基於HepG2穩定表達HBV野生株細胞系及其製備方法
2023-12-09 09:37:56 1
專利名稱：基於HepG2穩定表達HBV野生株細胞系及其製備方法
技術領域：
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及一種基於HepG2穩定表達HBV野生株細胞系，尤其涉及一種高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株(HepG2.HSWT)及其製備方法。
背景技術：
本領域公知，HBV細胞模型是篩選抗藥物、研究其生物學特點及其與細胞間相互作用的必要工具。尤其在研究有關肝疾病的發病機制、免疫機制、抗病毒藥物的篩選中具有重要作用；其中，Hep2. 2. 15細胞是HBV細胞模型開發研究的裡程碑，有研究顯示，其用含2個HBV頭對尾二聚體的pDolt-HBV-Ι重組載體轉染H印G2細胞，經G418篩選後獲得一個產高水平HBsAg和HBeAg的細胞克隆，其胞內外均能檢測到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒顆粒。迄今，Hep2. 2. 15仍是相關領域應用最為廣泛的HBV細胞模型。
然而，HepG2. 2. 15在HBV研究方面仍存在下述缺陷(1)H印G2.2. 15HBV蛋白如HBsAg, HBeAg表達水平相對較低，不利於相關病毒蛋白的研究，且與HBV-DNA —樣，其表達水平不穩定，受培養環境等因素影響較多；(2)其整合的HBV基因型非B、C基因型，對於研究中國人群HBV發病或耐藥機制方面的研究存在相當的局限性。鑑於中國是肝炎發病大國，Hep2. 2. 15顯然已經不能完全滿足目前相關的研究，國內目前的有關研究需要良好的HBV細胞模型和實驗平臺。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種基於!fepG2穩定表達HBV野生株細胞系，尤其涉及一種高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株(HepG2.HSWT)及其製備方法。本發明的細胞系有利於中國人群HBV發病或耐藥機制方面的深入研究，可進一步用於篩選抗HBV藥物、研究HBV生物學特點及其與細胞間相互作用的HBV細胞模型的建立。本發明的基於!fepG2穩定表達HBV野生株細胞系，能持續表達HBsAg及HBeAg，胞內有HBV複製，並可產生HBV顆粒；與所述的的Hep2. 2. 15細胞相比，本發明的細胞系表達HBsAg及HBeAg明顯高於!fep2· 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與Ifep2· 2. 15基本持平。本發明尤其提供了一種高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株0fepG2. HSWT)，所述的細胞株H印G2. HSffT其整合的HBV基因型為B或C基因型；該細胞株對LAM及ADV均敏感；HBV胞內複製水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發明將HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT轉染H印G2細胞後，通過潮黴素篩選，然後檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，並與H印2. 2. 15細胞株相比較，最終建成基於H印G2穩定表達HBV野生株細胞系，獲得高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株HepG2. HSWT,已於2011年6月I日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 4909，分類命名人肝癌細胞株H印G2. HSWT。
本發明中，所述的HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT，來源於福建醫科大學分子病毒
實驗室;所述質粒的載體骨架為pREPIO載體,該載體的優勢在於潮黴素Hygromycin抗性基因有利於細胞篩選工作以及EBNA-I基因轉錄蛋白能夠上調含OriP複製原點的真核表達質粒中基因轉錄和表達；
所述HBV複製子為含CP啟動子以及完整HBV前基因組的HBV1. 2倍體(B型，GeneBank登錄號AF100309)，插入切除RSV啟動子的pREPIO，構建成HBV真核表達質粒pREP-HBV-WTo本發明的細胞株具有以下生物學特性能持續表達HBsAg及HBeAg，胞內有HBV複製，並可產生HBV顆粒；與目前廣泛使用的H印2. 2. 15相比，其表達HBsAg及HBeAg明顯高於Hep2. 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與Hep2. 2. 15基本持平，該細胞株整合的HBV基因型為B或C基因型；其對LAM及ADV均敏感；HBV胞內複製水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發明的高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株0fepG2. HSWT)通過下述方法和步驟製備(I)質粒轉染H印G2細胞①細胞培養!fepG2細胞以DMEM培養液培養；所述培養液來源於Gibco公司，培養液中含10 %小牛血清，100U/ml青黴素，100 μ g/ml鏈黴素，0. 03%穀氨醯胺；②細胞轉染將處於生長對數期的細胞，以0.25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數；按5X IO5細胞/孔的濃度接種至6孔培養板，培養18-24小時後，待細胞約80-90%融合成片時，換新鮮無抗生素的培養液，準備轉染；按照每孔轉染2 μ g的量，將50 μ I OptiDMEM培養液與5 μ I Lipofectamin2000轉染試劑(Invitrogen)混合，同時將2 μ g質粒DNA稀釋於50 μ I OptiDMEM培養液中，混勻後室溫靜置5分鐘；將稀釋的Lipofectamin2000與質粒DNA混和，室溫靜置20分鐘；將混合物均勻滴加入6孔板中，6小時後用PBS清洗2遍後換新鮮培養液，繼續培養；(2)潮黴素篩選細胞克隆①轉染後細胞培養24小時後擴大培養至IOcm培養皿，並設空白對照(未轉染H印G2細胞)；②待細胞貼壁後加入潮黴素濃度至300ug/ml ；③每3天換液一次；④約14-21天待空白對照細胞全部死亡後觀察細胞克隆生長情況；⑤挑取細胞克隆至24孔培養板，以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；⑥待24孔培養板中細胞克隆密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦獲取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA陽性克隆，將陽性克隆傳至6孔培養板以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；(3)細胞克隆的有限稀釋步驟(2)中獲得的6株陽性克隆中的I株細胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平較高，經定量後上清HBsAg為30IU/ml左右，HBeAg水平60PeIU/ml左右，HBV-DNA水平維持於104-105COpieS/ml ;細胞傳至10代左右，採用有限稀釋法獲取更純淨以及高水平表達蛋白細胞克隆；將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數後細胞密度稀釋為lOcell/ml，接種96孔培養板，每孔150ul培養基(含潮黴素濃度150ug/ml);顯微鏡下觀察每孔細胞數，標記只接種Icell的培養孔，繼續培養，每周換液一次；2_3周後待細胞密度約60%左右後傳至24孔培養板繼續培養；待24孔中細胞密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，將HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平較高的一株細胞克隆定義為pREP-HBV-WT ；(4) HBV野生型細胞株的生物學特徵及表型耐藥分析①細胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平檢測
HBsAg 及 HBeAg 精確定量試劑盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit, HBV-DNA檢測採用上海科華生物工程有限公司B肝病毒核酸定量檢測試劑盒，檢測步驟按照試劑盒提供的說明書中記載的步驟，real-time PCR擴增儀採用ABI-7300，檢測結果如圖I所示；②細胞內病毒複製檢測細胞總DNA抽提，6孔板中細胞90%匯合度時加入400ul細胞裂解液，37°C過夜(細胞裂解液 lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris. HCl Ph7. 5> IOmM EDTA、IOOmM NaCl、0. 2% SDS)，加入等量的的酚進行DNA抽提、沉澱後DNA溶解於20ul TE0 I. 3%凝膠電泳後20XSSC轉膜，southern-blot雜交；結果顯示HBV雜交信號提示胞內HBV複製；③HBV野生型細胞株細胞表型耐藥分析IO5Cell/孔細胞密度接種12孔板，細胞貼壁後加入核苷類抗病毒藥物，拉米夫定設 0、0. luM、0. 3uM、luM、3uM、10uM、30uM、IOOuM 8 個濃度梯度，阿德福韋設 0、0. luM、
0.3uM、luM、3uM、10uM 6個濃度梯度，每個濃度梯度設復孔，隔天換液，第10天檢測細胞上清HBV-DNA水平，細胞抽提胞內總DNA檢測胞內HBV複製情況。檢測分析所述的高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HSffT,結果顯示，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM以及ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測水平以下，表明對LAM及ADV均敏感(如圖2所示)；雜交結果顯示，HBV胞內複製水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發明建立了一種基於H印G2穩定表達HBV野生株細胞系，尤其是高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株0fepG2. HSWT)，該細胞系HBsAg、HBeAg表達水平明顯高於H印G2. 2. 15，表達水平穩定，受培養環境等因素影響少，且整合的HBV基因型為B或C基因型，有利於研究中國人群HBV發病或耐藥機制，可用於篩選抗HBV藥物。
圖I顯示了 pREP-HBV (WT) HBV細胞株上清HBsAg、HBeAg表達水平，HBsAg水平維持於20-40IU/ml之間，為H印2. 2. 15細胞2-4倍左右；HBeAg水平40_70PeIU/ml之間，為H印2. 2. 15細胞4-8倍左右，HBV-DNA維持於IO4-IO5之間，略低於H印2. 2. 15細胞，隨傳代次數增加無明顯下降。
圖2顯示了 pREP-HBV (WT) HBV細胞株耐藥表型分析，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM和ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測下限之下，表明對LAM及ADV均敏感。圖3顯示了 pREP-HBV(WT)HBV細胞株細胞上清HBV-DNA基因測序結果表明野生型，與轉染質粒相同。圖4為pREP-HBV(WT)細胞株鏡下細胞形態圖，其中，左圖為高倍鏡下(20X)細胞形態圖，右圖為低倍鏡下(IOX)細胞形態圖。
具體實施例方式實施例I建立H印G2. HSffT細胞株將HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT轉染H印G2細胞後，通過潮黴素篩選，然後檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，並與Hep2. 2. 15細胞株相比較， 最終建成基於H印G2穩定表達HBV野生株細胞系，獲得高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株HepG2. HSWT,已於2011年6月I日保藏,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 4909，分類命名人肝癌細胞株H印G2. HSWT。所述的細胞株H印G2. HSffT通過下述方法和步驟製備(I)質粒轉染!fepG2細胞①細胞培養!fepG2細胞以DMEM培養液培養；所述培養液來源於Gibco公司，培養液中含10 %小牛血清，100U/ml青黴素，100 μ g/ml鏈黴素，O. 03%穀氨醯胺；②細胞轉染將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數；按5X IO5細胞/孔的濃度接種至6孔培養板，培養18-24小時後，待細胞約80-90%融合成片時，換新鮮無抗生素的培養液，準備轉染；按照每孔轉染2 μ g的量，將50 μ I OptiDMEM培養液與5 μ I Lipofectamin2000轉染試劑(Invitrogen)混合，同時將2 μ g質粒DNA稀釋於50 μ I OptiDMEM培養液中，混勻後室溫靜置5分鐘；將稀釋的Lipofectamin2000與質粒DNA混和，室溫靜置20分鐘；將混合物均勻滴加入6孔板中，6小時後用PBS清洗2遍後換新鮮培養液，繼續培養；(2)潮黴素篩選細胞克隆①轉染後細胞培養24小時後擴大培養至IOcm培養皿，並設空白對照(未轉染H印G2細胞)；②待細胞貼壁後加入潮黴素濃度至300ug/ml ；③每3天換液一次；④約14-21天待空白對照細胞全部死亡後觀察細胞克隆生長情況；⑤挑取細胞克隆至24孔培養板，以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；⑥待24孔培養板中細胞克隆密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦獲取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA陽性克隆，將陽性克隆傳至6孔培養板以潮黴素濃度150ug/ml繼續培養；(3)細胞克隆的有限稀釋
步驟(2)中獲得的6株陽性克隆中的I株細胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平較高，經定量後上清HBsAg為30IU/ml左右，HBeAg水平60PeIU/ml左右，HBV-DNA水平維持於104-105COpieS/ml ;細胞傳至10代左右，採用有限稀釋法獲取更純淨以及高水平表達蛋白細胞克隆；將處於生長對數期的細胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶後，用細胞培養液吹打成單個細胞懸液，計數後細胞密度稀釋為lOcell/ml，接種96孔培養板，每孔150ul培養基(含潮黴素濃度150ug/ml);顯微鏡下觀察每孔細胞數，標記只接種Icell的培養孔，繼續培養，每周換液一次；2_3周後待細胞密度約60%左右後傳至24孔培養板繼續培養；待24孔中細胞密度至60-70%後測上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，將HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平較高的一株細胞克隆定義為pREP-HBV-WT ；(4) HBV野生型細胞株的生物學特徵及表型耐藥分析
①細胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平檢測
HBsAg 及 HBeAg 精確定量試劑盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit, HBV-DNA檢測採用上海科華生物工程有限公司B肝病毒核酸定量檢測試劑盒，檢測步驟按照試劑盒提供的說明書中記載的步驟，real-time PCR擴增儀採用ABI-7300，檢測結果如圖I所示；②細胞內病毒複製檢測細胞總DNA抽提，6孔板中細胞90%匯合度時加入400ul細胞裂解液，37°C過夜(細胞裂解液 lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris. HCl Ph7. 5> IOmM EDTA、IOOmM NaCl、0. 2% SDS)，加入等量的的酚進行DNA抽提、沉澱後DNA溶解於20ul TE0 I. 3%凝膠電泳後20XSSC轉膜，southern-blot雜交；結果顯示HBV雜交信號提示胞內HBV複製；③HBV野生型細胞株細胞表型耐藥分析IO5Cell/孔細胞密度接種12孔板，細胞貼壁後加入核苷類抗病毒藥物，拉米夫定設 0、0. luM、0. 3uM、luM、3uM、10uM、30uM、IOOuM 8 個濃度梯度，阿德福韋設 0、0. luM、
0.3uM、luM、3uM、10uM 6個濃度梯度，每個濃度梯度設復孔，隔天換液，第10天檢測細胞上清HBV-DNA水平，細胞抽提胞內總DNA檢測胞內HBV複製情況。實施例2測試H印G2. HSffT細胞株如圖I所示，pREP-HBV (WT) HBV細胞株上清HBsAg、HBeAg表達水平，HBsAg水平維持於20-40IU/ml之間，為H印2. 2. 15細胞2-4倍左右；HBeAg水平40_70PeIU/ml之間，為H印2. 2. 15細胞4-8倍左右，HBV-DNA維持於IO4-IO5之間，略低於H印2. 2. 15細胞，隨傳代次數增加無明顯下降。如圖2所示，pREP_HBV(WT)HBV細胞株耐藥表型分析的結果表明，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM和ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測下限之下，表明對LAM及ADV均敏感。如圖3所示，pREP-HBV(WT)HBV細胞株細胞上清HBV-DNA基因測序結果表明野生型，與轉染質粒相同。結果顯示，所述的高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株H印G2.HSWT，細胞上清HBV-DNA水平隨LAM以及ADV濃度梯度升高從IO4下降至檢測水平以下，表明對LAM及ADV均敏感；雜交結果顯示，HBV胞內複製水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。
權利要求
1.基於HepG2穩定表達HBV野生株細胞系，其特徵在於，所述細胞係為高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株，保藏編號=CGMCC No. 4909，分類命名高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HSffT ;具有以下生物學特性 能持續表達HBsAg及HBeAg，胞內有HBV複製，並產生HBV顆粒；與!fep2. 2. 15相比，其表達HBsAg及HBeAg高於!fep2· 2. 15，細胞上清HBV顆粒水平與Ifep2· 2. 15基本持平，其整合的HBV基因型為B或C基因型；其對LAM及ADV均敏感；HBV胞內複製水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。
2.按權利要求I所述的細胞系的製備方法，其特徵在於，將HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT轉染H印G2細胞後，通過潮黴素篩選，然後檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，並與ifep2. 2. 15細胞株相比較，最終建成基於H印G2穩定表達HBV野生株細胞系，獲得高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HSWT。
3.按權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT的載體骨架為PREPlO載體。
4.按權利要求2方法，其特徵在於，所述的HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT通過含cp啟動子及完整HBV前基因組的HBV1. 2倍體，B型(GeneBank登錄號AF100309)的複製子插入切除RSV啟動子的pREPIO，構建成HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT。
5.權利要求I的基於H印G2穩定表達HBV野生株細胞系在篩選抗HBV藥物中的用途。
6.按權利要求5所述的用途，其特徵在於，所述的基於H印G2穩定表達HBV野生株細胞系選自高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株H印G2. HSWT。
全文摘要
本發明屬微生物動物細胞系領域，涉及一種基於HepG2穩定表達HBV野生株細胞系，尤其涉及一種高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株HepG2.HSWT及其製備方法。本發明將HBV真核表達質粒pREP-HBV-WT轉染HepG2細胞後，通過潮黴素篩選，檢測細胞中HBV複製、特異性抗原的表達及病毒顆粒的產生，獲得高表達野生型HBV病毒肝癌細胞株HepG2.HSWT；所述的細胞株其表達HBsAg、HBeAg水平明顯高於HepG2.2.15，表達水平穩定，受培養環境等因素影響少，整合的HBV基因型為B或C基因型，所述的細胞對LAM及ADV均敏感，HBV胞內複製水平隨LAM及ADV濃度上升逐步下降。本發明的基於HepG2穩定表達HBV野生株細胞系，可用於中國人群HBV發病或耐藥機制的研究和可用於篩選抗HBV藥物。
文檔編號C12N5/10GK102816737SQ20111015353
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者張繼明, 張軼俊 申請人:復旦大學附屬華山醫院