提高疫苗誘導的細胞毒性t細胞反應的治療性疫苗的製作方法

2023-12-09 03:37:01

專利名稱：提高疫苗誘導的細胞毒性t細胞反應的治療性疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於慢性病毒感染、癌症的預防和治療的疫苗，尤其是一種提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗。
背景技術：
慢性感染某些病毒可以引起癌症。感染人乳頭瘤病毒可以引起宮頸癌，而B型肝炎感染與肝癌的發生有關。雖然預防慢性病毒感染的疫苗，如B型肝炎病毒(KW)疫苗,人乳頭瘤病毒疫苗(HPV)已經在臨床應用，但是針對已經感染慢性病毒病人的治療性疫苗研究，仍然處於起步階段，疫苗誘導的細胞毒性T細胞不足以殺死病毒感染細胞或癌細胞。慢性病毒感染可以抑制固有和特異性免疫反應，而影響治療性疫苗的效率。例如病毒特異性調節T細胞可影響疫苗特異性細胞毒性T細胞(CTL)的產生和治療效果。HPV核殼蛋白LI誘導產生分泌白介素10的LI特異性調節T細胞。HPV早期蛋白E7，E6特異性調節T細胞存在於病人體內。病毒蛋白如HPV 16 E5蛋白可以減少MHC I分子在感染細胞膜上的表達；HPV16 E7蛋白影響幹擾素的激活，HPV16感染部位白介素10 (IL10)，轉移生長因子P (TGF P )水平升高，這些因素均可降低CTL對病毒感染細胞的殺傷作用。因此，有效的HPV治療性疫苗依賴於以下3個因素I、在HPV感染者體內誘導產生高質，足夠的CTL細胞和其它效應T細胞；2、吸引CTL細胞到病毒感染部位；3、CTL細胞克服病毒感染部位的免疫抑制因素，殺傷病毒感染細胞。病毒抗原暴露的小鼠抑制治療性疫苗CTL反應患者感染病毒後,常常產生對病毒抗原的無效的體液或/和細胞免疫反應。慢性乳頭瘤病毒感染病人產生針對早期蛋白E6，E7和晚期蛋白LI的細胞和體液免疫反應。而乳頭瘤病毒治療性疫苗常常使用E7，E6和LI基因或基因產物治療慢性乳頭瘤病毒感染者。因此，非常有必要研究慢性病毒感染個體中對病毒抗原已有的免疫性對治療性疫苗的影響。PV LI核殼蛋白(LlVLPs)致敏(primed)的小鼠，在接種攜帶HPV16E7 CTL，人免疫缺陷病毒(HIV) CTL決定簇的PV嵌和型LI的蛋白(L1E7，L1P18)治療性疫苗後，與未致敏小鼠相比，其E7，HIV P18特異性的CTL細胞分泌IFNy受到抑制(參見圖1，圖中表明，HPV病毒蛋白致敏的個體對治療性疫苗的反應與幼稚(naive)個體不同)。阻斷ILlO可以增強治療性疫苗的CTL反應。如果PV LI蛋白致敏(primed)的小鼠是ILlO缺陷鼠，在接種攜帶HPV16E7 CTL決定簇的PV嵌和型LI的蛋白治療性疫苗後，與未致敏小鼠相比，其E7特異性的CTL細胞產生IFNy則不受到抑制。如果在免疫致敏小鼠時同時阻斷IL10，E7特異性CTL也不受到抑制(參見圖2A)。使用另外一抗原系統卵蛋白/脂多糖(0VA/LPS)，重複了上述結果(參見圖2B)。ILlO 與 LCMV (lymphocytic choriomeningitis),西尼羅河病毒(West Nile Virus)病毒感染的清除密切相關。DNA疫苗免疫時阻斷IL10，可以提高疫苗誘導的T細胞反應，清除小鼠LCMV病毒感染。
綜上所述，ILlO與慢性病毒感染密切相關，治療性疫苗如果在免疫時阻斷IL10，可以提高疫苗誘導的T細胞反應，清除慢性病毒感染，阻斷宮頸癌的發生。抗原特異性的，分泌ILlO、IFN Y的⑶4+ T細胞可能抑制致敏小鼠對治療性疫苗的CTL反應。如果用特異性抗體將PV核殼蛋白致敏的小鼠體內的CD4+T細胞刪除，讓新生CD4+T細胞在體內重新出現後免疫小鼠，治療性疫苗誘導的CTL分泌IFNy反應則不受抑制；體外實驗顯示，PV核殼蛋白致敏的CD4+T細胞在受到抗原刺激後，分泌大量IL10，這些細胞表達膜 GITR (Glucocorticoid induced TNF receptor related protein)(參見圖3A)。0VA/LPS致敏的小鼠CD4也分泌IL10，表達GITR (參見圖3B)。上述結果表明，致敏小鼠對治療性疫苗的CTL反應的ILlO由抗原特異性的⑶4+GITR+T細胞分泌。這些細胞同時還分泌IFNy。致敏小鼠如果是IFN Y受體缺陷小鼠，對治療性疫苗的CTL反應也不受抑制。體外實驗顯示，IFNy促進抗原特異性⑶4+GITR+T細胞分泌ILlO。

發明內容
本發明g在解決慢性病毒感染者對現有預防慢性病毒感染疫苗存在抑制固有和特異性免疫反應，影響治療性疫苗效率的問題，而提供ー種可以提高細胞毒性T細胞數量，最終提高疫苗治療效率的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗。本發明解決所述問題採用的技術方案是
ー種提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其化學組分中含有白介素10(IL10)抑制劑和幹擾素Y (IFNy )0更進一歩
所述ILlO抑制劑含量可以是lpg-10g。所述IFN Y含量是可以lpg-10g。所述ILlO抑制劑是可以抑制ILlO功能的抗體、siRNA或特異性多肽、RNA或DNA。所述IFNy可以是蛋白、RNA或DNA。所述治療性疫苗的化學組分中可以含有抗原或/和佐劑。所述抗原可以是蛋白質、病毒樣顆粒、多肽、DNA或RNA。所述佐劑是任何可以提高特異或非特異免疫反應的試劑。與現有技術相比，本發明所述治療性疫苗在免疫吋，由於聯合使用了 ILlO抑制劑和IFN Y，顯著提高細胞毒性T細胞反應，進而可以提高疫苗治療效率。本發明可免疫正常人群，用於預防慢性病毒感染和癌症。其優點是在產生保護性抗體的同時，可以比常規疫苗誘導產生更強的細胞毒性T細胞反應，可以更好預防病毒感染或癌症發生。本發明免疫已經慢性感染病毒或癌症病人，可以誘導產生比常規疫苗更多的細胞毒性T細胞，細胞毒性T細胞對清除面型病毒感染細胞和癌細胞起重要作用，因此可以提高治療型疫苗效率。


圖I是LlVLPs敏的小鼠抑制嵌合型LlVLPs的CTL應答示意圖。圖中A L1P18 VLPs ；B :LlE7VLPs。
圖2是治療性疫苗和並中和ILlO免疫抗原致敏小鼠，提高疫苗誘導的CTL應答示意圖。圖中A :乳頭瘤病毒核殼蛋白抗原系統；B 0VA/LPS抗原系統。圖3是抗原特異性CD4+GITR+T細胞分泌ILlO示意圖。圖中A :乳頭瘤病毒核殼蛋白抗原系統；B ；0VA/LPS抗原系統。圖4是本發明提聞CTL反應不意圖。圖5是本發明GO吸附的抗ILlO 受體抗體，IFN Y提高0VA/LPS刺激的免疫反應示意圖。
具體實施例方式以下結合實施例進ー步闡述本發明，目的僅在於更好地理解本發明內容。因此，所舉之例並不限制本發明的保護範圍。實施例I.抗ILlO受體抗體(IL10抑制劑)2 μ g，與不同劑量的IFN Y (O. OOlng,0.01,0. I, Ing)溶於PBS緩衝液中，聯和使用，可以比單獨使用抗ILlO受體抗體，IFNy加20ng脂多糖(LPS)(佐劑)誘導的2xl05小鼠脾臟樹突狀細胞產生的IL12的分泌顯著增加(參圖4A)，表明這ー方法有利於提高細胞毒性T細胞反應，提示對腫瘤，慢性病毒感染者有較好的治療作用。實施例2.使用50 μ g 0VA/15 μ g LPS腹腔致敏小鼠，7天後使用溶於PBS緩衝液中 50yg 0VA/15 μ g LPS/500 μ g 抗 ILlO 受體抗體/5 μ g IFNy/ (抗原/佐劑/ILlO 抑制劑/IFN Y )腹腔免疫小鼠，6天後使用ELISP0T方法檢測OVA特異性的細胞毒性T細胞反應，結果顯示，免疫時聯合使用抗ILlO受體抗體和IFN Y，比単獨免疫時使用500 μ g抗ILlO受體抗體(IL10抑制劑)，顯著提高細胞毒性T細胞反應(參見圖4B)，對腫瘤，慢性病毒感染者有較好治療作用。實施例3.使用納米材料Graphene Oxide吸附抗ILlO受體抗體和IFN Y。PBS溶液中 G0/anti-IL10 受體抗體 /IFN y (G030 μ g, anti-ILlO 受體抗體 15 μ g, IFN y IOng)明顯促進20ng LPS誘導的脾樹突狀細胞表面CD86表達，樹突狀細胞CD86表達增高，有助於其誘導細胞毒性T細胞的產生。提示對腫瘤，慢性病毒感染者有較好的治療作用。實施例4.使用納米材料Graphene Oxide吸附抗ILlO受體抗體和IFN Y。PBS溶液中的 G0/anti-IL10 受體抗體/IFNy(G030y g，anti-IL10 受體抗體 15 μ g，IFN Y 10ng)明顯促進LPS誘導的脾細胞分泌IL12 (參見圖5A)。用溶於PBS中的50ug 0VA/15ug LPS聯合G0/anti-IL10受體抗體/IFN Y (抗原/佐劑/ILlO抑制劑/IFN Y )皮下免疫0VA/LPS致敏的小鼠，7天後取引流淋巴結，製成單個細胞後用100ug/ml OVA刺激，18小時取上清做IFNyELISA0結果顯示，GO吸附抗ILlO受體抗體、IFN Y後，OVA特異性IFNy分泌明顯提高。提示對腫瘤，慢性病毒感染者有較好的治療作用。實施例5.抗ILlO受體抗體500 μ g, 5 μ g IFN Y , 50 μ g病毒抗原乳頭瘤病毒樣顆粒溶於PBS緩衝液聯和使用(ILlO抑制劑/ IFNy/病毒樣顆粒)，可以比50 μ g病毒抗原乳頭瘤病毒樣顆粒単獨使用誘導更多細胞毒性T細胞反應。對慢性乳頭瘤病毒感染，宮頸癌有較好的治療作用。實施例6.抗ILlO受體抗體500 μ g，5 μ g IFNy ,10 μ g含腫瘤抗原HPV16 E7質粒DNA溶於PBS緩衝液聯和使用(ILlO抑制劑/ IFNy/質粒)，可以比10 y g含腫瘤抗原HPV16 E7質粒DNA單獨使用， 誘導更強的細胞毒性T細胞反應，對慢性乳頭瘤病毒感染，宮頸癌有較好的治療作用。
權利要求
1.一種提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述治療性疫苗的化學組分中含有白介素10 (ILlO)抑制劑和幹擾素Y (IFNy )0
2.如權利要求I所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述ILlO抑制劑含量可以是lpg-10g。
3.如權利要求I所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述IFNy含量可以是lpg-10g。
4.如權利要求I或2所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述ILlO抑制劑是可以抑制ILlO功能的抗體、siRNA或特異性多肽、RNA或DNA。
5.如權利要求I或3所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述IFNy可以是蛋白、RNA或DNA。
6.如權利要求I所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述治療性疫苗的化學組分中可以含有抗原或/和佐劑。
7.如權利要求I或6所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述抗原可以是蛋白質、病毒樣顆粒、多肽、DNA或RNA。
8.如權利要求I或6所述的提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗，其特徵在於，所述佐劑是任何可以提高特異或非特異免疫反應的試劑。
全文摘要
本發明涉及一種用於慢性病毒感染、癌症的預防和治療的疫苗，尤其是一種提高疫苗誘導的細胞毒性T細胞反應的治療性疫苗。所述治療性疫苗的化學組分中含有白介素10(IL10)抑制劑和幹擾素γ(IFNγ)。本發明由於聯合使用了IL10抑制劑和IFNγ，顯著提高細胞毒性T細胞反應，進而可以提高疫苗治療效率。本發明可免疫正常人群，其優點是在產生保護性抗體的同時，可以比常規疫苗誘導產生更強的細胞毒性T細胞反應，可以更好預防病毒感染或癌症發生；本發明免疫已經慢性感染病毒或癌症病人，可以誘導產生比常規疫苗更多的細胞毒性T細胞，細胞毒性T細胞對清除面型病毒感染細胞和癌細胞起重要作用，因此可以提高治療型疫苗效率。
文檔編號A61K39/29GK102631671SQ201210096650
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者倪國穎, 劉曉松 申請人:倪國穎, 劉曉松