新的巨核細胞擴增基因的製作方法

2023-12-09 09:35:56 1

專利名稱：新的巨核細胞擴增基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及來自人體的巨核細胞擴增基因(Megakaryocyte potentiator[以下縮寫為Meg-POT])，該擴增基因作用於由多功能性血液幹細胞分化而形成的巨核細胞群體細胞(Megakaryocyte Colony-Forming Unit，「CFu-Meg」)，並在具有白細胞介素(IL-3)等巨核細胞刺激基因(Megakaryocyte Colony-Stimu-lating Factor縮寫為Meg-CSF)活性的物質存在下促進巨核細胞的成熟。
血小板是在生體的止血，血栓形成中具有重要意義的血液有形成分之一。血小板由骨髓中的造血幹細胞經巨核細胞系前驅細胞而變成巨核芽細胞，並由進一步，成熟的巨核細胞排出血液中。
為從骨髓細胞形成巨核細胞，需要考慮具有不同作用的2種基因(Williams，N等人，「J，Cell Physial」110，101(1982))。也就是說，單獨形成巨核細胞群體的Meg-CSF，以及雖然只其本身沒有形成巨核細胞群體的活性，但若與Meg-CSF同時加入就可以顯示出增加巨核細胞群體數，或促進其成熟之作用的Meg-POT。
已經知道在人體中具有Meg-CSF活性的物質為IL-3(Teramura，M等人，「Exp.Hematol.」16，843(1988))以及顆粒細胞，巨噬細胞群體刺激基因(Teramura，M等人，「Exp.Hematal」17，1011(1989))等。另外，作為在人體中具有Meg-POT活性的物質已經知道白細胞介素6(Teramura，M和Mizoguchi，H「Int.J.Cell Cloning」8，245(1990))，白細胞介素11(Teramura，M等人，「Blood」79，327(1992))，紅細胞生成素(Bruno，E等人，「Blood」73，671(1989))等。
然而，人們已知這些物質不是對巨核細胞血小板系特異的基因，而倒不如說它們對其他的血細胞系或血細胞系以外的細胞也有作用。因此，將這些物質作為藥品以期待對巨核細胞，血小板系的作用而投藥的情況下，擔心出現與其不同的作用。由此，希望有一種對巨核細胞，血小板系有特異作用，並作為醫藥品實用性高的生理活性物質。
因此，本發明提供來自人體的離析的新巨核細胞擴增基因。
本發明人，培養來自人體胰臟癌腫瘤細胞的細胞株「HPC-YS」(Nozomi Yamaguchi等人，CANCER RESEARCH 50，7008(1990)(1991年12月27日在日工業技術院微生物工業技術研究所寄存，寄存號為微工研條寄第3703號(FERM BP-3703)，根據布達佩斯條約的國際寄存)，並由該培養上清液離析，精製成功巨核細胞擴增基因(Meg-POT)，解明其物性，完成了本發明，也就是說，本發明提供具有如下性質的巨核細胞擴增基因(1)在體外，IL-3存在下隨著用量增殖巨核細胞群體;
(2)根據SDS-聚丙烯醯胺凝膠，電泳測定的，分子量約為3200處具有單一譜帶;
(3)在逆相高速液體色譜法(HPLC)(柱Vydac Protein C4，4.6×250mm，顆粒尺寸5μm，Vydac社制)之中，洗提出0.1%三氟乙酸(TFA)中的乙腈濃度為40～45%的鎦分;以及(4)分子中胺基酸的序列為如下Gly Glu Tnr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu AspGly Val Leu。


圖1表示實施例3中的步驟7的逆相HPLC(Ⅲ)的結果。
圖2表示實施例4中Meg-POT的根據SOS-PAGE測定分子量的結果。
圖3表示實施例7中巨核細胞擴增基因的Meg-PoT活性的濃度-反應曲線、各點均表示二次測定的平均值。此外，縱軸的Meg-POT活性是以添加被檢體時和未添加被檢體時(重組型小鼠IL-3單獨)的巨核細胞群體數的差值表示。不添加被檢體時的巨核細胞群體數為22和25，平均為23.5。
本發明的巨核細胞擴增基因，例如由來自人的胰臟癌腫瘤細胞的細胞株「HPC-Y5」的培養上清液，以如下的方法可以離析、精製。首先，將細胞株「HPC-Y5」以下面實施例2中詳細所示的方法進行培養，並收集培養上清液。然後從該培養上清液，以在實施例3中詳細所示的順序精製並離析。
本發明的巨核細胞擴增基因可按實施例中所示那樣進行離析，精製，但一旦被離析，精製，並解釋清楚其性質之後，然後，以這些性質為指標，用蛋白質的離析、精製中所用的任意的常法就可以離析，精製本發明的巨核細胞擴增基因。
另外，用遺傳工程的手段也能夠製造本發明的巨核細胞擴增基因。例如，由上述細胞株「HPC-Y5」，根據常規方法離析mRNA，並基於該mRNA以常規方法可以製作cDNA庫。為篩選該cDNA庫-的DNA探針是，例如可根據由本發明而明確的巨核細胞擴增基因的部分胺基酸序列來設計，或者，將本發明的巨核細胞擴增基因，以酶或化學方法進行切斷，並在確定該片段的胺基酸序列之後，基於該胺基酸序列也可以設計DNA探針。
然後，將這樣得到編碼了巨核細胞擴增基因cDNA，插入適當的載體中之後，由該表達載體轉化宿主，並通過培養該轉化體，可以製造本發明的巨核細胞擴增基因。作為這樣的宿主可以用如大腸菌類的原核細胞，酵母等的下等真核細胞，如哺乳動物細胞的高等真核細胞常常用的宿主。
下面表示本發明的巨核細胞擴增基因的性質。
(1)分子量本發明的巨核細胞擴增基因，以SDS-聚丙烯醯胺凝膠、電泳法測定，在分子量大約32000(31000～33000)處具有單一譜帶。
(2)部分胺基酸序列將本發明的巨核細胞擴增因子，或者本基因，用蛋白酶消化之後，將由逆相HPLC所得的肽片段，用氣相式蛋白定序器(Protein Sequencer)470A型(ABI社制)進行(埃德曼)Edoman降解，將所得的PTH胺基酸用PTH-分析器120型(ABI社制)鑑定時，分子中具有如下的胺基酸序列(序列號1)Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu。該序列用PIR蛋白質資料庫及Suiss Prot蛋白質資料庫檢索的結果，沒有發現相同的序列。
(3)巨核細胞擴增基因活性本發明的巨核細胞擴增基因，通過逆相色譜法(柱Vyclac Protein C4，4.6×250mm，顆粒大小5um，Vydac社制)測定時，可以確認巨核細胞擴增基因的活性在0.1%TFA中乙腈濃度40～50%鎦分中。
另外，巨核細胞擴增基因活性用下述的方法進行測定。
巨核細胞擴增基因活性的測定方法用小白鼠骨髓細胞，通過單層軟瓊脂培養法進行。
也就是說，將馬血清(56℃處理30分鐘，Biocell社制)0.2ml，小白鼠(C57BL/6N系雄性，6～12周令)大腿骨骨髓細胞0.1ml(2×105有核細胞)，含重組型小白鼠IL-3的5ng/ml Iscove′s Modified Du-lbecco′s培養液(IMDM)0.2ml，含瓊脂0.75%的改性McCoy′s 5A培養液0.4ml以及被檢體(用含10%馬血清的IMDM稀釋的物質)0.1ml進行混合，裝入直徑為35mm的組織培養塑料皿中使其凝固之後，在37℃，5%二氧化碳氣/95%空氣，100%溼度的條件下進行培養。培養的第6天，把每個瓊脂層取在滑動玻璃片上進行乾燥，並將呈薄膜狀標本物用5%戊二醛固定，用Nakeff等人的方法(Pros，Soc，Exp.Biol，Med，151，587(1976年))進行乙醯膽礆酯酶染色以及巨核細胞群體數的計算。此時，將含有4個以上乙醯膽礆酯酶染色陽性細胞的集塊作為巨核細胞群體。檢鏡的倍率為200倍。另外，Meg-POT活性是以將添加被檢體而產生的巨核細胞群體數與不添加被檢體(只加作為溶劑的含10%馬血清的IMDM)，和重組型IL-3單獨產生的巨核細胞群體數之間的差作為指標。
此外，本發明的巨核細胞擴增基因，雖然是糖蛋白質，但可以認為由常法所得的脫糖鏈也具有巨核細胞擴增基因活性，因此這些理所當然地被包括在本發明中。
下面通過實施例詳細說明本發明，但本發明並不限於這些實施例。
實施例1產生Mey-POT的細胞株HPC-Y5的樹立通過將由胰臟癌患者的淋巴結得到的腫瘤，使用含10%牛胎兒血清(FBS)的RPMI1640培養基，在碳酸氣保溫箱(二氧化碳氣濃度5%，溼度100%)中進行培養的方法樹立。將該細胞株，在含1%FBS的Ham′sF10培養基上進行順化，進一步逐漸降低FBS濃度，一連順化至最終在不含蛋白的Ham′s F10培養基中也能增殖為止。本細胞株在塑料皿上以單層狀地增殖，培化時間大約為33小時。(參照Nozomi Yamaguchi等人，「CANCER RESEARCH」50，7008(1990))。
實施例2 由HPC-Y5的繼代培養以及旋轉瓶的大量培養在實施例1中所述的HPC-Y5細胞的繼代培養以如下所示的方法進行。用塑料培養燒瓶(150cm2，康寧社制)，在含有10-8M亞硒酸鈉，100u/ml青黴素G鉀以及100μg/ml硫酸卡那黴素的Ham′s Nutrent Mixture F12培養液50ml中培養HPC-Y5細胞，並每4天更換培養液一次。
細胞繼代時除去培養液，加入預先加熱至37℃的，含0.125%胰蛋白酶(GIBCO社制)，0.01%EDTA(和光純藥社制)，而不含Ca、Mg的Dulbeco′s PBS溶液，並在37℃加熱5分鐘。通過吸液法操作剝離細胞，並將細胞移至15ml的塑料制離心管中，以1500轉/分，5分鐘的離心收集細胞。將細胞懸浮在上述培養等液中，在新的燒瓶4～5個中進行繼代。靜放一夜之後，將培養液與非附著性細胞一起除去，重新加入上述培養液繼續進行培養。以後每4日更換培養液一次。
另外，通過旋轉瓶為提供實施例3中所述的Meg-POT精製中用的HPT-Y5細胞的大量培養按以下方法實施。
從上述所繼代的HPC-Y5細胞完全濃密增殖的150cm2塑料培養燒瓶中，如上所述用胰蛋白酶-EDTA收集細胞，將其浮遊在含0.2%牛胎兒血清(Hyclone社制)的上述培養液250ml中，並移至1700cm2的塑料制旋轉瓶(康寧社制)中，以0.5轉/分的速度進行旋轉培養。7天後更換到不含血清的上述培養液，以後每4天更換上述無血清培養液，以收集精製用無血清培養上清液。
實施例3 由HPC-Y5株培養上清液精製Meg-POT在實施例2中所述的方法得到的HPC-Y5細胞的培養上清液(27.3升)中加入Tween20，加到最終濃度為0.01%之後，用人工腎臟PAN 1200(旭medica社制)，濃縮約200倍。將濃縮液，在4℃下相對於含0.01%Tween20的10ml乙酸緩衝液(PH5.0)滲析一夜。對於滲析液施以離心操作(10000xg，60分)，除去不溶物後將其上清液用於下面的精製中。
(步驟-1)S-Sepharose離子交換色譜法在用含0.01%Tween20的20mM乙酸緩衝液(pH5.0)平衡的S-Sepharose Fast Flow(弗耳馬西亞社制)柱(5×10cm)中添加上述的離心上清液。用相同的緩衝液洗淨柱之後，在該緩衝液中，將Nacl的濃度順次提高為0.15M，0.3M以及1.0M洗提出吸附蛋白。按照前面所述的方法對於透明餾分，洗淨餾分，以及各鹽濃度洗提出的餾分測定活性結果，確認了0.15M-Nacl洗提出部分中具有Meg-POT活性。
(步驟-2)DEAE-Sepharose離子交換色譜法將步驟-1所得的活性餾分，在4℃下，對於含0.01%Tween20的10mMtris-鹽酸緩衝液(pH7.4)透析一夜。將透析內液添加到以相同的緩衝液平衡了的DEAE-Sepharose Fast Flow(弗耳馬西亞社制)柱(2.2×13cm)中，並用該緩衝液洗淨柱。以0.15M，0.3M以及1.0M順序提高該緩衝液中Nacl的濃度，洗提出吸附蛋白。按照前面所述的方法，對於透明餾分，洗淨餾分以及各鹽濃度中洗提出的餾分測定活性的結果，確定在0.15M-Nacl洗提餾分中有Meg-POT活性。
(步驟-3)逆相HPLC(Ⅰ)
在以步驟2所得的活性餾分中加入5%三氟乙酸(TFA)將pH調整至約2，並以流速1.0ml/分添加在以含0.1%TFA的5%乙腈平衡的逆相柱(Vydac Protein C4，10×250mm，顆粒大小5μm，Vydac社制)中，通過乙腈的直線濃度梯度(5%→65%，120分，0.5%乙腈/分)，以流速1ml/分洗提出了吸附蛋白。洗提出蛋白的檢驗是通過跟蹤220nm及280mm波長中的吸光度來進行，並且分鎦成1ml/份。對於每鎦份進行活性測定，其結果，確認了乙腈濃度40～45%鎦份中有Meg-POT活性。
(步驟-4)逆相HPLC(Ⅱ)將在步驟3中得到的活性餾分用0.1%TFA稀釋2倍，並以1.0ml/分的流速添加至用含0.1%TFA的35%乙腈平衡的逆相HPLC柱(Vydac Protein C4，4.6×250mm，顆粒大小5μm，Vydac社制)中。通過乙腈的直線濃度梯度(35%→50%，75分，0.2%乙腈/分)，以流速1ml/分洗提出了吸附蛋白。通過跟蹤220nm以及280nm中的吸光度進行洗提出蛋白的檢驗，並分鎦成每份為1ml。對每份進行活性測定，其結果判明了乙腈濃度40%～45%的鎦分有Meg-POT活性。
(步驟-5)DEAE離子交換HPLC將在步驟4中得到的活性餾分進行凍結乾燥之後，溶解在含0.01%Tween20的10mM tris-鹽酸緩衝液(pH8.0)中，並以0.7ml/分的流速添加到用該相同緩衝液平衡的Protein Pak G-DEAE柱(Waters社制，8.2×75mm)中吸附蛋白通過Nacl直線濃度梯度(0.0M→0.2M、40分、5mM Nacl/分)以0.7ml/分洗提出。在220nm中檢測洗提出蛋白，並分鎦成0.7ml/份。對於各餾份測定活性的結果，判明了Nacl濃度低於75mM的鎦份有Meg-POT活性。
(步驟-6)TSKgel G3000SW凝膠過濾將在步驟5中得到的活性鎦分，以3ml/分的流速流過以含0.01% Tween20以及0.15M Nacl的50mM tris-鹽酸緩衝液(pH7.4)進行平衡的TSKgelG3000SW柱(東曹社制，21.5×60nm，保護柱21.5×75nm)中，然後在220nm檢測，洗提出的蛋白。對於3ml/份的各鎦份測定活性的結果，判明為Meg-POT活性在洗提出時間49～54分鐘的那一鎦份上，因此收集了該鎦份。
(步驟-7)逆相HPLC(Ⅲ)將在步驟6中得到的活性鎦分中加入5%TFA以調整pH大約為2，並與步驟4中的逆相HPLC(Ⅱ)相同的條件下進行色譜法分離。對每份測定活性的結果，被判明為主峰(乙腈濃度40%～45%)中有Meg-POT活性。其結果示於圖1中。將在圖1中以橫坐標所示的峰值部分作為精製Meg-POT收集。
實施例4 巨核細胞擴增基因(Meg-POT)的分子量根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定了在實施例3中精製的巨核細胞擴增基因的分子量。分離凝膠濃度為12%，濃縮凝膠濃度為4%。用離心濃縮器(富精工社制)乾燥這些試樣，溶解在含5%α-巰基乙醇以及2%SDS的試樣用緩衝液(pH6.8)中，並煮沸3分鐘。泳動是在100V進行30分鐘，140V進行1小時，凝膠用甲醇∶乙酸∶水＝3∶1∶6來固定，並以銀染色試劑(第一化學藥品社制)染色蛋白質。
分子量標識器是使用biolatd社制低分子量標識器(Phoshorylaseb(92，5kd)，Bovine serum albumin(66，2kd)，Ovalbumin(45，0kd)，Carbonic anhydrase(31，0kd)，Soybean trypsin inhibitor(21，5kd)，Lysozyme(14，4kd).
其結果示於圖2。如由圖2清楚地看到，本發明的巨核細胞擴增基因(Meg-POT)是在分子量大約為32000(31000～33000)處顯示出單一譜帶。
實施例5 巨核細胞擴增基因(meg-POT)的胺基酸組成將在實施例3中得到的精製Meg-POT試樣，在含1%苯酚的6N Hcl中，110℃，24小時，減壓下進行加水分解，在游離的胺基酸中加入異硫氰酸苯酯，在室溫反應25分鐘，得到苯基硫代氨基甲醯(PCT)衍生物。將所得的PCT衍生物用Pico-Tag胺基酸自動分析系統(Waters社制)進行定量。定量結果以及Ala為24個或者Glx為29個時的胺基酸組成表示表1中。
表1Pmole Ala=24 Glx=29P11表 Asx(D,N) 542.4 18.2 18.0Glx(E,Q) 875.2 29.3 29.0Ser(S) 521.1 17.4 17.3Gly(G) 569.9 19.1 18.9His(H) 38.1 1.3 1.3Arg(R) 602.5 20.2 20.0Tur(T) 223.2 7.5 7.4Ala(A) 717.3 24.0 23.8Pro(P) 589.4 19.7 19.5Tyr(Y) 34.5 1.2 1.1Val(V) 329.4 11.0 10.9
Met(M) 35.1 1.2 1.2Cys(C) N、D＊- -Ile(I) 100.5 3.4 3.3Leu(L) 957.9 32.1 31.7Phe(F) 172.6 5.8 5.7Trp(W) N、D＊- -LYS(K) 89.6 3.0 3.0＊·N、D、沒有定量實施例6 巨核細胞擴增基因(Meg-POT)的胺基酸序列將在實施例3中得到Meg-POT試樣，用氣相式蛋白定序器470A型(appled bio systems·ink社制)進行。埃德曼降解，將所得的PTH-胺基酸用PTH分析儀120型(appled biosystems、ink社制)進行鑑定其結果，判明N末端附近的胺基酸序列(序列1～3)為下面表示的3種。另外，將用V8蛋白酶消化實施例3中得到的精製Meg-POT，並用以逆相HPLC離析肽片段，通過同樣的處理操作鑑定的胺基酸序列作為序列4表示。還有，Xaa表示未鑑定的胺基酸殘基。
1 5 10序列-1 Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu15Asp Gly Val1 5 10序列-2 Ala Gly Glu Tur Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu AspGly Val
1 5 10序列-3 Gly Glu Tur Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu AspGly Val1 5序列-4 Ala Ala Pro Leu AspGly Val序列-1 Leu(序列號5)15序列-2 Leu Ala (序列號4)15序列-3 Leu Ala Asn (序列號3)10 15 20序列-4 Leu Ala Asn Pro Pro Xaa Ile Ser Ser Leu Xaa Pro Arg25Gln Leu Leu Gly Pue Pro (序列號2)(序列上表示的數字為埃德曼降解時的循環數)上述序列1～3的胺基酸序列之中可以斷定以下的胺基酸序列為共同。
Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu(序列號1)實施例7 巨核細胞擴增基因(Meg-POT)巨核細胞擴增基因活性按照前面所述的方法測定對於實施例3中精製的巨核細胞擴增基因的小鼠骨髓細胞的巨核細胞擴增基因活性。也就是說，用含10%馬血清的IMDM，將精製Meg-POT稀釋10倍。將其調製成進一步用含馬血清的上述IMDM稀釋2，4，8，16，32以及64倍，然後把它作為被檢驗體進行活性測定，其結果得到如圖3所示的濃度-反應曲線。
由於本發明的巨核細胞擴增基因在IL-3的存在下，具有隨著用量增殖巨核細胞群體的作用，因此可以期待作為對如血小板減小或者血小板功能降低而引起的疾病治療劑的有用性。
按規則第13之2的微生物寄存情況寄存機關通商產業省工業技術院微生物工業技術研究所地址日本國茨城縣築坡市東1丁目1番3號寄存號及寄存日1、微工研條寄第3703號1991年12月27日序列表序列號1序列長度14序列型胺基酸拓樸學直線型序列的種類肽序列Gly Glu Tur Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val1 5 10Leu序列號2序列長度26序列型胺基酸拓樸學直線型序列種類肽序列Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Xaa1 5 10Ile Ser Ser Leu Xaa Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro15 20 25序列號3序列長度16序列型胺基酸拓樸學直線型序列種類肽序列Gly Glu Tur Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val1 10Leu Ala Asn15序列號4序列長度16序列型胺基酸拓樸學直線型序列種類肽序列 Ala Gly Glu Tur Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly1 5 10Val Leu Ala15
序列號5序列長度16序列型胺基酸拓樸學直線型序列種類肽序列Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp1 5 10Gly Val Leu1權利要求
1.一種巨核細胞擴增基因，具有下面的性質(1)在體外，ⅠL-3的存在下隨著用量增殖巨核細胞群體；(2)根據SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定時，在分子量大約32000處具有單一譜帶；(3)在逆相高速液體色譜法(柱VydacProteinC4，4.6×250mm，顆粒大小5μm，Vydac社制)中，0.1%三氟乙酸中乙腈濃度為40～45%之鎦份上洗提出；以及(4)分子中胺基酸為下列序列GlyGluTurGlyGlnGluAlaAlaProLeuAspGlyValLeu。
全文摘要
本發明提供一種來自人體的新的巨核細胞擴增基因(Meg-POT)。該Meg-POT在SDS-PAGB中具有大約32000的分子量。另外，分子中含有下述胺基酸序列。Gly Glu Tur Gly Gln Glu AlaAla Pro Leu Asp Gly Val Leu該Meg-POT可期待作為由於血小板減少或者降低血小板功能等而引起的疾病的治療藥。
文檔編號C07K14/47GK1075148SQ9211384
公開日1993年8月11日 申請日期1992年12月27日 優先權日1991年12月27日
發明者山口希, 大枝匡義, 服部有宏 申請人:中外製藥株式會社