子XIa或雙重因子XIa/血漿激肽釋放酶抑制劑可以加入到或接觸含有或疑似含有凝血酶的任何培養基，並且其中希望抑制血液凝固，例如當哺乳動物的血液與選自血管移植物、支架、矯形假體、心臟修復物和體外循環系統的材料接觸時。
本發明化合物可用於治療或預防哺乳動物的靜脈血栓栓塞(例如，由分離的血栓阻塞或閉塞靜脈；由分離的血栓阻塞或閉塞肺動脈)、心源性血栓栓塞(例如，由分離的血栓阻塞或閉塞心臟)、動脈血栓形成(例如，在動脈內形成血栓，其可能導致由動脈供應的組織梗塞)、動脈粥樣硬化(例如，以不規則分布的脂質沉積為特徵的動脈硬化)，以及用於降低與血液接觸的裝置凝結血液的傾向。
可以用本發明化合物治療或預防的靜脈血栓栓塞的實例包括靜脈阻塞、肺動脈阻塞(肺栓塞)、深靜脈血栓形成、與癌症和癌症化療相關的血栓形成、血栓形成性疾病遺傳的血栓形成如蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、抗凝血酶III缺乏和因子V萊頓，以及由獲得性血栓形成性病症例如系統性紅斑狼瘡(炎性結締組織病)引起的血栓形成。同樣關於靜脈血栓栓塞，本發明化合物可用於保持留置導管的通暢。
可以用本發明化合物治療或預防的心源性血栓栓塞的實例包括血栓栓塞性中風(導致與腦血液供應受損有關的神經性痛苦的分離性血栓)、與心房顫動相關的心源性血栓栓塞(上心室肌原纖維的快速、不規律抽搐)、與假體心臟瓣膜例如機械心臟瓣膜相關的心源性血栓栓塞以及與心臟病相關的心源性血栓栓塞。
動脈血栓形成的實例包括不穩定型心絞痛(冠狀動脈起源的胸部嚴重的收縮性疼痛)、心肌梗死(由供血不足引起的心肌細胞死亡)、缺血性心臟病(由於供血阻塞(例如通過動脈狹窄)引起的局部貧血)、經皮冠狀動脈腔內成形術期間或之後的再閉塞、經皮冠狀動脈腔內成形術後的再狹窄、冠狀動脈旁路移植的閉塞和閉塞性腦血管疾病。同樣關於動脈血栓形成，本發明化合物可用於保持動靜脈插管的通暢。
動脈粥樣硬化的實例包括動脈硬化。
本發明化合物還可以是激肽釋放酶抑制劑，並且特別可用於治療遺傳性血管水腫。
與血液接觸的裝置的實例包括血管移植物、支架、矯形假體、心臟修復物和體外循環系統。
根據本發明的藥物可以通過口服、吸入、直腸或經皮施用或通過皮下、關節內、腹膜內或靜脈內注射施用。優選口服施用。用式(I)化合物和與體內血液接觸的其它表面塗覆支架是可能的。
本發明還涉及製備藥物的方法，其包括使用藥學上合適的和藥學上可接受的載體和任選的其它合適的活性物質、添加劑或助劑將至少一種式(I)化合物引入合適的施用形式。
合適的固體或蓋侖製劑形式是例如顆粒、粉末、包衣片劑、片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、果汁、懸浮液、乳劑、滴劑或可注射溶液和具有活性物質的延長釋放的製劑，在所述製劑中使用常規賦形劑，例如媒介物、崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、助流劑或潤滑劑、調味劑、甜味劑和增溶劑。可以提及的常用助劑是碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石、乳糖、明膠、澱粉、纖維素及其衍生物、動物和植物油如魚肝油、向日葵、花生或芝麻油、聚乙二醇和溶劑，例如無菌水和一元醇或多元醇如甘油。
根據多種因素選擇利用因子XIa抑制劑或雙因子XIa/血漿激肽釋放酶抑制劑的劑量方案，包括患者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫學狀況；待治療病狀的嚴重程度；施用途徑；患者的腎和肝功能；和所用的具體化合物或其鹽。普通技術的醫師或獸醫可以容易地確定和開出預防、對抗或阻止病狀進展所需的藥物的有效量。
當用於指示效應時，因子XIa抑制劑或雙重因子XIa/血漿激肽釋放酶抑制劑的口服劑量範圍為約0.01mg/kg體重/天(mg/kg/天)至約30mg/kg/天，優選0.025-7.5mg/kg/天，更優選0.1-2.5mg/kg/天，最優選0.1-0.5mg/kg/天(除非另有指出，活性成分的量以游離鹼計)。例如，80kg患者將接受約0.8mg/天至2.4g/天，優選2-600mg/天，更優選8-200mg/天，最優選8-40mg/kg/天。因此，適當製備的用於每天一次施用的藥物將含有0.8mg至2.4g，優選2mg至600mg，更優選8mg至200mg，最優選8mg至40mg，例如，8mg、10mg、20mg和40mg。有利地，因子XIa抑制劑可以每天兩次、三次或四次的分劑量施用。對於每天兩次施用，適當製備的藥物將含有0.4mg至4g，優選1mg至300mg，更優選4mg至100mg，最優選4mg至20mg，例如4mg、5mg、10mg和20mg。
靜脈內，患者將接受足以遞送0.025-7.5mg/kg/天，優選0.1-2.5mg/kg/天，更優選0.1-0.5mg/kg/天的量的活性成分。這樣的量可以以許多合適的方式施用，例如，在一個延長的時間段內或每天幾次施用大體積的低濃度的活性成分，在短時間段內例如每天一次施用低體積的高濃度的活性成分。通常，可以製備常規靜脈內製劑，其含有約0.01-1.0mg/mL，例如0.1mg/mL、0.3mg/mL和0.6mg/mL濃度的活性成分，並以每天0.01mL/kg患者體重至10.0mL/kg患者體重，例如0.1mL/kg、0.2mL/kg、0.5mL/kg的量施用。在一個實例中，每天兩次接受8mL的活性成分濃度為0.5mg/mL的靜脈內製劑的80kg患者，每天接受8mg活性成分。葡萄糖醛酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸或在靜脈內施用可接受的pH範圍內具有合理緩衝能力的任何藥學上可接受的酸/共軛鹼可用作緩衝劑。取決於待施用的藥物的溶解度，適當的緩衝液和製劑pH的選擇容易由本領域普通技術人員進行。
式I和式Ia化合物可以作為單一療法和與其它治療劑組合施用，包括抗血栓形成劑(抗凝劑和血小板聚集抑制劑)、溶栓劑(纖溶酶原激活劑)、其它纖溶酶原活性物質、降壓藥、血糖調節劑、降脂劑和抗心律失常藥。
因子XIa抑制劑或雙重因子XIa/血漿激肽釋放酶抑制劑也可以與合適的抗凝劑共同施用，所述抗凝劑包括但不限於其它因子XIa抑制劑、凝血酶抑制劑、凝血酶受體拮抗劑、因子VIIa抑制劑、因子Xa抑制劑、因子IXa抑制劑、因子XIIa抑制劑、二磷酸腺苷抗血小板劑(例如，P2Y12拮抗劑)、纖維蛋白原受體拮抗劑(例如，用於治療或預防不穩定型心絞痛或預防血管成形術後的再閉塞和再狹窄)、其它抗凝劑例如阿司匹林和溶栓劑例如纖溶酶原激活劑或鏈激酶以在治療各種血管病變中實現協同作用。這樣的抗凝劑包括例如阿哌沙班、達比加群、坎格雷洛、替卡格雷、沃拉帕沙、氯吡格雷、依度沙班、米泊美生、普拉格雷、利伐沙班和semuloparin。例如，患有冠狀動脈疾病的患者和經受血管成形術程序的患者將受益於纖維蛋白原受體拮抗劑和凝血酶抑制劑的共同施用。因子XIa抑制劑可以在血栓形成之後首先施用，並且此後施用組織纖溶酶原激活劑或其它纖溶酶原激活劑。
或者或另外，一種或多種另外的藥理活性劑可以與本發明化合物組合施用。另外的一種活性劑(或多種活性劑)旨在表示在體內有活性的一種藥物活性劑(或多種活性劑)，包括施用後轉化為藥學活性形式的前藥，其不同於本發明化合物，並且還包括所述另外的活性劑的游離酸、游離鹼和藥學上可接受的鹽，當這些形式以商業銷售或另外化學上可能時。通常，任何合適的另外的一種或多種活性劑，包括但不限於抗高血壓劑、另外的利尿劑、抗動脈粥樣硬化劑例如脂質修飾化合物、抗糖尿病劑和/或抗肥胖劑，可以在單一劑量製劑中與本發明化合物以任何組合使用(固定劑量藥物組合)，或可以以一個或多個分開的劑量製劑施用於患者，其允許同時或順序施用活性劑(共同施用單獨的活性劑)。可以使用的另外的活性劑的實例包括但不限於血管緊張素轉化酶抑制劑(例如，阿拉普利、貝那普利、卡託普利、西洛普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、咪達普利、賴諾普利、莫維普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利或群多普利)；血管緊張素II受體拮抗劑，也稱為血管緊張素受體阻斷劑或ARB，其可以是游離鹼、游離酸、鹽或前藥形式，如阿齊沙坦例如阿齊沙坦酯鉀(EDARBI®)、坎地沙坦例如坎地沙坦西酯(ATACAND®)、依普沙坦例如甲磺酸依普沙坦(TEVETAN®)、依貝沙坦(AVAPRO®)、氯沙坦例如氯沙坦鉀(COZAAR®)、奧美沙坦例如奧美沙坦酯(BENICAR®)、替米沙坦(MICARDIS®)、纈沙坦(DIOVAN®)和與噻嗪類利尿劑如氫氯噻嗪(例如，HYZAAR®、DIOVAN HCT®、ATACAND HCT®等)組合使用的這些藥物中的任一種；保鉀利尿劑如鹽酸阿米洛利、螺內酯、依普利酮、氨苯蝶啶，各自具有或不具有HCTZ；中性肽鏈內切酶抑制劑(例如，塞奧芬和磷酸阿米酮)；醛固酮拮抗劑；醛固酮合酶抑制劑；腎素抑制劑；enalkrein；RO 42-5892；A 65317；CP 80794；ES 1005；ES 8891；SQ 34017；阿利吉侖(2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-氨基甲醯基-2-甲基丙基)-5-氨基-4-羥基-2,7-二異丙基-8-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)-苯基]-辛醯胺半富馬酸鹽) SPP600、SPP630和SPP635)；內皮素受體拮抗劑；血管擴張劑(例如硝普鹽)；鈣通道阻滯劑(例如，氨氯地平、硝苯地平、維拉帕米、地爾硫卓、非洛地平、戈洛帕米、尼魯地平、尼莫地平、尼卡地平)；鉀通道激活劑(例如，尼可地爾、吡那地爾、克羅卡林、米諾地爾、aprilkalim、氯普唑侖)；交感神經阻滯藥(sympatholitics)、β-腎上腺素能阻滯藥(例如，醋丁洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾、比索洛爾、卡維地洛、美託洛爾、酒石酸美託洛爾、納多洛爾、普萘洛爾、索他洛爾、噻嗎洛爾)；α腎上腺素能阻斷藥(例如，多沙唑嗪、哌唑嗪或α甲基多巴)；中樞α腎上腺素能激動劑；外周血管擴張劑(例如肼屈嗪)；降脂劑，例如HMG-CoA還原酶抑制劑，例如辛伐他汀和洛伐他汀，其以內酯前藥形式作為ZOCOR®和MEVACOR®銷售和在施用後起抑制劑作用，以及二羥基開環酸HMG-CoA還原酶抑制劑的藥學上可接受的鹽，如阿託伐他汀(特別是以LIPITOR®銷售的鈣鹽)、羅蘇伐他汀(特別是以CRESTOR®銷售的鈣鹽)、普伐他汀(特別是以PRAVACHOL®銷售的鈉鹽)和氟伐他汀(特別是以LESCOL®銷售的鈉鹽)；膽固醇吸收抑制劑例如依澤替米貝(ZETIA®)，和與任何其它降脂劑例如上述HMG-CoA還原酶抑制劑，特別是與辛伐他汀(VYTORIN®)或與阿託伐他汀鈣組合的依澤替米貝；立即釋放或控釋形式的煙酸，特別是與DP拮抗劑如拉羅皮蘭和/或與HMG-CoA還原酶抑制劑組合的煙酸；煙酸受體激動劑如阿昔莫司和阿昔呋喃，以及煙酸受體部分激動劑；代謝改變劑，包括胰島素敏化劑和相關化合物，其用於治療糖尿病，例如雙胍類(例如，二甲雙胍)、氯茴苯酸類(例如，瑞格列奈、那格列奈)、磺脲類(例如，氯磺丙脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲)、噻唑烷二酮類也稱為格列酮類(例如，吡格列酮、羅格列酮)、α葡糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖、米格列醇)、二肽基肽酶抑制劑(例如，西他列汀(JANUVIA®)、阿格列汀、維格列汀、沙格列汀、利格列汀、度格列汀(dutogliptin)、吉格列汀)、麥角生物鹼(例如，溴麥角環肽)、組合藥物如JANUMET®(西他列汀與二甲雙胍)和可注射的糖尿病藥物如艾塞那肽和醋酸普蘭林肽；或與有益於預防或治療上述疾病的其它藥物，包括但不限於二氮嗪；並且包括化學上可能的游離酸、游離鹼和藥學上可接受的鹽形式、前藥形式例如酯，和上述藥劑的前藥的鹽。提供上面提及的藥物的商標名稱是為了舉例說明市售形式的活性劑；這樣的藥物可以用於單獨劑型中，其用於與本發明化合物同時或順序施用，或其中的活性劑可以用於包括本發明化合物的固定劑量藥物組合中。
與其它合適的抗血小板劑、抗凝劑或溶栓劑組合的本發明的因子XIa抑制劑或因子XIa/血漿激肽釋放酶抑制劑的典型劑量可以與不共同施用另外的抗血小板劑、抗凝劑或溶栓劑的情況下施用的因子XIa抑制劑的那些劑量相同，或者可以基本上少於不共同施用另外的抗血小板劑、抗凝劑或溶栓劑的情況下施用的凝血酶抑制劑的那些劑量，這取決於患者的治療需要。
所述化合物以治療有效量施用於哺乳動物。「治療有效量」是指本發明化合物的量，當單獨或與另外的治療劑組合施用於哺乳動物時，其有效治療(即預防、抑制或改善)血栓栓塞性和/或炎性疾病狀況或治療宿主中疾病的進展。
本發明化合物優選以治療有效量單獨施用於哺乳動物。然而，本發明化合物還可以以治療有效量與如下定義的另外的治療劑組合施用於哺乳動物。當以組合施用時，化合物的組合優選但不一定是協同組合。例如由Chou and Talalay，Adv. Enzyme Regul.1984，22，27-55所述，當組合施用時化合物的作用(在該情況下，為抑制期望靶標)大於當作為單一試劑單獨施用時每種化合物的加和作用時，發生協同作用。通常，在化合物非最佳濃度下最明顯地顯示協同作用。協同作用可以是與單獨的組分相比具有較低的細胞毒性、增加的抗凝作用或組合的一些其他有益作用。
「組合施用」或「聯合治療」是指將本發明化合物和一種或多種另外的治療劑同時施用於正在治療的哺乳動物。當組合施用時，每種組分可以同時施用或在不同時間點以任何順序依次施用。因此，每種組分可以分開施用，但在時間上足夠接近，以提供所需的治療效果。
本發明的範圍不限於實施例中公開的具體實施方案，其旨在作為本發明的幾個方面的說明，並且功能上等同的任何實施方案在本發明的範圍內。實際上，除了本文所示和所述的那些之外，本發明的各種修改對於相關領域的技術人員將是顯而易見的，並且旨在落入所附權利要求的範圍內。
為了本說明書的目的，以下縮寫具有所示的含義：
縮寫列表：
ACN = 乙腈
DAST = 二乙基氨基三氟化硫
DMF = 二甲基甲醯胺
DMS = 硫酸二甲酯
DCM = 二氯甲烷
dppf = 1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵
EtOAc = 乙酸乙酯
EtOH = 乙醇
RP HPLC = 反相高壓液相色譜
[Ir(dF-CF3-ppy)2(dtbbpy)]PF6 = [4,4'-雙(叔丁基)-2,2'-聯吡啶]雙[3,5-二氟-2-[5-(三氟甲基)-2-吡啶基]苯基]銥(III)六氟磷酸鹽
LDA = 二異丙基氨基鋰
LHMDS = 六甲基二矽基胺基鋰
LiOH = 氫氧化鋰
Me = 甲基
mCPBA = 間氯過氧苯甲酸
PCC = 氯鉻酸吡啶鎓
Ph = 苯基
rt或RT = 室溫
THF = 四氫呋喃
Sat. = 飽和的
SFC = 超臨界流體色譜
SM = 原料
TFA = 三氟乙酸
Vac = 真空
HATU = 2-(1H-7-氮雜苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽甲銨鹽。
此外，TLC為薄層色譜；Ts為甲苯磺醯基；UV為紫外線；W為瓦特；wt.%為重量百分比；x g為重力加速度倍數；αD為偏振光在589nm的比旋光度；℃為攝氏度；%w/v為前一種試劑的重量相對於後一種試劑的體積的百分比。
LCMS條件：柱：SUPELCO Ascentis Express C18 3x100mm，2.7um。溶劑系統：A-0.05% TFA的水溶液和B-0.05% TFA的乙腈溶液。
梯度條件：在3.5分鐘內10%B至99%B。
一般方案
由式(i-b)表示的化合物可以在鹼如雙(三甲基甲矽烷基)氨基鋰(LHMDS)、二異丙基氨基鋰(LDA)或氫化鈉存在下，在對反應無活性的溶劑如四氫呋喃或甲苯中，在-78℃至室溫的溫度下，通過熟知的方法或類似於公開的文獻(例如，Hajri，Majdi；Blondelle，Clement；Martinez，Agathe；Vasse，Jean-Luc；Szymoniak，Jan Tetrahedron Letters (2013)，54(8)，1029-1031)中描述的方法，使市售的(i-a)與適當取代的烷基化試劑如烷基滷、甲烷磺酸烷基酯或對甲苯磺酸烷基酯反應來製備。
由式(i-c)表示的化合物可以在含水和有機共溶劑如甲醇、乙腈和四氫呋喃的水性溶劑中，通過熟知的方法或類似於公開的文獻(例如，Huang，Hanmin；Xia，Chungu；Xie，Pan，Ger. Offen. (2013)，DE 102012224021 A1 Nov 14，2013)中描述的方法，使適當取代的(i-b)與無機或有機鹼如氫氧化鋰、氫氧化鈉或叔丁醇鈉反應來製備。
由式(i-e)表示的化合物可以在縮合劑如1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC·HCl或EDC HCl)、O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、苯並三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻鎓六氟磷酸鹽(BOP試劑)或雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦醯氯(BOP-Cl)存在下，在對反應無活性的溶劑如滷化溶劑，例如二氯甲烷或氯仿；醚溶劑，例如乙醚或四氫呋喃；芳烴溶劑，例如甲苯或苯；極性溶劑，例如N,N-二甲基甲醯胺；或醇溶劑，例如甲醇、乙醇或2-丙醇中；在鹼，例如三乙胺或N,N-二異丙基乙胺存在或不存在下；在0℃至溶劑回流溫度的溫度下，通過熟知的方法或類似於公開的文獻(例如，Organic synthesis IV，Acids，amino acids，and peptides，pp. 191-309，1992，Maruzen Co.，Ltd.)中描述的方法，通過使酸(i-c)與胺(R3-NH2)反應來製備。
由式(i-f)表示的化合物可以通過通常稱為Suzuki偶聯反應的方法製備。(i-f)型化合物可以在合適的鈀催化劑如[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]-二氯化鈀(II)或四(三苯基膦)鈀(0)等，和弱鹼如碳酸鈉、磷酸鈉等存在下，用R1-B(OH)2型的芳基-或雜芳基-硼酸，或者可選地，R1-B(OR)2型的芳基-或雜芳基硼酸酯處理(Pure Appl. Chem. 1991，63，419-422)。該反應通常在惰性有機溶劑如甲苯、乙醇或二噁烷的適當脫氣水性混合物中，在升高的溫度下，通常在70℃至溶劑混合物的沸騰溫度進行3-24h。或者，本領域技術人員可以在合適的容器中進行上述Suzuki反應，所述容器能夠在微波反應器中加熱至過熱的反應溫度，其可以將反應時間減少至1min至1h。適合於在室溫下進行Suzuki反應的條件已經公開(例如，參見J. Am. Chem. Soc. 2000，122，4020-4028及其中的參考文獻)。
由式(i-g)表示的化合物可以通過使適當取代的吡啶醯胺(i-f)與通常被稱為過氧化物的氧化劑如過氧化氫、間氯過氧苯甲酸、過硫酸氫鉀複合鹽、二甲基二氧雜環丙烷和過乙酸，在適當的溶劑包括水、二氯甲烷和乙酸中反應來製備。反應通常在0至70℃的溫度下進行幾分鐘至幾天的時間段。這樣的一種或多種方法類似於公開的文獻(例如，參見Deng，Lisheng；Sundriyal，Sandeep；Rubio，Valentina；Shi，Zheng-zheng；Song，Yongcheng，Journal of Medicinal Chemistry (2009)，52(21)，6539-6542)中描述的方法。
中間體
1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-四唑
將4-氯-2-碘苯胺(3000mg，11.84mmol)與三甲氧基甲烷(3800mg，35.5mmol)和疊氮化鈉(2300mg，35.5mmol)混合。將混合物冷卻至5℃。緩慢加入乙酸(10ml)。將混合物在5℃下攪拌1小時，然後在室溫下攪拌過夜。加入另外的三甲氧基甲烷(2mL)、疊氮化鈉(1000mg)和乙酸(15mL)。然後將混合物在室溫下再攪拌一天。將混合物濃縮，並加入水。產物用乙酸乙酯溶解，並用水和鹽水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥後，濃縮溶液。粗產物通過矽膠柱色譜，Isolute Flash Si；預填充100g，用梯度0~30% EtOAc/異己烷洗脫純化，得到產物。
5-(2-溴-4-氯苯基)噁唑
將2-溴-4-氯苯甲醛(3g，14mmol)與甲苯磺醯基甲基異氰化物(3.20g，16mmol)和碳酸鉀(2.3g，16mmol)在MeOH(24ml)中混合。將所得混合物加熱至70℃達7小時。將混合物濃縮，並加入水。產物用乙酸乙酯溶解，並用水和鹽水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥後，濃縮溶液。粗產物通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充100g，用梯度0~30% EtOAc/異己烷洗脫純化，得到產物。
2-溴-4-氯-1-(二氟甲基)-3-氟苯
步驟1. 2-溴-4-氯-3-氟苯甲酸 在-78℃下通過注射泵經30min將4-氯-3-氟苯甲酸(2.0g，11.46mmol)的THF(25ml)溶液加入到LDA(13.18ml，26.4mmol)的THF(50ml)溶液中。隨後在-78℃下攪拌3h。然後，加入1,2-二溴四氯乙烷(7.5g，23mmol)的THF(25ml)溶液。反應在-78℃下進行30min，然後緩慢升溫至室溫並攪拌過夜。反應混合物用水淬滅，並用Et2O萃取。水相用4N HCl的二噁烷溶液(45.8ml，45.8mmol)中和，並用EtOAc萃取。有機相經MgSO4乾燥，過濾並濃縮，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 276.04 (M+H)。
步驟2. (2-溴-4-氯-3-氟苯基)甲醇 在0℃下將BH3.DMS(2.367ml，4.73mmol)加入到2-溴-4-氯-3-氟苯甲酸(1.0g，3.95mmol)的THF(30ml)溶液中。將混合物在0℃下攪拌1h後，除去冰浴，並將反應在室溫下進行5h。在0℃下向反應混合物中加入另外的BH3.DMS(2.367ml，4.73mmol)，並繼續攪拌過夜，同時緩慢溫熱至室溫。然後，將混合物用1N HCl(10ml)處理，並用EtOAc(2×50ml)萃取。合併的有機相經MgSO4乾燥，過濾，濃縮，並通過矽膠柱快速色譜，用0-30% EtOAc/己烷純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 240.25 (M+H)。
步驟3. 2-溴-4-氯-3-氟苯甲醛. 在0℃下將PCC(0.57g，2.66mmol)加入到(2-溴-4-氯-3-氟苯基)甲醇(0.58g，2.42mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液中。然後，除去冰浴，並將反應在室溫下進行2h。除去溶劑，殘餘物通過矽膠柱快速色譜，用0-20% EtOAc/己烷純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 238.31 (M+H)。
步驟4. 2-溴-4-氯-1-(二氟甲基)-3-氟苯. 在0℃下將DAST(0.31ml，2.37mmol)加入到2-溴-4-氯-3-氟苯甲醛(0.45g，1.90mmol)的CH2Cl2(15ml)溶液中。將混合物攪拌1h後，除去冰浴，並將反應在室溫下進行5h。混合物用1N HCl淬滅。分離有機相。水相用EtOAc萃取。合併的有機相經MgSO4乾燥，過濾，濃縮，並通過矽膠柱快速色譜，用0-20% EtOAc/己烷純化，得到產物。MS (ESI) m/z 397.25 (M+H)。
(1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲醇
步驟1. 1-疊氮基-4-氯-2-碘苯 向在冰水浴中的4-氯-2-碘苯胺(5600mg，22mmol)的乙酸乙酯(40ml)和水(5mL)溶液中加入濃HCl溶液(12ml，146mmol)。將所得混合物攪拌10分鐘。經3分鐘向該溶液中加入亞硝酸鈉(2550mg，37.0mmol)的水(7.5mL)溶液。將混合物攪拌30分鐘。緩慢加入疊氮化鈉(2400mg，37mmol)的水(8mL)溶液。然後將混合物在冰水浴中攪拌過夜。將水(60mL)加入到反應混合物中。產物用乙酸乙酯萃取。有機層用水(2×50mL)、碳酸氫鈉稀溶液和鹽水洗滌。分離有機層，並經無水硫酸鈉乾燥。濃縮後，粗產物通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充100g，用0~50%梯度DCM/己烷洗脫純化，得到產物。
步驟2. (1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲醇 將1-疊氮基-4-氯-2-碘苯(1400mg，5mmol)和丙-2-炔-1-醇(280mg，5.00mmol)在DMF(5ml)中混合。加入硫酸銅(1M，1.0ml，1.0mmol)，然後加入抗壞血酸鈉(0.4ml，0.400mmol)。將混合物在50℃下攪拌過夜。將混合物倒入100mL水中，然後在室溫下攪拌過夜。通過過濾收集沉澱，並用水洗滌，然後在真空中乾燥過夜。MS (ESI) m/z 335.9 (M+H)。
1-(4-氯-2-碘苯基)-4-(二氟甲基)-1H-1,2,3-三唑
步驟1. 1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲醛 將(1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲醇(500mg，1.490mmol)的DCM(7ml)溶液與Dess-Martin高碘烷(758mg，1.79mmol)混合。將混合物在室溫下攪拌過夜。將反應混合物過濾，並用DCM洗滌固體。濃縮溶液，並將殘餘物通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充50g，用梯度0~40% EtOAc/異己烷洗脫純化，得到產物。
步驟2. 1-(4-氯-2-碘苯基)-4-(二氟甲基)-1H-1,2,3-三唑 將1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲醛(300mg，0.9mmol)的DCM(6ml)溶液在冰水浴中冷卻。加入DAST(0.47ml，3.6mmol)。將混合物在0℃下攪拌1小時，然後在室溫下攪拌3小時。加入DCM(50mL)，並將混合物冷卻至0℃。緩慢加入NaHCO3(1M溶液)以猝滅過量的DAST。分離有機層，並經無水硫酸鈉乾燥。將其過濾並濃縮後，粗產物通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充50g，用梯度0~50% DCM/己烷洗脫純化，得到產物。MS (ESI) m/z 355.8 (M+H)。
2-(2-溴-4-氯苯基)噻唑
步驟1. 2-溴-4-氯苯甲醯胺 將2-溴-4-氯苯甲酸(3000mg，12.7mmol)的甲苯(30ml)溶液與SOCl2(1.4ml，19mmol)和DMF(0.020ml，0.26mmol)混合。然後將混合物加熱至80℃保持1.5小時。冷卻至室溫後，將混合物濃縮至幹。將醯氯中間體溶於DCM(50ml)中並在0℃下滴加到預冷卻的氫氧化銨(8.86ml，63.7mmol)溶液中。將混合物在室溫下攪拌4小時，然後通過旋轉蒸發儀濃縮。產物用水洗滌並在真空烘箱中在50℃下乾燥過夜。
步驟2. 2-溴-4-氯硫代苯甲醯胺 將2-溴-4-氯苯甲醯胺(2g，8.5mmol)的THF(40ml)溶液與Lawesson試劑(4.1g，10mmol)混合。將混合物在室溫下攪拌過夜。將反應混合物與矽膠混合，並濃縮至幹。用粗產物裝載矽膠，並連接到80克大小的矽膠柱上，用梯度0~40% EtOAc/異己烷洗脫，得到產物。MS (ESI) m/z 251.8 (M+H)。
步驟3. 2-(2-溴-4-氯苯基)噻唑 將2-溴-4-氯硫代苯甲醯胺(970mg，3.87mmol)的乙醇(4ml)溶液與溴乙醛縮二乙醇(839mg，4.26mmol)混合。將混合物在78℃下攪拌過夜。冷卻至室溫後，加入己烷以進一步沉澱產物。通過過濾收集產物，並用己烷洗滌。將產物在真空烘箱中在50℃下乾燥過夜。MS (ESI) m/z 275.8 (M+H)。
1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-1,2,4-三唑
步驟1. 1-(2-溴-4-氯苯基)-1H-1,2,4-三唑. 向2-溴-4-氯-1-氟苯(2g，9.6mmol)和4H-1,2,4-三唑(0.79g，11.5mmol)在DMF(20mL)中的混合物中加入K2CO3(5.28g，38.2mmol)，並將混合物在100℃下攪拌16h。混合物用水(50mL)稀釋，並用EtOAc(50mL×3)萃取。合併的有機層經硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過矽膠梯度色譜(SiO2，石油醚:EtOAc = 10:1-1:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.48 (s，1H)，8.14 (s，1H)，7.77 (s，1H)，7.46 (d，J=1.1 Hz，2H)。
步驟2. 1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-1,2,4-三唑. 向1-(2-溴-4-氯苯基)-1H-1,2,4-三唑(100mg，0.39mmol)和1,1,1,2,2,2-六甲基二錫烷(380mg，1.2mmol)在甲苯(2mL)中的混合物中加入Pd(Ph3P)4(89mg，0.077mmol)，並將所得混合物在90℃下攪拌12h。混合物用水(50mL)稀釋，並用EtOAc(10mL×3)萃取。合併的有機層用鹽水(10mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，石油醚:EtOAc = 10:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.25 (s，1H)，7.88 (s，1H)，7.42 (d，J=2.2 Hz，1H)，7.20-7.25 (m，1H)，7.13-7.18 (m，1H)，0.00 (s，9H)。 MS (ESI) m/z 343.9 (M+H)。
氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)吡嗪
步驟1. 2-(2-溴-4-氯苯基)吡嗪. 向2-溴-4-氯-1-碘苯(1.26g，4.0mmol)、2-(三丁基甲錫烷基)吡嗪(1.32g，3.6mmol)的DMF(20mL)脫氣溶液中加入Pd(Ph3P)4(230mg，0.2mmol)和CuI(80mg，0.4mmol)。然後將混合物用微波在100℃在N2保護下加熱4h。將反應混合物冷卻至室溫，然後用飽和KF水溶液(20mL)稀釋，並用DCM(20mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥並濃縮。然後將殘餘物通過矽膠柱色譜(PE/EtOAc = 100/1至10/1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.94 (br. s，1H)，8.52 - 8.77 (m，2H)，7.75 (br. s，1H)，7.39 - 7.61 (m，2H)。MS (ESI) m/z 270.8 (M+H)。
步驟2. 2-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)吡嗪. 向2-(2-溴-4-氯苯基)吡嗪(380mg，1.410mmol)和1,1,1,2,2,2-六甲基二錫烷(924mg，2.82mmol)在甲苯(4mL)中的混合物中加入Pd(Ph3P)4(163mg，0.141mmol)，並將混合物在100℃下攪拌12h。混合物用水(50mL)稀釋，並用EtOAc(10mL×3)萃取。合併的有機層用鹽水(10mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，石油醚:EtOAc = 10:1)純化，得到標題化合物。
MS (ESI) m/z：396.1 (M+ CH3CN)
4-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1,2,3-噻二唑
步驟1. (E)-2-(1-(2-溴-4-氯苯基)亞乙基)肼甲酸乙酯. 在10℃下向1-(2-溴-4-氯苯基)乙酮(1g，4.3mmol)和肼甲酸乙酯(0.54g，5.1mmol)在2-丙醇(5mL)和水(15mL)中的混合物中加入HOAc (0.012mL，0.21mmol)。將混合物在90℃下攪拌3h。將混合物過濾。濾餅用水(20mL)洗滌並真空乾燥，得到標題化合物，其不經進一步純化而用於下一步驟。MS (ESI) m/z 320.8 (M+H)。
步驟2. 4-(2-溴-4-氯苯基)-1,2,3-噻二唑. 將(E)-2-(1-(2-溴-4-氯苯基)亞乙基)肼甲酸乙酯(600mg，1.3mmol)在SOCl2(2880μL，39.4mmol)中的混合物在100℃下攪拌5h。將混合物濃縮。殘餘物用飽和NaHCO3(30mL)稀釋，並用EtOAc(30mL×3)萃取。合併的有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過矽膠梯度色譜(SiO2，石油醚:EtOAc = 500:1-100:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 9.01 (s，1H)，7.94 (d，J=8.4 Hz，1H)，7.76 (d，J=1.8 Hz，1H)，7.46 (dd，J=8.4，1.5 Hz，1H)。
步驟3. 4-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1,2,3-噻二唑. 向4-(2-溴-4-氯苯基)-1,2,3-噻二唑(100mg，0.363mmol)和1,1,1,2,2,2-六甲基二錫烷(357mg，1.089mmol)在甲苯(2mL)中的混合物中加入Pd(Ph3P)4(84mg，0.073mmol)，並將混合物在90℃下攪拌12h。混合物用水(50mL)稀釋，並用EtOAc(10mL×3)萃取。合併的有機層用鹽水(10mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，石油醚:EtOAc = 10:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ = 8.41 (s，1H)，7.48 (d，J=2.2 Hz，1H)，7.42 (d，J=7.9 Hz，1H)，7.21 (dd，J=8.4，2.2 Hz，1H)，0.00 (s，9H)。
1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-1,2,3-三唑
步驟1. 1-(2-溴-4-氯苯基)-1H-1,2,3-三唑. 向2-溴-4-氯-1-氟苯(5g，24mmol)和2H-1,2,3-三唑(6.60g，95mmol)的DMF(2mL)溶液中加入K2CO3(16.50 g，119mmol)。將混合物在100℃在N2氣氛下攪拌13h。混合物用水(10mL)稀釋，並用EtOAc(10mL×2)萃取。合併的有機層經硫酸鈉乾燥並濃縮。殘餘物通過柱色譜(SiO2，PE:EtOAc = 100:1至3:1)純化，得到標題化合物。
MS (ESI) m/z 260.0 (M+H)。
步驟2. 1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-1,2,3-三唑. 向1-(2-溴-4-氯苯基)-1H-1,2,3-三唑(300mg，1.16mmol)和1,1,1,2,2,2-六甲基二錫烷(0.602mL，2.90mmol)的甲苯(2mL)溶液中加入Pd(Ph3P)4(268mg，0.23mmol)。將反應脫氣三次，並用N2再填充，然後在100℃下攪拌2h。反應用水(20mL)淬滅，並用EtOAc(20mL×3)萃取。合併的有機層經硫酸鈉乾燥並濃縮。殘餘物通過柱色譜(SiO2，PE:EtOAc = 10:1至5:1)純化，得到標題化合物。
MS (ESI) m/z 343.8 (M+H)。
1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-吡唑
步驟1. 1-(2-溴-4-氯苯基)-1H-吡唑.
向2-溴-4-氯-1-氟苯(1g，4.77mmol)、1H-吡唑(0.341g，5.01mmol)的DMF(5mL)溶液中加入K2CO3 (1.98g，14mmol)，並將混合物在80℃下攪拌16h。混合物用水(30mL)稀釋，並用EtOAc(30mL×3)萃取。合併的有機層用鹽水(50mL×3)洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過矽膠梯度色譜(SiO2，石油醚:EtOAc = 10:1-3:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 7.80 (d，J=2.4 Hz，1H)，7.73 (d，J=1.5 Hz，1H)，7.70 (d，J=2.2 Hz，1H)，7.42-7.49 (m，1H)，7.35-7.41 (m，1H)，6.46 (t，J=2.1 Hz，1H)。MS (ESI) m/z 258.8 (M+H)。
步驟2. 1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-吡唑. 向1-(2-溴-4-氯苯基)-1H-吡唑(100mg，0.39mmol)和1,1,1,2,2,2-六甲基二錫烷(382mg，1.2mmol)在甲苯(2mL)中的混合物中加入Pd(Ph3P)4 (90mg，0.078mmol)，並將混合物在90℃下攪拌12h。混合物用水(50mL)稀釋，並用EtOAc(10mL×3)萃取。合併的有機層用鹽水(10mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，石油醚:EtOAc = 10:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 7.66 (d，J=2.2 Hz，1H)，7.38-7.49 (m，2H)，7.12-7.24 (m，2H)，6.29 (d，J=2.2 Hz，1H)，0.00 (s，9H)。
實施例1 & 2
(R)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例1)和(S)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-1-氧化物(實施例2)
步驟1. 2-(5-溴吡啶-2-基)-3-苯基丙酸甲酯(1-A)：在-78℃下向2-(5-溴吡啶-2-基)乙酸甲酯(1g，4.35mmol)的THF (20mL)溶液中加入LHMDS(4.35mL，4.35mmol，1M)。將混合物在-78℃下攪拌2hrs。緩慢加入(溴甲基)苯(0.743g，4.35mmol)。接著，除去冷浴，並將混合物在室溫下攪拌2小時。反應混合物用EtOAc稀釋，用水、鹽水洗滌，並經Na2SO4乾燥。真空除去溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物1-A。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：3.24 (1 H，dd)，3.45 (1 H，dd)，3.66 (3 H，s)，4.09 (1 H，t)，7.12-7.09 (4 H，m)，7.24-7.12 (2H，m)，7.73 (1 H，dd)，8.65 (1 H，d)。
步驟2. 4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-B)：向2-(5-溴吡啶-2-基)-3-苯基丙酸甲酯(1-A)(780mg，2.4mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入LiOH水溶液(2.92mL，2.92mmol，1M)。將混合物在50℃下加熱15min。真空除去溶劑。將其通過甲苯和MeOH共沸兩次。將酸中間體溶於DMF(10mL)中。加入4-氨基苯甲酸叔丁酯(706mg，3.65mmol)和HATU(1.85g，4.87mmol)。將其在室溫下攪拌30min。混合物用水淬滅，並用EtOAc萃取。有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，並除去溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到標題化合物1-B。1H NMR (500 MHz，CDCl3) δ：1.67 (9 H，s)，3.23 (1 H，dd)，3.51 (1 H，dd)，4.16 (1 H，m)，7.04 (3 H，t)，7.22-7.17 (3 H，m)，7.60 (2H，d)，7.74 (1 H，d)，7.95 (2H，d)，8.73 (1 H，d)，9.71 (1 H，s)。
步驟3. 4-(2-(5-(5-氯-2-硝基苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-C) 在微波管中向4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-B)(0.475g，0.987mmol)、(5-氯-2-硝基苯基)硼酸(0.397g，1.973mmol)、PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(0.16g，0.197mmol)在THF(5mL)中的混合物中加入磷酸鉀水溶液(2mL，4mmol，2M)。將管密封，脫氣並用N2再填充。將混合物在100℃下通過微波加熱1小時。反應混合物用水稀釋，用EtOAc萃取，合併有機層，用鹽水洗滌，並經Na2SO4乾燥。真空除去溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物1-C。1H NMR (500 MHz，CDCl3) δ：1.66 (9H，s)，3.32 (1 H，dd)，3.60 (1 H，dd)，4.10 (1 H，m)，7.05 (2 H，d)，7.10-7.24 (4H,m)，7.42 (1 H，d)，7.58-7.63 (4H，m)，7.95 (2 H，d)，8.03 (1 H，d)，8.59 (1 H，s)，10.00 (1 H，s)。
步驟4. 4-(2-(5-(2-氨基-5-氯苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-D) 向4-(2-(5-(5-氯-2-硝基苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-C)(0.61g，1.093mmol)的EtOH(2mL)和EtOAc(1mL)懸浮液中加入二氯化錫(II)二水合物(0.987g，4.37mmol)。將反應混合物在油浴中在50℃下加熱3小時，並冷卻至室溫。然後用EtOAc稀釋，用1N NaOH水溶液、鹽水洗滌，並經Na2SO4乾燥。真空除去溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物1-D。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：1.69 (9 H，s)，3.34 (1 H，dd)，3.63 (1 H，dd)，4.23 (1 H，m)，6.75 (1 H，d)，7.30-7.01 (9 H，m)，7.65 (2H，d)，7.78 (1 H，d)，7.96 (3 H，d)，8.72 (1 H，s)，10.05 (1 H，s)。
步驟5. 4-(2-(5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-E)將在燒瓶中的4-(2-(5-(2-氨基-5-氯苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-D)(0.48g，0.909mmol)、疊氮化鈉(0.177g，2.73mmol)和三甲氧基甲烷(0.289g，2.73mmol)在乙酸(9mL)中的反應混合物在90℃下加熱3小時。將混合物冷卻，並真空除去溶劑。殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用水、鹽水洗滌，並經Na2SO4乾燥。減壓蒸發溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物1-E。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：1.67 (9H，m)，3.23 (1 H，dd)，3.53 (1 H，dd)，4.00 (1 H，dd)，7.02-6.96 (3 H，m)，7.25-7.15 (4 H)，7.65-7.56 (5 H，m)，7.95-7.93 (2 H，m)，8.36 (2 H，s)，9.79 (1 H，s)。
步驟6. 2-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(1-F) 在室溫下向4-(2-(5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-E)(0.42g，0.723mmol)的CH2Cl2(3mL)溶液中加入mCPBA(0.356g，1.446mmol)。將其攪拌2小時。真空除去溶劑。殘餘物通過二氧化矽柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物1-F。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：1.71 (9H，s)，3.15 (1 H，dd)，3.70 (1 H，dd)，4.98 (1 H，t)，6.93 (1 H，dd)，7.3-7.1 (5H,m)，7.42 (1 H，d)，7.57-7.52 (4 H，m)，7.68 (1 H，dd)，7.90-7.88 (2 H，m)，8.27 (1 H，d)，8.55 (1 H，s)，10.34 (1 H，s)。
步驟7. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-1-氧化物 (1-G) 向2-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物 (1-F)(300mg，0.502mmol)的CH2Cl2(0.5mL)溶液中加入TFA(1mL，12.98mmol)。將其在室溫下攪拌15分鐘。真空除去溶劑。將殘餘物再溶於1mL ACN和0.5mL水中。將溶液冷凍乾燥，得到產物1-G。通過SFC用手性柱(AS-H)拆分化合物1-G，得到(R)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例1)和(S)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-1-氧化物 (實施例2)。1H NMR (500 MHz，丙酮-d6)δ：3.25 (1 H，dd)，3.57 (1 H，dd)，4.91 (1 H，t)，7.12 (1 H，d)，7.19 (1 H，t)，7.34-7.26 (5 H，m)，7.66 (3 H，dd)，7.84 (2 H，s)，7.88 (1 H，s)，7.97 (2 H，d)，8.39 (1 H，s)，9.33 (1 H，s)，10.63 (1 H，s)。
實施例3和4
(R)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物 (實施例3) & (S)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物(實施例4)
步驟1. 4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(2-A) 在微波管中向4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1-B)(0.65g，1.35mmol)、(3-氯-2,6-二氟苯基)硼酸(0.39g，2.0mmol)、乙酸鈀(II)/1,1'-雙(二叔丁基膦基)二茂鐵/磷酸鉀混合物(0.246g，0.27mmol)在THF(12mL)中的混合物中加入磷酸鉀水溶液(2.7mL，5.4mmol，2M)。將反應管密封，脫氣並用N2再填充。將混合物在100℃下通過微波加熱1hr。反應混合物用水稀釋，用EtOAc萃取，有機相用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥。真空除去溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物2-A。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：1.59 (9H，s)，3.35 (1 H，dd)，3.61 (1 H，dd)，4.07-4.05 (1H，m)，7.08-7.04 (3H，m)，7.22-7.16 (4 H，m)，7.46 (1 H，td)，7.64 (2 H，d)，7.71 (1 H，d)，7.97 (2 H，d)，8.79 (1 H，s)，10.05 (1 H，s)。
步驟2. 2-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物 (2-B) 在室溫下向4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(2-A)(250mg，0.455mmol)的DCM(5mL)溶液中加入mCPBA(225mg，0.911mmol)。將反應混合物攪拌1.5小時。減壓除去溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜，用EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物2-B。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：1.70 (9H，s)，3.23 (1H，dd)，3.81 (1 H，dd)，4.13 (1 H，q)，5.14-5.13 (1 H，m)，7.04 (1 H，dd)，7.20 (1 H，t)，7.34-7.24 (4H，m)，7.51-7.47 (2 H，m)，7.59 (3 H，t)，7.90 (2 H，d)，8.50 (1 H，s)，10.73 (1 H，s)。
步驟3. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物 (2-C) 向2-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物(2-B)(0.17g，0.25mmol)的CH2Cl2(0.5mL)溶液中加入TFA(1mL，12.98mmol)。將其在室溫下攪拌1小時。真空除去溶劑。將殘餘物再溶於1mL ACN和0.5mL水中。將溶液冷凍乾燥，得到產物2-C。
將2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物通過SFC用手性柱(AS-H)拆分，得到實施例3 (R)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物和實施例4 (S)-2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-1-氧化物。1H NMR (500 MHz，丙酮-d6) δ：3.33 (1 H，s)，3.36 (1 H，m)，3.64 (1 H，d)，3.91 (1 H，t)，5.06 (1 H，b)，7.19 (1 H，d)，7.28 (3H，m)，7.42 (2 H，d)，7.65 (1 H，m)，7.70 (3 H，d)，7.87 (1 H，d)，7.96 (2 H，d)，8.64 (1 H，s)，10.71 (1 H，s)。
通過使用上述方法和合適的原料，合成以下化合物。這些化合物通過LC/MS表徵。
實施例23 & 24
2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶1-氧化物(實施例23和24)
步驟1. 2-氯-4-甲氧基-5-硝基吡啶 (3-B) 向圓底燒瓶中加入THF(200mL)和氫化鈉(3.42g，85mmol，60%在油中)。然後，在0℃下滴加甲醇(2.490g，78mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌10min。滴加3-A(15g，78mmol)的THF(50mL)溶液。將混合物在0℃下攪拌1h。混合物用水(300mL)淬滅並用EtOAc(150mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，80g Agela flash柱，0-20% EtOAc/PE，60min，幹載)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.88 (s，1H)，7.10 (s，1H)，6.35 (s，1 H)，4.10 (s，3H)，4.05 (s，1H)。MS (ESI) m/z 189.2 (M+H)。
步驟2. 2-(4-甲氧基-5-硝基吡啶-2-基)丙二酸1-叔丁基3-乙基酯(3-C) 向圓底燒瓶中加入氫化鈉(2.316g，57.9mmol，60%在油中)、DMF(200mL)和丙二酸叔丁基乙基酯(10.90g，57.9mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌20min。然後，加入3-B(9.1g，38.6mmol)。將混合物在50℃下攪拌18h。混合物用水(500mL)淬滅，並用EtOAc(200mL×3)萃取。合併的有機層用鹽水(200mL×3)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過柱色譜(SiO2，PE:EtOAc=10:1)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.93 (s，1H)，7.32 (s，1H)，4.87 (s，1 H)，4.25 (dd，J = 13.0，6.9 Hz，2H)，4.04 (s，3H)，1.47 (s，9H)，1.28 (t，J = 7.0 Hz，3H)。MS (ESI) m/z 341.2 (M+H)。
步驟3. 2-(4-甲氧基-5-硝基吡啶-2-基)乙酸乙酯(3-D) 向圓底燒瓶中加入3-C(5.5g，16.16mmol)、DCM(60mL)和2,2,2-三氟乙酸(7.37g，64.6mmol)。將反應混合物在45℃下攪拌4h。將混合物濃縮，用水稀釋並用飽和NaHCO3溶液調節至pH 8-9。混合物用DCM(100mL×3)萃取，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，40g Agela flash柱，0-20% EtOAc/PE，60min，幹載)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 9.01 (s，1 H)，7.13 (s，1 H)，4.26 (q，J=7.1 Hz，2 H)，4.09 (s，3 H)，3.92 (s，2 H)，1.33 (t，J=7.0 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 240.9 (M+H)。
步驟4. 2-(4-甲氧基-5-硝基- -吡啶-2-基)-3-苯基丙酸乙酯(3-E) 在-78℃下向3-D(3.0g，12.5mmol)的THF(40mL)溶液中滴加二異丙基氨基鋰(2M的THF溶液，6.24mL，12.5mmol)。將混合物攪拌10min，然後加入(溴甲基)苯(2.136g，12.49mmol)。將混合物在14℃下進一步攪拌3h。混合物用飽和NH4Cl溶液(10mL)淬滅，用水(60mL)稀釋，並用EtOAc(40mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，40g Agela flash柱，0-20% EtOAc/PE，30min，幹載)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.98 (s，1 H)，7.17 - 7.30 (m，4 H)，7.10 (d，J=6.8 Hz，2 H)，6.82 (s，1 H)，4.13 (dd，J=12.7，7.0 Hz，3 H)，3.91 (s，3 H)，3.43 (dd，J=13.7，7.5 Hz，1 H)，3.24 (dd，J=13.8，8.1 Hz，1 H)，1.16 (t，J=7.2 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 331.2 (M+H)。
步驟5. 2-(5-氨基-4-甲氧基吡啶-2-基)-3-苯基丙酸乙酯(3-F) 向圓底燒瓶中加入3-E(3.2g，9.69mmol)、NH4Cl(5.18g，97mmol)、EtOH(32mL)、水(8mL)和鐵(5.41g，97mmol)。將反應混合物在80℃下攪拌3h，然後過濾並真空濃縮濾液。殘餘物用水(50mL)稀釋，並用EtOAc(40mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，得到標題化合物，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 7.95 (s，1 H)，7.11 - 7.24 (m，5 H)，6.64 (s，1 H)，4.05 - 4.13 (m，2 H)，3.97 (t，J=7.8 Hz，1 H)，3.83 (s，3 H)，3.37 (dd，J=13.7，8.6 Hz，1 H)，3.15 - 3.21 (m，1 H)，1.12 (t，J=7.1 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 301.2 (M+H)。
步驟6. 2-(5-溴-4-甲氧基吡啶-2-基)-3-苯基丙酸乙酯(3-G) 向圓底燒瓶中加入二溴化銅(II)(2.082g，9.32mmol)、溴化鋰(0.810g，9.32mmol)、乙腈(40mL)和亞硝酸叔丁酯(1.442g，13.98mmol)。將所得混合物在45℃下攪拌10min。然後加入3-F(2.8g，9.32mmol)的乙腈(20mL)溶液。將反應混合物在45℃下攪拌30min。混合物用水(60mL)稀釋，並用EtOAc(30mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，20g Agela flash柱，0-10% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.51 (s，1 H)，7.09 - 7.26 (m，5 H)，6.68 (s，1 H)，4.11 (dd，J=7.1，5.5 Hz，2 H)，4.02 (t，J=7.8 Hz，1 H)，3.83 - 3.88 (m，3 H)，3.37 - 3.44 (m，1 H)，3.18 - 3.25 (m，1 H)，1.14 (t，J=7.2 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 364.1 (M+H)。
步驟7. 2-(5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶-2-基)-3-苯基丙酸乙酯(3-I)在55℃下向圓底燒瓶中加入3-G(950mg，2.6mmol)、K3PO4 (1660mg，7.8mmol)、3-H(825mg，3.13mmol)、二噁烷(30mL)和Pd(dppf)Cl2 (170mg，0.26mmol)。將反應混合物在55℃下攪拌18h。過濾混合物，並濃縮濾液。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，20g Agela flash柱，0-10% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.32 (s，1 H)，7.69 (d，J=8.4 Hz，1 H)，7.38 - 7.52 (m，2 H)，7.15 - 7.27 (m，5 H)，6.83 (s，1 H)，4.14 (dd，J=13.6，7.0 Hz，3 H)，3.82 (s，3 H)，3.45 (dd，J=13.6，8.5 Hz，1 H)，3.28 (d，J=7.1 Hz，1 H)，1.16 (t，J=7.1 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 421.1 (M+H)。
步驟8. 2-(5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶-2-基)-3-苯基丙酸(3-J) 向圓底燒瓶中加入3-I(420mg，1.0mmol)、MeOH(5mL)、水(1mL)和氫氧化鋰水合物(50.3mg，1.2mmol)。將反應混合物在12℃下攪拌18h。LCMS顯示50%轉化。將溫度升至50℃，並將反應混合物進一步攪拌3.5h。LCMS顯示反應完成。將混合物濃縮，用HCl溶液(1M)調節至pH 5-6，並用DCM(10mL×4)萃取。合併的有機萃取物經無水硫酸鈉乾燥並過濾，得到粗溶液，將其直接用於下一步驟。MS (ESI) m/z 393.2 (M+H)。
步驟9. 4-(2-(5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶-2-基)-3-苯基丙- -醯胺基)苯甲酸乙酯 (3-K) 向圓底燒瓶中加入3-J(20mL，0.50mmol)(約0.025M DCM溶液)、HATU(228mg，0.60mmol)、4-氨基苯甲酸乙酯(99mg，0.60mmol)和Et3N(0.209mL，1.5mmol)。將反應混合物在12℃下攪拌1.5h。反應混合物用水(50mL)稀釋，並用DCM(20mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，12g Agela flash柱，0-10% EtOAc/PE，30min，幹載)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 10.35 (br. s.，1 H)，8.42 (s，1 H)，8.01 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.61 - 7.75 (m，3 H)，7.44 - 7.52 (m，2 H)，7.14 - 7.31 (m，4 H)，7.04 (d，J=7.1 Hz，2 H)，6.53 (s，1 H)，4.36 (d，J=7.3 Hz，2 H)，3.95 (dd，J=9.3，6.2 Hz，1 H)，3.71 (s，3 H)，3.58 (dd，J=13.2，6.0 Hz，1 H)，3.29 (dd，J=13.0，9.7 Hz，1 H)，1.39 (t，J=7.1 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 540.2 (M+H)。
步驟10. 5-(5-氯-2-氰基苯基)-2-(1-((4-(乙氧基羰基)-苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-4-甲氧基吡啶1-氧化物(3-L) 在14℃下向圓底燒瓶中加入3-K(50mg，0.093mmol)、DCM(3mL)和mCPBA(25mg，0.11mmol)。將反應混合物在氮氣氛下在50℃攪拌18h。加入飽和Na2SO3溶液(10mL)，並將混合物在室溫下攪拌5min。混合物用DCM(10mL×3)萃取。合併的有機層用飽和NaHCO3溶液(10mL×3)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，得到標題化合物，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 8.17 (s，1 H)，7.89 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.65 (d，J=8.4 Hz，1 H)，7.55 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.47 (dd，J=8.4，1.8 Hz，1 H)，7.35 (d，J=1.5 Hz，1 H)，7.20 - 7.29 (m，4 H)，7.16 (d，J=7.1 Hz，2 H)，6.93 (s，1 H)，4.24 - 4.30 (m，2 H)，3.86 (s，4 H)，3.75 (dd，J=13.9，9.0 Hz，1 H)，3.16 (br. s.，1 H)，1.30 (t，J=7.1 Hz，3 H)。MS (ESI) m/z 556.2 (M+H)。
步驟11. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶1-氧化物(3-M) 向圓底燒瓶中加入3-L(150mg，0.27mmol)、MeOH(3mL)、水(0.3mL)和氫氧化鋰水合物(13.6mg，0.32mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌3h。將混合物真空濃縮，並將殘餘物通過製備型HPLC(中性條件)純化，得到標題化合物。
1HNMR (CDCl3，400MHz)：δ 10.29 (br. s.，1 H)，8.33 (s，1 H)，8.00 (d，J=8.0 Hz，2 H)，7.78 (d，J=8.2 Hz，2 H)，7.71 (d，J=8.2 Hz，1 H)，7.53 (dd，J=8.3，1.7 Hz，1 H)，7.35 - 7.48 (m，3 H)，7.24 - 7.31 (m，3 H)，7.20 (d，J=7.3 Hz，1 H)，5.40 (d，J=6.8 Hz，1 H)，3.94 (s，3 H)，3.51 - 3.60 (m，1 H)，3.18 (d，J=10.4 Hz，1 H)。MS (ESI) m/z 528.2 (M+H)。
步驟12. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶1-氧化物(實施例23和24) 通過SFC(條件：儀器 SFC-80-(8)，柱AD(250mm*30mm，10um)，鹼-EtOH，流速(mL/min) 80)純化3-M(80mg，0.15mmol)，得到2-(1-((4-羧基苯基) 氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶1-氧化物(實施例23，第一個峰)和2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基-丙-2-基)-5-(5-氯-2-氰基苯基)-4-甲氧基吡啶1-氧化物(實施例24，第二個峰)。
實施例23 1HNMR (400MHz，CD3OD)：δ 8.37 (s，1 H)，7.92 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.84 (d，J=8.8 Hz，1 H)，7.57 - 7.66 (m，4 H)，7.47 (s，1 H)，7.35 (d，J=7.3 Hz，2 H),,7.27 (t，J=7.4 Hz，2 H)，7.15 - 7.21 (m，1 H)，4.99 (t，J=7.8 Hz，1 H)，3.96 (s，3 H)，3.50 - 3.58 (m，1 H)，3.38 - 3.45 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 528.1 (M+H)。
實施例241HNMR (400MHz，CD3OD)：δ 8.28 (s，1 H)，7.82 (d，J=8.4 Hz，2 H)，7.74 (d，J=9.0 Hz，1 H)，7.44 - 7.58 (m，4 H)，7.37 (s，1 H)，7.25 (d，J=7.3 Hz，2 H)，7.17 (t，J=7.4 Hz，2 H)，7.04 - 7.11 (m，1 H)，4.89 (t，J=7.7 Hz，1 H)，3.86 (s，3 H)，3.44 (dd，J=13.5，8.8 Hz，1 H)，3.28 - 3.35 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 528.1 (M+H)。
實施例25 & 26
2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-4-甲基吡啶1-氧化物(實施例25)和6-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-3-(3-氯-2,6-二氟苯基)-2-甲基吡啶1-氧化物 (實施例26)
步驟1. 4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸，TFA 向4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(0.4g，0.73mmol)的CH2Cl2(2ml)溶液中加入TFA(2ml，26.0mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時。通過旋轉蒸發儀除去溶劑和過量的TFA。粗產物通過凍幹進一步乾燥。MS (ESI) m/z 493 (M+H)。
步驟2. 4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-4-甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸和4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-6-甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸 在手套箱中，向小瓶中的4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸，TFA(410mg，0.676mmol)的乙酸(3378μl)和乙腈(3378μl)溶液中加入[Ir(dF-CF3-ppy)2(dtbbpy)]PF6(37.9mg，0.034mmol)，然後加入於溶劑油中的過氧化乙酸叔丁酯(431μl，1.351mmol)。將反應小瓶密封，並在LED藍光下在室溫下攪拌過夜。然後將反應混合物與0.3g二氧化矽-DMT樹脂混合併攪拌1小時，然後過濾。濃縮溶液，並將粗產物通過反相製備型HPLC在C-18柱上並用梯度乙腈/水(含有0.1%TFA)洗脫純化，得到4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-4-甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸和4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-6-甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸。MS (ESI) m/z 507 (M+H)。
步驟3. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-4-甲基吡啶1-氧化物(實施例25) 向4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-4-甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸(26mg，0.051mmol)的MeOH(1ml)溶液中加入H2O2(0.022ml，0.256mmol)和甲基三氧化錸(VII)(6.39mg，0.026mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時。用NaHSO3(10%水溶液)淬滅反應。產物用EtOAc萃取，並經無水Na2SO4乾燥。濃縮後，殘餘物通過矽膠柱色譜Redi 12g金，用梯度EtOAc/己烷(0-60%)洗脫純化，得到所需產物(實施例25)。MS (ESI) m/z 523 (M+H)。
步驟4. 6-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-3-(3-氯-2,6-二氟苯基)-2-甲基吡啶1-氧化物(實施例26) 向4-(2-(5-(3-氯-2,6-二氟苯基)-6-甲基吡啶-2-基)-3-苯基丙醯胺基)苯甲酸(18mg，0.036mmol)的MeOH(1ml)溶液中加入H2O2(0.16ml，1.8mmol)和甲基三氧化錸(VII)(4.43mg，0.018mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌3小時。減壓除去溶劑，殘餘物通過反相製備型HPLC在C-18柱上並用梯度乙腈/水(含0.1%TFA)洗脫純化，得到6-(1-((4-羧基苯基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-3-(3-氯-2,6-二氟苯基)-2-甲基吡啶1-氧化物 (實施例26)。MS (ESI) m/z 523 (M+H)。
實施例27 & 28
2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例27和28)
步驟1. 2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸乙酯 將THF(25ml)中的2-(5-溴吡啶-2-基)乙酸乙酯(2.0g，8.2mmol)冷卻至-78℃。加入雙(三甲基甲矽烷基)氨基鋰(1M，在己烷中，8.2ml，8.2mmol)。將混合物攪拌1.5小時。緩慢加入(碘甲基)環丙烷(0.795ml，8.19mmol)。將混合物在-78℃下攪拌1小時，然後在室溫下攪拌過夜。通過加入飽和NH4Cl水溶液(7mL)猝滅反應。產物用乙酸乙酯萃取，並用鹽水洗滌。有機層經無水硫酸鈉乾燥。過濾並濃縮後，粗產物通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充80g，用梯度0-30% EtOAc/異己烷洗脫純化，得到產物。MS (ESI) m/z 299.9 (M+H)。
步驟2. 2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸鋰 將MeOH(19ml)中的2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸乙酯(1.7g，5.70mmol)與LiOH溶液(1M，8.55ml，8.55mmol)混合，並加熱至50℃達30分鐘。將混合物濃縮至幹，然後在真空烘箱中在50℃下進一步乾燥過夜。產物不經進一步處理直接用於下一步驟。MS (ESI) m/z 271.9 (M+H)。
步驟3. 4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯 將DMF(10ml)中的2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸鋰(1570mg，5.7mmol)與4-氨基苯甲酸叔丁酯(1300mg，6.84mmol)和HATU(2600mg，6.84mmol)混合，然後加熱至50℃達2小時。冷卻至室溫後，在攪拌下將混合物緩慢倒入200mL水中。通過過濾收集沉澱，並用水洗滌，然後在真空烘箱中在50℃下乾燥過夜。產物不經進一步純化而用於下一步驟。
步驟4. 將4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1000mg，2.245mmol)與4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-聯(1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷)(570mg，2.245mmol)、[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II) (329mg，0.449mmol)和乙酸鉀(661mg，6.74mmol)在微波反應小管中混合。然後將小瓶蓋上。通過真空除去空氣並用氮氣回填(X3)。加入1,4-二噁烷(9ml)。將混合物在微波反應器中加熱至120℃達2小時。將反應混合物直接用於下一步驟。
步驟5. 4-(2-(5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯 將1-(4-氯-2-碘苯基)-1H-四唑(690mg，2.250mmol)和[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II)(165mg，0.225mmol)加入到步驟4的反應混合物中。將小瓶蓋上，真空除去空氣，並用氮氣回填(X3)。通過注射器加入K2CO3溶液(1M，6.75ml，6.75mmol)。然後將混合物加熱至85℃達2小時。冷卻至室溫後，混合物用乙酸乙酯稀釋。將混合物過濾。分離有機層，並經無水硫酸鈉乾燥。過濾並濃縮後，粗產物通過矽膠柱色譜(預填充100g)，用梯度0~70% EtOAc/己烷洗脫純化，得到產物。MS (ESI) m/z 545 (M+H)。
步驟6. 2-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物 將DCM(12ml)中的4-(2-(5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸叔丁酯(1200mg，2.202mmol)與甲基三氧化錸(165mg，0.661mmol)和過氧化氫(35%，1.012ml，11.01mmol)混合，然後在室溫下攪拌過夜。將混合物濃縮，並通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充100g，用0~80%梯度EtOAc/異己烷洗脫純化，得到產物。MS (ESI) m/z 561 (M+H)。
步驟7和8. 將DCM(3ml)中的2-(1-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(500mg，0.891mmol)與TFA(3.00ml)混合，然後在室溫下攪拌0.5小時。加入甲苯(20mL)。通過旋轉蒸發儀濃縮混合物。粗產物通過矽膠柱色譜Isolute Flash Si；預填充100g，用0~8%梯度的MeOH/DCM洗脫純化，得到產物。外消旋產物通過SFC在AS 21x250mm柱上，用2:1 MeOH/MeCN/CO2，70mL/min，100bar，35℃洗脫分離，得到兩種對映異構體：緩慢洗脫的異構體(實施例27)，MS (ESI) m/z 505 (M+H))和快速洗脫的異構體(實施例28)，MS (ESI) m/z 505 (M+H)。
實施例29 & 30
2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(3-氯-6-氰基-2-氟苯基)吡啶1-氧化物(實施例29和30)
步驟1. 4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸甲酯(6-B) 將LiOH H2O (0.44g，10.6mmol)加入到2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸甲酯(2.50g，8.8mmol)的甲醇(25ml)和水(5ml)溶液中，然後在50℃下攪拌1h。將混合物冷卻至室溫，減壓濃縮，並將殘餘物在50℃下在真空烘箱中乾燥，得到中間體，無需進一步純化。
將中間體溶於DMF(25ml)中，然後加入4-氨基苯甲酸甲酯(1.66g，11.0mmol)、HATU(4.18g，11.0mmol)和Hunig's鹼(1.92ml，11.0mmol)。在室溫下攪拌4h後，混合物用CH2Cl2和水稀釋。分離有機相，水相用CH2Cl2(2×20ml)萃取。合併的有機相用鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並在減壓下蒸發溶劑。殘餘物通過矽膠柱色譜(Teledyne Isco Si；預填充120g)，用0-10% EtOAc/CH2Cl2洗脫純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 404.69 (M+H)。
步驟2. 4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸 (6-C) 將LiOH H2O (0.08g，2.0mmol)加入到4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸甲酯(0.62g，1.54mmol)在MeOH(4ml)、THF(4ml)和水(2ml)的混合物中的溶液中，然後在50℃下攪拌1.5h。將反應混合物冷卻至室溫後，減壓除去溶劑，並將殘餘物溶於EtOAc(20ml)中。混合物用1N HCl(2ml，2.0mmol)中和。分離有機相，水相用EtOAc(2×10ml)萃取。合併的有機相經MgSO4乾燥，過濾並減壓濃縮。殘餘物通過矽膠柱色譜(Teledyne Isco Si；預填充40g)，用0-30% EtOAc/CH2Cl2洗脫純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 390.04 (M+H)。
步驟3和4. 4-(2-(5-(3-氯-6-氰基-2-氟苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)-苯甲酸 (6-F) 向微波小瓶中裝入4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸(119mg，0.3mmol)、雙(頻哪醇合)二硼(84mg，0.33mmol)、乙酸鉀(58.9mg，0.600mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵二氯化鈀(II)二氯甲烷絡合物(33mg，0.05mmol)並加蓋。通過真空/回填N2(X2)將空氣與N2交換。向混合物中加入二噁烷(3ml)和DMF(0.5ml)，並將其在120℃下加熱1h。冷卻後，將2-溴-4-氯-3-氟苄腈(63mg，0.27mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵二氯化鈀(II)二氯甲烷絡合物(33mg，0.05mmol)、碳酸鉀(83mg，0.60mmol)和水(0.4ml)加入到混合物中，並通過冷凍-真空-解凍和回填N2將其脫氣。然後，將混合物在90℃下加熱2h。冷卻後，反應混合物用EtOAc和水稀釋，通過硅藻土過濾並用EtOAc洗滌。分離有機相，水相用EtOAc萃取。合併的有機相經MgSO4乾燥，過濾，減壓濃縮，殘餘物通過矽膠柱柱色譜(Teledyne Isco Si；預填充40g)，用0-50% EtOAc/己烷洗脫純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 463.98 (M+H)。
步驟5. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(3-氯-6-氰基-2-氟苯基)吡啶1-氧化物(實施例29和30) 將mCPBA(47mg，0.28mmol)加入到4-(2-(5-(3-氯-6-氰基-2-氟苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸(6-F，51mg，0.11mmol)在CH2Cl2(2ml)中的混合物中，然後在室溫下攪拌2h。然後，減壓除去溶劑，殘餘物通過矽膠柱色譜(Teledyne Isco Si；預填充24g)，用0-10% MeOH/CH2Cl2洗脫純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 479.95 (M+H)。
外消旋體6-F用以下條件分離：柱IA(30X250mm)，洗脫劑80% 2:1 MeOH:MeCN/CO2，70ml/min，100bar，MeOH/CH2Cl2/NH4OH中10mg/ml，35℃，254nm，得到2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(3-氯-6-氰基-2-氟苯基)吡啶1-氧化物(實施例29，快速洗脫的異構體)和2-(1-((4-羧基苯基)-氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(3-氯-6-氰基-2-氟苯基)吡啶1-氧化物(實施例30，緩慢洗脫的異構體)。
實施例31 & 32
2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例31和32)
步驟1. 2-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氯苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸乙酯(7-B) 在13℃下向圓底燒瓶中加入7-A(2.7g，9.06mmol)、K3PO4(5.77g，27.2mmol)、(4-氯-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(3.52g，9.96mmol)、THF(40mL)、水(8mL)和Pd(dppf)Cl2(0.295g，0.453mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌2h。過濾混合物，並濃縮濾液。殘餘物用水(60mL)稀釋，並用EtOAc(20mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，40g Agela flash柱，0-20% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ8.56 (d，J=1.5 Hz，1 H)，8.03 (d，J=8.6 Hz，1 H)，7.65 (dd，J=8.1，2.1 Hz，1 H)，7.47 (d，J=8.2 Hz，1 H)，7.34 (dd，J=8.8，2.2 Hz，1 H)，7.17 (d，J=2.4 Hz，1 H)，6.25 (br. s.，1 H)，4.21 (dd，J=9.8，7.2 Hz，2 H)，4.00 (t，J=7.6 Hz，1 H)，2.01 - 2.09 (m，1 H)，1.85 - 1.93 (m，1 H)，1.44 (s，9 H)，1.26 (t，J=7.1 Hz，3 H)，0.66 - 0.74 (m，1 H)，0.43 (td，J=8.5，4.1 Hz，2 H)，0.10 - 0.17 (m，1 H)，-0.03 - 0.07 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 445.2 (M+H)。
步驟2. 2-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氯苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸(7-C) 向圓底燒瓶中加入7-B(2g，4.49mmol)、乙醇(40mL)、水(4mL)和氫氧化鋰水合物(0.207g，4.94mmol)。將反應混合物在15℃下攪拌18h。將反應混合物在35℃下攪拌24h。LCMS顯示反應完成。將反應混合物濃縮，用水(20mL)稀釋並用飽和檸檬酸溶液調節至pH 4-5。混合物用DCM(15mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液不經進一步純化直接用於下一步驟。MS (ESI) m/z 417.2 (M+H)。
步驟3. 4-(2-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氯苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)-3-氯苯甲酸甲酯(7-E) 在15℃下向圓底燒瓶中加入7-C(15mL，1.440mmol)的粗溶液、7-D(267mg，1.440mmol)、HATU(657mg，1.728mmol)和Et3N(0.602mL，4.32mmol)。將反應混合物在15℃下攪拌48h。將混合物濃縮，殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，20g Agela flash柱，0-20% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ10.78 (s，1 H)，8.68 (s，1 H)，8.58 (d，J=8.8 Hz，1 H)，8.05 (s，1 H)，7.93 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.69 - 7.75 (m，1 H)，7.44 (d，J=7.7 Hz，1 H)，7.37 (dd，J=8.9，2.3 Hz，1 H)，7.21 (d，J=2.2 Hz，1 H)，6.19 (br. s.，1 H)，3.97 (t，J=7.5 Hz，1 H)，3.90 (s，3 H)，2.06 - 2.15 (m，2 H)，1.43 (s，10 H)，0.70 (br. s.，1 H)，0.34 - 0.52 (m，2 H)，0.09 - 0.16 (m，1 H)，-0.08 - 0.01 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 584.2 (M+H)。
步驟4. 5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氯苯基)-2-(1-((2-氯-4-(甲氧基羰基)苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(7-F) 在15℃下向圓底燒瓶中加入7-E(500mg，0.855mmol)、DCM(10mL)和3-氯過氧苯甲酸(227mg，1.027mmol)。將反應混合物在15℃下攪拌18h。混合物用飽和Na2SO3溶液(3mL)淬滅，並用DCM(10mL×3)萃取。合併的有機層用飽和NaHCO3(10mL×3)溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，20g Agela flash柱，0-25% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ10.74 (s，1 H)，8.49 (d，J=8.6 Hz，1 H)，8.40 (s，1 H)，8.05 (s，1 H)，7.90 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.48 (d，J=8.2 Hz，1 H)，7.34 - 7.42 (m，2 H)，7.19 (d，J=2.2 Hz，1 H)，6.19 (s，1 H)，4.92 (dd，J=8.9，5.8 Hz，1 H)，3.89 (s，3 H)，2.39 - 2.50 (m，1 H)，1.65 - 1.74 (m，1 H)，1.40 (s，9 H)，0.84 (br. s.，1 H)，0.52 (d，J=7.9 Hz，2 H)，0.12 - 0.29 (m，2 H)。MS (ESI) m/z 600.3 (M+H)。
步驟5. 5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氯苯基)-2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(7-G) 在15℃下向圓底燒瓶中加入7-F(440mg，0.733mmol)、MeOH(10mL)、DCM(2mL)、水(2mL)和氫氧化鋰水合物(30.7mg，0.733mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌18h。將混合物濃縮，用飽和檸檬酸溶液調節至pH 4-5，並用DCM(10mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，得到標題化合物，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 9.93 (br. s.，1 H)，8.48 (s，1 H)，8.32 (d，J=8.6 Hz，1 H)，7.82 - 7.91 (m，2 H)，7.71 (d，J=8.8 Hz，1 H)，7.55 - 7.60 (m，1 H)，7.48 (d，J=8.4 Hz，1 H)，7.38 (dd，J=8.8，2.2 Hz，1 H)，7.23 (d，J=2.2 Hz，1 H)，6.64 (br. s.，1 H)，4.89 (dd，J=8.7，6.1 Hz，1 H)，2.37 - 2.46 (m，1 H)，1.72 - 1.81 (m，1 H)，1.39 (s，10 H)，0.83 (br. s.，1 H)，0.53 (d，J=7.9 Hz，2 H)，0.21 (d，J=19.4 Hz，2 H)。MS (ESI) m/z 586.0 (M+H)。
步驟6. 5-(2-氨基-5-氯苯基)-2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(7-H) 在15℃下向圓底燒瓶中加入7-G(450mg，0.691mmol)、DCM(6mL)和TFA(3mL)。將反應混合物在15℃下攪拌2h。將反應混合物濃縮，得到標題化合物，其不經進一步純化直接用於下一步驟。MS (ESI) m/z 486.2 (M+H)。
步驟7. 2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(7-I) 向圓底燒瓶中加入7-H(180mg，0.370mmol)、乙酸(5mL)、三甲氧基甲烷(786mg，7.40mmol)和疊氮化鈉(481mg，7.40mmol)。將反應混合物在40℃下攪拌18h。在0℃下將反應混合物用飽和亞硝酸鈉溶液(6mL)淬滅，並用EtOAc(15mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過製備型HPLC(TFA條件)純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 539.1 (M+H)。
步驟8. 2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例31和32) 7-I(100mg，0.185mmol)通過SFC(條件：儀器SFC-80-(8)，AD(250mm*30mm，10um)，鹼-IPA，開始B 55%，流速(mL/min) 80)純化，得到2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例31，第一個峰)和2-(1-((4-羧基-2-氯苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物 (實施例32，第二個峰)。
實施例31：(400 MHz，CD3OD)：δ 9.24 (s，1 H)，8.20 (d，J=1.3 Hz，1 H)，8.04 (d，J=8.6 Hz，1 H)，7.88 (s，1 H)，7.75 (dd，J=8.6，1.5 Hz，1 H)，7.60 - 7.70 (m，2 H)，7.54 - 7.59 (m，1 H)，7.43 (d，J=8.4 Hz，1 H)，7.08 (dd，J=8.3，1.4 Hz，1 H)，4.61 (dd，J=8.6，6.6 Hz，1 H)，1.98 - 2.07 (m，1 H)，1.64 - 1.73 (m，1 H)，0.64 - 0.73 (m，1 H)，0.34 (d，J=8.16 Hz，2 H)，-0.04 - 0.07 (m，2 H)。MS (ESI) m/z 539.0 (M+H)。
實施例32：(400 MHz，CD3OD)：δ 9.38 (s，1 H)，8.34 (d，J=1.5 Hz，1 H)，8.18 (d，J=8.6 Hz，1 H)，8.02 (d，J=1.8 Hz，1 H)，7.89 (dd，J=8.6，2.0 Hz，1 H)，7.75 - 7.84 (m，2 H)，7.68 - 7.74 (m，1 H)，7.57 (d，J=8.4 Hz，1 H)，7.23 (dd，J=8.2，1.5 Hz，1 H)，4.75 (dd，J=8.6，6.4 Hz，1 H)，2.16 (dd，J=14.7，7.6 Hz，1 H)，1.79 - 1.87 (m，1 H)，0.77 - 0.87 (m，1 H)，0.44 - 0.54 (m，2 H)，0.11 - 0.24 (m，2 H)。MS (ESI) m/z 539.1 (M+H)。
通過使用與上述那些類似的程序和合適的原料，合成以下化合物並通過LCMS表徵。
實施例53 & 54
2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例53和54)
步驟1. 2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸(8-B) 在10℃下向圓底燒瓶中加入2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙酸乙酯(2g ，6.7mmol)、MeOH(20mL)、水(2mL)和氫氧化鈉(0.40g，10mmol)。將反應混合物在10℃下攪拌18h。將反應混合物濃縮，用水(20mL)稀釋，並將混合物用飽和檸檬酸溶液調節至pH 4-5。混合物用DCM(10mL×3)萃取。合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾，並將濾液不經進一步純化直接用於下一步驟。MS (ESI) m/z 270.0 (M+H)。
步驟2. 4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸乙酯(8-C) 在12℃下向圓底燒瓶中加入8-B(30ml，6.0mmol)、HATU(2.75g，7.2mmol)、4-氨基苯甲酸乙酯(1.0g，6.0mmol)和三乙胺(2.5mL，18mmol)。將反應混合物在12℃下攪拌18h。將混合物濃縮，殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，40g Agela flash柱，0-25% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 9.60 (s，1 H)，8.60 (d，J=2.3 Hz，1 H)，7.89 (d，J=8.8 Hz，2 H)，7.72 (dd，J=8.3，2.26 Hz，1 H)，7.51 (d，J=8.5 Hz，2 H)，7.13 - 7.18 (m，1 H)，4.25 (q，J=7.2 Hz，2 H)，3.73 (dd，J=8.3，7.0 Hz，1 H)，1.88 (dt，J=18.2，7.3 Hz，2 H)，1.28 (t，J=7.2 Hz，3 H)，0.45 - 0.57 (m，1 H)，0.23 - 0.37 (m，2 H)，-0.05 - 0.04 (m，1 H)，-0.20 - -0.11 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 417.1 (M+H)。
步驟3. 5-溴-2-(3-環丙基-1-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(8-D) 在12℃下向圓底燒瓶中加入8-C(300mg，0.719mmol)、DCM(6mL)和3-氯過氧苯甲酸(207mg，0.935mmol)。將反應混合物在12℃下攪拌18h。混合物用飽和Na2SO3溶液(3mL)淬滅，用水(15mL)稀釋，並用DCM(10mL×3)萃取混合物。合併的有機層用飽和NaHCO3(10 mL×3)溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。殘餘物通過正相色譜(ISCO，SiO2，20g Agela flash柱，0-25% EtOAc/PE，40min，幹載)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 10.32 (br. s.，1 H)，8.30 (d，J=1.8 Hz，1 H)，7.76 (d，J=8.8 Hz，2 H)，7.39 (d，J=8.5 Hz，2 H)，7.31 (dd，J=8.5，1.8 Hz，1 H)，7.06 (s，1 H)，4.52 (dd，J=8.8，6.3 Hz，1 H)，4.14 (q，J=7.1 Hz，2 H)，2.12 - 2.22 (m，1 H)，1.43 (d，J=6.8 Hz，1 H)，1.17 (t，J=7.0 Hz，3 H)，0.57 (d，J=7.3 Hz，1 H)，0.24 - 0.31 (m，2 H)，-0.01 (d，J=5.0 Hz，1 H)，-0.10 - -0.04 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 435.0 (M+H)。
步驟4. 5-(5-氯-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-2-(3-環丙基-1-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(8-F) 在15℃下向圓底燒瓶中加入8-D(60mg，0.138mmol)、1-(4-氯-2-(三甲基甲錫烷基)苯基)-1H-1,2,3-三唑(47.4mg，0.138mmol)、甲苯(2mL)和Pd(Ph3P)4(16.00mg，0.014mmol)。將反應混合物在110℃下攪拌18h，並將混合物在140℃下攪拌5h。將混合物過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，PE:EtOAc=1:1)純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 532.3 (M+H)。
步驟5. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(8-G)
在13℃下向圓底燒瓶中加入8-F(60mg，0.068mmol)、MeOH(3mL)、水(1mL)和氫氧化鈉(5.41mg，0.135mmol)。將反應混合物在13℃下攪拌18h。將混合物濃縮，並將殘餘物通過製備型HPLC(TFA緩衝液)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ 7.96 - 8.09 (m，2 H)，7.80 (d，J=8.4 Hz，2 H)，7.40 - 7.65 (m，7 H)，7.06 (d，J=8.5 Hz，1 H)，4.41 - 4.51 (m，1 H)，1.68 - 1.86 (m，2 H)，0.68 (br. s.，1 H)，0.32 (d，J=7.5 Hz，2 H)，0.00 (d，J=5.1 Hz，2 H)。MS (ESI) m/z504.2 (M+H)。
步驟6. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例53和54) 外消旋化合物2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)吡啶1-氧化物(25mg，0.050mmol)通過SFC在Chiralpak OD柱上，用50:50的超臨界CO2/MeOH(0.1%NH3H2O)以50mL/min洗脫分離，得到實施例53(第一個峰)和實施例54(第二個峰)。
實施例53：1H NMR (CD3OD，400MHz)：δ 8.11 - 8.23 (m，2 H)，7.96 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.63 - 7.82 (m，6 H)，7.58 (d，J=8.4 Hz，1 H)，7.22 (d，J=8.2 Hz，1 H)，4.58 - 4.65 (m，1 H)，1.87 - 2.01 (m，2 H)，0.83 (br. s.，1 H)，0.48 (d，J=7.7 Hz，2 H)，0.16 (d，J=5.1 Hz，2 H)。MS (ESI) m/z 504.1 (M+H)。
實施例54：1H NMR (CD3OD，400MHz)：δ 8.15 (d，J=19.6 Hz，2 H)，7.94 (d，J=8.2 Hz，2 H)，7.61 - 7.79 (m，6 H)，7.57 (d，J=8.6 Hz，1 H)，7.20 (d，J=7.4 Hz，1 H)，4.60 (dd，J=8.6，6.3 Hz，1 H)，1.85 - 1.98 (m，2 H)，0.82 (d，J=7.0 Hz，1 H)，0.46 (d，J=7.4 Hz，2 H)，0.10 - 0.19 (m，2 H)。MS (ESI) m/z 504.1 (M+H)。
實施例55
2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(吡啶-2-基)苯基)吡啶1-氧化物
步驟1. 4-(3-環丙基-2-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)吡啶-2-基)丙醯胺基)苯甲酸乙酯 在15℃下向圓底燒瓶中加入4-(2-(5-溴吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸乙酯(100mg，0.240mmol)、乙酸鉀(70.6mg，0.719mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-聯(1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷)(91mg，0.359mmol)、二噁烷(2mL)和[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(35.1mg，0.048mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌18h。反應混合物不經進一步純化直接用於下一步驟。MS (ESI) m/z 383.2 (M+H)。
步驟2. 4-(2-(5-(2-溴-5-氯苯基)吡啶-2-基)-3-環丙基丙醯胺基)苯甲酸乙酯(9-B) 在13℃下向圓底燒瓶中加入來自步驟1的9-A、1-溴-4-氯-2-碘苯(66.0mg，0.208mmol)、K2CO3 (43.1mg，0.312mmol)和[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(15.22mg，0.021mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌18h。將混合物過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，PE:EtOAc=2:1)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ10.21 (s，1 H)，8.71 (d，J=2.0 Hz，1 H)，8.06 (d，J=8.8 Hz，2 H)，7.76 - 7.88 (m，2 H)，7.71 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.43 - 7.50 (m，2 H)，7.33 (d，J=8.2 Hz，1 H)，4.41 (q，J=7.1 Hz，2 H)，3.98 (t，J=7.5 Hz，1 H)，2.03 - 2.20 (m，2 H)，1.44 (t，J=7.1 Hz，2 H)，0.69 - 0.81 (m，1 H)，0.42 - 0.56 (m，2 H)，0.19 (dd，J=9.2，4.5 Hz，1 H)，-0.02 - 0.06 (m，1 H)。MS (ESI) m/z 529.2 (M+H)。
步驟3. 5-(2-溴-5-氯苯基)-2-(3-環丙基-1-((4-(乙氧基羰基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(9-C) 在15℃下向圓底燒瓶中加入9-B(80mg，0.129mmol)、DCM(4mL)和3-氯過氧苯甲酸(42.8mg，0.193mmol)。將反應混合物在15℃下攪拌18h。混合物用飽和Na2SO3溶液(3mL)淬滅，用水(10mL)稀釋，並用DCM(10mL×3)萃取。合併的有機層用飽和NaHCO3 (10mL×3)溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，得到標題化合物，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
1H NMR (CDCl3，400MHz)：δ10.86 (br. s.，1 H)，8.33 (s，1 H)，7.91 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.66 (d，J=1.5 Hz，1 H)，7.58 (d，J=8.6 Hz，2 H)，7.35 - 7.39 (m，2 H)，7.17 - 7.20 (m，2 H)，4.74 - 4.83 (m，1 H)，4.27 (q，J=7.1 Hz，2 H)，2.36 - 2.47 (m，1 H)，1.56 - 1.60 (m，1 H)，1.31 (t，J=7.2 Hz，3 H)，0.80 (d，J=10.1 Hz，1 H)，0.44 (d，J=7.1 Hz，2 H)，0.04 - 0.23 (m，2 H)。MS (ESI) m/z 545.2 (M+H)。
步驟4. 5-(5-氯-2-(吡啶-2-基)苯基)-2-(3-環丙基-1-((4-(乙氧基羰基)苯基) 氨基)-1-氧代丙-2-基)吡啶1-氧化物(9-D) 向微波管中加入9-C(35mg，0.064mmol)、2-(三丁基甲錫烷基)吡啶(28.4mg，0.077mmol)、甲苯(2mL)和Pd(PPh3)4(14.87mg，0.013mmol)。將反應混合物在微波下在140℃攪拌40min。將混合物過濾並濃縮。殘餘物通過製備型TLC(SiO2，PE:EtOAc=1:2)純化，得到標題化合物。MS (ESI) m/z 542.3 (M+H)。
步驟5. 2-(1-((4-羧基苯基)氨基)-3-環丙基-1-氧代丙-2-基)-5-(5-氯-2-(吡啶-2-基)苯基)吡啶1-氧化物(實施例55) 在15℃下向圓底燒瓶中加入9-D(15mg，0.028mmol)、MeOH(3mL)、水(1mL)和氫氧化鈉(2.214mg，0.055mmol)。將反應混合物在15℃下攪拌18h。LCMS顯示反應完成。將混合物濃縮，並將殘餘物通過製備型HPLC(TFA緩衝液)純化，得到標題化合物。
1H NMR (CD3OD，400MHz)：δ 8.44 (d，J=4.7 Hz，1 H)，8.04 (s，1 H)，7.83 (d，J=8.6 Hz，3 H)，7.51 - 7.63 (m，4 H)，7.35 - 7.48 (m，4 H)，7.14 (d，J=7.4 Hz，1 H)，4.44 - 4.51 (m，1 H)，1.74 - 1.86 (m，2 H)，0.70 (br. s.，1 H)，0.33 (dt，J=7.2，3.8 Hz，2 H)，-0.03 - 0.07 (m，2 H)。MS (ESI) m/z 514.1 (M+H)。
通過使用上述方法和合適的原料，合成以下化合物。這些化合物通過LC/MS表徵。
因子XIa測定
本發明化合物作為凝血因子XIa抑制劑的有效性可以使用相關的純化絲氨酸蛋白酶和合適的合成底物來測定。在不存在和存在本發明化合物的兩種情況下測量相關絲氨酸蛋白酶對發色或螢光底物的水解速率。測定在室溫或37℃下進行。底物的水解導致氨基三氟甲基香豆素(AFC)的釋放，通過在405nm激發下測量在510nm處的發射增加，通過螢光分光光度法監測。在抑制劑存在下螢光變化速率的降低指示酶抑制。這樣的方法是本領域技術人員已知的。該測定的結果表示為抑制常數Ki。
在pH 7.4的含有150mM NaCl、5mM CaCl2和0.1% PEG 8000(聚乙二醇；JT Baker或Fisher Scientific)的50mM HEPES緩衝液中進行因子XIa測定。使用終濃度為40pM的純化人因子XIa(Sekisui Diagnostics)和濃度為100μM的合成底物Z-Gly-Pro-Arg-AFC，TFA鹽(Sigma #C0980)進行測定。
通過將底物儲液稀釋至含有酶或用抑制劑平衡的酶的溶液中至少十倍至終濃度≤0.1 Km進行活性測定。在對照實驗中測定在酶和抑制劑之間實現平衡所需的時間。測量在不存在抑制劑(Vo)或存在抑制劑(Vi)時產物形成的初速度。假定為競爭性抑制，並且相比Km/[S]、[I]/e和[I]/e (其中[S]、[I]和e分別代表底物、抑制劑和酶的總濃度)，個體可忽略不計，抑制劑從酶解離的平衡常數(Ki)可以從Vo/Vi對[I]的依賴性獲得，如下式所示。
Vo/Vi = 1 + [I]/Ki
該測定顯示的活性表明本發明化合物可以治療上用於治療或預防患有不穩定型心絞痛、急性冠狀動脈症候群、難治性心絞痛、心肌梗死、短暫性腦缺血發作、心房顫動、中風例如血栓性中風或栓塞性中風、靜脈血栓形成、冠狀動脈和腦動脈血栓形成、腦和肺栓塞、動脈粥樣硬化、深靜脈血栓形成、彌散性血管內凝血、以及再通血管的再閉塞或再狹窄的患者的各種心血管和/或腦血管血栓栓塞性病狀。
激肽釋放酶測定
本發明化合物作為激肽釋放酶抑制劑的有效性可以使用相關的純化絲氨酸蛋白酶和合適的合成底物來測定。在不存在和存在本發明化合物的兩種情況下測量相關絲氨酸蛋白酶對發色或螢光底物的水解速率。測定在室溫或37℃下進行。底物的水解導致氨基三氟甲基香豆素(AFC)的釋放，通過在405nm激發下測量在510nm處的發射增加，通過螢光分光光度法監測。在抑制劑存在下螢光變化速率的降低指示酶抑制。這樣的方法是本領域技術人員已知的。該測定的結果表示為抑制常數Ki。
在pH 7.4的含有150mM NaCl、5mM CaCl2和0.1% PEG 8000(聚乙二醇；Fisher Scientific)的50mM HEPES緩衝液中進行激肽釋放酶測定。使用終濃度為0.5nM的純化人血漿激肽釋放酶(Enzyme Research Laboratories)和濃度為100mM的合成底物乙醯基-K-P-R-AFC(Sigma # C6608)進行測定。
通過將底物儲液稀釋至含有酶或用抑制劑平衡的酶的溶液中至少十倍至終濃度≤0.2 Km進行活性測定。在對照實驗中測定在酶和抑制劑之間實現平衡所需的時間。在線性進展曲線條件下進行反應，並在405 Ex/510 Em nm下測量螢光增加。將值轉化為對照反應的抑制百分比(減去100%抑制值後)。IC50通過來自四參數對數曲線擬合的拐點確定。使用Cheng Prusoff方程，Ki = IC50/(1+([S]/Km))計算Ki。
該測定顯示的活性表明本發明化合物可以治療上用於治療或預防患有不穩定型心絞痛、急性冠狀動脈症候群、難治性心絞痛、心肌梗死、短暫性腦缺血發作、心房顫動、中風例如血栓性中風或栓塞性中風、靜脈血栓形成、冠狀動脈和腦動脈血栓形成、腦和肺栓塞、動脈粥樣硬化、深靜脈血栓形成、彌散性血管內凝血、以及再通血管的再閉塞或再狹窄的患者的各種心血管和/或腦血管血栓栓塞性病狀。
所選化合物的因子XIa(FXIa)和血漿激肽釋放酶(P. KLK)數據如下：
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