使用大鼠胚胎幹細胞構建嵌合大鼠的方法

2023-11-10 20:18:52

專利名稱：使用大鼠胚胎幹細胞構建嵌合大鼠的方法
技術領域：
本發明涉及製備具有提高的種系傳遞效率的嵌合胚胎的方法，所述方法使用大鼠多能幹細胞、特別是大鼠胚胎幹細胞(在下文中稱作「ES細胞」)，使用所述嵌合胚胎製備嵌合大鼠的方法，通過所述方法製備的嵌合大鼠，和可用於製備嵌合大鼠的培養基。
背景技術：
ES細胞是一種幾乎全能的細胞系，非常適用於製備基因修飾動物等。例如，通過將ES細胞(其中已經破壞了特定基因)注射進要與宿主胚胎的細胞混合的正常宿主胚泡中，並將所述混合物返回子宮，可以生產嵌合動物，通過雜交所得嵌合動物或後代，並選擇出生的動物，可以生產其中已經破壞了特定基因的基因修飾動物(敲除動物)。大鼠是具有比小鼠更適合操作的大小的哺乳動物，且是在不同領域(包括醫學)廣泛使用的最有用的實驗動物之一。因此，一直希望建立大鼠ES細胞並使用所述細胞生產嵌合大鼠。但是，迄今為止尚未建立有效地製備嵌合大鼠的技術，其中ES細胞分化成生殖細胞譜系，來自ES細胞的遺傳信息被傳遞給下一代，而不受大鼠ES細胞的品系和宿主胚胎的品系的影響(即，傳遞種系的嵌合大鼠)。關於證實了種系傳遞的嵌合大鼠的製備，Qi-Long Ying等人的研究組和AustinSmith等人的研究組分別在2008年提供了報導(專利文件1，非專利文件I和2)。在這2個報導中，使用大鼠ES細胞來製備嵌合大鼠；但是，在兩種情況下，從ES細胞品系和宿主胚胎品系的多種組合中的僅一種組合成功地製備出傳遞種系的嵌合大鼠。已暗示在製備敲除大鼠的常規實踐中，重要的是使用ES細胞品系和宿主胚胎品系的多種組合來實現嵌合大鼠的製備，這提出了一個在將來要解決的問題。另外，儘管事實上已經報導了製備傳遞種系的嵌合大鼠的一些實際案例，儘管如上所述它們是有限的，並沒有關於建立基因靶向的基因修飾大鼠(例如，敲除大鼠、敲入大鼠)的報導。這可能是由於起始大鼠ES細胞的特性的影響。儘管使用MEK抑制劑、GSK3抑制劑和I型TGFP受體Alk5抑制劑(Α_83_01)會建立能夠生產嵌合體的大鼠iPS細胞，但尚未實現種系傳遞(非專利文件3)。另外，還已經報導，MEK抑制劑和Alk5抑制劑的組合會顯著提高從人成纖維細胞生產iPS細胞的效率(非專利文件4)。近年來，Watanabe等人已經發現，Rho結合激酶(Rho相關的激酶；ROCK)抑制劑Y-27632會阻斷人ES細胞的細胞凋亡，並在通過酶處理分離出單個細胞以後誘導生長(非專利文件5)，也沒有報導ROCK抑制劑用於人幹細胞培養的有用性(專利文件2)。[文件列表]
[專利文件]
專利文件 I: W02008/015418 專利文件 2: W02008/035110 [非專利文件]、非專利文件 l:Cell, 135，1299-1310 (2008)
非專利文件 2:Cell, 135，1287-1298 (2008)
非專利文件 3: Cell Stem Cell 4，16-19 (2009)
非專利文件 4: Nat. Methods, 6，805-808 (2009)
非專利文件 5: Mol. Pharmacol. 57，976-983 (2000)。

發明內容
本發明要解決的問題 本發明的目的是，提供一種製備新穎的嵌合胚胎的方法，所述方法使得可有效地得到傳遞種系的嵌合大鼠，而無需限制大鼠多能幹細胞品系和宿主胚胎品系的組合，使用所述嵌合胚胎製備嵌合大鼠的方法，和它們所用的培養基，並從而提供常規尚不可能製備的、包含大鼠多能幹細胞品系和宿主胚胎品系的組合的傳遞種系的嵌合大鼠。本發明的另一目的是，提供一種大鼠ES細胞，其即便是在ES細胞製備以後經歷基因修飾後，也維持產生嵌合大鼠的能力，特別是將基因修飾傳遞給種系的能力，以及使用該大鼠ES細胞提供一種基因修飾的、特別是基因靶向的基因修飾大鼠。解決問題的方法
發明人進行了廣泛研究以開發使用大鼠ES細胞製備嵌合大鼠的方法，結果發現，通過在ES細胞分化抑制劑的存在下將大鼠ES細胞注射進宿主胚胎中，可有效地製備具有提高的種系傳遞效率的嵌合胚胎，並且通過使用所述嵌合胚胎，可製備傳遞種系的嵌合大鼠。經發現，當將小量的大鼠ES細胞注射進宿主胚胎中時，會得到更好的結果，因為除了 ES細胞分化抑制劑以外當在ROCK抑制劑存在下進行注射處理時，ES細胞與胚泡的粘附強度增加。此外，發明人新近發現，通過使用ES細胞分化抑制劑或通過使用與ROCK抑制劑相組合的ES細胞分化抑制劑，利用大鼠ES細胞品系和宿主品系的多種組合，可製備具有提高的種系傳遞效率的嵌合胚胎，並可利用所述嵌合胚胎有效地製備傳遞種系的嵌合大鼠。此外，發明人通過在建立大鼠ES細胞時將ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑加入培養基中，成功地建立了大鼠ES細胞，其即便在經歷基因修飾以後也維持產生嵌合大鼠的能力，並且還使用該ES細胞成功地製備出嵌合大鼠，其具有基因靶向的ES細胞的貢獻。發明人已經進行了以這些發現為基礎的進一步研究，所述研究導致本發明的完成。因此,本發明如下
(I) 一種製備嵌合胚胎的方法，所述方法包括下述步驟(a)和(b)
Ca)在ES細胞分化抑制劑的存在下使從雌性大鼠採集的受精宿主胚胎與大鼠多能幹細胞接觸的步驟，
(b)培養該與大鼠多能幹細胞接觸的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步驟。(2)根據(I)所述的方法，其中通過將大鼠多能幹細胞注射進宿主胚胎中來實現所述接觸。(3)根據(I)或(2)所述的方法，其中在步驟(a)中，在ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的存在下，使所述大鼠多能幹細胞與所述宿主胚胎接觸。(4)根據(I)至(3)中任一項所述的方法，其中所述大鼠多能幹細胞是基因重組細胞。(5)根據(I)至(4)中任一項所述的方法，其中在與大鼠多能幹細胞接觸之前，在ES細胞分化抑制劑的存在下，預培養所述宿主胚胎。(6)根據(5)所述的方法，其中在ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的存在下，進行所述預培養。(7)根據(I)至(6)中任一項所述的方法，其中在ES細胞分化抑制劑的存在下，進行步驟(b)中的培養。(8)根據(7)所述的方法，其中在ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的存在下，進行步驟(b)中的培養。
(9)根據(I)至(8)中任一項所述的方法，其中所述ES細胞分化抑制劑由至少2種選自下述的藥物組成=MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF β受體抑制劑和FGF受體抑制劑。(10)根據(9)所述的方法，其中所述ES細胞分化抑制劑由MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFβ受體抑制劑組成。(11)根據(I)至(10)中任一項所述的方法，其中所述多能幹細胞是ES細胞。(12)根據(I)至(11)中任一項所述的方法，其中所述大鼠多能幹細胞是從這樣的大鼠品系製備的多能幹細胞在步驟(a)中，在ES細胞分化抑制劑的非存在下與宿主胚胎接觸時，所述大鼠品系不會生產傳遞種系的嵌合大鼠。(13)根據(I)至(12)中任一項所述的方法，其中所述宿主胚胎源自這樣的大鼠品系在步驟(a)中，在ES細胞分化抑制劑的非存在下與大鼠多能幹細胞接觸時，所述大鼠品系不會生產傳遞種系的嵌合大鼠。(14) 一種製備嵌合大鼠的方法，所述方法包括將根據(I)至(13)中的任一項所述的方法製備的嵌合胚胎移植進假妊娠的雌性大鼠的子宮或輸卵管中，以使後代大鼠生出。(15)根據(14)所述的方法，所述方法進一步包括證實嵌合大鼠中的種系傳遞。(16) 一種傳遞種系的嵌合大鼠，其通過將根據(12)或(13)所述的方法製備的嵌合胚胎移植進假妊娠的雌性大鼠的子宮或輸卵管中以使後代大鼠生出而得到。(17)—種製備大鼠的方法，所述大鼠具有大鼠多能幹細胞對整個身體的貢獻，所述方法包括使具有根據(15)所述的方法證實的種系傳遞的嵌合大鼠與異性大鼠交配。(18)—種用於製備嵌合大鼠的培養基，所述培養基包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑 TGF β抑制劑。(19)根據(18)所述的培養基，所述培養基進一步包含ROCK抑制劑。(20) ES細胞分化抑制劑用於生產培養基的用途，所述培養基用於製備嵌合大鼠。(21) ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑用於生產培養基的用途，所述培養基用於製備嵌合大鼠。(22)根據(20)或(21)所述的用途，其中所述ES細胞分化抑制劑是MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGF β抑制劑。(23)嵌合大鼠的種系傳遞效率提高劑，其包含ES細胞分化抑制劑。(24)根據(23)所述的試劑，所述試劑進一步包含ROCK抑制劑。(25)根據(23)或(24)所述的試劑，其中所述ES細胞分化抑制劑由至少2種選自下述的藥物組成MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF β受體抑制劑和FGF受體抑制劑。(26)根據(25)所述的試劑，其中所述ES細胞分化抑制劑由MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFβ受體抑制劑組成。(27) 一種使用ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑製備ES細胞的方法。(28)根據(27)所述的方法，其中所述ES細胞分化抑制劑包括ΜΕΚ抑制劑、GSK3抑制劑和TGF β受體抑制劑的組合，或MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體抑制劑的組合。(29) 一種使用根據(19)所述的培養基製備ES細胞的方法。(30)根據(27)至(29)中任一項所述的方法，其中所述ES細胞是大鼠ES細胞，其即便在經歷基因修飾以後也能夠維持產生嵌合大鼠的能力。(31)根據(30)所述的方法，其中所述基因修飾是通過基因靶向進行的修飾。 (32)根據(30)或(31)所述的方法，其中所述嵌合大鼠是傳遞種系的嵌合大鼠。(33) —種大鼠ES細胞，其即便在經歷基因修飾以後也能夠維持產生嵌合大鼠的能力。(34)根據(33)所述的方法，其中所述基因修飾是通過基因靶向進行的修飾。(35)根據(33)或(34)所述的細胞，其中所述嵌合大鼠是傳遞種系的嵌合大鼠。(36) 一種基因修飾嵌合大鼠，其具有根據(33)至(35)中任一項所述的基因修飾大鼠ES細胞的貢獻。(37)根據(36)所述的大鼠，其具有基因修飾ES細胞對生殖細胞系的貢獻。(38)通過交配根據(37)的大鼠得到的大鼠，其具有基因修飾ES細胞對整個身體的貢獻。(39) 一種用於製備大鼠ES細胞的培養基，所述大鼠ES細胞即便在經歷基因修飾以後也能夠維持產生嵌合大鼠的能力，所述培養基包含ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑。(40) 一種用於製備大鼠ES細胞的培養基，所述大鼠ES細胞即便在經歷基因修飾以後也能夠維持產生嵌合大鼠的能力，所述培養基包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGFii受體抑制劑和ROCK抑制劑。(41) 一種基因修飾大鼠，其具有經歷雙等位基因基因修飾大鼠ES細胞的貢獻。(42) 一種製備基因修飾大鼠的方法，所述方法包括對大鼠ES細胞進行雙等位基因基因修飾的步驟。本發明的效果
根據本發明，不論大鼠多能幹細胞的品系或所述宿主胚胎的品系如何，均可以製備具有提高的種系傳遞效率的嵌合胚胎；通過使用所述嵌合胚胎，可以高效率地製備傳遞種系的嵌合大鼠。因此，可容易地製備基因修飾大鼠(敲除大鼠、敲入大鼠等)，所述大鼠可以廣泛地用於各種藥理學研究或生理學研究，以及用於再生醫學研究等。


圖I顯示了胚泡在(a)沒有添加YPAC因子和(b)添加YPAC因子的ES細胞培養基中的生長暈的照片。將4. 5天的胚泡接種在分裂滅活的MEF上。使用Tyrode緩衝溶液，去除透明帶。(c)是顯示內細胞團(ICM)中的Venus、0ct4、Nanog、Sox2和Rexl的定量PCR分析結果的圖示。在接種7天後，從沒有添加YPAC因子和添加YPAC因子的7或4個胚泡誘導的ICM的穹頂樣部分中提取RNA。數據是3個獨立實驗的平均值，分別是REF、ICM和ICM+YPAC因子中的相對基因表達水平。[圖2-1]該圖顯示了大鼠ES細胞的特徵檢查的結果。(a)顯示的集落照片顯示了 Y-27632的影響。將分離的單個細胞(I X IO5 Tgffffl細胞，代數6)接種至6-孔板。左圖顯示了向培養基中加入MEF+YPAC因子所得到的集落，中圖顯示了加入PAC因子得到的集落，右圖顯示了加入Y因子得到的集落。(b)顯示了相同的各種細胞的鹼性磷酸酶(ALP)染色的照片。(c)是50個TgWL2細胞(代數7)的吉姆薩染色的照片。TgWL2 (代數7)表現出42條染色體(包括XX性染色體)的核型。(d)是通過散布圖分析來對比基因表達模式的圖示。Tgffffl和REF顯示在左圖中，Tgffffl和LL顯示在右圖中。使用Agilent基因晶片(全大鼠基因組微陣列試劑盒)進行微陣列分析。中心線代表當量曲線；在它上面和下面的線表明樣品基因表達水平相差2倍。(e)是對比REF、TgffLU Tgffffl和LL的基因表達模式的圖示。這些是大鼠ES細胞系中的Venus、0ct4、Nanog、Sox2和Rexl的Q-PCR的結果。數據是3個獨立實驗的平均值，分別是REF、TgWLl、Tgffffl和LL的相對基因表達水平。(f)是顯示來自大鼠細胞的畸胎瘤形成的照片。這是通過將2.6X106 Tgffffl (代數5)細胞皮 下移植到免疫缺陷的小鼠所產生的畸胎瘤。[圖2-2](g)的圖顯示了微陣列分析和分級簇分析的結果。使用了含有41，000個基因的基於單色微陣列的基因表達分析(Agilent Technology)。圖上的數字值指示相關係數。(h)顯示了大鼠ES細胞中的0ct4、Nanog和Sox2的免疫染色圖(下圖)。上圖顯示了DAPI染色圖像。(i)顯示了從Tgffffl ES細胞系誘導的畸胎瘤的3個胚層的橫截面視圖。圖3是顯示胚胎體(Eb)和YPAC因子的作用的檢查結果的圖示。顯示了在沒有Y-27632存在下在基礎培養基中培養ES細胞3天後和7天後拍攝的胚胎體(TgWLl)的照片Ca)沒有加入PAC因子，和(b)加入PAC因子。(c)是顯示EB中的Venus、0ct4、Nanog、Sox2和Rexl的Q-PCR分析的結果的圖示。數據是3個獨立實驗的平均值，分別是沒有加入抑制劑(空心圓圈)和加入PAC因子(實心正方形)培養0、3和7天時ES細胞中的基因表達水平。[圖4-1]關於通過YPAC注射方法製備種系嵌合體的圖示。(a)是通過將p-CAG-AmCyanl質粒導入核酸中產生的穩定轉化的克隆中的AmCyanl的表達的圖示。(b)是顯示YPAC因子在注射方法中的影響的檢查結果的照片。將YPAC因子加入ES基礎培養基中得到的圖像顯示在右圖中，沒有加入時得到的圖像顯示在左圖中。上圖是在溫育5小時後拍攝的照片；下圖是在溫育30小時後拍攝的照片。(c)顯示胎兒種系嵌合體的照片。將Tgffffl+C細胞注射進Wistar胚泡中。在18天時在整個胎兒、腎和睪丸中檢測到Venus和AmCyanl突光。(d)顯示通過YPAC注射方法製備的嵌合彩色大鼠的產生。(e)顯示成年嵌合體中的種系傳遞。使嵌合體(TgWLl)與雌性Wistar交配。通過它們的毛色,鑑別種系個體(4/16)。(f)顯示雌性嵌合體(TgWL2)的Fl的基因分型分析。採集尾巴基因組DNA以後，通過PCR來擴增Venus區域。6個個體中的3個被鑑定為種系個體。Venus基因具有199 bp大小；M指示100 bp的DNA標誌物。泳道1、2和3顯示具有刺鼠毛色的種系個體，泳道4、5和6顯示了刺鼠毛色為陰性(白化變種)的個體。(g)顯示注射進胚泡中的單個細胞(Tgffffl)的照片。在注射以後溫育3小時時對胚泡拍攝照片。各箭頭指示注射的細胞。
(h)顯示具有經證實的種系傳遞的嵌合大鼠胎兒的照片。在16天的生殖腺的一側檢測到Venus-陽性的生殖細胞。比例條是100 μ m。[圖4-2](i)顯示長期傳代培養的ES細胞中的種系傳遞。將長期培養的ES細胞(TgffL2:代數22)注射進胚泡中；17. 5天以後，檢測出生殖腺上的Venus螢光(比例條300 μπι)。上圖顯示明視野圖像，下圖顯示螢光圖像。(j)顯示沒有添加YPAC因子通過注射得到的毛色嵌合體的一個實例。(k)顯示添加YPAC通過注射得到的毛色嵌合體的一個實例。圖5是關於從ES細胞製備Tg大鼠的圖示。(A)和(B)顯示0ct4_Venus轉化體細胞的克隆和表達。將0ct4-VenuS轉基因導入第5代的ES細胞(LL2)中，並在沒有藥物選擇下傳代培養Venus-陽性的克隆。(A)中的箭頭指示Venus表達受到抑制。(B)顯示0ct4-Venus在ES細胞中的均一表達。(C)顯示從表現出0ct4_Venus的均一表達的ES細胞得到的Tg大鼠。箭頭指示通過種系傳遞從嵌合大鼠得到的esTG大鼠。(D)顯示在處於胚胎16天的esTg大鼠的生殖腺上的Venus螢光。(E)顯示esTg胚泡在YPAC培養基中的生長暈。(F)顯示了源自esTg胚泡的大鼠ES細胞系。甚至在10代以後，也沒有觀察到 0ct4_Venus 的表達的抑制。(比例條300 μ m (A, B, D) , 100 μ m (E, F))
圖6是關於經由ZFN通過同源重組製備敲入大鼠的圖示。(A)是關於0ct4靶向的示意圖。所述ZFN對會識別外顯子I。各灰色框指示編碼區，各空心框指示非編碼區。禿線指示同源臂。各P是引物。(B)顯示基因靶向的ES細胞克隆的基因分型PCR分析。(C)顯示基因靶向的ES細胞克隆編號11 (代數14)(空心箭頭未分化的細胞，實心箭頭分化的細胞)。圖7是關於經由ZFN通過同源重組製備敲除大鼠的圖示。這是關於P53靶向的示意圖。所述ZFN對會識別外顯子4。禿線指示同源臂。圖8 (A)顯示基因靶向的ES細胞克隆的基因分型PCR分析(WT:野生型，KI:p53基因靶向的等位基因)。(B)顯示AmCyanl在同源重組的p53+/_ ES細胞克隆中的表達。圖9 (A)顯示通過交配雌性嵌合體和野生型LEA-品系大鼠得到的p53基因敲除大鼠(箭頭指示種系傳遞大鼠)。(B)顯示作為交配雌性嵌合體和野生型LEA-品系大鼠的結果所產生的大鼠的基因分型分析(ΚΙ: p53基因靶向的等位基因)。圖10是關於經由ZFN通過同源重組製備敲除大鼠的圖示。(A)是關於p53靶向的示意圖。所述ZFN對會識別外顯子4。禿線指示同源臂。(B)顯示基因靶向的ES細胞克隆的基因分型分析(WT:野生型，ΚΙ: p53基因靶向的等位基因)。泳道從左側編號為1-7。(C)顯示p53+ ES細胞[細胞系p53e/z]的基因靶向的細節。(D)顯示AmCyanl在同源重組的p53+/_ ES細胞克隆中的表達。在圖11中，(A)顯示基因靶向的ES細胞克隆的基因分型分析(WT:野生型)。(B)顯示AmCyanl和tdTomato在同源重組的ρδβ+ ES細胞克隆中的表達。圖12顯示(A)從ρ53+ ES細胞[細胞系p53e/K2]發育成的嵌合大鼠胎兒。(B)顯示了從P53+ ES細胞[細胞系p53e/K2]發育成的嵌合大鼠胎兒的頭部畸形(在圖的左側)。(C)顯示了 AmCyanl在(B)的胎兒的頭中的表達。
具體實施例方式本發明提供一種使用大鼠多能幹細胞來有效地製備傳遞種系的嵌合大鼠的方法，而無需限於大鼠多能幹細胞的特定品系或宿主胚胎的品系。下面描述了本發明所述的大鼠多能幹細胞、製備嵌合胚胎和嵌合大鼠的方法、製備基因修飾大鼠的方法和用於製備嵌合大鼠的試劑盒。I.大鼠多能幹細胞
在本發明中，「多能幹細胞」表示維持未分化狀態和多能性的細胞，其以ES細胞和誘導的多能幹細胞(iPS細胞)為代表。ES細胞可以是從體細胞的細胞核重新程序化得到的ES細胞，但是優選地通過以後描述的方法從大鼠早期胚胎製備。除了 ES細胞以外，實例包括源自原始生殖細胞的胚胎生殖細胞(EG細胞)、從睪丸分離出的多能種系幹細胞UGS細胞)等。優選地，要在本發明中使用的大鼠多能幹細胞是大鼠ES細胞或大鼠iPS細胞，更優選大鼠ES細胞。1-1.大鼠ES細朐
在本發明中用於生產嵌合大鼠的大鼠ES細胞可以源自任意大鼠品系，只要它可以生 產傳遞種系的嵌合大鼠。儘管大鼠的品系沒有特別限制，例如，它選自諸如下述的大鼠品系ffistar Kyoto 品系(WKY)、Brown Norway 品系(BN)、Goto_Kakizaki 品系(GK)、SD 品系、F344/Du 品系(Fischer)、Wistar 品系、Wistar Hannover 品系、Long-Evans刺鼠品系(LEA)、ACI品系等。另外，在本發明中，所述品系可以是純品系，或通過雜交2個品系或更多品系得到的品系。考慮到本發明的不論大鼠ES細胞品系如何均可以有效地製備傳遞種系的嵌合大鼠的特徵，在使用從下述大鼠品系製備的ES細胞時，本發明是特別有用的在下述的使宿主胚胎和大鼠ES細胞接觸的步驟中，在ES細胞分化抑制劑的非存在下使大鼠ES細胞與宿主胚胎接觸時，所述大鼠品系不會生產傳遞種系的嵌合大鼠。能夠生產傳遞種系的嵌合大鼠的大鼠ES細胞，可以在給定情形下從上面例證的細胞系得到，或者也可以根據本身已知的方法來生產。大鼠ES細胞的生產方法的實例包括Buehr M 等人的方法(Cell 2008; 135:1287-1298)等。通過執行包括下述步驟(A)至(C)的方法，也可以建立和製備具有製備傳遞種系的嵌合大鼠的能力的大鼠ES細胞
(A)離解通過培養大鼠胚泡形成的內細胞團的步驟，
(B)培養從離解的內細胞團的培養物得到的原代胚胎幹細胞直到它可以傳代的步驟，
(C)離解已經變得能夠傳代的原代胚胎幹細胞、保留細胞聚集體的狀態和培養它們的步驟。上述的製備方法中的培養，優選地使用含有至少2種ES細胞分化抑制劑的培養基來進行，更優選地使用含有至少2種ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的培養基來進行。在這裡，「ES細胞分化抑制劑」是指除了白血病抑制因子(LIF)以外的這樣的物質其能夠抑制ES細胞分化成其它細胞或組織等，且在本發明中，可以是具有抑制大鼠ES細胞的分化的作用的任意物質。ES細胞分化抑制劑包括，例如，MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGFP受體抑制劑、FGF受體抑制劑等。就該培養而言，具體地，優選地使用含有MEK抑制劑和GSK3抑制劑的培養基；更優選地使用含有MEK抑制劑、GSK3抑制劑、FGF受體抑制劑和ROCK抑制劑的培養基；更優選地使用含有MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGFP受體抑制劑和ROCK抑制劑的培養基；特別優選地使用含有MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGFP受體抑制劑和ROCK抑制劑的培養基。
通過使用含有ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的培養基，可能製備大鼠ES細胞，其即便是在ES細胞建立以後經歷基因修飾後，也能夠維持產生嵌合大鼠的能力，特別是產生傳遞種系的嵌合大鼠的能力。MEK抑制劑沒有特別限制，只要它具有抑制MEK (MAP激酶-ERK激酶)的功能的作用，例如，可以提及 AZD6244、CI-1040 (PD184352)、PD0325901、RDEAl 19 (BAY869766)、SL327、U0126 (以上都來自 Selleck)、PD98059、U0124、U0125 (以上都來自 COSMO BIO Co.,Ltd.)等。要加入培養基中的MEK抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.01 -100 11111，優選0. 1-5 ilM。GSK3抑制劑沒有特別限制，只要它具有抑制糖原合酶激酶(GSK) 3的功能的作用，例如，可以提及 SB216763 (Selleck)、CHIR98014、CHIR99021 (以上都來自 Axon Medchem), SB415286 (Tocris Bioscience)、Kenpaullone (COSMO BIO Co. , Ltd.)等。要加入培養基中的GSK3抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.01 - 100 ym，優選I - 10U m0TGFP受體抑制劑沒有特別限制，只要它具有抑制轉化生長因子(TGF) ^受體的功能的作用，例如，可以提及2-(5-苯並[1，3] 二氧雜環戊烯-4-基-2-叔丁基-IH-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3- (6-甲基吡啶-2-基)-4- (4-喹啉基)- I-苯基硫代氨甲醯基-IH-卩比唑(A-83-01 )、2_(5_氣_2_氣苯基)喋唳-4-基)卩比唳_4_基胺(SD-208)、3-(吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)]-lH-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)_1H_吡唑-4-基)-1,5-萘啶(以上都來自 Merck)、SB431542 (Sigma Aldrich)等。TGFP 受體抑制劑也包括TGFP受體拮抗劑。要加入培養基中的TGFP受體抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0. 01 - 10 iim，優選0.1 - I UM0FGF受體抑制劑沒有特別限制，只要它具有抑制成纖維細胞生長因子(FGF)受體的功能的作用，例如，可以提及 SU5402 (COSMO BIO Co. , Ltd. )、PD173074 (STEMGENT)等。FGF受體抑制劑也包括FGF受體拮抗劑。要加入培養基中的FGF受體抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.005 - 500 iim，優選0. 07 - 50 Um0ROCK抑制劑沒有特別限制，只要它具有抑制Rho結合激酶的功能的作用。ROCK抑制劑的實例包括GSK269962A (Axon Medchem)、鹽酸法舒地爾(Tocris Bioscience)、Y-27632、H-1152 (以上都來自 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)等。要加入培養基中的ROCK抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.0001 - 500 ym，優選I - 50U m0要用於建立和培養大鼠ES細胞的基礎培養基沒有特別限制，只要它可以用於培養動物細胞。其實例包括BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、改良的MEM Zinc Option培養基、頂DM培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、a MEM培養基、DMEM培養基、hamF12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer氏培養基和它們的
混合培養基等。所述培養基可以是含有血清的培養基或不含血清的培養基。當使用非條件的或未純化的血清時，所述血清必須加入培養基中至下述程度不會由於血清的影響而使大鼠ES細胞喪失其產生傳遞種系的嵌合大鼠的能力。當加入5%或更多(例如約10至約20%)的血清時，希望使用條件的或純化的血清進行ES細胞培養。這樣的用於ES細胞培養的血清(例如，牛胎血清)是可商業得到的。所述培養基也可含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如，非必需胺基酸)、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽等。在培養大鼠ES細胞的情況下，也可以使用白血病抑制因子(LIF)。所述LIF特別優選地是大鼠衍生的LIF (rLIF)。所述LIF可以在上述的製備方法的步驟(B)和步驟(C)的培養中適宜地加入培養基使用。同時，在步驟(A)中，為了增加內細胞團形成效率、大鼠ES細胞建立效率，和大鼠ES細胞質量，加入培養基中的rLIF的濃度非常優選地不超過100單位/mL培養基，更優選地，使用不含LIF的培養基培養大鼠ES細胞至少至內細胞團形成階段，優選經歷整個步驟(A)。對於rLIF,可以購買和使用商業產品(Chemicon Company
-Tf- ) o優選地進一步使用飼養細胞來生產和培養大鼠ES細胞。飼養細胞可以是源自本領域普通技術人員可得到的任意物種的細胞，且優選地是正常成纖維細胞，而不是建立的飼養細胞系。具體地，可以提及正常的小鼠胚胎成纖維細胞。更具體地，可以提及在妊娠第12天至第16天之間的小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養細胞(正常的成纖維細胞)。作為正常的成纖維細胞，例如，例示有第12. 5天的ICR胎兒小鼠的正常成纖維細胞。通過常規方法，可以製備飼養細胞。也可以使用可商業得到的產品(小鼠成纖維細胞；Asahi TechnoGlass Corporation,等)。優選地,使用通過絲裂黴素C等處理滅活的飼養細胞。用於培養大鼠ES細胞的培養容器沒有特別限制，只要它可用於細胞培養；這樣的培養容器包括，例如，燒瓶、組織培養瓶、平皿、培養皿、組織培養皿、多皿、微量培養板、微 孔平板、多板、多孔平板、室載玻片、培養皿、試管、託盤、培養袋、滾瓶等。所述培養容器可以是非細胞附著的或細胞附著的。可以使用細胞附著的培養容器，其表面塗有細胞支持基底層，用於改善細胞附著的目的；這樣的細胞支持基底層包括，例如，膠原、明膠、基質膠、聚-L-賴氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白等。所述培養可以例如，在CO2培養箱中，在約I至約10%、優選約2至約5%、更優選約5%的CO2濃度的氣氛下，在約30至約40 °C、優選約35至約37. 5 °C、更優選約37 °C下進行。作為培養基中的其它組分，適當地包含常規地用於培養ES細胞的組分，這通過將它們組合在本領域普通技術人員的普通知識內來實現。在下面例證了培養基的具體組成。I)用於大鼠ES細胞建立的培養基(培養基)
在從胚泡至內細胞團形成的步驟中使用的培養基稱作「用於大鼠ES細胞建立的培養
其」(組成的具體實例)
包括 110 mg/L 丙酮酸鈉和 200 mM GlutaMax (GIBCO)的 DMEM 20% FBS (ES CELL QUALIFIED FBS) (GIBCO)
0. I mM 2_ 疏基乙醇(Sigma)
1%非必需胺基酸儲備液(GIBCO)
1% IX抗生素抗黴菌劑(GIBCO)
10 uM Y-27632 (WAKO)I li M PD0325901 (Axon Medchem)
0. 5 uM A-83-01 (TOCRIS)
3 uM CHIR99021 (Axon Medchem)
2)大鼠ES細胞的培養基
在內細胞團形成以後的培養(包括建立的大鼠ES細胞的培養)中使用的培養基稱作「大鼠ES細胞的培養基」。(組成的具體實例)
ES細胞的培養基與用於生產大鼠ES細胞的培養基類似，且可以另外含有大鼠白血病 抑制因子(rLIF)。rLIF優選地在即將使用前加入和混合。
( I)大鼠ES細胞建立方法
在下面顯示了用於建立本發明的大鼠ES細胞的方法的一個具體實施例。I)卵母細胞(處於胚泡期的胚胎)取樣
作為用於卵母細胞取樣的大鼠，可以使用來自下述品系的大鼠諸如前述的WistarKyoto (WKY)品系、Brown Norway (BN)品系、Goto-Kakizaki (GK)品系、SD 品系、F344/Du(Fischer)品系、Wistar 品系、Wistar Hannover 品系、Long-Evans 刺鼠品系(LEA)和 ACI品系。可以使用在8-40周齡範圍內的大鼠,優選地使用10-20周齡的大鼠，更優選地使用10-12周齡的大鼠。通過本領域普通技術人員已知的常規方法，可以進行卵母細胞取樣。具體地，使大鼠自然地雜交，在陰道栓檢測約4-5天後，處死用於卵母細胞取樣的雌性大鼠，以摘出子宮。用合適的培養基灌注該子宮，以回收受精的卵母細胞(胚胎)。在這裡使用的培養基包括，例如，mw 培養基(640. 0 mg/100 ml NaCl、35.6 mg/100 ml KCl,16. 2 mg/100 mlKH2PO4,29. 4 mg/100 ml MgS04_7H20、190. 0 mg/100 ml NaHCO3UOO. 0 mg/100 ml 葡萄糖、
2.5 mg/100 ml 丙酮酸鈉、46. 0 mg/100 ml 乳酸鈣、5. 0 mg/100 ml 鏈黴素、7. 5 mg/100 ml青黴素、0.5% 酚紅(0.2 ml),20 mM ^ -ME (10 u 1),100 mM EDTA_2Na (10 u 1),300. 0mg/100 ml BSA)，M2 培養基(0. 251 g/L 氯化鈣 _2H20、0. 143 g/L 硫酸鎂、0.356 g/L 氯化鉀、0.162 g/L 磷酸鉀、5. 532 g/L 氯化鈉、4.0 g/L 白蛋白、1.0 g/L D-葡萄糖、4. 969 g/LHEPES、0. 01 g/L 酚紅-Na、0.036 g/L 丙酮酸-Na、0. 35 g/L 碳酸氫鈉、0.06 g/L 青黴素 G、0. 05 g/L硫酸鏈黴素、4. 349 g/L D, L-乳酸)等。也可以在諸如mw培養基、M2、M16等培養基中培養回收的胚胎。通過該培養，從受精的卵母細胞(胚胎)經過桑椹胚而發育成胚泡(處於胚泡期的胚胎)。為了促進向該階段的發育，所述培養通常在5% CO2培養箱中在37 °C過夜進行。通過顯微鏡觀察可以證實，發育已經進行至胚泡期。優選地，所述發育進行至晚胚泡期。2)內細胞團的形成和分離
用顯微鏡證實在前述I)中得到的胚泡，並去除透明帶。使用Acidic TyrodeCpH 2.5)、透明質酸酶、鏈黴蛋白酶等，去除透明帶。然後，將用絲裂黴素C處理過的飼養細胞接種在培養皿上，將去除了透明帶的大鼠胚泡轉移至該皿，並使用用於大鼠ES細胞建立的培養基開始培養。在培養的第I天和第4天之間，去除了透明帶的大鼠胚泡(晚期)附著於飼養細胞上。在附著後5-10天，使用200 u I移液器等機械地分離從胚泡出現的內細胞團。使用移液器或蛋白酶諸如胰蛋白酶-EDTA、Accutase (註冊商標，Innovative Cell Technologies)等，機械地離解該分離的內細胞團。該離解步驟優選地使用移液器等進行，直到所述內細胞團變成由約5-20個細胞組成的細胞聚集體。用顯微鏡可以證實維持的細胞聚集體的狀態。3) ES細胞的建立
在明膠包被的培養皿(其中接種了飼養細胞)中，在大鼠ES細胞的培養基中培養在前述2)中離解的內細胞團。原代ES細胞集落通常在培養開始後第2天至第4天之間出現。通過顯微鏡觀察，可以證實原代ES細胞集落的出現(出現的ES細胞稱作「原代ES細胞」)。通過此後繼續培養約5-10天，原代ES細胞集落變成處於能夠被傳代的狀態。在本文中使用的「能夠被傳代的狀態」是指這樣的狀態其中構成所形成的原代ES細胞集落的細胞的數目已經達到大約200-600個，且每個細胞間隔已經變得緊湊，且細胞團顯示出具有光澤的穹頂樣形式。在用顯微鏡證實它具有這樣的形態學的同時，使用200 移液器等分離ES細胞集落。將該分離的ES細胞集落轉移至含有大鼠ES細胞的培養基的滅菌試管等，並機械地離解，直到它變成由約5-20個細胞組成的細胞聚集體，或通過使用蛋白酶諸如Accutase(註冊商標)進行離解。機械離解是優選的。在明膠包被的培養皿(其中接種了飼養細胞)中， 在大鼠ES細胞的培養基中對離解的ES細胞集落進行原代培養(處於第I代的細胞)。ES細胞集落在培養開始以後約2-4天出現，並在約5-10天時變成處於能夠被傳代的狀態。在去除培養基以後，用預先在37 °C溫育的Accutase (註冊商標)或2. 5%胰蛋白酶，包被已經在上述中變成能夠被傳代的ES細胞集落及其整個表面。當用顯微鏡證實全部ES細胞集落的70%或更多正在脫離飼養細胞的狀態時，立即停止蛋白酶處理。可以如下停止蛋白酶處理例如，加入含有10%胎牛血清的培養基或大量不含血清的培養基。然後，使用5 ml移液器等，進一步機械地打散所述ES細胞集落，將所述細胞懸浮液離心(約3分鐘、在室溫、1000 rpm)，以分離細胞和培養基，並僅回收細胞。將細胞懸浮於大鼠ES細胞的培養基中，在用顯微鏡證實所述細胞形成5-20個細胞的聚集體(而不是變成完全單個細胞)的狀態以後，將細胞轉移至培養皿(其中接種了飼養細胞)，並培養(第2代的細胞)。此後，由於細胞每約3-5天變成能夠被傳代的狀態，通過用蛋白酶諸如Accutase(註冊商標)離解細胞或機械地離解細胞，可以對它們連續傳代和培養。可以證實，大鼠ES細胞保留ES細胞的性能，也就是說，所希望的ES細胞維持未分化狀態(全能性)的性能，例如，通過檢查ES細胞特異性的基因(例如，0ct3/4基因、Nanog基因)的表達、鹼性磷酸酶活性、胚狀體形成能力、SSEA-I和SSEA-4的表達、染色體的數目、傳代培養後的狀況、體外多能性、分化成3種生殖細胞的細胞的能力、畸胎瘤形成能力等。使用本身已知的技術(參見，例如，WO 2005/085427)，可以實現它們的驗證，在下面的實施例中給出了一些具體實例。1-2.大鼠 iPS 細胞
根據例如在Cell Stem Cell 4，16-19(2009)中描述的方法，可以製備大鼠iPS細胞。作為原料，可以使用從前述大鼠ES細胞品系採集的大鼠體細胞、胎兒、幼兒或成年體細胞。具體地，可以使用組織幹細胞(體幹細胞)諸如神經幹細胞、造血幹細胞、間質幹細胞、精子幹細胞等；組織祖細胞；已經分化的細胞諸如淋巴細胞、上皮細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等；等。作為用於細胞核重新程序化的重新程序化因子，除了在前述參考文獻中使用的那些以外，也可以在可行的範圍內適當地選擇和使用可以用於在小鼠、人和其它哺乳動物中建立iPS細胞的重新程序化因子。作為用於提高細胞核重新程序化效率的MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFP抑制劑，可以適當地選擇和使用與上面關於大鼠ES細胞的建立所述的那些相同的物質。通過上述的方法，可以證實建立的大鼠iPS細胞對未分化狀態(全能性)的維持。2.製備嵌合胚胎和嵌合大鼠的方法
本發明提供了一種製備具有提高的種系傳遞效率的嵌合胚胎的方法，和一種通過從經歷嵌合胚胎移植的大鼠得到後代大鼠來製備嵌合大鼠的方法。通過使用本發明的方法，可有效地提供傳遞種系的嵌合大鼠，而不受大鼠多能幹細胞或宿主胚胎的品系的限制。大鼠是具有在實驗方面合適的尺寸(是小鼠的尺寸的約10倍)的哺乳動物，且在下述方面有利(I)可以容易地將藥物施用進細胞內的血管中，(2 )可以進行外科手術或移植實驗，(3)可以採集大量組織等。儘管以往已經開發和發現了許多人疾病模型大鼠，由於沒 有建立有效地製備傳遞種系的嵌合大鼠且不受大鼠ES細胞品系和宿主大鼠品系限制的方法，尚未製備基因修飾大鼠、特別是需要基因靶向的基因修飾大鼠(諸如敲除大鼠和敲入大鼠)。使用通過本發明的方法製備的嵌合大鼠，可以容易地生產基因修飾大鼠，而不受大鼠多能幹細胞譜系和宿主大鼠譜系限制。在這裡，「基因修飾大鼠」是指本領域普通技術人員已知的任意基因修飾大鼠，諸如嵌合大鼠、敲除大鼠、敲入大鼠、轉基因大鼠和沉默大鼠。更具體地，本發明的嵌合胚胎的製備方法包括下述步驟(a)和(b)
Ca)在ES細胞分化抑制劑的存在下使從雌性大鼠採集的受精宿主胚胎與大鼠多能幹細胞接觸的步驟，
(b)培養與大鼠多能幹細胞接觸的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步驟。另外，本發明的嵌合大鼠的製備方法包括下述步驟將通過上述方法製備的嵌合胚胎移植進假妊娠的雌性大鼠的子宮或輸卵管中，以使後代大鼠生出。用於製備本發明的嵌合大鼠的大鼠多能幹細胞是在上面的「I.大鼠多能幹細胞」中提及的細胞，優選大鼠ES細胞或大鼠iPS細胞，更優選大鼠ES細胞。所述大鼠多能幹細胞可以是具有通過公眾已知的方法重組的特定基因的基因重組細胞。實例包括人工去除了特定基因的ES細胞、人工引入了特定基因的ES細胞等。用於獲得本發明的宿主胚胎的大鼠可以源自任意大鼠品系。例如，所述大鼠品系包括 Wistar Kyoto 品系(WKY)、Brown Norway 品系(BN)、Goto-Kakizaki 品系(GK)、SD 品系、F344/Du 品系(Fischer)、Wistar 品系、Wistar Hannover 品系、Long-Evans 刺鼠品系(LEA)、ACI品系等。在本發明中，所述品系可以是純品系，或通過雜交2種或更多種得到的品系。考慮到本發明的不論大鼠ES細胞品系均可以有效地製備傳遞種系的嵌合大鼠的特徵，在使用從下述大鼠品系採集的宿主胚胎時，本發明是特別有用的在使宿主胚胎和大鼠多能幹細胞接觸的步驟中，在ES細胞分化抑制劑的非存在下使大鼠ES細胞與大鼠多能幹細胞接觸時，所述大鼠品系不會生產傳遞種系的嵌合大鼠。可以使用在8-40周齡範圍內的雌性大鼠進行卵母細胞取樣，優選地使用10-20周齡的大鼠，更優選地使用10-12周齡的大鼠。原料宿主胚胎沒有特別限制，只要它是從雌性大鼠採集的受精的早期胚胎；經常，可以提及在胚泡期之前的早期胚胎(例如，8-細胞期胚胎、16-細胞期胚胎、桑椹期胚胎、胚泡期胚胎)等。通過本身已知的方法，可以從交配的雌性大鼠採集宿主胚胎。所述交配可以是自發的交配，或可以在誘導排卵以後進行。採集宿主胚胎的方法沒有特別限制；為了具體地解釋，使用於卵採集的雌性大鼠自發地或在施用促性腺激素(濾泡刺激激素、然後促黃體激素)以誘導過度排卵以後與相同品系的雄性大鼠交配，此後在適當時間(例如，對於8-細胞期胚胎，在交配後3. 5天，對於16-細胞期胚胎，在交配後3. 75天，對於桑椹期胚胎，在交配後4天，對於胚泡期胚胎，在交配後4. 5天)殺死用於卵採集的雌性大鼠，摘出子宮，用適當的培養基灌注該子宮，由此可以回收早期胚胎。在這裡，用於灌注的培養基的實例包括上述的用於建立大鼠ES細胞的培養基、上述的也用於回收早期胚胎的mw培養基、M2培養基等。在與大鼠多能幹細胞接觸之前，可以培養採集的宿主胚胎。作為用於預培養的基礎培養基，可以使用與用於建立大鼠ES細胞的基礎培養基類似的培養基。所述培養基可以是含有血清的培養基或不含血清的培養基。所述培養基也可以含有脂肪酸或脂質、胺基酸 (例如，非必需胺基酸)、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝齊Li、無機鹽等。在一個優選的實施方案中，將ES細胞分化抑制劑加入上述的預培養基中。作為ES細胞分化抑制劑，可以提及至少2種選自下述的藥物MEK抑制劑、GSK抑制劑、TGFP受體抑制劑和FGF受體抑制劑。作為MEK抑制劑、GSK抑制劑、TGF ^受體抑制劑和FGF受體抑制劑，可以使用上述的用於培養大鼠ES細胞的物質。ES細胞分化抑制劑優選地是包括MEK抑制劑和GSK抑制劑的組合，更優選的實施例是進一步使用TGFP受體抑制劑的組合。要加入培養基中的MEK抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.01 - 100Pm，優選0.1 - 5 UM0要加入培養基中的GSK3抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.01 - 100 Pm，優選I - 10 Pm。要加入培養基中的TGF P受體抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.001 - 10 iim，優選0.1 - I PM。要加入培養基中的FGF受體抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.005 - 500 iim，優選0. 07 - 50 Um0在另一個優選的實施方案中，除了 ES細胞分化抑制劑以外，可以另外將ROCK抑制劑加入用於宿主胚胎預培養的培養基中。ROCK抑制劑的具體實例包括上述的用於大鼠ES細胞培養的物質。要加入培養基中的ROCK抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.0001 - 500 um,優選 I - 50 u m。預培養可以例如，在CO2培養箱中，在約I至約10%、優選約2至約5%、更優選約5%的CO2濃度的氣氛下，在約30至約40 °C、優選約35至約37. 5 °C、更優選約37 1下進行。在適當時，從上面在I中描述的那些中，選擇要與宿主胚胎接觸的大鼠多能幹細胞，優選地為上面1-1中描述的大鼠ES細胞。為了促進嵌合大鼠的製備，希望所述大鼠多能幹細胞是具有報導基因(例如，GFP (包括修飾的GFP諸如EGFP和Venus)、P-gal、螢光素酶等)的重組大鼠多能幹細胞，所述報導基因通過常規方法預先導入其中。在僅使用毛色選擇嵌合大鼠時，將在後代世代中證實種系傳遞；但是，假如使用報導多能幹細胞，可以通過檢測報導基因在嵌合大鼠的生殖細胞中的表達，在嵌合大鼠的當前世代中證實種系傳遞。具體地，可以預先製備引入了報導基因的轉基因大鼠，可以從上述的大鼠得到多能幹細胞；或者，可以將表達載體(其含有轉化體細胞選擇標記基因諸如藥物抗性基因以及報導基因)導入如上所述通過電穿孔等製備的大鼠多能幹細胞中，並可以通過藥物選擇等選擇引入了報導基因的大鼠ES細胞。通過技術人員已知的方法，可以使大鼠多能幹細胞與宿主胚胎接觸。例如，通過顯微操作，將大鼠多能幹細胞移植進大鼠胚泡的囊胚腔中或桑椹期或16-細胞期胚胎中，並與內細胞團一起或作為內細胞團的一部分(microinjection method: Gordon J. ff.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 77: 7380-7384 (1980))發育。或者，從 2 個 8-細胞胚胎去除透明帶，注射多能幹細胞，並共培養所述胚胎以形成聚集體。當培養所得的聚集體時，得到一個胚泡(cell aggregate method: Dvorak P.等人，Int. J. Dev. Biol.,39' 645-652 (1995))。當注射大鼠多能幹細胞時，優選地用礦物油、油滴、液體石蠟等覆蓋大鼠ES細胞，並進行向宿主胚胎中的注射。作為用於使大鼠多能幹細胞和宿主胚胎接觸的培養基，可以使用與用於建立大鼠 ES細胞的基礎培養基類似的培養基作為基礎培養基。所述培養基可以是含有血清的培養基或不含血清的培養基。所述培養基也可以含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如，非必需胺基酸)、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽等。將2種或更多種ES細胞分化抑制劑加入接觸培養基中。所述至少2種ES細胞分化抑制劑選自MEK抑制劑、GSK抑制劑、TGFP受體抑制劑和FGF受體抑制劑。MEK抑制劑、GSK抑制劑、TGF ^受體抑制劑和FGF受體抑制劑的實例包括上述的用於培養大鼠ES細胞的物質。所述至少2種ES細胞分化抑制劑優選地包括包括MEK抑制劑和GSK抑制劑的組合，更優選的實施例是進一步使用TGFP受體抑制劑的組合。要加入培養基中的MEK抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.01 - 100Pm，優選0.1 - 5 UM0要加入培養基中的GSK3抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.01 - 100 Pm，優選I - 10 Pm。要加入培養基中的TGF P受體抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.001 - 10 iim，優選0.1 - I PM。要加入培養基中的FGF受體抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0. 005 - 500 iim，優選0.07 - 50 Um0在一個優選的實施方案中，除了 ES細胞分化抑制劑以外，可以進一步將ROCK抑制劑加入接觸培養基中。ROCK抑制劑的具體實例包括上述的用於大鼠ES細胞培養的物質。要加入培養基中的ROCK抑制劑的濃度可以適當地選自下述範圍例如，0.0001 - 500 u m,優選 1-50 ii m。在與大鼠多能幹細胞接觸以後，當繼續培養時，所述宿主胚胎可以形成嵌合胚胎。這種用於後培養的培養基可以具有與前述用於接觸的培養基相同的組成；所述培養基優選地是含有ES細胞分化抑制劑的培養基，更優選含有2種或更多種ES細胞分化抑制劑的培養基。具體地，含有MEK抑制劑和GSK3抑制劑的培養基是優選的，含有MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFP受體抑制劑的培養基是更優選的。此外，可以將ROCK抑制劑加入培養基中。所述後培養可以在與用於前述預培養的那些條件類似的條件下進行。將上面製備的嵌合胚胎移植進假妊娠的雌性大鼠(通過與輸精管結紮術處理以後的雄性大鼠自然異種交配來製備)的子宮或輸卵管中，以使該大鼠生產後代大鼠，由此可以得到嵌合大鼠。通過例如嵌合大鼠中大鼠多能幹細胞的來源大鼠品系的毛色的表達、嵌合大鼠的組織切片中報導基因的表達等，可以證實通過本發明的方法製備的嵌合大鼠具有源自大鼠多能幹細胞的組織的事實。具體地，通過報導基因在生殖細胞中的表達來檢測向生殖細胞系的分化，由此可迅速地且方便地證實種系傳遞的存在與否。可以如下實現種系傳遞的最終證實例如，從通過嵌合大鼠的同胞交配得到的後代大鼠的細胞提取DNA，並通過DNA印跡法、基因組PCR等檢測報導基因的存在。通過使具有經證實的種系傳遞的嵌合大鼠與異性大鼠交配，可製備具有對其整個身體做出貢獻的大鼠多能幹細胞的大鼠，即，這樣的大鼠其所有的細胞都攜帶源自大鼠多能幹細胞的遺傳信息。例如，通過使傳遞種系的嵌合大鼠和野生型大鼠交配得到的後代大鼠將具有僅一個源自大鼠多能幹細胞的同源染色體，而通過嵌合大鼠的同胞交配得到的後代大鼠將具有2個源自大鼠多能幹細胞的同源染色體。3.製備基因修飾大鼠的方法
如上所述，通過使傳遞種系的嵌合大鼠與異性大鼠交配，可製備具有對其整個身體做出貢獻的大鼠多能幹細胞的大鼠；因此，通過基因修飾大鼠多能幹細胞，可建立這樣的基因修飾大鼠其所有細胞都具有基因修飾。因此，本發明也提供了一種使用通過上述「2.制 備嵌合胚胎和嵌合大鼠的方法」製備的嵌合大鼠來製備基因修飾大鼠的方法，和通過所述方法製備的基因修飾大鼠。在這裡，「基因修飾大鼠」是指本領域普通技術人員已知的任意基因修飾大鼠，諸如敲除大鼠、敲入大鼠、轉基因大鼠和沉默大鼠。優選地，用於製備基因修飾大鼠的嵌合大鼠是這樣的嵌合大鼠其具有對其做出貢獻的、在上面1-1中描述的、使用ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑建立的大鼠ES細胞。敲除大鼠是指其中靶基因已經被人工破壞的突變型大鼠，且也稱作基因靶向的大鼠。可以製備敲除大鼠，例如，根據在Donehower，A. L.等人艙tore, 356\ 215-221(1992)等中所述的敲除小鼠的製備方法。具體而言，基於靶基因的基因組DNA序列，構建用於同源重組的載體(靶向載體)。在此時，引入藥物抗性基因(諸如G418抗性基因、潮黴素抗性基因等)作為用於選擇重組克隆的標記基因。通過電穿孔方法等，將構建的靶向載體導入大鼠多能幹細胞中。基於標記基因等，從得到的引入了靶向載體的細胞中選擇出其中已經發生同源基因重組的集落。使用如此得到的基因重組的大鼠多能幹細胞，根據本發明的嵌合大鼠生產方法，生產嵌合大鼠。通過使所述嵌合大鼠與野生型大鼠雜交，可以在其後代大鼠中生成雜合的敲除大鼠，且當雜交雜合的敲除大鼠時，可以在其後代大鼠中生成純合的敲除大鼠。近年來，已可能在細胞水平容易地進行靶基因的雙等位基因修飾。具體地，例如，這可以使用諸如鋅指核酸酶(ZFN)等技術來促進。因此，對於大鼠ES細胞，通過使用這些公眾已知的技術造成靶基因發生雙等位基因缺陷，並使用雙等位基因缺陷的ES細胞，可以容易地生產同型敲除(homo-knockout)大鼠。前述敲除大鼠的種類包括有條件的敲除大鼠。「有條件的敲除」是指，使用Cre/IoxP系統或FLP/FRT系統，位點特異性地或時間特異性地敲除基因的系統。具體而言，用偵賭IoxP序列或FRT序列的基因替換要靶向的基因的兩端(3』 -端和5』 -端)，並供給Cre或FLP蛋白以切割前述IoxP序列或FRT序列側接的基因(Sternberg N.，等人，J. MoLBiol. , 150\ 487-507 (1981))。「敲入大鼠」是指這樣的突變型大鼠其中已經在其位點中導入了具有與靶基因的同源性的人工製備的外源基因。所述外源基因的導入可能破壞或不破壞靶基因的功能。例如，為了監測靶基因的表達，可以導入標記基因諸如IacZ基因、GFP基因等，或可以將基因替換為其中已經導入了突變的基因。可以生產敲入大鼠，例如，根據在Pewzner-Jung, Y.等人，J. Immunol. , 161:4634-4645 (1998)等中描述的敲入小鼠的製備方法。基本上，通過與在前述敲除大鼠中相同的原理，可以生產所述大鼠。「轉基因的大鼠」是指其中已經人工導入外源基因的大鼠。常規地通過顯微操作將目標基因注射進從供體動物採集的受精卵母細胞的雄性原核中，從而製備轉基因的動物(顯微注射方法)。將所述受精卵移植進受體動物的輸卵管中，自然地出生的動物變成轉基因的動物。對嵌合大鼠的要求不象在前述敲除大鼠和敲入大鼠的情況下那樣高。但是，本發明的嵌合大鼠的製備方法可有效地用於增加外源基因的導入效率和轉基因的動物個體的製備效率。可以生產轉基因大鼠，例如，根據在Yamamoto H.等人，Cancer Res. , 62'1641-1647 (2002)等中所述的轉基因小鼠的製備方法。
前述轉基因大鼠的種類包括有條件的轉基因的大鼠。「有條件的轉基因的」是指，使用Cre/loxP系統或FLP/FRT系統，位點特異性地或時間特異性地表達基因的系統。具體而言，通過向目標基因中插入其中藥物抗性基因等的兩端(3』 -端和5』 -端)側接IoxP序列或FRT序列的盒，由此抑制目標基因的表達，並供給Cre或FLP蛋白以切割所述IoxP序列或FRT序列側接的基因，由此表達目標基因(Sternberg, N.，等人，J. Mol. Biol. , 150 \487-507 (1981))。「沉默大鼠」是指這樣的大鼠其中已經人工地導入和表達短雙鏈RNA(siRNA，它是用於RNAi (RNA幹擾)的中間體)或反義核酸，且SiRNA或反義核酸的作用會抑制靶基因的表達。基於載體系統對siRNA的表達系統的建立匆仏550-553(2002), NatureBiotech. 20-. 500-505 (2002)等)，已經實現了這樣的沉默動物的製備。可以生產沉默大鼠,例如,根據在Tiscornia, G.等人，Proc. Natl. Acad Sci.USA. 100: 1844-1848 (2003)等中描述的方法。基本上，通過與在前述轉基因的大鼠中相同的原理，可以生產所述大鼠。4.用於製備嵌合大鼠的試劑盒
本發明提供了一種試劑盒，其包含用於製備傳遞種系的嵌合大鼠的培養基。在本發明的試劑盒中包含的培養基(例如，培養液)也可以用於建立大鼠ES細胞，其具有產生傳遞種系的嵌合大鼠的能力。本發明的試劑盒的一個特徵是，它包含含有ES細胞分化抑制劑作為組分的培養基。所述ES細胞分化抑制劑可以是任意物質，只要它在本發明中具有抑制大鼠ES細胞的分化能力的作用。ES細胞分化抑制劑包括，例如，MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF3受體抑制劑和FGF受體抑制劑。在本發明中，使用它們中的至少2種ES細胞分化抑制劑。優選地，ES細胞分化抑制劑包括MEK抑制劑和GSK抑制劑的組合，MEK抑制劑、GSK抑制劑和TGF ^受體抑制劑的組合，以及MEK抑制劑、GSK抑制劑和FGF受體抑制劑的組合；因為產生傳遞種系的嵌合大鼠的高能力，MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFP受體抑制劑是更優選的。在另一個優選模式的實施方案中，除了 ES細胞分化抑制劑以外，可以進一步加入ROCK抑制劑。MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF ^受體抑制劑、FGF受體抑制劑和ROCK抑制劑的細節如上所述。本發明的試劑盒可以含有単獨的或與至少2種或更多種(在適當時)組合的前述ES細胞分化抑制劑。當在所述試劑盒中組合地包含2種或更多種ES細胞分化抑制劑時，可以混合多種ES細胞分化抑制劑並封裝在單個容器中，但是它們優選地封裝在分開的容器中。所述試劑盒可以包含在上面「 I.大鼠多能幹細胞」中定義的大鼠多能幹細胞作為試劑盒組分。所述大鼠多能幹細胞優選地是大鼠ES細胞。前述試劑盒可以進一歩含有飼養細胞作為構成組分。所述飼養細胞可以是源自本領域普通技術人員可得到的任意物種的細胞，且優選地是正常成纖維細胞，而不是建立的飼養細胞系。具體地，可以提及在妊娠第12天至第16天之間的小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養細胞(正常的成纖維細胞)。作為正常的成纖維細胞，例如，例示有第12. 5天的ICR胎兒小鼠的正常成纖維細胞。通過常規方法，可以製備飼養細胞。也可以使用可商業得到 的小鼠胚胎成纖維細胞(Asahi Techno Glass Corporation)。
實施例在下面解釋本發明的實施例，它們不應解釋為限制性的。實施例I:螢光報導基因轉基因大鼠的製備
為了建立和驗證ES細胞，製備了轉基因大鼠，用於通過螢光監測0ct4基因的表達。使用KOD Ver. 2 DNA聚合酶(Toyobo)，通過PCR從Wistar大鼠基因組DNA擴增0ct4啟動子區DNA,並插入pCS2_Venus質粒中。將0ct4啟動子-Venus DNA注射進Wistar大鼠的受精卵的原核中，以得到0ct4-VENUS轉基因的大鼠。實施例2:大鼠ES細胞的製備 (I)試劑和飼養細胞的製備
首先，製備4種抑制劑，即，1-27632作為ROCK抑制劑(WAK0 Company)、PD0325901作為 MEK 抑制劑(Axon Medchem Company)、A-83-01 作為 I 型 TGF-^ 受體抑制劑(T0CRISCompany)和 ￡HIR99021 作為 GSK3 抑制劑(Axon Medchem Company)(在下文中，這 4 種抑制劑稱作「YPAC因子」)。通過將用於ES 細胞的 20% FBS (批號 1204059: GIBCO Company),0. I mM 2-巰基こ醇(Sigma Company)、1%非必需胺基酸儲備液(GIBC0 Company)和1% IX抗生素抗黴菌劑(GIBC0 Company)加入含有 110 mg/L 丙酮酸鈉和 200 mM GlutaMax 的 DMEM (GIBC0Company)中，製備ES細胞的基礎培養基。將YPAC因子加入用於ES細胞的該基礎培養基中，以得到下述濃度10 y M的ROCK抑制劑Y-27632、10 y M的MEK抑制劑PD032590U0. 5 y M的I型TGF- ^受體抑制劑A-83-01和3 ii M的GSK3抑制劑CHIR99021，並將所述培養基用於實驗(在下文中，該培養基稱作「YPAC培養基」)。使用的飼養細胞是絲裂黴素C處理過的新黴素抗性的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF:Millipore)，它們使用如下製備的培養基來維持將10% FBS (EQUITECH-BI0 Company,批號SFB30-1502)和1% IX抗生素抗黴菌劑(GIBC0 Company)加入DMEM中。(2) ES細胞的建立通過用ES細胞的基礎培養基灌注懷孕4. 5或5天的懷孕大鼠的子宮，得到大鼠胚泡。在使用Tyrode緩衝溶液(Ark Resource Company)去除透明帶以後,將所述胚泡轉移至6-孔板，並使用通過將(I)中的YPAC因子加至飼養細胞(MEF)而得的ES細胞的基礎培養基(YPAC培養基)進行培養。約7天後，將胚泡的生長暈重新接種至YPAC培養基；使用Accutase (Innovative Cell Technologies Company),酶促地分離 ES 細胞集落,並培養。在MEF-YPAC培養基條件下培養所建立的ES細胞，並每3_4天傳代。根據常規方法，向YPAC培養基中加入DMSO (二甲基亞碸)，冷凍和融化ES細胞。在加入1000 U/mL rLIF下，培養TgffLl (ES細胞)和TgWL2 (ES細胞)，直到代數達到3或4。(3)使用多種大鼠品系的研究
使用在上面(2)中描述的建立大鼠ES細胞的方法，進行研究來確定是否可以建立非-Wistar品系的大鼠的大鼠ES細胞。結果，能夠建立研究的所有品系的大鼠ES細胞，如表I所示。
表I
品系ICMttttn牛.長錄b鐵續細胞系c
TgWL222 2
TgWW151511
WW9911
LL19192 2
TgWWa332 2
WWa330 0
總汁5151 (100%)88 (100%)
a.使用不同的培養基(FBS:MEF培養，EQUITECH+BI0)
b.生長暈指示ICM的伸長。
c.細胞係指示，培養持續至少7代。在第I代和第3代之間開始單細胞傳代培養。由單細胞連續形成未分化的細胞的穹頂集落。
TgffL:在Wistar和LEA之間的轉基因雜種 Tgffff:在Wistar和野生型Wistar之間的轉基因雜種 WW:野生型Wistar LL: LEA0實施例3:大鼠ES細胞的驗證
驗證了在實施例2中得到的大鼠ES細胞和它們的製備方法。(I) YPAC培養基中的內細胞團(ICM)的生長暈
使用來自在實施例I中製備的轉基因大鼠的胚泡的內細胞團(ICM)，在向實施例2的ES細胞的基礎培養基中添加和不添加YPAC因子的情況下，進行了研究。在沒有YPAC因子存在下，在平板接種以後3天檢測到0ct4-VenUS螢光；但是，7天後，與小鼠ES集落類似的穹頂樣生長出現，但是隨後消失。在有YPAC因子存在下，所述ICM細胞快速地生長，同時在甚至7天後也維持0ct4-Venus螢光(圖Ia和b)。通過定量PCR，檢查多能性因子0ct4、Nanog,Sox2和Rexl的基因表達；與在沒有YPAC因子存在下相比，添加YPAC因子時發現了更高的水平。在有YPAC因子存在下，0ct4 mRNA減少，如同Venus mRNA和螢光強度的表達(圖lc)。在該實驗中，使用的胚泡是從轉基因的Wistar (Tgffff, Arbino)、野生型Wistar(Wff, albion)、LEA (LL,刺鼠)或轉基因的Wistar/LEA (TgffL,刺鼠)雜種衍生出的那些。通過免疫染色證實，在有YPAC因子存在下建立的大鼠ES細胞表達0ct4、Nanog和甚至Sox2(圖 2h)。(2)培養基中的Y因子(ROCK抑制劑)的作用的驗證
當使用不含有ROCK抑制劑(在下文中，稱作「 Y因子」)、但是補充了 MEK抑制劑、I型TGF-^受體抑制劑和GSK3抑制劑(在下文中，這3種抑制劑稱作「PAC因子」)的ES細胞培養基培養所建立的大鼠ES細胞時，得到的集落維持未分化狀態，但是變成稀疏的集落(圖2a)。同吋，當使用補充了單獨的Y因子的ES細胞培養基進行培養時，大鼠ES細胞附著於MEF上並繁殖，但是不能維持未分化狀態，且沒有表現出鹼性磷酸酶活性(圖2a，b)。(3) ES細胞中的核型分析
通過吉姆薩染色，分析了得到的50個大鼠ES細胞的核型；幾乎所有細胞表現出正常的42-染色體核型(圖 2c)。結果是TgWLl (70%,XX,P14), TgffL2 (84%，XX，P7，圖 2c)，Tgffffl(92%, XX，P5)，和 LLl (84%, XX，P6)。(4) DNA微陣列分析
(i)微陣列分析I
作為微陣列分析的結果，發現Tgffffl和LL ES細胞具有類似的基因表達，但是在Tgffffl和大鼠胚胎成纖維細胞(REF)之間觀察到差異。ES細胞的統計分析掲示0. 968的相關係數；儘管多能性標誌物0ct4、Sox2、Dppa3、Tbx3、Fbxo15和Cdhl (也稱作E-鈣粘著蛋白)在Tgffffl和LL中的表達水平是類似的(圖2d)，但是比在REF中更高(圖2e)。(ii)微陣列分析2
作為微陣列分析的結果，發現TgWLl、Tgffffl和LLl ES細胞具有類似的基因表達，但是在ES細胞和大鼠胚胎成纖維細胞(REF)之間觀察到差異(圖2g)。ES細胞的統計分析掲示TgffLl和Tgffffl之間的0. 971的相關係數以及Tgffffl和LLl之間的0. 961的相關係數。(5)畸胎瘤的形成
使用Accutase，將在實施例2中製備的Tgffffl細胞(ES細胞)分散成單個細胞，此後用10 mL PBS洗滌細胞2次，並將懸浮於100 uL PBS中的2. 6 X IO6細胞皮下注射進免疫缺陷的小鼠中；在34天時在該小鼠中檢測到畸胎瘤(圖2f)。將所述畸胎瘤固定在石蠟中，並使用蘇木素-曙紅進行組織學染色；證實了分化成內胚層、中胚層和外胚層3個胚層(圖2i)。(6) ES細胞胚狀體的形成(胚狀體EB)
使用Accutase，將在實施例2中製備的大鼠ES細胞分散成單個細胞，此後使用通過將不含Y因子的3種抑制劑(PAC因子)添加至低附著力皿(NUNC Company)上的實施例2的ES細胞培養基而製備的ES細胞培養基培養來細胞，以獲得胚狀體(EB);所述細胞高效率地聚集，形成明顯的三維EB (圖3b)。0ct4-VenuS螢光強度在7天時增加，通過定量PCR證實，Venus、0ct4、Nanog、Sox2和Rexl的表達也得到維持(圖3c)。同時，在沒有添加PAC因子的情況下，EB的製備效率顯著低於小鼠EB(圖3a)，但是各種多能性標記基因的表達降低(圖 3c)。實施例4:使用多個品系通過YPAC注射製備種系傳遞嵌合大鼠使用如下所述的多個ES細胞品系，製備種系傳遞嵌合大鼠。(I)胚泡的製備
在注射培養基(不含抗生素的YPAC培養基)中溫育從懷孕4. 5天的懷孕大鼠得到的胚泡2-3小時，然後用於顯微注射。(2) ES細胞的製備
使用玻璃管，採集在實施例2中的ES細胞的10-20個穹頂樣集落，並用Accutase處理5分鐘，然後將它們在注射培養基中分散成單個細胞。接著，將所述細胞轉移至500 UL注射培養基，並在室溫溫育30-60分鐘，然後離心ES細胞，並轉移至注射培養基，用礦物油(SIGMA Company)覆蓋。(3) ES細胞注射進胚泡中
將10-15個ES細胞注射進胚泡中，並恢復胚胎的原始狀態，在注射培養基中在37 °〇溫育胚泡3-5小時。將10-20個胚胎轉移至懷孕3. 5天的假妊娠大鼠的子宮角。通過毛色來鑑定嵌合大鼠，並通過出生的Fl大鼠(作為交配嵌合大鼠的結果)的毛色和通過胎兒生殖細胞的0ct4-VENUS螢光來鑑定種系傳遞。通過對尾巴DNA進行PCR，實現基因分型。實施例5:種系傳遞嵌合大鼠和及其製備方法的驗證 如下所述驗證YPAC注射方法和種系傳遞的實用性。(I)大鼠ES報導細胞(青色)的製備
為了監測大鼠ES細胞,使用小鼠ES細胞Nucreofector試劑盒(Amaxa Company),將5Ug 口046^11^&111導入3.2\106個1§111細胞(ES細胞)中；使用玻璃管，採集發射青色/綠色螢光的CAG-AmCyanl/0ct4-VENUS陽性的ES細胞的集落，並在沒有藥物選擇下擴增，將這些用作監測細胞(Tgffffl+C)。另外，將10 u g 0(^4;6皿8導入2.4父106個1^細胞(￡3細胞)中，並以相同的方式製備報導ES細胞(LL1+V)。(2)添加YPAC因子的注射培養基的作用的驗證
進行了向注射培養基中添加和不添加YPAC因子的研究。在溫育5小時以後，在沒有YPAC因子存在下進行注射所得到的結果與在有YPAC因子存在下進行注射(在下文中，稱作「YPAC注射」)所得到的結果之間沒有差異；多個青色陽性的細胞附著到內細胞團(ICM)和營養外胚層(TE)上。但是，在沒有YPAC因子存在下溫育30小時以後，小量凋亡的青色陽性的細胞存在於胚泡中，而在有YPAC因子存在下，一些細胞積累在ICM上，且胚泡的形狀得到維持(圖4b)。(3)產生種系嵌合大鼠的能力的驗證
將實施例5 (I)的ES細胞Tgffffl+C注射進胚泡中，並溫育3. 5小時，然後將它們轉移至假妊娠3. 5天的小鼠的子宮中。發現處於18天胚胎的9個個體中的2個在表皮和腎中是青色陽性的且0ct4-Venus陰性的。在生殖腺的生殖細胞中特異性地檢測到0ct4_Venus陽性的細胞(圖4c)。對於所有其它ES細胞，也通過檢測胎兒生殖腺上的0ct4-Venus螢光，證實種系嵌合體的形成。在12隻小鼠中的2隻中，甚至在經過22代的長期培養的TgWL2細胞中，也鑑別出種系嵌合體。此外，也在LL1+V中證實了種系傳遞，所述LL1+V通過將0ct4-Venus基因導入從LEA大鼠品系誘導的LL細胞中來製備。為了通過毛色來鑑定嵌合體，在添加YPAC因子的情況下，將TgWLl細胞注射進Wistar大鼠中。在23個個體中，經過11或12的代數，從TgWLl細胞形成了 8隻嵌合彩色大鼠(圖4d)。同吋，當在沒有添加YPAC因子的情況下進行注射時，儘管使用具有6或8的小代數的相同細胞系，也難以製備嵌合彩色大鼠，44個個體中僅I個是嵌合彩色大鼠；嵌合體比率低。在所有4個細胞系中，使用YPAC因子來製備嵌合彩色大鼠都是成功的。為了證實在Fl中的種系傳遞，使TgWLl嵌合體和Wistar大鼠交配；雌性嵌合體中的ー個個體生產了 16個含有TgWLl細胞系的種系傳遞的個體中的4個刺鼠色的後代個體(圖4e)。另外,也在源自TgWL2細胞系的細胞中證實了 Fl種系傳遞。已經發現，如表2和表3所示，當使用YPAC因子來製備嵌合大鼠時，可以製備出傳遞種系的嵌合大鼠，而不受大鼠ES細胞品系和宿主大鼠品系的限制。使用的細胞系是TgWLl和TgWL2，它們是從TgWL大鼠(轉基因的Wistar大鼠和LEA大鼠之間的雜種)建立的ES細胞，Tgffffl和Tgffff2，它們是從Tgffff大鼠(Tgffff:轉基因的Wistar大鼠和野生型Wistar大鼠之間的雜種)建立的ES細胞，Wffl，它是從Wff大鼠(野生型Wister大鼠)建立的ES細胞，以及LLl和LL2，它們是從LL大鼠(LEA大鼠)建立的ES細胞。為了通過基因分析鑑定Venus區，採集尾巴基因組DNA，並通過PCR進行擴増。R)嵌合體的0ct4-VenuS基因通過孟德爾定律遺傳給3個刺鼠色的Fl種系個體中的2個(圖4f)。如表2所示，當將長期培養的ES細胞(TgWL2:代數22)注射進胚泡中時，在17. 5天的胚胎的生殖腺上檢測到Venus螢光(圖4i)。此外，研究了 YPAC因子對嵌合體比率的影響。當在將TgWLl大鼠ES細胞(代數6)注射進胚泡中時和在培養胚泡時不添加YPAC地製備嵌合體時(圖4j)，如圖4j中的箭頭所示，發現刺鼠毛色嵌合體比率較低。同時，在有YPAC因子存在下，製備Tgffffl和LLl ES細胞的嵌合體(A細胞注射進LEA胚泡中；B :將LLl細胞注射進Wistar胚泡中)；如圖4k所示，發現刺鼠毛色嵌合體比率較高。圖4k中的箭頭指示ES細胞對嵌合體的貢獻程度。
權利要求
1.一種製備嵌合胚胎的方法，所述方法包括下述步驟(a)和(b) Ca)在ES細胞分化抑制劑的存在下使從雌性大鼠採集的受精宿主胚胎與大鼠多能幹細胞接觸的步驟， (b)培養該與大鼠多能幹細胞接觸的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步驟。
2.根據權利要求I所述的方法，其中通過將大鼠多能幹細胞注射進宿主胚胎中來實現所述接觸。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中在步驟(a)中，在ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的存在下，使所述大鼠多能幹細胞與所述宿主胚胎接觸。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中在與大鼠多能幹細胞接觸之前，在ES細胞分化抑制劑的存在下，預培養所述宿主胚胎。
5.根據權利要求4所述的方法，其中在ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的存在下，進行所述預培養。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中在ES細胞分化抑制劑的存在下，進行步驟(b)中的培養。
7.根據權利要求6所述的方法，其中在ES細胞分化抑制劑和ROCK抑制劑的存在下，進行步驟(b)中的培養。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述ES細胞分化抑制劑由至少2種選自下述的藥物組成=MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF ^受體抑制劑和FGF受體抑制劑。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述ES細胞分化抑制劑由MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFP受體抑制劑組成。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述多能幹細胞是ES細胞。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述大鼠多能幹細胞是從這樣的大鼠品系製備的多能幹細胞在步驟(a)中，在ES細胞分化抑制劑的非存在下與宿主胚胎接觸時，所述大鼠品系不會生產傳遞種系的嵌合大鼠。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述宿主胚胎源自這樣的大鼠品系在步驟(a)中，在ES細胞分化抑制劑的非存在下與大鼠多能幹細胞接觸時，所述大鼠品系不會生產傳遞種系的嵌合大鼠。
13.一種製備嵌合大鼠的方法，所述方法包括將根據權利要求1-12中任一項所述的方法製備的嵌合胚胎移植進假妊娠的雌性大鼠的子宮或輸卵管中，以使後代大鼠生出。
14.一種製備大鼠的方法，所述大鼠具有大鼠多能幹細胞對整個身體的貢獻，所述方法包括使嵌合大鼠與異性大鼠交配。
15.一種用於製備嵌合大鼠的培養基，所述培養基包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑和TGFP抑制劑。
16.根據權利要求15所述的培養基，所述培養基進一步包含ROCK抑制劑。
17.—種基因修飾大鼠，其具有經歷雙等位基因基因修飾大鼠ES細胞的貢獻。
18.一種製備基因修飾大鼠的方法，所述方法包括對大鼠ES細胞進行雙等位基因基因修飾的步驟。
全文摘要
本發明提供了嵌合胚胎和嵌合大鼠的製備方法，其特徵在於，在ES細胞分化抑制劑的存在下，使大鼠多能幹細胞和宿主胚胎接觸。所述方法包括(a)在ES細胞分化抑制劑的存在下使從雌性大鼠採集的受精宿主胚胎與大鼠多能幹細胞接觸的步驟，和(b)培養與大鼠多能幹細胞接觸的宿主胚胎以形成嵌合胚胎的步驟。
文檔編號C12N5/073GK102762717SQ20108005462
公開日2012年10月31日 申請日期2010年11月30日 優先權日2009年12月1日
發明者川又理樹, 落谷孝廣 申請人:Ds製藥生物醫學株式會社, 日本國立癌症研究中心