包括不同類型轉移因子的組合物,製備該組合物的方法,以及使用該組合物的治療方法
2023-12-09 05:13:41 3
專利名稱：包括不同類型轉移因子的組合物,製備該組合物的方法,以及使用該組合物的治療方法
技術領域：
本發明總地涉及包括轉移因子的組合物，更具體地，涉及包括來自不同類型來源動物的轉移因子的組合物。本發明還涉及製備包括不同類型轉移因子的組合物的方法以及涉及引發或提高患者免疫系統的T-細胞介導的免疫應答的方法。
背景技術：
許多致命的病原體從動物界傳到人類。例如，猴子是I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)的來源，該病毒導致獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)和猴痘，後者與天花相似；認為居住地面的哺乳動物是伊波拉病毒的來源；果蝠和豬是Nipah病毒的來源；Hendra病毒來自馬；引起「香港流感」的病毒源自雞；以及野生鳥類，尤其是鴨，是許多致命流感病毒的來源。許多疾病也具有動物儲存庫。例如，小鼠攜帶漢坦病毒，大鼠攜帶黑鼠疫，以及鹿攜帶萊姆病。
免疫系統脊椎動物的免疫系統是配備用來識別侵入的病原性生物如寄生蟲、細菌、真菌和病毒並保護身體免遭其侵害的。脊椎動物的免疫系統通常包括細胞組分和非細胞組分。
免疫系統的細胞組分包括通常所說的「淋巴細胞」或白細胞，其存在幾種類型。成熟免疫系統的細胞組分通常引起對入侵病原體的初次、非特異性應答，以及參與對病原體的二次、特異性應答。
對病原體感染的初次或初始應答中，稱為吞噬細胞的白細胞定位並攻擊入侵病原體。通常，吞噬細胞將內在化，或「吃掉」病原體，然後消化病原體。此外，白細胞在應答致病感染中生產並分泌化學物質，預期該化學物質攻擊病原體或有助於指導對病原體的攻擊。
只有當入侵病原體感染持續逃避初次免疫應答時，才需要對病原體的特異性、二次免疫應答。因為這種二次免疫應答通常是延遲的，因此也稱為「遲髮型超敏反應」。哺乳動物，靠其自身，通常直至病原體感染後約七(7)至約十四(14)天才引發對病原體的二次免疫應答。二次免疫應答也被稱為對特異性病原體的獲得性免疫。病原體具有一種或多種特徵蛋白，其稱為「抗原」。二次免疫應答中，稱為B淋巴細胞或「B-細胞」和T淋巴細胞或「T-細胞」的白細胞「學習」識別病原體的一種或多種抗原。B-細胞和T-細胞一起起作用來產生稱為「抗體」的蛋白質，其對於病原體上的一種或多種特定抗原是特異性的(例如，經構造來結合或「識別」所述抗原)。
T-細胞主要引起對病原體或抗原物質的二次免疫應答或遲髮型超敏反應。存在三種類型的T-細胞T-輔助細胞、抑制性T-細胞和抗原特異性T-細胞，後者還稱為細胞毒性(意思是「細胞殺傷」)T-淋巴細胞(CTL)或T-殺傷細胞或天然殺傷(NK)細胞。T-輔助細胞和抑制性T-細胞，儘管對某些抗原不是特異性的，但是執行調節功能(例如，通常伴隨感染的炎症)，該調節功能幫助從感染宿主除去病原體或抗原物質。
抗體，其只構成免疫系統非細胞組分的一部分，識別特異性抗原並因此認為是「抗原特異性的」。然後產生的抗體主要幫助白細胞定位並消除身體中的病原體。通常，一旦白細胞產生針對病原體的抗體，白細胞及其所有的遠祖細胞持續產生抗體。消除感染後，少量與所識別抗原對應的T-細胞和B-細胞保持於「休眠」狀態。當相應的致病物質或抗原物質再次感染宿主時，「休眠」T-細胞和B-細胞激活並在約四十八(48)小時內誘導快速的免疫應答。通過如此的應答，免疫系統引發對病原體的二次免疫應答，認為免疫系統具有對該病原體的「記憶」。
還知道哺乳動物的免疫系統產生較小的蛋白，稱為「轉移因子」，作為對感染病原體二次免疫應答的一部分。轉移因子是哺乳動物免疫系統的另一種非細胞組分。認為抗原特異性轉移因子結構上與抗體類似，但是分子大小小得多。抗原特異性轉移因子和抗體都包括抗原特異性位點。此外，轉移因子和抗體都包括與其各自效應細胞上受體位點相互作用的高度保守區域。轉移因子和抗體分子中，第三個區域，「銜接物」，連接抗原特異性位點和高度保守區域。
轉移因子在免疫系統中的作用轉移因子是淋巴細胞的低分子量分離物。狹義地說，轉移因子可具有對單個抗原的特異性。美國專利5,840,700和5,470,835，兩者都是頒發給Kirkpatrick等的(此後共同稱為「Kirkpatrick專利」)，公開了對某些抗原具有特異性的轉移因子的分離。更廣義地說，已經從單克隆淋巴細胞的細胞培養物產生「特異性」轉移因子。即使這些轉移因子是針對單個病原體產生的，它們也具有對該病原體多個抗原位點的特異性。因此，認為這些轉移因子是「病原體特異性的」，而不是抗原特異性的。同樣地，從已經感染特定病原體的宿主得到的轉移因子是病原體特異性的。儘管由於當特定抗原存在時它們引發二次免疫應答的能力通常在本領域中將這樣的製品稱為「抗原特異性的」，但是具有不同特異性的轉移因子也可以存在於這樣的製品中。因此，甚至所稱的「抗原特異性的」，病原體特異性轉移因子製品也可以對多種抗原是特異性的。
此外，認為抗原特異性和病原體特異性轉移因子可以導致宿主來引發對病原體或抗原的遲髮型超敏反應免疫應答，該轉移因子分子對所述病原體或抗原不是特異性的。轉移因子至少「招引」非特異性T-細胞、誘導性T-細胞和抑制性T-細胞至感染病原體或抗原物質，以促進對感染病原體或抗原物質的二次免疫應答或遲髮型超敏反應。
通常，轉移因子包括蛋白質的分離物，該蛋白質是從免疫活性哺乳動物來源獲得的，分子量小於約10,000道爾頓(D)。已知當體外或體內加入哺乳動物免疫細胞系統中時，轉移因子提高或正常化受體哺乳動物免疫系統的應答。
新生兒的免疫系統通常沒有足夠發育或「成熟」來有效保護新生兒免遭入侵病原體的侵害。此外，在出生前，許多哺乳動物通過其母親使之不受各種病原體的侵害。因此，許多新生哺乳動物不能立即引發對各種病原體的二次應答。相反地，通常其母親給予了新生哺乳動物對病原體的二次免疫。已知母親加強新生兒免疫系統的一種方式是給新生兒提供一套轉移因子。哺乳動物中，母親在初乳中給新生兒提供轉移因子，初乳通常在一天或兩天後由母親的乳汁替代。轉移因子主要將母親的獲得性、特異性(即，遲髮型超敏)免疫性傳遞給新生兒。該傳遞的免疫性通常調節新生兒免疫系統的細胞以抗原特異性方式以及以抗原或病原體非特異性方式反應來對抗病原體，直至新生兒的免疫系統能夠獨立地保護新生兒免遭病原體的侵害。因此，當轉移因子存在時，調節新生兒的免疫系統以超敏應答對病原體作出反應，如以典型的遲髮型超敏應答發生的超敏反應。因此，認為轉移因子「助推起動」了免疫系統對病原體的反應性。
近些年已經進行了許多涉及轉移因子的研究。通常，認為轉移因子是具有約四十四(44)個胺基酸長度的蛋白質。轉移因子通常具有約3,000至約5,000道爾頓(Da)，或約3kDa至約5kDa的分子量，但是轉移因子分子可能具有該範圍外的分子量。還認為轉移因子包括三個功能部分，其中每個部分包括不同類型的轉移因子分子誘導部分；免疫抑制部分；和抗原特異性部分。本領域中許多人認為轉移因子還包括核苷部分，其可以連接蛋白分子或與其分開，該核苷部分可以提高轉移因子導致哺乳動物免疫系統引發二次免疫應答的能力。核苷部分可以是轉移因子的誘導部分或抑制部分的一部分。
認為抗原特異性轉移因子的抗原特異性區域包括約八個(8)至約十二(12)個胺基酸。認為約十個(10)胺基酸的第二個高度保守區域是非常高親合性的T-細胞受體結合區域。剩餘的胺基酸可以用來連接兩個活性區域或可以具有另外的，至今未發現的特性。轉移因子分子的抗原特異性區域，其與抗體已知的抗原特異性結構類似，但是分子量大小小得多，看來似乎是高變區並適合識別一種或多種病原體上的特徵蛋白。認為誘導部分和免疫抑制部分給予了轉移因子調節免疫系統各種細胞的能力，使得細胞更充分地應答其環境中的病原刺激。
非細胞免疫系統組分的來源按照慣例，已經從奶牛的初乳中獲得轉移因子，如通過Wilson等的美國專利4,816,563中所述的方法(下文中稱為「Wilson」)。儘管奶牛通常產生大量初乳且因此在相對短的時間段內產生大量轉移因子，但是奶牛每年只有約一天或一天半產初乳。因此，奶牛既不是轉移因子的恆定來源也不是轉移因子的有效來源。
還從多種其它哺乳動物來源獲得了轉移因子。例如，在研究轉移因子中，已經將小鼠用作轉移因子的來源。通常將抗原皮下引入小鼠中，然後在對抗原產生遲髮型超敏反應後將小鼠處死。此後從小鼠的脾細胞中獲得轉移因子。
儘管通常使用不同機理來產生抗體，抗體的原始來源也可以是哺乳動物。例如，可以通過如下方法獲得單克隆抗體，給小鼠、兔子或另一種哺乳動物注射抗原，從哺乳動物獲得產生抗體的細胞，然後將產生抗體的細胞與無限增殖化細胞融合來產生雜交瘤細胞系，其將在細胞幾個世代的整個過程中，因此在長時間段內持續產生單克隆抗體。
已經從多種來源獲得針對哺乳動物病原體的抗體，這些來源包括小鼠、兔子、豬、牛和其它哺乳動物。此外，導致一些人類疾病如感冒的病原體，已知起源於鳥類。因為已經認識到鳥類(即，鳥)免疫系統和哺乳動物免疫系統非常相似，一些研究者已經轉向將鳥作為產生抗體的來源。
通過將抗原引入蛋中已經獲得對感染哺乳動物的病原體或「哺乳動物病原體」具有特異性的鳥抗體。或者，將來源動物暴露於抗原後，抗體可以存在於蛋中，抗原包括哺乳動物病原體的抗原。美國專利5,080,895，於1992年1月14日頒發給Tokoro(下文中稱為「895專利」)，公開了一種方法，包括給母雞注射導致新生哺乳動物腸感染疾病的病原體。然後母雞產生對這些病原體具有特異性的抗體，其將存在於母雞產的蛋中。「895」專利公開了包括這些病原體特異性抗體的組合物及其治療和預防新生小豬和牛犢腸疾病的用途。然而，用鳥抗體治療哺乳動物的病原體感染可能具有不良結果，因為哺乳動物的免疫系統可以通過引發針對體自身的免疫應答來消極地應答大的鳥抗體分子。此外，由於哺乳動物的免疫系統不因鳥抗體識別某些病原體的能力或鳥抗體對這類病原體的抗原的特異性而將其識別為有用的，鳥抗體通常不能在哺乳動物中引發所需的免疫應答。
還已知可以從蛋獲得轉移因子。Hennen等的美國專利6,468,534(下文中稱為「Hennen」)描述了一種方法，通過該方法將雌性小雞(即，母雞)暴露於一種或多種抗原，導致小雞引發免疫應答，免疫應答包括二次免疫應答。二次免疫應答的結果是，轉移因子分子存在於雞的蛋中。然後可以將蛋進行加工來提供其中存在轉移因子的產品。這樣的產品可以採取噴霧乾燥或冷凍乾燥或凍幹蛋粉的形式，並可以包括蛋的全部或部分。然後將蛋粉直接摻入明膠膠囊中或與其它物質混合然後引入明膠膠囊。
圖2圖示了通常用於將蛋粉形式的蛋衍生的鳥轉移因子包入膠囊的一種類型的裝膠囊設備。該裝膠囊設備20包括組分供料鬥24，進料站28，以及每個組分供料鬥24和進料站28之間傳送的推進加料器26。推進加料器26將全蛋粉從組分供料鬥24傳送至進料站28。
當推進加料器26運行時，其發熱至超過膽固醇相對低熔點的溫度，膽固醇來自蛋粉中的蛋黃。溫熱的膽固醇是粘性的，覆蓋了推進加料器26，與此連通的管道，和進料站28，因此降低了裝膠囊設備20運轉的效率。因此，必須定期拆卸並清洗裝膠囊設備，可能花費相當長的時間(例如，長達約8小時)，使得裝膠囊設備20的生產力顯著降低，並因此顯著降低以此形成的膠囊數量。因此，加工全蛋粉來獲得含有轉移因子的產品稍微有些不理想。
此外，源自單個來源動物產品(例如，蛋或初乳)的組合物通常只包括對來源動物所暴露的抗原具有特異性的轉移因子分子。這樣有限暴露的結果可能是含有這樣轉移因子的組合物在預防或治療某些類型的感染或病症中的有效性也是有限的。
因此，需要可用於促使所治療患者的免疫系統引發對更寬範圍病原體的免疫應答的組合物，以及需要提高裝膠囊和其它形成組合物設備的運轉效率和生產力的方法。
發明內容
本發明包括引發患者中T-細胞介導的免疫應答的組合物。該組合物包括來自至少兩種不同類型來源動物的轉移因子。如在此所用的關於來源動物的術語「類型」，描述了可以從其獲得轉移因子的來源動物並涉及不同綱的來源動物(例如，哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、昆蟲，等)。如在此所用的術語「類型」，也涉及來自不同亞綱、目(例如，偶蹄目、靈長目、食肉動物等)、科(牛科、人科、貓科，等)、亞科、屬(例如，牛、人、家貓，等)，甚至種和亞種的來源動物。在此使用關於轉移因子的術語「類型」表示從其獲得轉移因子的來源動物的類型。
組合物的示範性實施方案包括來自哺乳動物和非哺乳動物來源動物兩者的轉移因子，轉移因子的類型在此也分別稱為「哺乳動物轉移因子」和「非哺乳動物轉移因子」。作為非限制性實例，哺乳動物轉移因子可以以初乳或其部分或提取物包括於組合物中，其在此總地稱為「初乳衍生產物」或如本領域已知的其它形式(例如，作為白血球(白細胞)提取物，作為脾的(「來自脾的」)提取物，等)。還例如，示範性組合物的非哺乳動物轉移因子可以從蛋或其部分或提取物獲得，其在此也稱為「蛋衍生產物」。已經發現當將不同類型的轉移因子組合併給藥於所治療的動物(例如，哺乳動物)時，發生了一定的協同作用。
當本發明的組合物包括初乳衍生產物和蛋衍生產物時，這兩種產物可以以大約相等的量(例如，以總混合物的重量、體積等計)，或初乳衍生產物和蛋衍生產物中的一種比另一種多的量包括在混合物中。實驗結果表明來自具有高度依賴性幼崽的來源動物如奶牛的轉移因子，誘導了相對快的二次免疫應答，伴隨相對快的無反應性(即，白細胞對轉移因子分子敏感性的缺乏)建立。來自具有獨立幼崽的來源動物如雞或其它「鶉雞類」鳥類的轉移因子，沒有誘導快的二次免疫應答，但是確實提供了更持久的二次免疫應答。因此，可以調整初乳衍生的轉移產物和蛋衍生產物的相對濃度來引發二次免疫應答發生或持續特定的時間段。
引入本發明教導的組合物中還可以包括另外的成分。例如，本發明的組合物可以包括一種或多種維生素、礦物質、蛋白質或天然產物(例如，草藥、蘑菇、根，等)或其提取物。特別地，認為多糖在本發明組合物引發治療動物二次免疫應答的有效性中提供進一步的協同作用。示範性多糖以β-葡聚糖和蘑菇提取物(當然，其包括其它成分)的形式可獲得。
另一方面，本發明包括加工或製造包括轉移因子的蛋衍生產物的方法。本發明的加工或製造方法包括在將蛋衍生產物引入製造或其它加工設備之前或同時，將基本上無脂肪的成分如初乳衍生產物和蛋衍生產物混合，初乳衍生產物可以包括或不包括轉移因子。裝膠囊是其中可以使用這樣技術的加工或製造方法的一個實例。
另外，本發明包括降低用於加工蛋衍生產物的製造或其它加工設備如裝膠囊設備的清洗頻率的方法。該方法包括在蛋衍生產物引入加工設備之前或同時，將少脂肪或基本上無脂肪的物質如初乳衍生產物和蛋衍生產物混合。
本發明還包括治療患者的方法。引入本發明教導的治療方法包括將根據本發明的組合物給藥於患者。因為組合物包括轉移因子，所以將組合物給藥於患者將促使患者的免疫系統引發T-細胞介導的免疫應答或將通過已經在進行中的患者的免疫系統來提高T-細胞介導的免疫應答。
根據隨後的說明、附圖和所附的權利要求，對本領域普通技術人員來說本發明的其它方面和優勢將變得顯而易見。
在附圖中，描繪了本發明各個方面的示範性實施方案圖1描繪了可以使引入本發明教導的組合物具體化的方式的實例；圖2是裝膠囊設備的圖示，該裝膠囊設備可以用於將本發明組合物的粉末狀實施方案引入明膠膠囊中；和圖3圖示說明了示範性測試實驗方案，進行該測試實驗方案來測定本發明各方面的功效。
實施本發明的最佳方式引入本發明教導的組合物的示範性實施方案包括來自至少兩種不同類型來源動物的轉移因子。作為非限制性實例，根據本發明的組合物可以包括哺乳動物轉移因子和非哺乳動物轉移因子。
本發明組合物不同類型的轉移因子可以從任何合適的來源獲得。例如，可以從初乳獲得哺乳動物轉移因子，如Wilson中所述的或如本領域已知的(例如，白細胞(白血球)提取物，脾的(即，「來自脾的」)提取物，等)。非哺乳動物轉移因子的示範性來源是動物如雞的蛋，如Hennen中所述的。因此，根據本發明的組合物可以包括第一種成分，其包括初乳或其部分或提取物，在此將其總地稱為「初乳衍生產物」，以及第二種成分，包括蛋或其部分或提取物，在此也稱為「蛋衍生產物」。
由於引入本發明教導的組合物包括來自不同類型來源動物的轉移因子，所以它們可以包括具有比常規含有轉移因子的組合物更寬陣列抗原特異性或病原體特異性的轉移分子。因此，根據本發明的組合物能夠使得治療動物的免疫系統來引發T-細胞介導的免疫應答以對抗比常規含有轉移因子的組合物有效對抗的那些更寬陣列的病原體。這是因為不同類型的動物可以暴露於不同類型的抗原或病原體，如通過接種疫苗，動物的環境，等等。此外，已知某些動物中的一些病症通過多重感染引起，甚至進一步擴展根據本發明的組合物的特異性。例如，一種或多種病原體對宿主的免疫系統可以具有不利影響(例如，抑制或壟斷)，同時可以允許一種或多種其它病原體來引起宿主的病況。作為另一實例，一些病況由病原體的組合引起。
例如，包括來自奶牛和雞兩者的含有轉移因子成分的組合物將包括對奶牛所暴露的抗原和病原體具有特異性的轉移因子分子，以及對雞所暴露的抗原或病原體具有特異性的轉移因子分子。因為奶牛和雞兩者均可能暴露於另一者所未暴露的抗原或病原體，這樣的組合物可以包括具有隻包括來自奶牛的轉移因子(例如，通過初乳衍生產物)或來自雞的轉移因子(例如，通過蛋衍生產物)的組合物中不存在的抗原或病原體特異性的轉移因子分子。
就重量或體積測量而言，本發明的組合物可以包括約相同量的初乳衍生產物和蛋衍生產物(即，約50％的初乳衍生產物和約50％的蛋衍生產物)。或者，引入本發明教導的組合物可以包括比蛋衍生產物(約15％或40％，以重量計)多量的初乳衍生產物(例如，約85％或60％，以初乳衍生產物和蛋衍生產物的總重來計)。作為另一可供選擇的方案，本發明的組合物包括比初乳衍生產物(例如，約40％或15％重量)多量的蛋衍生產物(例如，約60％或85％重量)。作為另一實施例，引入本發明教導的組合物包括約1％重量的初乳衍生產物和蛋衍生產物中的一種，和約99％重量的初乳衍生產物和蛋衍生產物中的另一種。儘管提供了初乳衍生產物和蛋衍生產物的特定量，其任意組合是在本除了包括轉移因子的來源(例如，初乳衍生產物，蛋衍生產物，等)，引入本發明教導的組合物可以包括一種或多種其它成分，包括但不限於，維生素、礦物質、蛋白質、天然產物(例如，草藥，蘑菇，根，等，或其提取物)，等等。其它成分可以用於對施用該組合物的患者提供更多的優勢，或可以提高組合物中轉移因子引發或增強二次免疫應答或延遲型超敏反應的能力。
如圖1中所示，在不限制本發明的範圍的情況下，根據本發明的組合物10可以採取粉末或顆粒物質的形式，其包括多種類型的轉移因子(未顯示)。為了確保將合適和精確劑量的組合物10給藥於患者(未顯示)，可以將組合物10包含於公知類型且本領域技術人員容易獲得的明膠膠囊12中。結果是圖示的膠囊14。或者，根據本發明的組合物可以具體化為片劑，所謂的「囊片」，未包膠的粉末、液體、凝膠或任何其它藥物學上可接受的形式。將本發明的組合物放入任何這樣形式中的合適方法對本領域技術人員而言是顯而易見的。
製造或形成根據本發明的組合物的方法的示範性實施方案中，可以將第一種類型的轉移因子與第二種類型的轉移因子組合。此外，可以將一種或多種其它類型的轉移因子與第一種和第二種類型的轉移因子組合。組合的不同類型的轉移因子可以是基本上純化的轉移因子，包括轉移因子的成分或「產物」，或其任何組合。
再次轉向圖2，提供了形成如圖1中所示的填充了組合物的膠囊14的方法，只是作為製造引入本發明教導的組合物的方法的實例。如所示的，使用工業中已知類型的標準裝膠囊設備20，如從CapPlusTechnologies of Phoenix，Arizona可獲得的SF-135膠囊填充機製得組合物10和形成填充了組合物的膠囊14。
除了一個或多個組分供料鬥24，與每個組分供料鬥24連接的推進加料器26，以及與每個推進加料器26和其中包含推進加料器26的導管27連通的進料站28之外，裝膠囊設備20還包括一個或多個膠囊料鬥30，以及用於將膠囊體12a和/或膠囊帽12b運送至進料站28的風力給料系統32。
因為裝膠囊設備將混合物引入患者可以吞咽的膠囊中，通常優選以粉末形式將基本上無脂肪的成分和蛋衍生產物引入裝膠囊設備中。相對於蛋衍生產物中存在的脂肪濃度，基本上無脂肪的成分稀釋了混合物中存在的脂肪(例如，來自蛋黃)的量或濃度。因此，可以調整基本上無脂肪產物和蛋衍生產物的相對量來提供最小化裝膠囊設備堵塞的脂肪濃度。
繼續組合物10的實例，其包括作為基本上無脂肪成分的初乳衍生產物10a和蛋衍生產物10b，初乳衍生產物10a和蛋衍生產物10b可以同時引入裝膠囊設備20的單個組分供料鬥24中。例如，初乳衍生產物10a和蛋衍生產物10b可以在其引入組分供料鬥24時混合，如所示的，或預混合。通過將脂肪含量比蛋衍生產物10b低的物質與蛋衍生產物10b一起引入組分供料鬥24中，所得到混合物的脂肪含量(例如，濃度)低於蛋衍生產物10b的脂肪含量，降低或消除了組分供料鬥24、推進加料器26、管道27、進料站28或裝膠囊設備20的任何其它部件將被膽固醇或脂肪覆蓋的可能性。
將預定量的組合物10引入在進料站的膠囊體12a後，將裝滿的膠囊體12a運送至膠囊封閉站34，在那裡裝配膠囊帽12b以將組合物10完全包含在膠囊12中。
另外，填充了組合物的膠囊14隻是可以使引入本發明教導的組合物具體化的方式的一個實例。本發明的組合物還可以採取其它形式，如片劑、囊片、鬆散的粉末、液體、凝膠、填充了液體或填充了凝膠的膠囊，本領域已知的任何其它藥物學上可接受的形式，每種形式都可以通過已知的方法製得。
可以通過任何合適的方法(例如，腸內、胃腸外等)將本發明的組合物給藥於患者(例如，哺乳動物，如人、狗或貓，鳥，爬行動物，魚，等)，當然，取決於組合物的形式。例如，實際上任何形式的組合物(例如，膠囊、片劑、囊片、粉末、液體、凝膠，等)都可以口服給藥(即，通過患者的口)，只要該組合物包括本領域已知類型的藥物學上可接受的載體，該載體將防止由於持續存在於患者消化道中的條件而引起的轉移因子分子的降解或破壞而基本上不會影響組合物中所含轉移因子分子的功效。
給藥於患者的組合物或組合物中轉移因子的劑量取決於各種因素，包括但不限於，患者的體重，患者的健康狀況，或患者已經暴露的環境(例如，病原體)。
將組合物給藥於患者可以促使患者的免疫系統引發針對一種或多種抗原或病原體的T-細胞介導的免疫應答。因此，可以將組合物給藥於患者來治療患者經受的病況，預防患者呈現由特定病原體引起的病況，或只是提高患者免疫系統的整體健康和擊退感染或入侵病原體的能力。
具體實施方案以下實施例說明了包括來自多種類型來源動物的轉移因子的組合物促使所治療患者的免疫系統引發對靶細胞形式的各種病原體的T-細胞介導的免疫應答的提高的能力。實施例中所用的比例基於特定測試樣品中所用材料(例如，蛋粉，初乳粉)的重量。
實施例1實施例1中，初步試驗，靶細胞包括細菌(例如，肺炎衣原體(C.pneumoniae)和幽門螺桿菌(H.pylori))和病毒(例如，單純皰疹病毒-1(HSV-1)和單純皰疹病毒-2(HSV-2)，以病毒感染細胞的形式存在，以及癌，或惡性細胞(例如，K562紅白血病細胞)。
用於進行這些測定的體外技術為所謂的「鉻-51釋放測定法」，其包括測量由受到NK細胞攻擊的細胞所釋放的放射性鉻-51(Cr-51)的量。例如，可以使用Beckman 2000 Gamma Counter獲得放射性測量，其可以從Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，California獲得。
初步試驗的實施例1中，營養培養基和細胞環境中提供了固定量(每毫升營養培養基和細胞環境5微克)的粉末狀組合物，以及基本上固定量的NK細胞。所用的粉末狀組合物的實例包括漂白的小麥粉，轉移因子TM(TF)，從4Life Research，LLC，Sandy，Utah可獲得，轉移因子PlusTM(TFP或TF+)，也可以從4Life Research獲得，凍幹(即，冷凍乾燥的)全蛋粉中可獲得的鳥轉移因子，以及TF和TFP(在美國銷售的配方和在國際上銷售的配方)與鳥轉移因子的混合物，比例為約85％重量的TF或TFP(即，牛轉移因子)對約15％重量的鳥轉移因子。將粉末狀組合物、營養培養基、NK細胞和靶細胞混合併在測量通過NK細胞對靶細胞的破壞所釋放的放射性原子之前孵育四小時。每個示範性反應重複進行三次，將三次反應的結果進行平均。
除了包括一種或多種類型的轉移因子之外，TF+還包括多種其它成分，包括灰樹花和香菇、冬蟲夏草、肌醇六磷酸、β葡聚糖、β谷甾醇和橄欖葉提取物。已知灰樹花和香菇是多糖的良好來源並促進T-細胞的功能。冬蟲夏草也富含多糖。β葡聚糖，另一類多糖，也已知是重要的免疫細胞刺激劑。
下表包括用靶細胞和粉末狀組合物的每種組合獲得的每分鐘計數的數據，以及每種粉末狀組合物在引發NK細胞介導的針對靶細胞的免疫應答相對於在漂白小麥粉存在下對相同類型和濃度的靶細胞的NK細胞介導的免疫應答(以百分比增加測量)的功效。
實施例1表1靶細胞
值得注意的是，「TF+」表示的製劑只包括約一半(0.466667)「TF」表示的製劑中存在的轉移因子。因此，本領域的普通技術人員期望對應於以「Bov-Av TF+US」和「Bov-Av TF+Intl」表示的產物誘導的細胞毒性的數據稍微低於以Bov-Av TF表示的產物誘導的細胞毒性。相反，這些數字高得多。實際上，看來對應於「Bov-Av TF+US」和「Bov-AvTF+Intl」的數據約高10倍多。因此，已經對表1進行了適當的校正。此外，從隨後的實施例明顯看出，已經進行了進一步的測試來評價和證明不同類型轉移因子的組合來引發所治療動物中T-細胞應答的能力。
列於表1中的初步結果顯示了將本發明的組合物給藥於患者可能會增強通過NK細胞實現的，患者針對一種或多種病原體的二次免疫應答或延遲型超敏反應至遠遠超過由初乳衍生的轉移因子和蛋衍生的轉移因子單獨啟動的NK細胞活性的程度。實際上，結果顯示了引入本發明教導的組合物可導致具有意想不到程度的協同作用的NK細胞活性的促進。
鑑於這些結果，進行了進一步的實驗來測定更寬範圍的本發明各方面的功效。
實施例2評價了各種轉移因子組合物，包括引入本發明教導的組合物對淋巴細胞在攻擊癌細胞中的活性的影響。圖3圖示了評價的實驗方案。從健康捐獻者獲得血液，參照符號40。通過標準phycol-urographin方法，使用密度梯度p＝i，077g/cm3，從血液的其它成分中分離出單核細胞，包括天然殺傷細胞，參照符號42。然後將分離的單核細胞，或「效應細胞」，以約60,000細胞/100μl培養基的稀釋度，以100μl的等份引入96孔微量滴定平板的孔中，如平板可以以COSTAR的商品名稱從Corning Incorporated of Corning，New York獲得，如參照符號44所示。
此後，將含有轉移因子的測試樣品或「添加物」，如以下表2至表5中所注釋的，引入每個孔中，所得到的測試樣品濃度為1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml，0.001mg/ml、0.0001mg/ml和0.00001mg/ml，也如參照符號44所示。還使用了沒有包括轉移因子產物的對照。然後將微量滴定平板放入CO2-培養箱中溫育24小時和48小時，條件為5％CO2氣氛，100％溼度，和37℃的溫度。每個研究變量重複進行三次。
溫育後，將約30,000個K-562腫瘤細胞(即，骨髓成紅血細胞增多性人白血病)或「靶細胞」引入每個孔中，如參照符號46所示，提供了效應細胞與靶細胞的比例約為2∶1。然後在上述相同的條件下，將效應細胞和靶細胞在CO2培養箱中溫育18小時和24小時。
此後，如參照符號48，限定細胞培養物存活力的MTT方法，其使用可溶性的黃色溴化物，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-四唑(MTT)，用於測定每個孔中殺滅的K-562腫瘤細胞的數量。該測試中，活細胞將MTT還原成MTT-甲(MTT-f)的不溶性紫-藍色胞內晶體。不能生活的死細胞不能夠將MTT還原成MTT-f。因此，可以評價所獲得溶液的光學特性來表明各種含有轉移因子產物對效應細胞殺滅K-562腫瘤細胞的能力的影響。更具體地，MTT轉化成MTT-f的強度反映出所研究細胞的脫氫酶活性的總的水平並通過所結合的發酵系統的活性來調節；例如，電子傳遞的呼吸鏈，等。
如本領域已知的，在5mg/ml Henks』鹽水溶液中製備該實施例中所用的MTT溶液。將相等體積等分的MTT溶液引入微量滴定平板的孔中，然後在上述相同的條件下，將平板在CO2培養箱中溫育約三小時至約四小時。然後將微量滴定平板在約1,500rpm下離心約5分鐘，除去上清液，並將150μl等份的二甲基亞碸(DMSO)引入孔中。
然後將微量滴定平板在室溫下靜置30分鐘，使甲晶體完全溶解。此後，使用多孔分光光度計(LABSYSTEMS MultiScan MSS 340，從Cambridge Scientific Products of Cambridge，Massachusetts可獲得)在波長540nm下評價每個微量滴定板中的每個孔。
如參照符號50所示，然後將用分光光度計獲得的光密度(OD)測量值用於計算每個孔的細胞毒性指數(％)(CI(％))。根據標準的公式進行CI(％)的計算CI(％)＝[I-(ODe+t-ODe)/ODt]*100，
其中ODe+t是實驗系列中的OD，ODe是只包括效應細胞的孔中的OD，而ODt是只包括靶細胞的孔中的OD。
表224小時時的CI(％)
表324小時時CI的％增加(相對於自發的CI)
表448小時時的CI(％)
表548小時時CI的％增加(相對於自發的CI)
表2至表5所提供的數據證實了多數測試樣品(即，含有轉移因子的組合物)刺激了健康供體的淋巴細胞針對K-562腫瘤細胞的提高的(相對於自發性腫瘤細胞死亡)抗腫瘤活性和細胞毒性活性。
最大的刺激作用出現在48小時的結果中，刺激濃度的最有效範圍為約0.1mg/ml至約0.0001mg/ml。包括初乳衍生的轉移因子和蛋衍生的轉移因子兩者的測試樣品在給定的實驗條件中再次顯示出最有效，裂解了多達80-98％的K-562腫瘤細胞。
另外，表5的結果表明不同類型轉移因子的組合，尤其是85∶15比例的TF+和蛋衍生的轉移因子，可能比從所治療動物體內消除不良細胞和病原體的其它治療過程更有效。更具體地，由於本發明者在等同的測試中認識到，用白細胞介素-2治療獲得的最佳結果為對24小時溫育的K-562腫瘤細胞76％的細胞毒性(等於相對於該細胞自發性死亡的322％增加)和對48小時溫育的K-562腫瘤細胞88％的細胞毒性(等於相對於該細胞自發性死亡的389％增加)。
實施例3進行了另一證實性測試來證明上述結果並評價更多種本發明組合物對誘導NK細胞和其它單核細胞殺滅K-562腫瘤細胞的作用。在實施例3的測試中使用了實施例2中所述的相同實驗方案。
每種包括蛋粉和牛初乳粉的多種組合物製劑溫育24和48小時的結果列於表6至表9中。
表624小時時的CI(％)
表724小時時CI的增加％(相對於自發的CI)
表848小時時的CI(％)
表948小時時CI的％增加(相對於自發的CI)
表6至表9的數據，尤其是表6和表8的數據，顯示了當根據本發明的組合物中存在較多的初乳衍生的轉移因子時(例如，85∶15)，初始的(24小時測試)應答高於由包括較少初乳衍生的轉移因子的組合物產生的應答，但是隨著時間沒有顯著增強(48小時測試)。這些結果表明可以相對快地發生對牛衍生的轉移因子的無反應性(即，降低的敏感性)。
包括更多蛋衍生的轉移因子的組合物(例如，50∶50和30∶70)提供了類似的短期結果(24小時測試)，但是提供了更好的長期(48小時測試)結果。
這些結果支持組合不同類型的轉移因子提供了協同效應的理論。它們還表明了可以調節組合物中不同類型轉移因子的比例來提供理想的結果。
實施例4表10CI(％)
實施例4比較了以上實施例2和實施例3中所獲得的數據來說明在TF+中包括另外的成分，主要是多糖，提高了引入本發明教導的組合物誘導NK細胞和其它單核血細胞殺滅K-562腫瘤細胞並因此引發二次免疫應答的效率。
值得注意的是，48小時測試中，在其中包括多糖，在所有高於0.0001mg/ml稀釋度下細胞毒性大於相應的缺少多糖的組合物。因此，認為多糖提高了兩種或多種類型的轉移因子的協同作用，或在引發二次免疫應答中提供另外的協同作用。
儘管以上的描述包含許多細節，但是這些不應認為構成對本發明範圍的限制，而僅僅是提供了一些本發明優選實施方案的說明。同樣地，可以設計其它實施方案而不脫離本發明的精神或範圍。可以結合使用不同實施方案的特徵。因此，本發明的範圍只通過附加的權利要求及其法律等價物，而不是通過之前的描述來表明和限定。因此包括對在此公開的落入權利要求的意思和範圍內的本發明的所有添加、刪除和修改。
權利要求
1.啟動患者中T-細胞介導的應答的組合物，包括第一種類型的轉移因子；和另一種，第二種類型的轉移因子。
2.權利要求1的組合物，其中所述的第一種類型的轉移因子包括哺乳動物轉移因子。
3.權利要求2的組合物，其中所述的哺乳動物轉移因子包括初乳衍生的產物。
4.權利要求1-3任一項的組合物，其中所述的第二種類型的轉移因子包括非哺乳動物轉移因子。
5.權利要求4的組合物，其中所述的非哺乳動物轉移因子包括鳥轉移因子。
6.權利要求5的組合物，其中所述的鳥轉移因子包括蛋衍生的產物。
7.權利要求1-6任一項的組合物，其中調節所述的第一種類型的轉移因子與所述的第二種類型的轉移因子的比例以在所治療的動物中提供即時免疫應答。
8.權利要求1-7任一項的組合物，其中調節所述的第一種類型的轉移因子與所述的第二種類型的轉移因子的比例以在所治療的動物中提供延長的免疫應答。
9.權利要求1-8任一項的組合物，其中所述的第一種和第二種類型的轉移因子的總重包括多達約99％重量的所述的第一種類型的轉移因子，和少至約1％重量的所述的第二種類型的轉移因子。
10.權利要求1-8任一項的組合物，其中所述的第一種和第二種類型的轉移因子的總重包括約85％重量的所述的第一種類型的轉移因子，和約15％重量的所述的第二種類型的轉移因子。
11.權利要求1-8任一項的組合物，其中所述的第一種和第二種類型的轉移因子的總重包括約60％重量的所述的第一種類型的轉移因子，和約40％重量的所述的第二種類型的轉移因子。
12.權利要求1-8任一項的組合物，包括按重量計約等量的所述的第一種類型的轉移因子和所述的第二種類型的轉移因子。
13.權利要求1-12任一項的組合物，進一步包括多糖。
14.權利要求1-13任一項的組合物，其中通過第一種類型的來源動物在對所述第一種類型的來源動物所暴露的第一套抗原物質的T-細胞介導的免疫應答中產生所述的第一種類型的轉移因子，和通過第二種類型的來源動物在對所述第二種類型的來源動物所暴露的第二套抗原物質的T-細胞介導的免疫應答中產生所述的第二種類型的轉移因子，所述第一套抗原物質和所述第二套抗原物質包括至少一種非共同的抗原物質。
15.形成根據權利要求1-14任一項的組合物的方法，包括將所述的第一種類型的轉移因子和所述的第二種類型的轉移因子組合。
16.提高或引發患者中T-細胞介導的免疫應答的方法，包括將根據權利要求1-14任一項的組合物給藥於患者。
17.降低用於加工蛋衍生產物的設備的清洗頻率的方法，包括在將蛋衍生產物引入裝膠囊設備之前或期間將初乳衍生產物與蛋衍生產物組合。
18.權利要求17的方法，其中所述的組合包括組合約等重的所述初乳衍生產物和蛋衍生產物。
19.權利要求17的方法，其中所述的組合包括將以重量計，比蛋衍生產物多量的所述初乳衍生產物與蛋衍生產物組合。
20.權利要求17的方法，其中所述的組合包括將以重量計，比蛋衍生產物少量的所述初乳衍生產物與蛋衍生產物組合。
21.權利要求17-20任一項的方法，進一步包括將蛋衍生產物脫脂。
22.權利要求17-21任一項的方法，進一步包括將至少一種多糖與蛋衍生產物和所述初乳衍生產物中的至少一種組合。
23.權利要求17-22任一項的方法，其中所述組合包括將所述初乳衍生產物和蛋衍生產物與所述的包括轉移因子的初乳衍生產物和蛋衍生產物中的至少一種組合。
全文摘要
引發患者中T－細胞介導的免疫應答的組合物包括來自至少兩種不同類型來源動物的轉移因子。例如，該組合物可包括哺乳動物轉移因子和非哺乳動物轉移因子。例如，該組合物包括含有哺乳動物轉移因子的初乳衍生產物和含有非哺乳動物轉移因子的蛋衍生產物的組合。此外，蛋衍生產物基本上無脂肪。還公開了形成組合物的方法和引發已經用組合物治療的患者中T－細胞介導的免疫應答的方法。
文檔編號A61K39/395GK1901925SQ200480030905
公開日2007年1月24日 申請日期2004年9月15日 優先權日2003年9月15日
發明者D·裡森比, W·J·漢南, F·J·道爾蒂 申請人:4Life研究有限公司