天然肽及其優化的衍生物作為疫苗的應用的製作方法

2023-11-11 05:33:07 1

專利名稱：：天然肽及其優化的衍生物作為疫苗的應用的製作方法天然肽及其優化的衍生物作為疫苗的應用本發明屬於疫苗領域，更具體地屬於抗腫瘤和抗病毒疫苗領域。本發明涉及天然肽在藥物組合物中的應用，用於選擇和/或增強部分CTL免疫反應，該反應被所述天然肽的優化免疫原肽所激發。癌症免疫治療意於刺激細胞毒T淋巴細胞(CTL)，CTL識別從腫瘤抗原衍生得來並通過HLAI級分子遞呈在腫瘤細胞表面的肽。CTL耙向的肽可以是顯性的或者隱性的(MoudgilandSercarz，1994)。、S性肽具有高HLA親和力並經常被腫瘤細胞遞呈。相對的，隱性肽具有低HLA親和力並很少被腫瘤細胞遞呈。至今測試過的所有癌症疫苗對顯性肽的靶向相對很不成功(Slingluff，Yamshchikovetal.2001;Knutson,Schiffmanetal.2002;Schaed,Klimeketal,2002;Parkhurst，Rileyetal.2004;Vonderheide,Domcheketal.2004)。使用小鼠模型的研究顯小二這種功效的缺乏是源於對腫瘤抗原的耐受，尤其是對其顯性肽的耐受(Cibotti,Kanellopoulosetal.1992;Theobald,Biggsetal.1997;Colella，Bullocketal.2000;Hernandez,Leeetal.2000;Grossmann,Davilaetal.2001;Gross,Graff-Duboisetal.2004)。為迴避這種耐受，最近提出了具有隱性肽的疫苗。觀察到在人源化小鼠中，對隱性肽的耐受很低或者沒有，只要隱性肽的免疫原性得到優化，其就能有效地在體內誘導抗腫瘤免疫(Tourdot,Scardinoetal.2000;Scardino，Grossetal.2002;Gross,Graff-Duboisetal.2004)。在此之前描述了優化幾乎所有測試過的低親和力HLA-A*0201-限制性肽的肽序列修飾(Tourdot,Scardinoetal.2000)。TERT572Y是一個從TERT衍生得到的HLA-A*0201-相關的優化的隱性肽，是在85%人腫瘤中過表達的抗原(Kim,Piatyszeketal.1994)。TERTs72Y在人和鼠TERT中都存在，並能夠誘導HLA-A*0201轉基因小鼠內的抗腫瘤免疫；然而也觀察到了對正常TERT-表達組織無自體免疫(Gross,Graff-Duboisetal.2004)。在體外，TER丁572y剌激健康供體和前列腺癌患者的抗腫瘤CTLs。CTLs殺死表達TERT的腫瘤細胞，而不殺死表達TERT的正常細胞(Hernandez，Garcia-Ponsetal.2002;Scardino,Grossetal.2002)。然而，一個相似的疫苗方法報導了具有優化的gplOO，M的黑色素瘤患者的疫苗導致了T細胞的擴增，這些T細胞不再能識別天然gpl002Q9M肽或者表達gpl0029M的黑色素瘤細胞(Clay,Custeretal.1999)。因此，現在需要能夠激發和維持T細胞對靶亞顯性或隱性表位反應的疫苗方案，尤其是當這種反應被優化的肽所激發的時候。f述實施例1中公開的研究設計用來評估i)TERTs72Y在晚期癌症忠者體內刺激抗腫瘤免疫反應的能力；和ii)誘導抗表達TERT-正常細胞和組織，如造血前體、腸、胸腺和肝臟的自體免疫的風險。具有TERT572Y的晚期癌症患者的疫苗剌激了功能完整並且能夠在體外殺死過表達TERT的腫瘤細胞的特異CTLs。而且，疫苗是安全的，不會誘導抗TERT陽性正常組織的任何自體免疫。這是第一次在人體+證明，優化隱性肽能夠被考慮用於腫瘤免疫治療。而且，這些結果以及實施例2、3和4中的結果顯示，用天然肽的同源的優化肽接種疫苗後，再注射天然肽能夠維持被所述優化肽激發的免疫反應。沒有理論支持，假設在被優化肽趨化的T細胞中，天然肽的使用可以選擇和/或增強那些對由腫瘤細胞遞呈的天然肽具有最高特異性的細胞。這些發現允許提議天然隱性或非優化肽用於提高同源的優化肽引起的CTL免疫反應中的應用。對於一個給定MHC分子，"隱性肽"是能夠結合所述MHC分子的肽，但具有很低親和力和/或對MHC/肽複合物具有很低的穩定性。所以，在能衍生出所述肽的抗原的CTL反應中，這樣的肽在抗原遞呈細胞表面被所述MHC分子遞呈很差，或者根本不遞呈。例如，在HLAA2的例子中，隱性肽可被定義為具有低親和力和弱穩定性的月太(RA〉5以及DC50<2小時)，可參見WO0208716中的描述。"天然肽"(隱性或非隱性)是無任何序列修飾且與抗原的片段反應的肽。對於給定的天然肽，"優化肽"是通過在所述天然肽上取代一個或多個胺基酸得到的肽，所述的修飾導致了對MHC分子更高的親和力和/或MHC/肽複合物更好的穩定性。例如，HLA-A2.1相關肽可以通過在第一位置導入一個酪氨酸(P1Y取代)來修飾其序列從而被優化(Tourdot,Scardinoetal.2000)。鑑定隱性肽和製備同源的優化肽的方法在例如PCTWO02/08716中公開，其內容併入本文作為參考。對於優化HLAA2肽的其他修飾也有描述，例如用甲硫氨酸或亮氨酸取代位置2的胺基酸(Parkhurst,Salgalleretal.1996;Bakker,vanderBurgetal.1997;Valmori,Fonteneauetal.1998)，或用纈氨酸或亮氨酸取代C端胺基酸(Parkhurst,Salgalleretal.1996)。實施這些肽的修飾可以得到優化的肽用於完成本發明。隱性肽不能在體外產生針對靶細胞的特異性CTL反應，其中靶細胞表達衍生該隱性肽的蛋白，相反，同源的優化肽能夠產生對同樣靶細胞的特異CTL反應，其中至少部分CTLs對所述隱性肽具有高親和力。本發明的一個目的是天然肽的應用，用於製備維持其同源的優化肽激發的CTL免疫反應的藥物組合物。根據本發明的優選的實施方本發明在抗腫瘤或抗病毒免疫治療領域特別有用。因此，該天然肽有利地來源於腫瘤抗原或從病毒抗原，尤其是從產生長時間感染的病毒，如HIV、HCV和HBV的抗原。根據本發明，天然肽可以用於先前接受了同源的優化肽的患者的免疫。本發明從而包括免疫接種患者以預防腫瘤或病毒抗原的方法，其中所述的方法包括第一步，使用與所述抗原的天然肽同源的優化肽免疫接種，其中的優化肽特別是隱性肽，第二步，用所述天然肽免疫後面實施例1中給出了使用天然隱性肽TERT572(RLFFYRKSV)和其同源的優化肽TERT572Y(YLFFYRKSV)的抗腫瘤免疫實例。根據本發明的優選實施方案，隱性肽由HLAA2遞呈，和優化肽由酪氨酸殘基取代隱性肽N末端的胺基酸獲得。在PCTWO02/08716和下面表1中描述可用於本發明的HLAA2遞呈的成對隱性肽和優化肽的非限制性實例。本發明可以使用的其他成對天然和同源的優化肽也在表1中列出。表1:本發明可用的HLAA2遞呈的成對天然和優化肽的實例。tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10本發明的另一方面是關於體外獲得對天然肽，尤其是天然隱性肽具有高親和力的CTLs的方法，其通過使用所述的天然肽剌激CTLs，該CTLs遞呈在用同源的優化肽免疫的患者來源的生物樣品上。在這一方法中，天然和優化肽具有如上所述的優點。本發明還涉及用於免疫部分的試劑盒，其包括至少一個劑量的天然肽和至少一個劑量的其同源的優化肽。在優選的實施方案中，免疫試劑盒包括2個或3個劑量的優化肽，和3、4、5或6個劑量的天然肽。本發明的特定試劑盒適用於6次注射的第一次免疫接種次序，並包括2或3個劑量的優化肽，和4或3個劑量的天然肽。在長期疾病中，優選通過定期回復來維持第一次免疫接種得到的免疫力水平。例如，通過每3至6個月注射來完成。因此，互補試劑盒，其包括至少2個劑量和至多40或50個劑量的天然肽，也是本發明的一個部分。另外，免疫試劑盒可包括2至3個劑量的優化肽和3至40或至多50個劑量的天然肽。當然，試劑盒中的所述天然和優化肽均如上所述。每劑量藥劑包括0.5至10mg的肽，優選l至5mg。在優選的實施方案中，每個劑量藥劑製備成用於皮下注射。例如，每劑量藥劑可製成0.3至1.5ml的乳液，液體溶液用Montanide佐劑乳化。熟練的技術人員可選擇任何其他佐劑替換(或添加到)Montanide。在一個特別的實施方案中，藥劑是液體溶液的形式。可選擇地，藥劑是凍幹肽，在注射前即時製備液體溶液。本發明通過下述附圖和實施例進一步說明。圖h在患者#1、#3、#8、#11和#13中體外檢測的TERs72Y-特異性CD8細胞。解凍從患者#1、#8、#11和#13收集的免疫接種前以及在第二(#1、#8、#H)和第六(#i3)疫苗注射後對PBMC用PE標記的TERT572Y四聚體、APC標記的抗CD8和FITC標記的抗CD3染色。分析CD3+門控細胞。圖2:在體外用患者#6和#18來源的PBMC刺激後，檢測的TERs72Y特異的CD8細胞。解凍的患者#6和#18來源的PBMC在缺少(未剌激)或有(刺激)10pMTERT572Y下培養9天。其後按照圖l說明進行細胞染色和分析。圖3:免疫反應時間進程。圖4:免疫誘導的TERT^Y特異的CD8細胞的功能分析。A)第二次疫苗注射3周後從患者#4收集的PBMC在體外用TERT572Y肽剌激9天。純化TERTs72Y特異細胞並用PHA擴增。擴增的細胞用TERT572Y四聚體和CD8mAb染色。B)TERT572Y四聚體陽性細胞用TERT572Y和不相關的FluM58剌激6小時，其後用PE-標記的抗CD107a染色，用皂苷對細胞穿孔，用FITC-標記的抗-IFNY染色以估算細胞內顧y。C)在傳統的51Cr釋放分析中，TERT572Y四聚體陽性細胞和51Cr標記的N418以及TERT572Y轉染的N418細胞一起孵育4小時。顯示E/T率。D)在傳統的51Cr釋放分析中，TERT572Y四聚體陽性細胞和51Cr標記的NA8以及ME290腫瘤細胞一起孵育4小時。顯示E/T率。實施例實施例l:在黑色素瘤的晚期患者體內，優化隱性肽TERTwv的安全性和免疫原性I期臨床研究1.患者和方法患者抗化療惡性腫瘤患者適於本研究。其他合適的標準是沒有其他有益治療選擇的進行性疾病；至少6個月的預期存活期；患者必須是HLA-A*0201陽性；年齡18-75歲，健康狀況(WHO)10g/dl)、腎臟(肌氨酸酐<1.5mg/dl)以及肝臟(膽紅素95%)的確認。在-80'C保存2年多後未觀察到純度或濃度的下降。每種肽製備成凍乾粉用於在無菌水中還原和稀釋。頓船中夫腿患者接受每3周一次、總共6次的皮下免疫接種。0.5ml液體溶液中的肽在注射前立即用0.5mlMontanideISA51乳化。使用優化TERT572Y肽作為最早的2次免疫接種，天然TERT572Y肽用作剩餘的4次免疫接種。研究了5種劑量水平的肽；劑量水平包括2、3、4、5和6mg的兩種肽。每個劑量水平有3個患者參與。另有3個患者計劃用於觀察當劑量限制時的劑量水平。每個患者在所有6次免疫接種中接受等量的肽劑量。在免疫接種期間不準進行其他可能抗癌活性的治療，即化療、放療、激素治療或皮質甾類給藥。患者評估在進入研究前，對所有患者評估完整的醫療記錄、生理測試以及用不同的、血清化學和基線測定相關腫瘤標籤對完整的血細胞計數。而且，通過標準成像方法(胸部X射線、超聲波、胸腔和腹腔CT掃描、如果指定則進行核磁共振成像(MRI)以及全身骨掃描)確定可檢測的疾病。免疫接種規程期間的毒性通過每周重複全血計數和每三周在下--次注射前以及其後每月進行的醫療記錄、生理檢査和血清化學來進行評估。使用國家癌症研究所(NCI)通用毒性標準(Ajani，Welchetal.1990)評估和打分。在整個免疫接種規程期間，評估劑量限制毒性(DLT)，並將其確定為以下狀態中的一種4級血液毒性；3-4級嗜中性白血球減少症並發熱〉38.2'C;3-4級非血液毒性；以及因為毒性的任何治療延遲。如果只掃50%接受治療的患者在某一水平出現了DLT，則停止劑量增加，並達到了DLT劑量水平。MTD劑量水平定義為低於DLT劑量水平的第一個水平。對治療的反應通過每兩次免疫接種後或如果有臨床症狀則提前，重複基線成像研究或相關腫瘤標籤測定來評估。對治療的反應使用標準的WHO標準(Miller,Hoogstratenetal，1981)記做完全反應(CR)、部分反應(PR)、穩定疾病(SD)和進行性疾病(PD)。通過獨立放射醫生小組進行確認放射性反應。CR和PR維持最少4周。反應的時段從第一次對疾病發展的反應記錄開始計算。進展時間(TTP)通過治療開始到客觀記錄疾病發展的第一時間之間的間隔來確定。總生存期(OS)從進入研究的日期到死亡日期來計算。隨訪時間從第一次實施治療到最後一次聯繫或死亡來計算。免疫反應在第-一次注射前、第二、四和六次注射後測試。外周血單核細胞(PBMC)在每個時間點收集並凍存。細胞系T2是突變的人T/B雜交細胞，其缺少TAP分子但表達HLA-A*0201。HLA-A*0201陽性N418纖維原細胞，TERT轉染N418細胞和黑色素瘤細胞系Na8和Me290由P.Romero(LudwigInstituteforCancerResearch,Lausanne,Switzerland)提供。肽用於實驗室研究的I級限制性肽包括TERT572(RLFFYRKSV，SEQIDNo:1)、TERT572Y(YLFFYRKSV，SEQIDNo:2)禾口FluM58(GILGFVFTL，SEQIDNo11)，都由Epytop(Nimes，France)生產。PBMC體外刺激解凍的PBMC(200^1內3xl5個細胞/孔)在含10pMTERT572Y肽的完全培養基(含8%人AB血清的RPMI1640)內在96孔圓底板上培養。48小時和96小時後添加IL2至終濃度10U/ml。細胞在37°C5%C02空氣中培養。在培養的第9天，匯集6個孔的細胞通過TERT572Y四聚體染色分析存在的TERT^y特異性CD8細胞。TERTs72y四聚體染色用PE偶聯的TERT572Y四聚體(PromimuneLtd,Oxford,UK)在室溫下孵育細胞30分鐘，其後用APC偶聯的抗CD8(BDPharmingen,Mississauga,Canada)禾卩FITC偶聯的抗-CD3(BDPharmingen,Mississauga,Canada)mAbs在4。C孵育30分鐘。染色的細胞用流式細胞儀(FACSCalibur，BDBiosciences,MountainView,CA)分析。TERTmv—四聚體-陽性細胞的多克隆擴展用lOpMTERTs72y在10U/mlIL2存在下刺激PBMCs9天。在用細胞分類器分離細胞前，使用抗CD8mAb和TERT572Y四聚體標記細胞。分類的細胞用PHA(Difco)刺激14天。Cdl07和細胞內IFNY雙標記用肽UOpM)負載的T2細胞在20嗎/mlBrefeldinA(Sigma，Oakville,Canada)存在下刺激T細胞。6小時後，洗滌這些細胞，在PBS裡4°C下用PE偶聯的抗CD107mAb(BDPharmingen,Mississauga,Canada)染色25分鐘，再次洗滌並用4%多聚甲醛固定。細胞用PBS/0.2%Saponin/0.5%BSA(Sigma)穿孔並用APC偶聯的抗IFNmAb(BDPharmingen,MississaugaCanada)染色，再進行流式細胞儀分析(FACSCalibur，BDBiosciences,MountainView,CA)。繼帛她靶細胞用100nCi的51Cr標記卯分鐘，洗滌2次，塗布在96孔圓底板(添加5%胎牛血清的lOOul的RPMI1640中3xlS個細胞/孔)。每孔添加效應子細胞(lOOjiDn4小時後，收集100pl上清，用蓋格計數器測量放射性。特異裂解的百分比按下述確定裂解=(實驗釋放-即時釋放)/(最大釋放-即時釋放)x100。1.2結果患者特徵、免疫接種和臨床反應19名患者在試驗中的特徵顯示在表2中。除了一名患者(#11患者)外，所有的患者都患有IV期癌症，其主要在骨骼、肝臟和肺上具有多種轉移。患者都具有活性的進行性疾病，並在進入免疫接種規程之前接受了多種治療，主要是化療。3名患者參與試劑水平為2、3、4和5mg的肽，而7名患者接受了6mg的肽。5名患者在第四(#1、#5、#14和#19)或第五(#18)次疫苗注射後退出了規程，原因是快速的疾病發展。這5名患者隨後在6個月內都死於疾病發展。剩餘的14名患者完成了免疫接種規程。疾病在4名(29%)患者(#9、#11、#12和#13)中穩定下來，在10名患者中繼續發展。後面的10名患者其後接受了化療，之中的6名仍然健在。4名患者中的1名(#11)病情穩定9個月後繼續發展，而其他3名患者在免疫接種結束後沒有附加治療的情況下，仍然病情穩定(#9和#12患者穩定到12個月後，#13患者穩定到9個月後)。表2:患者特徵NSCLC-非小細胞肺癌、S-手術、CT-化療、HT-激素質粒、RT-放療、汀=免疫治療(IL2、INFa)、PS,康狀況、P》進行性疾病、S》穩定疾病tableseeoriginaldocumentpage16總體來說，在10.7個月(範圍在4.4至27.6)的中值回訪後，9名患者死亡，全部歸咎於疾病發展。腫瘤發展的中值時間是4.2個月(範圍在2.3至11.2)，中值總體存活15.2個月(範圍在4.4至27.6)。毒性和有害事件在整個研究期間未觀察到DLT，因此未達到MTD劑量水平(表3)。13名患者發展到I級毒性。其組成為局部皮膚反應(11名患者)、貧血(6名患者)、血小板減少(2名患者)、疲勞(l名患者)和厭食(1名患者)。除了局部皮膚反應，其他毒性似乎大多與疾病而不是免疫接種相關。I級毒性發生在免疫接種過程的早期。3名患者發展到II級毒性，其組成為疲勞(3名患者)、噁心(2名患者)和厭食(2名患者)。#5患者(NSCLC)在第三次免疫接種後出現疲勞和噁心，在沒有任何特殊治療情況下2周後消失。#10患者(結直腸癌)在第三次免疫接種後觀察到的疲勞、噁心和厭食感覺是因為疾病而不是免疫接種。該患者發展出致命的腸內阻塞。#18患者的疾病極快速的發展，因而在第四次免疫接種後退出了規程。她在兩月後死亡。特別的是，儘管TERT在這些正常細胞和組織中表達，但未觀察到明顯的血液、腎臟、胃腸或肝臟的毒性。對患者的毒性監測時間為中值10.7個月(範圍在4.4至27.6)。即使在完成或停止免疫接種程序後，對患者進行每月回訪，以發現任何延遲毒性的發生。然而，未觀察到延遲毒性的徵兆或發現。表3:毒性tableseeoriginaldocumentpage17免疫反應在間接體內和用TERTs72Y肽體外刺激9天後，通過TERT572Y四聚體、抗CD8和抗CD3mAbs三倍染色PBMCs來檢測外周血中的肽特異CD8+細胞。在初步的研究中，TERT572Y四聚體在7個HLA-A*0201健康供體(平均0.035士0.035，範圍在0.0-0.11°/。)中標記少於0.11。/。的CD8細胞(數據未顯示)。因此將特異性免疫的陽性終止點設定在0.14%(平均值+3SD)，在14個免疫接種的患者中研究了免疫反應(表4)。只有一名患者(#2)沒有對疫苗產生反應。在4名(29%)患者(圖1)中間接體內檢測到TERT572Y特異細胞。在#1、#8和#11患者中，第二次免疫接種後出現特異免疫力，#13患者在第六次免疫接種後出現。值得注意的是，在免疫接種前，TERTs72y四聚體在體外PBMC刺激後在弁1、#8和#11患者內標記了0.29%、0.33%和1.00%的CD8+細胞(表4)。在體外刺激後，9名患者(64%)中檢測到TERT572Y特異細胞，第二次(#3、#4、#5、#6、#12、#15、和#19)或第四次(#7和#18)注射的3周後分別在患者中檢測到TER丁572y特異細胞。代表性的結果(#6和#18患者)顯示在圖2中。在免疫接種規程結束後的3和14個月，分別對#13和#11患者檢測了免疫反應。在兩個患者中，他們用PBMC體外刺激後檢測到大於1.5%的四聚體陽性CD8細胞。表4:免疫接種患者的外周血單核細胞中，TERTs72Y四聚體陽性CD8細胞的百分比。％大於背景的以粗體表示。tableseeoriginaldocumentpage18為檢測TERTs72Y特異性CD8+細胞的功能，對來源於#4患者的體外PBMCs刺激的TERT572Y四聚體陽性細胞(圖4A)分類，用PHA擴展，測試他們對TERT572Y肽特異反應以及殺死TERT-過表達腫瘤細胞的能力。90。/。以上的擴增細胞用TERT572Y四聚體標記(圖4A)。由於純化的TERT572Y特異細胞產生IFNY並對TERT572Y肽活化表現出CD107a上調，所以他們是全功能的(圖4B)。CTL識別內源的TERT並特異殺死TERT轉染但不殺死非轉染的N418纖維原細胞(圖4C)。重要的是，CTLs殺死過表達TERT的腫瘤細胞(Na8細胞)但不殺死低水平表達的TERT的腫瘤細胞(ME290細胞)(圖4D)。1.3討論本臨床試驗的目標是評估毒性譜並證明來源於普通腫瘤抗原的隱性肽能在癌症患者體內誘導免疫力，從而可視作腫瘤免疫治療的觀點。發明人使用了隱性肽TERT572Y，其由HLA-A*0201遞呈並衍生於TERT，TERT是被85。/。腫瘤表達的普通腫瘤抗原。通過用酪氨酸取代第一胺基酸增強了免疫原性(Tourdot，Scardinoetal，2000)。這些結果說明TERT572Y免疫晚期癌症的患者刺激了特異CTLs，而特異CTLs是全功能的，能夠在體外殺死TERT過表達腫瘤細胞。免疫具有很好的耐受性，並未表現出誘導對TERT表達正常組織的自體免疫。這些結果提供了第一次人體內確證優化的隱性肽是腫瘤免疫治療的優秀候選。腫瘤抗原是非突變自體蛋白，也被正常組織，包括胸腺表達，並參與耐受誘導。耐受是阻礙有效抗腫瘤T細胞反應的主要障礙，具有高親和力的主要CTL通過該耐受過程將T細胞譜型清除。然而，耐受主要塑造對顯性而不是隱性肽特異的T細胞譜型(Cibotti，Kanellopoulosetal.1992;MoudgilandSercarz1994)。使用人源化小鼠模型，最近發現具有兩個來源於鼠TERT(TERTs72y和TERT988y)的隱性肽的免疫招募了能夠引發有效抗腫瘤免疫力的高親和力CTLs(Gross，Graff-Duboisetal.2004)。在本臨床研究中，90%以上的免疫患者發育出能夠殺死過表達TERT的腫瘤細胞的特異性T細胞。相對的，只有用Monatanide乳化的顯性肽TERT540處理的患者的50%對疫苗產生反應(Parkhurst,Rileyetal.2004)。然而，最早描述的顯性TERT540的天然過程(Vonderheide，Hahnetal.1999;Minev，扭ppetal.2000;Vonderheide,Domcheketal.2004)沒有被最近的研究(Ayyoub，Migliaccioetal.2001;Parkhurst，Rileyetal.2004)確認，這提示TERT540可能不屬於自體免疫。考慮到關於顯性TERT54o肽遞呈的含糊，其與隱性肽的直接隨機比較能產生難於解釋的結果。本研究中，患者的疫苗反應率比至今報導的大約50個臨床腫瘤免疫接種研究中得到的反應率要高(Pullarkat，Leeetal.2003;Slingluff,Petronieta1.2003)。值得注意到是，幾乎所有的在先臨床研究表明高免疫反應率包括了具有最小限度疾病和優秀健康狀況的患者(Disis，Gooleyetal.2002;Pullarkat,Leeetal.2003;Disis，Schiffinanetal.2004;Vonderheide,Domcheketal.2004)。Scheibenbogenetal(Scheibenbogen,Leeetal.1997)證明了黑色素瘤患者的免疫反應與疾病減輕相關。相對的是，在本研究中，所有的患者都是晚期疾病。在免疫反應的數量和肽施用劑量之間未發現相關性。這與HER/neu疫苗的免疫反應不依賴於疫苗劑量的最新數據相一致(Disis，Schiffinanetal.2004)。在疫苗劑量和出現可檢測反應的時間間隔之間未發現相關性。所有13位反應的患者在第二和第四次疫苗注射之間都具有可檢測到的特異CTLs。免疫力的快速誘導在該組中，尤其具有快速進行性惡性腫瘤的患者中是重要的。使用天然TERT572肽進行第三到第六次疫苗注射的原理是在被優化TERT572Y招募的T細胞中選擇，這些T細胞對腫瘤細胞遞呈的TERTs72具有高特異性。實際上，Clay等(Clay，CusteretaL1999)證明了對黑色素瘤患者免疫接種優化的gpl002Q9M，擴增的T細胞不再能識別天然gpl002Q9或表達gpl00的黑色素瘤細胞。上述結果說明注射天然肽能夠維持優化肽激發的免疫反應。而且，在免疫接種後，免疫反應可以持續多於1年說明遞呈在腫瘤細胞表面的天然肽能自己維持特異的免疫反應。體內抗腫瘤免疫的特點是自體免疫。當自體免疫不靶向關鍵的正常細胞和組織，如黑素細胞時，其是可接受的，但當它靶向重要的細胞，如造血細胞前體時，可能阻礙疫苗發展。儘管TERT被造血幹細胞、腸、胸腺和活化的B及T細胞所表達200680016011.2說明書第17/28頁(Ramakrishnan，Eppenbergeretal.1998;Liu，Schoonmakeretal.1999)，但即使在免疫接種後24小時也沒有患者表現出自體免疫的徵兆。這進一步證實了之前用TERT572Y肽，其也是鼠TERT的部分，免疫接種的HLA-A*0201轉基因HHD小鼠中得到的結果(Gross,Graff-Duboisetal.2004)。免疫接種的HHD小鼠發育出抗腫瘤活性，而沒有自體免疫徵兆。而且，TERT572Y特異CTLs殺死腫瘤細胞，而不殺死活化的B細胞。一個可能的解釋是在正常細胞(與腫瘤細胞相對)上的TERT表達不足以遞呈低親和力肽，如TERTs72。在本發明中觀察到的毒性實質上很小，而且除了Montanide佐劑引起的瞬時皮膚反應外，所有其他溫和的毒性都可歸因於所發生的疾病。考慮到本次試驗中參與患者數量小以及因為晚期疾病造成的相對短的回訪，可以認為該免疫接種過程沒有主要的急性和短期毒性。然而，應該在具有更好預後、更可能治癒其惡性疾病的患者中評估長期毒性。因為倫理的原因，本研究包括了晚期癌症患者，他們不是腫瘤免疫治療最佳的候選患者。通常認為免疫治療最好針對具有最小殘存疾病的患者施用，目標是阻止復發而不是治療晚期癌症。疫苗對根除活躍生長的腫瘤無效已經在先在動物模型中證明了(CheeverandChen1997)。儘管在高度預治療患者組中未觀察到腫瘤收縮導致的臨床抗腫瘤活性，但4名患者表現出穩定在I期的長期疾病。這些患者具有在先的進行性疾病並發展出TERT特異性的CTL，該CTL即使在免疫接種程序完成後幾個月都不能在他們的血液中檢測到。有趣的是2名患腎癌的患者(#9和#13)在過去成功地使用IL2和IFNa治療，證實了該癌症對免疫治療敏感。相對的，11名換腎癌的患者用線性TERTs4o肽免疫接種，即使當他們發育出肽-特異的免疫反應，其中也無人有客觀的臨床反應(Parkhurst,Rileyetal.2004)。總結，本研究證明了用優化的隱性TERTs72Y肽免疫接種晚期癌症患者是安全的，並且能夠在90%以上的患者中誘導出抗腫瘤免疫力。這是第一次臨床證實隱性肽是癌症免疫治療的有希望的候選。實施例2:對天然曈性肽具有富親和力的CTLs的佑外逸賽和擴孀2.1材料和方法胜肽TERT娜y(YLQVNSLQTV，SEQIDNo:4)、TERT鄉(DLQVNSLQTV,SEQIDNo:3)、MAGE-A248V9(YLEYRQVPV，SEQIDNo:6)和MAGE國A腦(YLEYRQVPD，SEQIDNo:5)由Epytop(Nimes，France)生產。動物和細胞HLA-A*0201轉基因HHD小鼠和鼠RMAS/HHD腫瘤細胞如上所述(Pascolo，Bervasetal.1997)。HHD小鼠中製備CTLHHD小鼠皮下注射壬烷肽，該肽用含150嗎的I-Ab限制HBVcore128輔助性T表位的不完全弗氏佐劑(IFA)乳化。將免疫的HHD小鼠來源的脾細胞(10ml中含5xl07cells)在體外用含在RPMI1640+10n/。FCS中的肽(l(HiM)刺激5天。通過每周在體外，在有肽和50U/mlIL-2(Proleukin，ChironCorp.,Emeryville,CA)存在下用照射的脾細胞重複刺激確立CTL系。毒性分析鼠RMAS/HHD細胞用作上述毒性的耙(Tourdot，Scardinoetal.2000)。簡單說，2.5xls的"Cr標記的耙用升高劑量(0.00001-lOpM)的肽在37-C衝擊60分鐘。再添加lOOpl的效應子細胞，在37'C孵育4小時。孵育後，收集100pl上清用蓋格計數器測量放射性。特異裂解按下述確定裂解=(實驗釋放-即時釋放)/(最大釋放-即時釋放)。CTL親和力定義為最大裂解一半時的肽濃度。因此測量的親和力(nM)越低，CTLs的親和力越高。體內腫瘤保護分析HHD小鼠用含150嗎的I-Ab限制HBVcore128表位的IFA乳化的10(Hig肽免疫接種一次，兩周後再次免疫接種。第二次免疫接種後一周，用2xl(^EL4/HHD細胞皮下激發。每兩天記錄存活狀況。2.2結果通過TERT抗原的隱性表位獲得的結果HHD小鼠用優化的隱性TERT988Y肽免疫。11天後，收集免疫接種小鼠的脾細胞，用含50IU/mlIL2的10pMTERT988Y或IOmM天然隱性TERT988肽連續刺激。每周重複刺激。第一、第三和第六次體外刺激時，用傳統的51Cr釋放細胞毒分析測試CTL系對天然TERT988肽的親和力(表5)。表5:CTL系對天然TERT卿肽的親和力，CTL系是用TERT988Ytableseeoriginaldocumentpage23通過MAGE抗原的隱性表位獲得的結果用相應於隱性MAGE-A248D9的優化MAGE-A248V9肽(都在WO03083L24中有描述)免疫HHD小鼠。11天後，收集免疫接種小鼠的脾細胞，用含50IU/mlIL2的lOpMMAGE-A2柳9或IO^iM天然隱性MAGE-A248D9肽連續剌激。每周重複刺激。第一、第三和第六次體外刺激時，用傳統的51Cr釋放細胞毒分析測試CTL系對天然MAGE-A248D9肽的親和力(表6)。表6:用MAGE-a248v9或MAGE-a248d9肽體外刺激MAGE-A248V9初次接觸的脾細胞建立的CTL系的親和力tableseeoriginaldocumentpage232.3結論用優化隱性肽的免疫接種招募了CTL譜型，該譜型包含對天然隱性肽具有高親和力的細胞。這些高親和力CTL能在體外通過天然肽而不是優化的隱性肽的刺激而選擇和擴增。實施例3:對天然瞳性肽具有富親和力的CTLs體外選賽和擴遒3.1材料和方法使用與實施例2相同的材料和方法。3.2結果HHD小鼠用上述優化的隱性TERT572Y肽免疫接種。15天後，這些小鼠用同樣的優化或天然隱性TERTs72肽增強。增強後7天，這些小鼠的脾細胞用IOmMTERTs72刺激。測試體外刺激一個周期後產生的CTL對TERTs72的親和力。表7顯示了從6個單獨小鼠中得到的結果。表7:HHD小鼠產生的CTL的親和力，小鼠首先用優化的隱性TERT^y肽引發，再用同樣的優化或天然TERTs72肽來增強。tableseeoriginaldocumentpage243.3結論體內與優化的隱性肽接觸招募了包含對天然肽有高親和力的CTL的譜型。這些高親和力的CTLs能在體內通過用天然而不是優化肽的增強來選擇和擴增。實施例4:HHD小&的腫痛免疫力4.1材料和方法使用與實施例2相同的材料和方法。另外使用了一個名為gpl00l54的肽KTWGQYWQV(犯QIDNO:8)04.2結果HHD小鼠用上述優化的隱性TERT572Y和TERT988Y肽免疫接種。15天後，這些小鼠用同樣的優化或相應的天然隱性肽增強。增強後10天，小鼠用EL4/HHD腫瘤細胞激發並監測腫瘤的生長和存活。使用gpl00,54初次接觸和增強的小鼠用作陰性對照(表8)。100%的對照小鼠在激發後43天死亡。17%用優化肽初次接觸和增強的小鼠和50%用天然肽初次接觸和增強的小鼠明顯受到針對腫瘤的保護。表8:用優化肽初次接觸以及用同樣的優化或相應的天然肽增強的HHD小鼠的存活。tableseeoriginaldocumentpage25用優化肽初次接觸以及用天然肽增強的小鼠的腫瘤免疫力比用同樣優化肽初次接觸和增強的小鼠更加有效。參考文獻Ajani，J.A"S.R.Welch,etal.(1990)."Comprehensivecriteriaforassessingtherapy-inducedtoxicity."CancerInvest8(2):147-59.Ayyoub，M.，M.Migliaccio,etal.(2001)."LackoftumorrecognitionbyhTERTp印tide540-548-specificCD8(+)Tcellsfrommelanomapatientsrevealsinefficientantigenprocessing."EurJImmunol31(9):2642-51.Bakker，A.B.，S.H.vanderBurg,etal.(1997)."AnaloguesofCTLepitopeswithimprovedMHCclass-Ibindingcapacityelicitanti-melanomaCTLrecognizingthewild-typeepitope."IntJCancer70(3):302-9.Cheever，M.A.andW.Chen(1997)."TherapywithculturedTcells:principlesrevisited."ImmunolRev157:177-94.Cibotti，R.，J.M.Kanellopoulos,etal.(1992)."Tolerancetoaself-proteininvolvesitsimmunodominantbutdoesnotinvolveitssubdominantdeterminants."ProcNatlAcadSciUSA89(1):416-20.Clay,T.M.，M.C.Custer,etal.(1999)."Changesinthefinespecificityofgpl00(209-217)-reactiveTcellsinpatientsfollowingvaccinationwithapeptidemodifiedatanHLA-A2.1anchorresidue."JImmunol162m:1749-55.Colella，T.A.，T.N.Bullock^etal.(2000)."Self-tolerancetothemurinehomologueofatyrosinase-derivedmelanomaantigen:implicationsfortumorimmunotherapy."JExpMed191(7):1221-32.Disis，M.L"T.A.Gooley,etal.(2002)."GenerationofT-cellimmunitytotheHER-2/neuproteinafteractiveimmunizationwithHER-2/neupeptide-basedvaccines."JClinOncol20(11):2624-32.Disis，M.L.,K.Schiffin肌，etal.(2004)."Effectofdoseonimmuneresponseinpatientsvaccinatedwithanher-2/neuintracellulardomainprotein—basedvaccine."JClinOncol22(10):1916-25.Gross,D.A"S.Graff畫Dubois，etal.(2004)."Highvaccinationefficiencyoflow-affinityepitopesinantitumorimmunotherapy."JClinInvest113(3):425-33.Grossmann,M.E.，E.Davila，etal.(2001)."AvoidingToleranceAgainstProstaticAntigensWithSubdominantPeptideEpitopes."IImm咖ther24(3):237-241.Hernandez,J.,F.Garcia-Pons，etal.(2002)."IdentificationofahumantelomerasereversetranscriptasepeptideoflowaffinityforHLAA2.1thatinducescytotoxicTlymphocytesandmediateslysisoftumorcells."ProcNatlAcadSciUSA99(19):12275-80.Hernandez,J.，P.P.Lee，etal.(2000)."TheuseofHLAA2.1/p53peptidetetramerstovisualizetheimpactofselftoleranceontheTCRrepertoire."JImmunol164(2):596-602.Kim，N.W"M.A.Piatyszeketal.(1994)."Specificassociationofhumantelomeraseactivitywithimmortalcellsandcancer."266(5193):2011-5.Knutson，K.L.，K.Schiffinan,etal.(2002)."ImmunizationofcancerpatientswithaHER-2/neu，HLA-A2peptide,p369畫377，resultsinshort-livedpeptide-specificimmunity."ClinCancerRes8(5):1014-8.Liu，K"M.M.Schoonmaker,etal.(1999)."Constitutiveandregulatedexpressionoftelomerasereversetranscriptase(hTERT)inhumanlymphocytes."ProcNatlAcadSciUSA96(9):5147-52.Miller,A.B.，B.Hoogstraten,etal.(1981)."Reportingresultsofcancertreatment."^^;47(1):207-14.Minev，B.,J.Hipp,etal.(2000)."CytotoxicTcellimmunityagainsttelomerasereversetranscriptaseinhumans."ProcNatlAcadSciUSA97(9):4796-801.Moudgil，K.D.andE.E.Sercarz(1994)."Canantitumorimmuneresponsesdiscriminatebetweenselfand加nself"ImmunolToday15(8):353-5.Parkhurst,M.R"J.P.Riley,etal.(2004)."ImmunizationofpatientswiththehTERT:540畫548peptideinducespeptide-reactiveTlymphocytesthatdonotrecognizetumorsendogenouslyexpressingtelomerase."ClinCancerRes10(14):4688-98.Parkhurst,M.R.,M.L.Salgaller,etal.(1996)."Improvedinductionofmelanoma-reactiveCTLwithpeptidesfromthemelanomaantigengplOOmodifiedatHLA-A*0201-bindingresidues."JImmunol157(6):2539-48.Pascolo，S.，N.Bervas,etal.(1997)."HLA-A2.1-restrictededucationandcytolyticactivityofCD8(+)Tlymphocytesfrombeta2microglobulin(beta2m)HLA-A2.1monochaintransgenicH-2Dbbeta2mdoubleknockoutmice."JExpMed185(12):2043-51.Pullarkat，V"P.RLee，etal.(2003)."AphaseItrialofSD-9427(progenipoietin)withamultipeptidevaccineforresectedmetastaticmelanoma."ClinCancerRes9(4):1301-12.Ramakrishnan,S.，U.Eppenbeiger，etal.(1998)."Ejqwessionprofileoftheputativecatalyticsubunitofthetelomerasegene."CancerRes58"):622-5.Scardino,A.,D.A.Gross,etal.(2002)."HER-2ZneuandhTERTcrypticepitopesasnoveltargetsforbroadspectrumtumorimmunotherapy."JImmunol168(11):5900-6.Schaed，S.GL，V.M.Klimeketal.(2002)."T國cellresponsesagainsttyrosinase368畫376(370D)peptideinHLA*A0201+melanomapatients:randomizedtrialcomparingincompleteFreund'sadjuvant,granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor,andQS-21asimmunologicaladjuvants."ClinCancerRes8(5):967-72.Scheibenbogen,C.，K.H.Lee，etal.(1997)."AnalysisoftheTcellresponsetotumorandviralpeptideantigensbyanIFNgamma曙ELISPOTassay."IntJCancer71(6):932-6.Slingluff,C.L.,Jr.,GR.Petroni，etal.(2003)."ClinicalandimmunologicresultsofarandomizedphaseIItrialofvaccinationusingfourmelanomapeptideseitheradministeredingranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorinadjuvantorpulsedondendriticcells."JClinOncol21(21):4016-26.Slingluff,C.L.,Jr.,GlYamshchikov,etal.(2001)."PhaseItrialofamelanomavaccinewithgp100(280-288)peptideandtetanushelperpeptideinadjuvant:immunologicandclinicaloutcomes."ClinCancerRes7(10):3012-24.Theobald,M.,J.Biggs,etal.(1997)."Tolerancetop53byA2.1-restrictedcytotoxicTlymphocytes."JExpMed185(5):833-41.Tourdot，S.，A.Scardino,etal.(2000)."Ageneralstrategytoenhanceimmunogenicityoflow-affinityHLA-A2.1-associatedpeptides:implicationintheidentificationofcryptictumorepitopes."EurJImmunol30"2):3411-21.Valmori，D.，J.F.Fonteneau,etal.(1998)."Enhancedgenerationofspecifictumor-reactiveCTLinvitrobyselectedMelan誦A/MART畫limmunodominantpeptideanalogues."IImmunol160(4):1750-8.Vonderheide,R.H.,S.M.Domchek，etal.(2004)."VaccinationofcancerpatientsagainsttelomeraseinducesfunctionalantitumorCD8+Tlymphocytes."ClinCancerRes10(3):828-39.Vonderheide,R.H.,W.C.Hahn，etal.(1999)."Thetelomerasecatalyticsubunitisawidelyexpressedtumor-associatedantigenrecognizedbycytotoxicTlymphocytes."Immunity10(6):673-9.權利要求1.天然肽在製備維持CTL免疫應答的藥物組合物中的應用，其中CTL免疫應答由該天然肽的同源的優化肽激發。2.根據權利要求1的應用，其中所述的所述天然肽來自腫瘤抗原或來自病毒抗原。3.根據權利要求1或2的應用，其中所述天然肽是隱性肽。4.根據權利要求1-3任意一項的應用，其中所述天然肽和優化肽由HLAA2遞呈，優化肽是通過用酪氨酸殘基取代所述天然肽的N末端胺基酸獲得。5.根據權利要l-4任意一項的應用，其中天然肽和其同源的優化肽選自以下成對的肽[TERT572(SEQIDNo:1),TERT572Y1(SEQIDNo:2)];[TERT，(SEQIDNo:3),TERT誦(SEQIDNo:4)];[MAGE-A腦(SEQIDNo:5),MAGE-A扁(SEQIDNo:6)];[MAGE-A248G9(SEQIDNo:7),MAGE-A248V9(SEQIDNo:6)];[Gpl00l54(SEQIDNo:8),Gpl00154Y1(SEQIDNo:9)];[Gpl00154(SEQIDNo:8),Gpl00154M155(SEQIDNo:10)];[FluM58(SEQIDNo:11),FluM58Y1(SEQIDNo:12)];[HIVgag76(SEQIDNo:13),HIVgag76Y1(SEQIDNo:14)];[HBVpol575(SEQIDNo:15),HBVpol575Y1(SEQIDNo:16)];[HBVpol765(SEQIDNo:17),HBVpol765Y1(SEQIDNo:18)];[Mart-127(SEQIDNo:19),Mart-127Y1(SEQIDNo:20)];[Mart-126(SEQIDNo:21),Mart-126L27(SEQIDNo:22)];[Gpl00177(SEQIDNo:23),Gp畫訓(SEQIDNo:24)];[Gpl00178(SEQIDNo:25)，Gpl00178YI(SEQIDNo:26)];[Gpl00570(SEQIDNo:27),Gpl00訓(SEQIDNo:28)];[GplOO，(SEQIDNo:29),Gp畫誦(SEQIDNo:30)];[Gpl00209(SEQIDNo:29),Gpl002。9M21。(SEQIDNo:31)];[Gpl00476(SEQIDNo:32),Gpl00476Y1(SEQIDNo:33)];[Gpl00457(SEQIDNo:34)，Gpl00457Y1(SEQIDNo:35)];[HER-2/neu799(SEQIDNo:36)，HER-2/neu799Y1(SEQIDNo:37)];[HER-2/neu369(SEQIDNo:38),HER-2/neu369Y1(SEQIDNo:39)];[HER-2/neu789(SEQIDNo:40),HER-2/neu789YI(SEQIDNo:41)];[HER-2/neu48(SEQIDNo:42),HER-2/廳額(SEQIDNo:43)][HER-2/neu773(SEQIDNo:44)，HER-2/neu773Y1(SEQIDNo:45)][HER-2/neu5(SEQIDNo:46),HER-2/neu5Y1(SEQIDNo:47)][HER-2/neu851(SEQIDNo:48),HER-2/neu85m(SEQIDNo:49)][HER-2/neu661(SEQIDNo:50)，HER-2/neu661Y1(SEQIDNo:51)][HER-2/neu650(SEQIDNo:52),HER-2/neu650Y(SEQIDNo:53)][HER-2/neu466(SEQIDNo:54),HER國2/廳楊y,(SEQIDNo:55)][HER-2/neu402(SEQIDNo:56),HER-2/neu402Y1(SEQIDNo:57)][HER-2/neu391(SEQIDNo:58)，HER-2/neu391Y1(SEQIDNo:59)][HER-2Zneu97i(SEQIDNo:60),HER-2/neu971Y1(SEQIDNo:61)][HBVpo!28(SEQIDNo:62),HBVpol腦(SEQIDNo:63)][HBVpol594(SEQIDNo:64)，HBVpol594Yl(SEQIDNo:65)][HBVpol985(SEQIDNo:66),f,pol985Y1(SEQIDNo:67)];[EphA26,(SEQIDNo:68),EphA26m(SEQIDNo:69)];[HER2(川(SEQIDNo:70),HER91iYlvl0(SEQIDNo:71)];[HER491i(SEQIDNo:72),HER9ilYlvl。(SEQIDNo:71)J;[HER1911(SEQIDNo:73),HER911Y1V10(SEQIDNo:71)];[HER2722(SEQIDNo:74)，HER722Y1Vo(SEQIDNo:75)];[HER3722(SEQIDNo:76),HER722Y1V9(SEQIDNo:75)];[HER4722(SEQIDNo:77),HER722Y1V9(SEQIDNo:75)J;[HER1722(SEQIDNo:78),HER722Y1V9(SEQIDNo:75)];[HER2845(SEQIDNo:79)，HER845Y1(SEQIDNo:80)];[HER3845(SEQIDNo:81),HER訓(SEQIDNo:80)J;[HER2904(SEQIDNo:82),HER904Y1(SEQIDNo:83)];[HER4904(SEQIDNo:84),HER訓(SEQIDNo:83)];[HER2933(SEQIDNo:85),HER933Y1(SEQIDNo:86)];[HER1933(SEQIDNo87),H￡R933Y1(SEQIDNo:86)];[HER2945(SEQIDNo:88)，HER945yi(SEQIDNo:90)];[HER3945(SEQIDNo:89),HER945Y1(SEQIDNo:90)];[HER4945(SEQIDNo:91),HER945Y1(SEQIDNo:90)];and[HER1945(SEQIDNo:92),HER訓(SEQIDNo:卯)]。6.根據權利要求l-5任一項的應用，其中天然的隱性肽是TERT572(RLFFYRKSV，SEQIDNo:1)，其同源的化月太是TERT572Y(YLFFYRKSV，SEQIDNo:2)。7.根據權利要求1-5任一項的應用，其中天然的隱性肽是TERT98s(DLQVNSLQTV，SEQIDNo:3)，其同源的優化肽是TERT988Y(YLQVNSLQTV，SEQIDNo:4)。8.根據權利要求1、2、3或5任一項的應用，其中天然的隱性肽是MAGE-A，D9(YLEYRQVPD，SEQIDNo:5)或MAGE-A248G9(YLEYRQVPG，SEQIDNo:7)，其同源的優化肽是MAGE-A248V9(YLEYRQVPV，SEQIDNo:6)。9.一種體外獲得對天然肽具有高親和力的CTLs的方法，包括在來自患者的生物學樣品中刺激CTLs呈現的步驟，所述患者已經過來向所述天然肽的優化的免疫原肽的免疫，所述的剌激用天然肽實施。10.根據權利要求9的方法，其中所述天然肽和優化的肽如權利要求2-8任一項所述。11.一種免疫接種試劑盒，其包括至少一個劑量的天然肽和至少-個劑量的從所述天然肽得到的優化的免疫原肽。12.根據權利要求11的免疫接種試劑盒，其包括2個或3個劑量的優化肽，以及3、4、5、6或多至50個劑量的天然肽。13.根據權利要求11或12的免疫接種試劑盒，其中每一個劑量包括1至5mg的肽。14.根據權利要求11-13任一項的免疫接種試劑盒，其中所述免疫接種劑量是製成皮下注射用的。15.根據權利要求11-14任一項的免疫接種試劑盒，其中所述天然肽和優化肽如權利要求2-8任一項所述。全文摘要本發明屬於疫苗領域，更具體地屬於抗腫瘤和抗病毒疫苗領域。本發明涉及天然肽在藥物組合物中的應用，以選擇和/或增強部分CTL免疫反應，該反應被所述天然肽衍生的優化免疫原肽所起始。本發明也涉及包含多劑量優化肽及其同源天然肽的疫苗試劑盒。文檔編號A61K39/00GK101171032SQ200680016011公開日2008年4月30日申請日期2006年5月9日優先權日2005年5月9日發明者科斯坦提努斯(科斯塔斯)·科斯馬託普洛斯申請人:瓦克松生物技術公司