基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法

2023-12-08 22:25:46 2

專利名稱：：基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法
技術領域：
：本發明屬於生物工程
技術領域：
，特別是指一種基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法
背景技術：
：本項目主要在基因工程藥物領域創立抗體晶片檢測技術平臺，自主研發抗B肝疫苗抗體晶片檢測試劑盒(抗體晶片)完全是由中國人自主開發，應用這一晶片，可通過多種方式、多種渠道、多測面檢測B肝疫苗製品的效價和含量，將檢測靈敏度由ug提高到ng級，從而達到更準確、更全面的效果3其檢測結果即可定性也可定量。抗B肝疫苗抗體晶片檢測試劑盒(抗體晶片)對促進我國生物高技術前沿領域的發展具有重大鼓舞作用，對提升我屬生物晶片技術、產品和巿場的國際竟爭力具有重大意義，此方法完全符合分子免疫學原理。目前國外幾乎所有的主要製藥公司都不同程度地採用了生物晶片技術來尋找藥物靶標，查檢藥物的毒性或副作用及進行藥物產品的定量和定性。用晶片技術進行大規模的藥物篩選可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，從而帶動創新藥物的研究和開發。
發明內容本發明的目的在於提供一種基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法。本發明的整體技術構思是利用細胞融合、亞克隆及酶聯免疫吸附實驗進行特異性篩選技術，獲得高效價.高特異性抗人基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體，由於此單抗效價高、特異性好，可直接應用二晶片的點樣，結合CY3標記的基因工程藥物B肝疫苗與被檢產品建立抗體晶片竟爭抑制法檢測基因工程B肝疫苗含量的方法。抗體晶片竟爭抑制法檢汰'基因工程B肝疫苗含量具有靈敏度高，特異性好、操作簡單、高通量等優點，可用於生產線的監測和質控。基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，它包括如下工藝步驟(1)動物免疫將高純度的人基因工程藥物B肝疫苗lml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每隻腹腔注射乳化後的高純度人神經巢蛋白，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液後的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞並製成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1:IO比例混合，30秒內逐漸加入45。/。PEG(分子量4000)，靜止90秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇培養基進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第七天時，吸取％孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養並凍存；(5)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周後收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A28tom時收集，1.44(吸光單位)濃度為lmg/ml。(6)將基因工程B肝疫苗進行CY3標記(7)基因工程藥物B肝疫苗微陣列點樣一張晶片點100個點，檢測線性範圍0。01~10ng/ml。本發明的具體工藝步驟和各步驟中的工藝參數是=步驟U)將基因工程藥物B肝疫苗lml加等量的完全福氏佐劑並經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在812周，每隻腹腔注射0.2ml,間隔2周注射一次；釆用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清。步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨喧細胞，鋪植96孔培養板，將換液後15小時的Sp2/0細胞調整為9xl05/3il細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞。步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml培養液；間隔2分鐘滴加5ml培養液，然後加培養液50ml,以HAT選擇培養基按36%的孔為1個細胞/孔進行細胞培養。步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0%~20%孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。步驟(5)中選用的BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周後將5xl5雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周後有明顯的腹水產生，每隻小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位=1.44時濃度為lmg/ml。步驟(6)中選用的是CY3對基因工程藥物B肝疫苗的標記步驟(7)中選用基因工程藥物B肝疫苗微陣列點樣一張晶片點100個點，檢測線性範圍0。01~10ng/ml。本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在於所獲得的抗人基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體經AKTA蛋白純化儀FPLC純化，其效價高、特異性非常好，可直接將有限稀釋的抗體點於晶片上，與標記的B肝疫苗和製品進行雜交，藉助目前先進的晶片檢測儀器進行檢測。此技術與傳統的檢測方法比較，具有快速、操作便捷、高通量檢測的特點；並可快速、準確地進行定性和定量檢測。本發明所公開的方法是將高純度基因工程藥物B肝疫苗經免疫動物、細胞融合、克隆化培養、以及大量的組織細胞原位特異性篩選從而獲得高效價、高特異性的抗人基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體，此抗體可直接應用於臨床檢測和基礎研究。單克隆抗體在生物學和醫學研究領域中具有極大的應用價值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的抗體，是免疫檢驗中的新型試劑，是生物治療的導向武器。作為基因工程藥物B肝疫苗的檢測試劑，抗人基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體可以充分發揮其優勢。單克隆抗體的特異性強，可將抗原抗體反應的特異性大大提高，減少了可能的交叉反應，使試驗結果可信度更大。單克隆抗體的均一性,生物活性單一性使抗原抗體反應結果便於質量控制，利於標準化和規範化。其各項指標如下1、免疫BLAB/C鼠的抗血清酶聯免疫吸附實驗效價大於1:S0002、陽性克隆孔酶聯免疫吸附實驗效價大於l:le03G3、陽性克隆孔腹水酶聯免疫吸附實驗效價大於1:5G冊04、陽性克隆孔特異性表達與基因工程藥物B肝疫苗製品呈陽性表達。與其它基因工程藥物人胰島素、人生長激素、幹擾素、人促紅細胞生成素(Epo)、GM-集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-2(IL-2)、白介素-11(IL-ll)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)呈陰性表達如下tableseeoriginaldocumentpage8具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步描述基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於它包括如下工藝步驟_(1)動物免疫將高純度的人基因工程藥物B肝疫苗lml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每隻腹腔注射乳化後的高純度人基因工程藥物B肝疫苗，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液後的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞並製成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1:IO比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇培養基進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第七天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，然後進行抗原特異性免疫組織化學原位測定，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養並凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經酶聯免疫吸附實驗檢測抗體效價大於1:l師00的l性孔的上清，與多種其它基因工程藥物進行特異性篩選。(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周後收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，1."(吸光單位)濃度為lmg/ml。步驟(1)將高效價、高特異性抗人基因工程藥物B肝疫苗lml加等量的完全福氏佐劑並經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在9周，每隻腹腔注射0.2ml,間隔2周注射一次；測定抗血清。步驟(2)進行完畢後採用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50麵ol/L、pH=9的碳酸鹽緩衝液將步驟(1)中的高純度基因工程B肝疫苗l:500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽乾，密封4i:保存備用。b、封閉每孔加入P'H為-7。4的磷酸鹽緩衝液200jul洗滌、內含1%山羊血清；c、加樣'每孔加入第三次免疫後3天的小鼠外周血清50ial(1:5000稀釋)，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩衝液)，洗滌；d、加入酶標二抗每孔1Q0pl，洗滌；e、顯色每孔加入底物100n1;f、比色以空白調零，405謹波長測定光密度(0。D);g、結果判斷P/》測定標本0。D均值/陰性血清0。E均值，P/N^2。l為陽性。步驟a中的聚乙烯板規格為200jul/孔、真空抽千溫度為4'C,洗滌釆用0。05%的Tween-20磷酸鹽緩衝液洗滌3次。步驟b中的工藝參數為每孔加入pH-7。4、含PA山蘭血清磷酸鹽緩衝液200pl,溫度為37i:、時間1小時，洗滌3次。步驟c中的工藝條件為每孔加入1:5000稀釋後的第三次免疫後3天的小鼠外周血清50ji1,每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩衝液X溫度為37°C、時間為1小時，洗滌3次。步驟ci中的工藝條件加入酶標二抗每孔100jul，溫度為37°C、時間為1小時，洗滌3次。步驟e中的工藝條件為室溫、時間為10分鐘5然後使用終止液終止反應，經酶標儀在波長450nm處讀取光密度值。步驟(3)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液後15小時的Sp2/0細胞調整為9x107ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞。步驟(4)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml培養液；間隔2分鐘滴加5ml培養液，然後加培養液50ml,以HAT選擇培養基按36%的孔為1個細胞/孔進行細胞培養。步驟(5)中是將細胞培養至覆蓋10%孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，與多批次基因工程B肝疫苗經ELISA篩選呈陽性表達。然後確定高分泌、高特異性細胞株擴大培養或凍存。步驟(6)中選用的BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周後將5xl5雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周後有明顯的腹水產生，每隻小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位=1.44時濃度為lmg/ml。步驟(7)中選用的CY3標記基因工程藥物B肝疫苗步驟(8)中選用的基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗^本徽陣列點樣一張晶片點100個點，從第一個點至第IOO個點每一個點的含量以10pg/ml遞增，檢測線性範圍0。01~10ng/ml。步驟(9)中選用的與其它基因工程藥物進行特異性篩選。此基因二程藥物B肝疫苗抗體晶片經30批次的基g工程藥物B肝疫苗產品的特異性篩選表達均為陽性，與9種251批次的其它基因工程藥物進行特異性篩選陽性表達為0。表明此晶片特異性很高5適合提供繪基因工程藥物企業進行基因工程藥物B肝疫苗的鑑定和質控評價，此抗體還可製成免疫組化或酶聯免疫吸附實驗試劑盒開展醫學基礎研究。權利要求1、基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於它包括如下工藝步驟(1)動物免疫將高純度的人基因工程藥物B肝疫苗1-10ml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每隻腹腔注射乳化後的高純度人基因工程藥物B肝疫苗，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液後的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞並製成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美國Sigma公司出品)使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇性培養基(美國海克隆公司出品)進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第5-10天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，然後進行抗原特異性免疫組織化學原位測定，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養並凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經酶聯免疫吸附實驗檢測抗體效價大於1∶10000的陽性孔的上清，與多廠家、多批次的基因工程藥物B肝疫苗進行特異性和效價篩選。(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，後將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周後收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司製造)將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，1.44(吸光單位)濃度為1-10mg/ml。(7)CY3標記基因工程藥物B肝疫苗用CyDyeDIGEFluor，Cy3minimaldye系統採用標準方法將基因工程藥物B肝疫苗標記上CY3。(8)基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體微陣列點樣一張晶片點100個點，從第一個點至第100個點每一個點的含量以10pg/ml遞增，檢測線性範圍0.01～10ng/ml。(9)與其它基因工程藥物進行特異性篩選。2、根據權利要求l所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(1)將高效價、高特異性基因工程藥物B肝疫苗1-lOffll加等量的完全福氏佐劑並經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在822周，每隻腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫後第三天抽取外周血；測定抗血清。U)基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體微陣列點祥一張晶片點100個點，檢測線性範圍0。01~10ng/證l。3、根據權利要求1或2所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(1)進行完畢後採用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以5Ommol/L、pH=9的碳酸鹽緩衝液將步驟(1)中的高純度基因工程藥物B肝疫苗l:500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽乾，密封rC保存備用。b、封閉每孔加入pH為7。4的磷酸鹽緩衝液200ni1洗滌、內含1%山羊血清；c、力口樣每孔加入第三次免疫後3天的小鼠外周血清50-100in1(h5000-10000稀釋)，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩衝液)，洗滌；d、加入酶標二抗每孔100-2冊]ul，洗滌；e、顯色每孔加入底物50-100pl;f、比色以空白調零，405謹波長測定光密度(0。D);g、結果判斷:P/N-測定標本0。D均值/陰性血清G。iD均值，P/N》2。l為陽性。4、根據權利要求3所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟c中的工藝條件為每孔加入1:5000-10000稀釋後的第三次免疫後3天的小鼠外周血清50-100^1，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩衝液)，溫度為37r、時間為l小時，洗滌3次。5、根據權利要求3所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法5其特徵在於所述的步驟e中的工藝條件為室溫、時間為G分鐘，然後使用終止液終止反應，經酶標儀在波長'450iMi處讀取光密度值。6、根據權利要求1所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液後15小時的Sp2/0細胞調整為1-9x107ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞1-9^105—Vml。7、根據權利要求l所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1:10-100的比例混合，30-60秒內逐漸加入450露(分子量:4000)，靜止90-120秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第l分鐘滴加4.5mll640培養液；間隔2分鐘滴加5ml1640培養液，然後加1640培養液至50ml，1500rpm/分鐘離心IO分鐘，以HAT選擇性培養基(美囯海克隆公司出品)按20-50%的孔為l個細胞/孔進行細胞培養。8、根據權利要求l所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0%~20%孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，然後進行抗原特異的免疫組織化學測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。9、根據權利要求l所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(5)中選用的多廠家30批次的基因工程藥物B肝疫苗與此單克隆抗體呈陽性表達。10、根據權利要求1所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(6)中選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周後將5><105雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周後有明顯的腹水產生，每隻小鼠可收集10-15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280im時收集，吸光單位=1.44時濃度為1-10mg/ml。11、根據權利要求1所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(7)對其基因工程藥物B肝疫苗進行CT3標記。12、根據權利要求1所述的基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法，其特徵在於所述的步驟(8)基因工程藥物B肝疫苗單克隆抗體微陣列點樣一張晶片點100個點，檢測線性範圍0。01-10ng/ffil。全文摘要本發明屬於生物工程
技術領域：
，特別是指一種基因工程藥物B肝疫苗抗體晶片的製備方法。其中動物免疫、分離脾細胞、細胞融合、篩選雜交瘤細胞、單克隆抗體特異性篩選、單克隆抗體純化保存、B肝疫苗的標記、單克隆抗體的矩陣點樣、晶片的雜交等工藝步驟，解決了傳統技術存在的費時、費力、結果重複性差等技術問題。此晶片可直接應用於一線基因工程藥物生產企業進行檢測和質控研究，在基因工程藥物研究領域中具有極高的應用價值，單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應結果便於質量控制，利於標準化和規範化。目前國外幾乎所有的主要製藥公司都不同程度地採用了生物晶片技術來尋找藥物靶標，檢查藥物的毒性或副作用及進行藥物產品的定量和定性。用晶片技術進行大規模的藥物篩選可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，從而帶動創新藥物的研究和開發。文檔編號G01N33/577GK101556286SQ20081008896公開日2009年10月14日申請日期2008年4月10日優先權日2008年4月10日發明者銳張,彬李,倩梁申請人:李彬;梁倩;張銳