腫瘤修復基因突變的螢光實時pcr檢測方法及試劑系統的製作方法

2023-12-09 01:45:31 1

專利名稱：腫瘤修復基因突變的螢光實時pcr檢測方法及試劑系統的製作方法
技術領域：
本發明屬於檢測技術領域，具體涉及一種腫瘤修復基因突變的螢光實時PCR檢測方法 及試劑系統。
技術背景腫瘤是多因素疾病，許多因素可以引起細胞的DNA損傷。正常情況下，機體具有自我 修復損傷的能力。但如果這種修復能力下降則會引發腫瘤的產生。隨著社會的發展和環境 的汙染，以及吸菸率的增高，肺癌已經成為許多國家癌症死亡的首位原因。目前關於肺癌 的研究主要集中在基因修複方面。很多因素可以導致基因損傷，如，輻射，烷化劑等。對 於不同的損傷基因修復的方式也不同，同時，又有許多種修復基因參與基因的修復過程中。 DNA修復是對損傷的主要生物學反應，促使DNA中損傷的、不合適的或錯配的鹼基恢復本來 的生物化學過程，維持遺傳物質的穩定。一基因修復的主要方式1 NER (核苷酸切除修復)主要修復累積性損傷，是人類最主要和最重要的DNA損傷修複方式。包括連續性損傷 的識別、染色質的重塑、在受損的DNA兩端切開形成切口、切除受損的寡核苷酸、填補缺 口連接DNA鏈。此過程有30多個蛋白參與，包括的修復基因主要有ERCC1 (剪切修復交叉互 補組l)、 ERCC2(剪切修復交叉互補組2，亦稱XPD)。吸菸導致的細胞DNA損傷主要通過NER 途徑來修復。2 DSB (DNA雙鏈斷裂修復) DNA雙鏈斷裂主要由於複製錯誤或外源因素(離子輻射等)所致，由同源性重組和非同源性DNA末端連接完成修復。參與的修復基因中與腫瘤放射敏感性密切相關的基因主要有 XRCC3 (X線交叉互補組3)。大量研究已經證明，機體DNA修復能力的降低使機體發生各種腫瘤的風險大大增加。 DNA損傷修復能力的降低可能導致肺癌的形成。然而，降低的DNA修復能力卻有利於鉑-DNA 加合物持續的抗腫瘤活性。換句話說，增高的DNA修復能力會增加抗藥性，這對於患者的 藥物治療方面是不利的。因此，在癌的易感性和對藥物的抗性方面，DNA修復被認為是一 個"雙刃刀"。人們研究還發現，基因的多態性的分布與種族差異而不同，且與腫瘤的形成 有關。人們又發現不同的基因型與治療的預後也有關聯。例如，XRCC3 Met241Met在預測用gem/cis治療的年輕的NSCLC患者的生存方面是一個易於評估和有力的預測指標。綜上所 述，基因的多態性不僅與腫瘤的形成和對藥物的敏感性有關，還可以用來判斷預後。臨床 上可以根據患者不同的個體，制定最佳的治療方案，從而做到個體化治療。二實時螢光定量PCR試劑系統是由前端引物，後端引物，探針組成，與普通常規PCR 相比，有很高的特異性，敏感性高，通常達102拷貝/ml,其檢測範圍廣，且重複性好，以CT 值為閾，能更精確的反映起始模板的拷貝數,可有效的解決模板汙染的風險。T叫man探針檢 測的是積累螢光。常用的螢光基團有FAM， TET， VIC， HEX等等。當探針完整的時候，由於 3'端的螢光淬滅基團在吸收5'端報告基團所發射的螢光能量，本身會發射波長不同的熒 光而導致本底高，因此TaqMan探針近來又有新的發展——TaqMan MGB探針。MGB探針的淬 滅基團採用非螢光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher),本身不產生螢光，可以大大降 低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，可以將 探針的Tm值提高10C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通T叫Man探針設計 得更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高——因為在模板的DNA鹼 基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設計。實驗證明，TaqMan MGB探針對於富 含A/T的模板可以區分得更為理想。本發明基於以上技術原理，以ERCC1等腫瘤修復基因突變位點為目的基因，自主設計 一系列成套特異性寡核苷酸探針序列和引物序列，採用螢光實時定量PCR技術方法，用於 突變位點的檢測。 發明內容本發明的目的在於創立一套用於腫瘤相關修復基因突變的螢光實時PCR檢測方法及試 劑系統。本發明提出的腫瘤相關修復基因突變的PCR檢測方法，是以腫瘤相關修復基因為檢測的 目的基因，使用專門設計的特異性寡核苷酸引物序列和水解探針，採用Taqman-MGB檢測試 劑系統，通過螢光實時定量PCR方法，對腫瘤相關基因的特點位點突變進行檢測。本發明中所述的的腫瘤相關基因是指ERCC1基因及其突變基因位點，ERCC2基因及其 突變基因位點，XRCC3基因及其突變基因位點。所述的特異性寡核苷酸探針序列和引物序列如下引物序列至少包括下述之一種，以及由該引物序列採用任意表記方法或者修飾方法而 生成的寡核苷酸衍生物引物名稱 寡核苷酸序列 針對ERCC1基因GGAATTACGTCGCCAAATTCC GCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGAGACGGACGCCCACCT GGAGGCGGGAAAGGGACT CCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCT CACTCAGAGCTGCTGAGCAATC或者:ERCC1-118FP ERCC1-118RP 針對ERCC2基因 ERCC2-312FP ERCC2-312RP ERCC2-751FP ERCC2-751RP 針對XRCC3基因 XRCC3-241FP XRCC3-241RP 探針至少包括下述-酸衍生物 探針名稱 針對ERCC1基因 ERCC1-118FAM(C) ERCC1-118FAM(T) 針對ERCC2基因 ERCC2-312FAM(C) ERCC2-312FAM(T) ERCC2-751FAM(T) ERCC2-751層(G) 針對XRCC3基因XRCC3-241FAM(C) FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T) FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB 其中，FAM代表FAM基團(螢光素基團)，MGB代表MGB基團(淬光基因)，其中FAM可用其他任 意用於標記的螢光素替代，如HEX，TET等(1) 在ERCC1基因的片段SEQ.ID.N01中的突變位點(〉表示錯配突變) ERCC1: 19007 C〉T(2) 在ERCC2基因的片段SEQ. ID.N02中的突變位點(〉表示錯配突變) ERCC2: 23591 G〉A(3) 在ERCC2基因的片段SEQ.ID.N03中的突變位點(〉表示錯配突變)ATGGCTCGCCTGGTGGT CCCTGCCTTGGTGCTCAC -種，以及由該探針採用任意標記方法或修飾方法而生成的寡核苷寡核苷酸及標記集團FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGB FAM-CAGGGCACATTGC-MGB層-CTTCGTCGGGCAGCA-MGB FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGB FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGB FAM- CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGB或者:ERCC2: 35931 A>C(4)在XRCC3基因的片段SEQ. ID.N04中的突變位點(〉表示錯配突變) XRCC3: 18067 C〉T本發明所述Ta卿an-MGB螢光實時檢測試劑系統是指包含有本方法所涉及的任何寡核 苷酸引物序列和探針序列的螢光實時定量PCR系統，下述組成一和組成二組成 組成一Taqman-MGB實時定量PCR試劑系統 (2) 5XPCR反應緩衝液50-250mmol/LTris Cl (20。C下PH8.3-8.8) 訓陽500mmol/L KC1 0.5-25mmol/L MgCI2 25mmol/L 二硫蘇糖醇 0.25-2.5% Triton X-100(2) dNTP0.5-15mmol/L各種dNTP(3) 前端引物和後端引物 由前面所述引物序列合成的引物，各種引物濃度範圍:20-200mmol/L(6) 探針由前面所述探針序列合成的探針,探針濃度範圍:20-200mmol/L(7) 熱啟動DNA聚合酶 酶使用量在0.5-5U組成二:DNA提取系統標本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式離心法或其他方法提取 本發明所涉及的ERCC1,ERCC2和XRCC3基因突變及其突變類型的檢測方法具體操作如下本方法的檢測標本種類包括手術標本，活檢標本，外周血，胸腹水，石蠟包埋組織等本方法的檢測目的基因包括ERCC1， ERCC2和XRCC3本方法所涉及的設備包括臺式高速離心機，超淨工作檯，螢光定量PCR儀本發明方法的基本步驟1. 標本的處理及其DNA抽提 手術標本和活檢標本標本量活檢腫瘤標本，手術腫瘤標本5 — 50mg。採用下述方法之一抽提DNA(1) 酚/氯仿DNA抽提純化法(2) 微量柱式離心法(3) 其他簡化抽提方法 外周血和胸腹水標本量外周血2-5ml，胸腹水2-5ml，均使用非抗凝管。採用下述方法之一抽提DNA(1) 酚/氯仿DNA抽提純化法(2) 微量柱式離心法(3) 其他簡化抽提方法 石蠟包埋組織標本量3-5片5-IO陶厚的石蠟包埋組織切片。採用下述方法之一抽提DNA(1) 改良的酚/氯仿DNA抽提純化法(2) Gpel氏石蠟包埋組織DNA提取法2. Taqman-MGB螢光實時定量PCR方法反應系統組分包含本發明所涉及的任何寡核苷酸引物序列和探針序列 本發明使用的反應體系如下(1) PCR反應緩衝液20-50腿ol/L Tris Cl (20 。C下PH8.3-8.8),80-160腿ol/L KCl,0.8-5腿ol/L MgCl2,25mmol/L 二硫蘇糖醇,0.5-2.0% Triton X-100(2) dNTP: 0.5-2.0mmol/L各種dNTP(3) 前端引物和後端引物如前面所述引物序列合成的引物，引物濃度範圍:20-200mmol/L(4) 探針如前面所述的探針序列合成的探針，探針濃度範圍80-150mmol/L(5) 熱啟動DNA聚合酶酶使用量在0.5-5U擴增條件實時螢光定量PCR儀，採用如下參數94°C， l-5分鐘94。Cl-5秒，60。C5-30秒,30-50循環。 本發明涉及的用途包括(1)用於腫瘤相關修復基因的突變檢測。腫瘤相關修復基因具體指ERCC1, ERCC2， XRCC3。具體突變指腫瘤相關修復基因的錯配突變(2)用於腫瘤患者的臨床個體化用藥方案的指導及分子靶向抗腫瘤藥物的指導用藥。 分子靶向抗腫瘤藥物包括易瑞沙(Iressa),阿瓦斯汀(Arastin),格列衛(Glivec) ， Tarceva 等具體實施方式
實施例l:外周血DNA基因組DNA抽提法的ERCC1， ERCC2, XRCC3的突變檢測(1) 標本DNA抽提採集外周靜脈血2ml， 5000r/min離心3分鐘，移去上層血清。取 下層血移入離心管、加入PBS緩衝液溶解、12000r/min離心15分鐘、倒去上層、加入SDS、 蛋白酶K、 37'C搖床過夜，再用酚一氯仿抽提DNA、無水乙醇沉澱、75%乙醇洗漆，自然幹 燥，最後融入200ijL TE液中。一2(TC冰箱保存。(2) Taqman-MGB螢光實時定量PCR檢測突變使用下述反應體系-5XPCR Buffer dNTP MixtureMg Solution 0.514 XRCC3-241FPXRCC3-241RP 0.5 WXRCC3-241FAM(C) 0.5WXRCC3-241FAM(T) 0.5W(另外一管)ExTaqHS 0,2514標本基因組DNA 1M1ddH20 補充至25W若檢測ERCC2 G23591A基因突變，則加入ERCC2-312FP引物，ERCC2-312RP引物 及探針ERCC2-312FAM(C)， ERCC2-312FAM(T)若檢測ERCC2A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探針ERCC2-751 FAM(T) ， ERCC2-751 FAM(G)若檢測ERCC2 A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探針ERCC2-751FAM(T)， ERCC2-751FAM(G)若檢測ERCC1 C19007T基因突變，則加入ERCC1-118FP引物，ERCC1-118RP引物及 探針ERCC1-118FAM(C) ， ERCC1陽118FAM(T)擴增條件實時螢光定量PCR儀，採用如下參數94°C， 1-5分鐘94。Cl-5秒，60°C5-30秒，30-50循環。檢測結果選取的20例基因組DNA，(其中16例為野生純和子，3例為雜合子，l例為突 變純和子)檢測與XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)的反應情況。其中野生純 和子與XRCC3-241FAM(C)反應有特異性擴增曲線出現，雜合子與XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)反應時都有特異性擴增曲線出現，突變純和子只與 XRCC3-241FAM(T)反應有特異性擴增曲線出現。檢測結論能夠準確分辨出XRCC3 C18067T位點的基因突變，根據基因突變指導臨 床用藥。實施例2:腫瘤標本基因組DNA抽提法的ERCC1， ERCC2， XRCC3的突變檢測(1) 標本DNA抽提酚/氯仿DNA純化法。取腫瘤標本2-10mg，倒入液氮，研磨成粉末， 加入lml分裂緩衝液(10mmol/LTris. CLPH7. 5， 10隱ol/LNaCL， 25臓ol/LEDTA);加入O. lml 1(mSDS,混勻;加入O. lmg蛋白酶K， 37。C水浴2-4小時，直到組織塊完全分解。2500rpm離 心20秒，取上清至新離心管。再用酚一氯仿抽提DNA、無水乙醇沉澱、75%乙醇洗滌，自 然乾燥，最後融入200fjL TE液中。一20'C冰箱保存。(2) Taqman-MGB螢光實時定量PCR檢測突變 使用下述反應體系5XPCR BufferdNTP Mixture 0.75W Mg Solution 0.5rt XRCC3-241FP 0.514 XRCC3-241RP 0.514 XRCC3陽241FAM(C)XRCC3隱241FAM(T) 0.5W(另外一管) ExTaqHS 0.2514標本基因組DNA 1M1 ddH20 補充至25W。若檢測ERCC2 G23591A基因突變，則加入ERCC2-312FP引物，ERCC2-312RP引物及 探針ERCC2陽312FAM(C) ， ERCC2-312FAM(T)。若檢測ERCC2 A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探針ERCC2-751 FAM(T) ， ERCC2-751 FAM(G)。若檢湖UERCC2 A35931C基因突變，則加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物 及探針ERCC2陽751FAM(T)， ERCC2陽751FAM(G)。若檢領!]ERCC1 C19007T基因突變，則加入ERCC1-118FP引物，ERCC1-118RP引物 及探針ERCC1-118FAM(C) ， ERCC1-118FAM(T)。擴增條件實時螢光定量PCR儀，採用如下參數94°C， l-5分鐘94。Cl-5秒，6(TC5-30秒，30-50循環。檢測結果選取的20例基因組DNA，(其中16例為野生純和子，3例為雜合子，l例為突 變純和子)檢測與XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)的反應情況。其中野生純和子 與XRCC3-241FAM(C)反應有特異性擴增曲線出現，雜合子與XRCC3-241FAM(C), XRCC3-241FAM(T)反應時都有特異性擴增曲線出現，突變純和子只與XRCC3-241FAM(T) 反應有特異性擴增曲線出現。檢測結論能夠準確分辨出XRCC3 C18067T位點的基因突變，根據基因突變指導臨 床用藥。序列表SEQ. ID.恥1:TCCCTATTGATGGCTTCTGCCCTTCGTCCCTCCCCAGAGGGGCAATCCCGTACTGMGTTCGTGCGCAMraSTODO微BsffimiTi紘'孤lCGGGCCCGG SEQ. ID.恥3:GGTGAGTGCAGCCATGTGGTGTGTGCACCTCTGTGCAGGTGCCAGGGGCACAGC
權利要求
1、一種腫瘤修復基因突變的實時PCR檢測方法，該方法以檢測腫瘤修復基因為目的，使用針對腫瘤修復基因的專門設計的特異性寡核苷酸引物序列和水解探針，採用Taqman-MGB檢測試劑系統，通過螢光實時定量PCR方法，對腫瘤修復基因的特定位點進行檢測；所述的腫瘤修復基因包括ERCC1，ERCC2，XRCC3基因；所述的特異性寡核苷酸引物序列至少包括下述之一種，以及由該引物序列採用任意表記方法或者修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物引物名稱 寡核苷酸序列ERCC1-118FPGGAATTACGTCGCCAAATTCCERCC1-118RPGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTERCC2-312FPGAGACGGACGCCCACCTERCC2-312RPGGAGGCGGGAAAGGGACTERCC2-751FPCCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCTERCC2-751RPCACTCAGAGCTGCTGAGCAATCXRCC3-241FPATGGCTCGCCTGGTGGTXRCC3-241RPCCCTGCCTTGGTGCTCAC所述水解探針至少包括下述一種，以及由該探針採用任意標記方法或修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物探針名稱寡核苷酸及標記集團ERCC1-118FAM(C)FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGBERCC1-118FAM(T)FAM-CAGGGCACATTGC-MGBERCC2-312FAM(C)FAM-CTTCGTCGGGCAGCA-MGBERCC2-312FAM(T)FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGBERCC2-751FAM(T)FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGBERCC2-751FAM(G)FAM-CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGBXRCC3-241FAM(C)FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T)FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB其中，FAM代表FAM基團，MGB代表MGB基團；而且FAM可用其他任意用於標記的螢光素替代；所述的Taqman-MGB檢測試劑系統，由以下兩部分構成一Taqman-MGB實時定量PCR試劑系統(1)5XPCR反應緩衝液50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下PH8.3-8.8)100-500mmol/L KCl0.5-25mmol/L MgCl225mmol/L二硫蘇糖醇0.25-2.5％Triton X-100；(2)dNTP0.5-15mmol/L各種dNTP；(3)前端引物和後端引物由所述引物序列合成的引物，各種引物濃度範圍20-200mmol/L；(4)探針由所述水解探針序列合成的探針，探針濃度範圍20-200mmol/L；(5)熱啟動DNA聚合酶酶使用量在0.5-5U；二DNA提取系統標本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式離心法或其他方法提取。
全文摘要
本發明屬藥物療效檢測技術領域，具體涉及一種腫瘤相關基因突變的實時PCR檢測方法及試劑系統。本發明針對腫瘤個體化治療相關的腫瘤修復基因XRCC3，ERCC1和ERCC2作為檢測的目的基因，使用專門設計的特異性寡核苷酸引物序列和水解探針，採用Taqman-MGB檢測試劑系統，通過螢光實時定量PCR方法，對腫瘤相關基因的特點位點突變進行檢測，試劑系統是指包含本發明所涉及的任何特異性寡核苷酸序列和探針的實時螢光定量PCR試劑系統。本發明可用於臨床個體化用藥方案的效果檢測。
文檔編號G01N21/00GK101266207SQ20071004650
公開日2008年9月17日 申請日期2007年9月27日 優先權日2007年9月27日
發明者周彩存, 頡 張, 張增利 申請人:上海市肺科醫院