一種乙醯膽鹼酯酶的複合固定化方法與流程
2023-11-11 06:35:42
本發明屬於酶固定化領域，具體涉及一種乙醯膽鹼酯酶的複合固定化方法。
背景技術：
乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase，簡稱為ache，ec3.1.1.7)是膽鹼酯酶的一大類，廣泛存在於人、動物、昆蟲等體內，可專一性將乙醯膽鹼水解為膽鹼和乙酸，是一種十分重要的與神經傳導相關的酶。乙醯膽鹼酯酶可被有機磷、氨基甲酸酯類農藥特異性抑制，據此乙醯膽鹼酯酶被廣泛用於農藥檢測、環境檢測等多個領域。
酶的固定化技術(enzymeimmobilization)是指將酶束縛或限制於一定區域內，但仍保留其催化特性並可回收和重複使用的一類技術。與游離酶相比，固定化酶具有高穩定性、易分離、可重複使用等特點，被廣泛應用於工業、農業、醫藥和食品等領域。
目前，乙醯膽鹼酯酶(ache)固定化方法多使用一般酶的常規固定方法，如吸附法和交聯法等。在乙醯膽鹼酯酶(ache)固定化過程中研究多集中於尋找溫和、親和性好的固定化材料和固定方法，而未考慮乙醯膽鹼酯酶(ache)蛋白分子的結構特點與區域性差異，導致乙醯膽鹼酯酶(ache)在固定化的過程中部分酶的結構發生改變，活性大幅下降。這嚴重影響了固定化酶的使用，成為固定化乙醯膽鹼酯酶(ache)實際應用的瓶頸。
乙醯膽鹼酯酶的結構基礎為蛋白質，其胺基酸序列和分子三維晶體結構信息已被完全解析。同時，針對乙醯膽鹼酯酶的區域性結構功能關係的研究已較為完備。研究顯示，乙醯膽鹼酯酶分子上不同區域具有不同的理化性質(如，疏水性、帶電性等)，存在顯著的區域性功能差異。
為了改善現有技術中固定化乙醯膽鹼酯酶(ache)的性能，開發一種分子水平設計的專門針對乙醯膽鹼酯酶區域差異的酶固定化方法具有重要意義。
技術實現要素：
本發明為了解決現有技術中乙醯膽鹼酯酶固定化過程中結構發生改變而導致活性降低的問題，基於分子對接篩選技術，提出一種乙醯膽鹼酯酶的複合固定化方法。具體技術方案如下：
一種乙醯膽鹼酯酶的複合固定化方法，包括如下步驟：
(1)區域打分：構建乙醯膽鹼酯酶的三維結構數據，使用分子對接軟體或模塊將小分子分別與乙醯膽鹼酯酶分子上的區域i、區域ii進行分子對接打分，獲得小分子的區域i打分和區域ii打分；
(2)評估分類：計算步驟(1)中所述小分子總打分，並據此將小分子分類，分為優先類小分子、良好類小分子和淘汰類小分子；
(3)酶固定化：將步驟(2)中所述優先類小分子或良好類小分子與固定化載體表面連接，之後與乙醯膽鹼酯酶孵育，即得到複合固定化乙醯膽鹼酯酶。
進一步地，所述乙醯膽鹼酯酶為人類乙醯膽鹼酯酶，或與其胺基酸序列具有85％以上相似性的具有相似功能的人類乙醯膽鹼酯酶。
進一步地，所述人類乙醯膽鹼酯酶的胺基酸序列如seqidno.1所示。
步驟(1)中所述乙醯膽鹼酯酶的三維結構數據來自公開數據，或通過insightii、modeller軟體進行構建。
步驟(1)中所述小分子為位於固定化載體末端，且能與乙醯膽鹼酯酶分子發生相互作用的分子或官能團，其分子量為50-8000da。
進一步地，所述小分子為不限於如下的種類：抗生素類、農藥類、獸藥類或人藥類。
進一步地，所述小分子具體可以是有機磷類、甾體化合物、四環素類、醯胺類或低分子量聚合物類。
步驟(1)中所述區域i為乙醯膽鹼酯酶分子上由胺基酸val330、val331、lys332、asp333、glu334、gly335、ser336、arg395、glu396、ser399、asp400、gly403、asp404、val408、val429、glu431、trp442、met443、gly444、tyr510、leu524和arg525所構成的區域。
步驟(1)中所述區域ii為乙醯膽鹼酯酶分子上由胺基酸gln71、tyr72、asp74、gly82、thr83、trp86、asn87、pro88、gly120、gly121、gly122、tyr124、ser125、gly126、ala127、leu130、tyr133、gln202、ser203、ala204、ser229、gly230、trp236、trp286、val294、phe295、arg296、phe297、tyr337、phe338、tyr341、val407、trp439、met443、pro446、his447、gly448、tyr449和ile451所構成的區域。
步驟(1)中所述分子對接軟體或模塊為dock、3d-dock、autodock、surflex、glide、gold、flexx、z-dock、ftdock、molegrovirtualdocker或affinity分子模擬軟體、模塊或程序。
步驟(1)中所述分子對接打分為根據分子對接計算所得小分子與乙醯膽鹼酯酶區域位點的結合常數(logka)。
步驟(2)中所述計算小分子總打分的方法為：如果小分子的區域ii打分大於等於零，則該小分子總打分等於其區域i打分減去其區域ii打分；如果小分子的區域ii打分小於零，則該小分子總打分等於其區域i打分。
步驟(2)中所述小分子分類的方法為：如果小分子總打分＞7.0，則此小分子為優先類小分子，在固定化乙醯膽鹼酯酶時優先考慮和選擇；如果4.5≤小分子總打分≤7.0，則此小分子為良好類小分子，在固定化乙醯膽鹼酯酶時可予以考慮和選擇；如果小分子總打分＜4.5，則此小分子為淘汰類小分子，在固定化乙醯膽鹼酯酶時不予考慮和選擇。
步驟(3)中所述固定化載體為聚合物、電極、介孔材料、納米材料、無機材料或複合材料。
步驟(3)中小分子與固定化載體表面連接為直接的、間接的或複合型的化學連接或物理連接。
本發明的有益效果為：
1、本發明突破性地基於酶蛋白分子的三維結構信息，通過分析乙醯膽鹼酯酶分子上不同區域的結構與性質差異，建立小分子篩選多位點評價方法，在分子層面設計固定化載體和固定方式，使酶的構象達到最適，最大限度保留了酶的活性。
2、固定化乙醯膽鹼酯酶的穩定性得到極大提高，並可多次重複使用，其使用範圍更廣。
3、乙醯膽鹼酯酶的固載量增大，可廣泛應用於工業生產。
具體實施方式
以下實施例便於更好地理解本發明，但不限於本發明。
以下實施例選用乙醯膽鹼酯酶(acetylcholineesterase，ache)，使用pdb編號為1f8u的人體乙醯膽鹼酯酶分子三維晶體結構(三維晶體結構來自proteindatabankhttp://www.rcsb.org/pdb)。
基於乙醯膽鹼酯酶蛋白分子的三維結構信息，通過分析乙醯膽鹼酯酶分子上不同區域的結構與性質差異，在分子層面設計固定化載體和固定方式。乙醯膽鹼酯酶的三維結構可以使用insightii、modeller等軟體進行構建，也可以使用已有資料庫中公開的酶蛋白的三維結構數據。
區域i為上述乙醯膽鹼酯酶分子上由胺基酸val330、val331、lys332、asp333、glu334、gly335、ser336、arg395、glu396、ser399、asp400、gly403、asp404、val408、val429、glu431、trp442、met443、gly444、tyr510、leu524和arg525所構成的區域。
區域ii為上述乙醯膽鹼酯酶分子上由胺基酸gln71、tyr72、asp74、gly82、thr83、trp86、asn87、pro88、gly120、gly121、gly122、tyr124、ser125、gly126、ala127、leu130、tyr133、gln202、ser203、ala204、ser229、gly230、trp236、trp286、val294、phe295、arg296、phe297、tyr337、phe338、tyr341、val407、trp439、met443、pro446、his447、gly448、tyr449和ile451所構成的區域。
本發明中小分子是指位於固定化載體末端、能與乙醯膽鹼酯酶分子表面發生相互作用、用於連接酶蛋白與固定化載體的分子或官能團，例如但不限於如下的種類：抗生素類、農藥類、獸藥類、人藥類，具體可以是有機磷類、甾體化合物、四環素類、醯胺類和低分子量聚合物類。
本發明製備的複合固定化乙醯膽鹼酯酶的活性檢測方法為：
反應體系配製(終體積0.2ml)
0.1mol/l，ph＝8.0的磷酸緩衝溶液100μl
0.75mmol/l底物(碘化硫代乙醯膽鹼)50μl
酶源(調整蛋白含量在40～80μg/ml)或等酶量的固定化酶50μl
體系配製完成後在37℃下反應5min，然後加入1.8mldtnb-磷酸鹽-乙醇試劑，在412nm波長下進行比色測定，調透光度到100％的空白管加入顯色劑後再加入與測定管等量的酶液，以消除酶本身對光吸收的影響。
實施例1
乙醯膽鹼酯酶複合固定化方法具體包括如下步驟：
(1)使用suflex-dock分子對接模塊進行區域i和區域ii的小分子篩選。備選小分子來自常用有機小分子庫(zinc資料庫中的purchasable範圍中的小分子化合物資料庫，http://zinc.docking.org/)，共12520個分子。分子對接結果顯示，編號為zinc18060741(cas60-09-3)的分子與乙醯膽鹼酯酶的區域i打分為8.723，區域ii打分為-0.897。
(2)由於其區域ii打分小於零，zinc18060741分子的總打分為8.723，屬於優先類小分子，優先用於乙醯膽鹼酯酶的固定化。
(3)將15ml體積分數20％的對苯二醛乙醇溶液與2g氨基矽膠混合，30℃攪拌反應30min，沙芯漏鬥過濾。將上述矽膠加入30ml乙醇，滴加20ml質量分數5％的zinc18060741乙醇溶液，於40℃攪拌反應60min。抽濾，並用20ml乙醇溶液洗滌3次，20ml水洗滌3次，製得固定化載體。將1g固定化載體分散在30ml0.1mtris-hcl緩衝溶液(ph＝7.4)中，加入1ml30u的乙醯膽鹼酯酶的0.1mtris-hcl溶液，0℃攪拌反應15min，過濾並用0℃20ml0.1mtris-hcl緩衝溶液(ph＝7.4)洗滌3次，即製備得到複合固定化乙醯膽鹼酯酶。
使用乙醯膽鹼酯酶活性測定方法測定複合固定化乙醯膽鹼酯酶的酶活性回收率為79.8％。重複10次使用，酶活性較首次使用的複合固定化酶活性可以保持76.2％以上。-18℃0.1mtris-hcl溶液存放10天，酶活性較第一天使用的複合固定化酶活性可以保持93.0％以上。
實施例2
乙醯膽鹼酯酶複合固定化方法具體包括如下步驟：
(1)使用autodock分子對接模塊進行區域i和區域ii的小分子篩選。備選小分子來自常用有機小分子庫(zinc資料庫中的purchasable範圍中的小分子化合物資料庫，http://zinc.docking.org/)，共12520個分子。分子對接結果顯示，編號為zinc05273799(cas108608-63-5)的分子與乙醯膽鹼酯酶與區域i打分為7.923，區域ii打分為0.897。
(2)由於其區域ii打分大於零，zinc05273799分子的總打分為7.026，屬於優先類小分子，優先用於乙醯膽鹼酯酶的固定化。
(3)將5g石英濾膜加入到3mol/l的鹽酸中，於100℃攪拌反應8h，過濾，120℃乾燥活化12h。活化後的5g石英濾膜，加入100ml無水甲苯，5ml3-氨丙基三乙氧基矽烷，110℃回流24h，過濾，並用20ml甲苯清洗3次。室溫真空乾燥6h，製成氨基石英濾膜。將20ml體積分數20％的對苯二醛乙醇溶液與3g氨基石英濾膜混合，30℃攪拌反應30min，將上述石英濾膜加入30ml乙醇，滴加20ml質量分數5％的zinc05273799乙醇溶液，於40℃攪拌反應90min。抽濾，並用20ml乙醇溶液洗滌3次，20ml水洗滌3次，製得固定化載體。將1g固定化載體放入在30ml0.1mtris-hcl緩衝溶液(ph＝7.4)中，加入1ml25u的乙醯膽鹼酯酶的0.1mtris-hcl溶液，於0℃攪拌反應15min，過濾並用0℃20ml0.1mtris-hcl緩衝溶液(ph＝7.4)洗滌3次，即製備得到複合固定化乙醯膽鹼酯酶。
使用乙醯膽鹼酯酶活性測定方法測定複合固定化乙醯膽鹼酯酶的酶活性回收率為81.7％。重複10次使用，酶活性較首次使用的複合固定化酶活性可以保持78.1％以上。-18℃0.1mtris-hcl溶液存放10天，酶活性較第一天使用的複合固定化酶活性可以保持95.6％以上。
實施例3
乙醯膽鹼酯酶複合固定化方法具體包括如下步驟：
(1)使用suflex-dock分子對接模塊，進行區域i和區域ii的小分子篩選。備選小分子來自常用有機小分子庫(zinc資料庫中的purchasable範圍中的小分子化合物資料庫，http://zinc.docking.org/)，共12520個分子。分子對接結果顯示，編號為zinc04272010(cas538-41-0)的分子與乙醯膽鹼酯酶與區域i打分為7.142，區域ii打分為1.067。
(2)由於其區域ii打分大於零，zinc04272010分子的總打分為6.075，屬於良好類小分子，可用於乙醯膽鹼酯酶的固定化。
(3)使用2g氨基修飾的磁性氧化碳納米顆粒(200-400nm)。將20ml體積分數20％的對苯二醛乙醇溶液與2g氨基修飾的磁性氧化碳納米顆粒(200-400nm)混合，30℃攪拌反應30min，磁分離出固體顆粒，加入30ml乙醇，滴加20ml質量分數5％的zinc04272010乙醇溶液，於40℃攪拌反應90min。磁分離並用20ml乙醇溶液洗滌3次，20ml水洗滌3次，製得固定化載體。將1g固定化載體放入30ml0.1mtris-hcl緩衝溶液(ph＝7.4)中，加入1ml25u的乙醯膽鹼酯酶的0.1mtris-hcl溶液，於0℃攪拌反應15min，過濾並用0℃20ml0.1mtris-hcl緩衝溶液(ph＝7.4)洗滌3次，即製備得到複合固定化乙醯膽鹼酯酶。
使用乙醯膽鹼酯酶活性測定方法測定複合固定化乙醯膽鹼酯酶的酶活性回收率為65.8％。重複10次使用，酶活性較首次使用的複合固定化酶活性可以保持63.2％以上。-18℃0.1mtris-hcl溶液存放10天，酶活性較第一天使用的複合固定化酶活性可以保持90.6％以上。
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中國農業大學
一種乙醯膽鹼酯酶的複合固定化方法
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人類（homosapiens）
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