腎症候群出血熱檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
2023-12-09 04:06:51
專利名稱：腎症候群出血熱檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及傳染病學、分子生物學和免疫學領域。更具體地，本發明涉及腎症候群出血熱的檢測方法和檢測試劑盒。
腎症候群出血熱(HFRS)是由肯亞病毒科漢坦病毒屬(Hanta Virus)中某些病毒引起的人類急性傳染病。發病後死亡率很高，因此早期的正確診斷非常必要。在我國，腎綜合症出血熱(HFRS)是除病毒性肝炎外危害最大的一種傳染病，本病的疫區範圍涉及歐亞非等世界各地，我國的發病人數亦無減少趨勢。在上海浦東地區，由於外來人口的增多，HFRS的發病居多不下。因此，對該病的早期快速診斷和及時治療，對人民的生命健康具有現實意義。
漢坦病毒是HFRS的病原體，該病毒血清學診斷國內常用的免疫螢光技術和酶聯免疫試驗(ELISA)檢測特異性抗體IgG與IgM，都存在一定的局限性，檢測時間至少也要4小時，國外開發的高密度顆粒凝集試驗(HDPA)能在1小時內完成檢測，但尚未在國內普遍推廣。
斑點金免疫滲濾試驗(滴金法)是最新的先進、快速技術，曾成功地用於多種傳染病的檢測，但尚未見用於HFRS檢測的試劑盒面市。滴金法具有操作簡便、快速(可在幾分鐘內完成)及特異性高等特點，因此是一種HFRS的早期快速診斷提新的有實用價值的候選檢測方法，特別適於在基層醫療單位推廣應用。
儘管，某些文獻描述了一些用金標法檢測腎症候群出血熱的方法，但是完全按照這些文獻所公開的方法和程序重複進行實驗時，卻無法獲得令人滿意的結果，甚至根本無法檢測。在《中國醫學檢驗雜誌)》1998年3月第21卷第2期中，公開了一種滴金法檢測腎症候群出血熱血清特異性IgM的方法，但是完全按照該法卻無法重複實驗結果。其原因可能是抗原的製備方法有問題。
目前，在開發腎症候群出血熱滴金法檢測和試劑盒時，因為IgM抗體產生的時間最早，所以為了早期檢測都把注意力集中在檢測IgM上。沒有公開過任何針對IgG的滴金法和試劑盒。
因此，迫切需要一種能快速、正確和簡便的診斷腎症候群出血熱的方法和試劑盒。
本發明的目的就是提供一種快速、正確和簡便的檢測腎症候群出血熱的方法及相應的檢測試劑盒。
一方面，本發明提供了一種檢測樣品中是否含有抗漢坦病毒的IgG抗體的方法，它包括步驟(a)將純化的漢坦病毒核蛋白包被在硝酸纖維素膜上，形成在點樣區中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜；(b)以非人的抗人IgG抗體和膠體金為原料，製備膠體金-抗人IgG抗體的結合物；(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區上；(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區；(e)將步驟(b)的膠體金-抗人IgG抗體的結合物滴加在點樣區上；(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區；點樣區出現紅色斑點表示樣品中存在抗漢坦病毒的IgG抗體，不出現紅色斑點表示樣品中不存在抗漢坦病毒的IgG抗體。
另一方面，本發明提供了一種檢測腎症候群出血熱的檢測試劑盒，該試劑盒包含硝酸纖維素膜，在該膜的點樣區包被有純化的漢坦病毒抗原，膠體金-非人抗IgG抗體結合物溶液，和可選的洗滌緩衝液。
本發明還提供了一種檢測樣品中是否含有抗漢坦病毒的IgM抗體的方法，它包括步驟(a)將純化的漢坦病毒抗原包被在硝酸纖維素膜上，形成在點樣區中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜，其中該純化的抗原是如下製備的收集培養的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心後，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉澱即為純化的漢坦病毒抗原；(b)以非人的抗人IgM抗體和膠體金為原料，製備膠體金-抗人IgM抗體的結合物；(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區上；(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區；(e)將步驟(b)的膠體金-抗人IgM抗體的結合物滴加在點樣區上；(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區；
點樣區出現紅色斑點表示樣品中存在抗漢坦病毒的IgM抗體，不出現紅色斑點表示樣品中不存在抗漢坦病毒的IgM抗體。
本發明是基於如下意外發現基礎上完成的在受到漢坦病毒感染後，IgG會很快產生，因而可作為檢測對象。眾所周知，在受到感染後，通常IgM抗體最早產生。而IgG抗體的產生則較慢，而且IgG的滴度較低，因此通常不適宜作為滴金法的檢測對象。然而，本發明的發明人發現，在受到漢坦病毒感染後，IgG會很快產生(約1-2天內)，而且滴度水平可以達到滴金法的檢測靈敏度。並在此基礎上完成了本發明。
無論是選擇IgG還是IgM作為檢測對象，為了成功地進行滴金法檢測，漢坦病毒抗原的製備很關鍵。通常要求純度高，與IgG和IgM結合特異的抗原，在本發明的一個實施例中，採用分步離心的方法來製備抗原，即收集培養的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心後，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉澱即為純化的漢坦病毒抗原(核蛋白)。
為了獲得漢坦病毒，可以將其接種於一些採用的宿主細胞，如Vero-E6細胞和沙鼠腎細胞。較佳地，可接種於沙鼠腎細胞。
接種後，在35-37℃按常規方法傳導培養7-10天後，可收穫病毒。培養方法可參見例如《現代微生物學實驗技術及其應用)》，人民衛生出版社，1997年10月；《醫學病毒學及實驗技術》1990年，科學出版社；和《醫學實驗病毒學》人民軍醫出版社，1985年等文獻。
在獲得了純化的漢坦病毒抗原之後，可用常規方法將其包被在檢測膜的點樣區上。
為了消除非特異性結合，獲得的在點樣區中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜還經過預結合處理，例如用0.75-1.5％BSA溶液封閉2-24小時。封閉時間也可進一步延長。但通常2小時就足夠了。
在本發明中，可供使用的與IgG抗體結合的雙抗可以是任何非人的抗人IgG抗體，它們包括(但並不限於)羊抗人IgG抗體，小鼠抗人IgG抗體和兔抗人IgG抗體較佳地，是羊抗人IgG抗體，上述非人的抗人IgM抗體可用常規方法製備，或購買得到；在本發明中，可供使用的檢測膜可以是平均孔徑在0.3-1.2微米之間的各種材質膜。較佳地，所用的是硝酸纖維素膜。各種規格的膜的平均孔徑不同，因此，在製備檢測膜時，應根據孔徑大小來確定膠體金的顆粒大小(粒徑)。這可通過控制膠體金製備過程中檸檬酸鈉與水的重量比。研究表明，檸檬酸鈉用量增加，膠體金粒徑下降。具體用量可通過常規實驗確定。例如當該硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.65微米時，在用檸檬酸還原法製備的並且在製備時檸檬酸鈉與水的重量比為0.035-0.045∶100，較佳地0.038-0.042∶100，最佳地約0.04∶100。用這樣的膠體金所製備的膠體金-抗人IgM或IgG抗體結合物可以有效地滲透入0.65微米的膜中。
通常，在檸檬酸還原法製備膠體金的常規方法中氯金酸與水的重量比0.0075-0.03∶100，較佳地約0.01-0.02∶100。
在獲得了膠體金和抗人IgG抗體(或抗人IgM抗體)後，兩者的偶聯可根據常規方法進行。例如如下進行製備以10毫升膠體金溶液為基準，加入8-30微克的非人抗人IgG抗體，靜置後加BSA，使BSA終濃度為1％，再靜置後，加入聚乙二醇(PEG)0.8-0.12克(防止膠體金自聚沉澱)，混勻，加入適量防腐劑。製得膠體金-抗人IgG抗體(或抗人IgM抗體)結合物溶液。其中，偶聯時，抗人IgG抗體(或抗人IgM抗體)的用量上限也可進一步提高，這樣做雖對檢測結果無影響，但是出於減低成本，用量宜為8-30微克/10毫升膠體金溶液，較佳地9-20毫克/10毫升膠體金溶液，更佳地10-15毫克/10毫升膠體金溶液。
在檢測時，通常包括如下步驟A、取包被了漢坦病毒抗原的檢測膜，在下方墊一次性吸水材料。
B、在點樣區上滴加適量(通常1滴即足夠)洗滌緩衝液(如PBS-Tween 20緩衝液)，以活化膜表面。待滲入即可(該活化步驟可省略)。
C、在點樣區滴加適量血清樣品，待滲入即可。
D、在點樣區滴加適量洗滌緩衝液，以洗滌點樣區。可重複洗滌2-5次，通常共3次。
E、在點樣區滴加適量(通常1滴即可)本發明的膠體金-羊抗人IgG抗體結合物(或膠體金-羊抗人IgG抗體結合物溶液)。
F、在點樣區滴加適量洗滌緩衝液，以洗滌點樣區。可重複洗滌2-5次，通常共3次。觀察結果，在點樣區出現紅色斑點為陽性，無紅色斑點為陰性。
為了更準確地檢測，可同時檢測IgM和/或使用陽性和陰性對照。在試劑盒中，也可包含選自下組的物質膠體金-非人抗IgM抗體結合物溶液，陽性和陰性對照。
本發明方法製備的漢坦病毒抗原非常適合作為金標法檢測腎症候群出血熱的抗原蛋白。選用該核蛋白製作的金標檢測試紙，在檢測樣品中是否存在抗漢坦病毒的抗體時，靈敏度大大提高，可以快速和正確地得出受檢對象是否被漢坦病毒所感染，從而十分有利於降低腎症候群出血熱的死亡率。
此外，由於被檢測的IgG抗體的特異性遠高於IgM抗體，所以可有效地降低假陽性，並且有利於臨床確診腎症候群出血熱。
此外，本發明的檢測方法簡便，使用極其簡單，不需要特殊的培訓就可掌握，因此非常適合檢測腎症候群出血熱這一在經濟較不發達地區(尤其是半開墾地，城鄉結合區)發病率較高的疾病。
下面結合實施例進一步闡述本發明，這些實施例僅用於說明目的而不用於限定本發明範圍。
實施例1漢坦病毒抗原的製備將野鼠型漢坦病毒株76-118接種於沙鼠腎細胞，按常規方法在35-37℃傳導培養7-10天後，收集細胞培養物。
超聲波破細胞處理之後，於3000rpm粗離心30分鐘，以去除細胞膜碎片等雜質。取上清液，在40000rpm離心2小時以便使漢坦病毒抗原沉澱。棄去上清液，取沉澱。沉澱溶解後，測定溶液中蛋白含量。如蛋白含量較低，可再離心濃縮，使漢坦病毒抗原的終濃度為1-2MG/ML。
實施例2膠體金的製備在250毫升三角燒瓶中加入100毫升去離子雙蒸水，加1％檸檬酸鈉4毫升，煮沸後迅速加入1％氯金酸1毫升。繼續煮沸15分鐘，冷卻後用0.1M碳酸鉀將pH調至8.5。
實施例3膠體金-羊抗IgG抗體結合物的製備(a)羊抗IgG抗體的製備將購自上海市生物製品研究所的羊抗IgG抗體，經硫酸銨純化處理後備用。
(b)穩定性試驗由於購買的(或用常規方法製備的)各種生物製品的效價存在波動，因此，為了提高重複性，宜對各批抗體繼續穩定性試驗，以確定最佳的抗體添加量。
以一批抗體濃度約為1毫克/毫升的羊抗IgG抗體溶液為例。在1毫升在實施例2中製備的膠體金溶液中，分別加入0微升、2微升、4微升、6微升、8微升、10微升、12微升的，在室溫下混合均勻後，在室溫下靜置10分鐘。在每管中加入10％氯化鈉0.1毫升，混合均勻後，在室溫下靜置2小時。保持紅色不變且加入量最少(為了節約成本，減少浪費)的一管，即為穩定1毫升膠體金溶液所需的最佳蛋白量。通常，可在該最佳蛋白量的基礎上再加10％，作為標記抗體的實際用量。結果發現，在加人6微升時可產生紅色，且紅色變化不大。在加入8微升和10微升時，產生的紅色保持不變。因此，將該批抗體實際添加量定為11微升。
(c)製備膠體金-羊抗IgG抗體結合物溶液取10毫升實施例2中新鮮製備膠體金溶液，加入11微升羊抗人IgG抗體，10分鐘後加5％BSA，使BSA終濃度為1％。室溫下靜置10分鐘後，加入聚乙二醇(PEG)0.1克(防止膠體金自聚沉澱)，混勻，加10％疊氮化鈉(NaN3)75微升(起防腐作用)。
實施例4檢測膜的製備1.將0.65微米硝酸纖維素膜用軟鉛劃成1釐米×1釐米的小格。
2.在每小格的中央(點樣區)滴加1微升實施例1中的漢坦病毒抗原(核蛋白)溶液。
3.膜在室溫中乾燥後，用1％BSA封閉2小時，以便去除非特異性結合，從而進一步降低假陽性機率。
實施例5膠體金-羊抗IgM抗體結合物的製備重複實施例3，不同點僅在於，用羊抗IgM抗體(購自上海市生物製品研究所)代替羊抗IgG抗體。
實施例6樣品的檢測A、取實施例4中製備的檢測膜，在下方墊一次性吸水材料。
B、在點樣區上滴加PBS-Tween 20緩衝液1滴，以活化膜表面。待滲入即可。
C、在點樣區滴加10微升血清樣品。待滲入即可。
D、在點樣區滴加PBS-Tween 20緩衝液1滴，以洗滌點樣區。重複洗滌2次。
E、在點樣區滴加實施例3中製備的膠體金-羊抗人IgG抗體結合物(或實施例3中製備的膠體金-羊抗人IgG抗體結合物溶液)1-2滴。
F、在點樣區滴加PBS-Tween 20緩衝液1滴，以洗滌點樣區。重複洗滌2次。
觀察結果，在點樣區出現紅色斑點為陽性，無紅色斑點為陰性。
通過對2組ELISA法檢測為陽性的血清樣品(分別30個樣品和20個樣品)，20例陰性樣品，和15例正常人樣品的檢測，可以在3-8分鐘內即獲得檢測結果。對於50例陽性樣品，有46例檢測為陽性(這是因為滴金法的靈敏度稍低於ELISA法所導致的結果)且所有陰性或正常樣品都為陰性。由於受漢坦病毒感染後很短時間內受感染者體內相應的IgM和IgG抗體就迅速上升(達到或大大超過滴金法的檢測靈敏度)，因此在實際臨床檢測時的準確性預計將更高。
實施例7-8重複實施例6，不同點僅在於實施例7中省略步驟B；實施例8中用蒸餾水代替PBS-Tween 20緩衝液。
結果，對檢測結果無影響。
實施例9試劑盒的製備將實施例4製備的檢測膜劃成1釐米×1釐米的小片(具有一個點樣區，檢測IgG或IgM)，或1釐米×2釐米的小片(具有2個點樣區，在一片上檢測IgG和IgM)，或2釐米×2釐米的小片(具有4個點樣區，在一片上檢測IgG和IgM並且具有陽性和陰性對照)。
將各小片膜(點樣區朝上)分別裝在相應大小的塑料盒中，在點樣區上方開有直徑約0.6釐米的小孔，在膜下方墊入一次性吸水材料。
在各塑料盒中，再放置每管0.5毫升的實施例3中製備的膠體金-羊抗人IgG抗體結合物和/或實施例3中製備的膠體金-羊抗人IgG抗體結合物溶液。
此外，試劑盒可同時裝有洗滌液，如PBS-Tween 20緩衝液。
權利要求
1.一種檢測樣品中是否含有抗漢坦病毒的IgG抗體的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)將純化的漢坦病毒核蛋白包被在硝酸纖維素膜上，形成在點樣區中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜；(b)以非人的抗人IgG抗體和膠體金為原料，製備膠體金-抗人IgG抗體的結合物；(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區上；(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區；(e)將步驟(b)的膠體金-抗人IgG抗體的結合物滴加在點樣區上；(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區；點樣區出現紅色斑點表示樣品中存在抗漢坦病毒的IgG抗體，不出現紅色斑點表示樣品中不存在抗漢坦病毒的IgG抗體。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該純化的漢坦病毒核蛋白是如下製備的收集培養的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心後，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉澱即為純化的漢坦病毒核蛋白。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，該宿主細胞選自下組沙鼠腎細胞和Vero-E6細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該非人的抗人IgG抗體選自下組羊抗人IgG抗體，小鼠抗人IgG抗體，小鼠抗人IgG抗體和兔抗人IgG抗體。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.65微米，而且該膠體金是用檸檬酸還原法製備的並且在製備時檸檬酸鈉與水的重量比為0.035-0.045∶100，而氯金酸與水的重量比0.0075-0.03∶100。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中獲得的在點樣區中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜還經過如下處理用0.75-1.5％BSA溶液封閉2-24小時。
7.如權利要求1所述方法，其持徵在於，步驟(b)中，膠體金-抗人IgG抗體的結合物是如下進行製備的以10毫升膠體金溶液為基準，加入8-30微克的非人抗人IgG抗體，靜置後加BSA，使BSA終濃度為1％，再靜置後，加入聚乙二醇0.8-0.12克，混勻，加入適量防腐劑。
8.一種檢測腎症候群出血熱的檢測試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包含硝酸纖維素膜，在該膜的點樣區包被有純化的漢坦病毒抗原，膠體金-非人抗IgG抗體結合物溶液，和可選的洗滌緩衝液。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於，還包含選自下組的物質膠體金-非人抗IgM抗體結合物溶液，陽性和陰性對照。
10.如權利要求8和9所述的試劑盒，其特徵在於，硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.65微米，該非人抗IgG抗本是羊抗人IgG抗體，而且該漢坦病毒抗原如下得到的收集培養的接種過漢坦病毒的宿主細胞，經2800-3200rpm 20-40分鐘粗離心後，取上清液在35000-45000rpm離心1-4小時，棄去上清液，沉澱即為純化的漢坦病毒核蛋白，溶解後使終濃度為1毫克/毫升。
全文摘要
本發明提供了一種滴金法檢測腎症候群出血熱檢測方法及檢測試劑盒。在該方法中,將血清中抗漢坦病毒的IgG抗體作為檢測對象,它包括步驟:(a)將純化的漢坦病毒核蛋白包被在硝酸纖維素膜上,形成在點樣區中包被有漢坦病毒核蛋白的硝酸纖維素檢測膜;(b)以非人的抗人IgG抗體和膠體金為原料,製備膠體金－抗人IgG抗體的結合物;(c)將待檢測的血清樣品滴加在步驟(a)中獲得的檢測膜的點樣區上;(d)洗滌步驟(c)的檢測膜的點樣區;(e)將步驟(b)的膠體金－抗人IgG抗體的結合物滴加在點樣區上;(f)洗滌步驟(e)的檢測膜的點樣區。該方法和試劑盒可快速、正確和簡便的檢測腎症候群出血熱。
文檔編號G01N33/53GK1267831SQ9911354
公開日2000年9月27日 申請日期1999年3月18日 優先權日1999年3月18日
發明者儲峰, 季青, 嚴潤民, 王霞明 申請人:上海市南匯縣南華醫院