開發萜烯合酶變體的方法
2023-12-10 06:27:02 4
開發萜烯合酶變體的方法
【專利摘要】本公開內容涉及通過經工程改造的宿主細胞開發萜烯合酶變體的方法。具體地，本公開內容提供了開發具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的方法，所述萜烯合酶變體可用於萜烯產物的商業生產。在本公開內容中另外包括優良的萜烯合酶變體和包含這樣的萜烯合酶變體的宿主細胞。
【專利說明】開發萜烯合酶變體的方法
【1.【技術領域】】
[0001]本公開內容涉及通過經工程改造的宿主細胞開發萜烯合酶變體的方法。具體地，本公開內容提供了開發具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的方法，所述萜烯合酶變體可用於萜烯產物的商業生產。在本公開內容中另外包括優良的萜烯合酶變體和包含這樣的萜烯合酶變體的宿主細胞。
【2.【背景技術】】
[0002]萜類是在許多生物中產生的一大類烴。它們通過連接異戊二烯(C5H8)單元而衍生出，並且根據存在的異戊二烯單元的數目來分類。半萜由單個異戊二烯單元組成。異戊二烯自身被視作唯一的半萜。單萜由2個異戊二烯單元構成，且具有分子式CltlH1615單萜的例子是香葉醇、檸檬烯和松油醇。倍半萜由3個異戊二烯單元組成，且具有分子式C15H2415倍半萜的例子是金合歡烯、法尼醇和廣藿香醇。二萜由4個異戊二烯單元構成，且具有分子式C2(iH32。二萜的例子是咖啡醇、咖啡白脂、西柏烯和紫杉二烯。二倍半萜由5個異戊二烯單元構成，且具有分子SC25H4tl。二倍半萜的一個例子是香葉基法尼醇。三萜由6個異戊二烯單元組成，且具有分子式C3tlH4815四萜含有8個異戊二烯單元，且具有分子式C4(iH64。生物學上重要的四萜包括無環的番茄紅素、單環的Y-胡蘿蔔素和二環的α-胡蘿蔔素和β-胡蘿蔔素。多萜由許多異戊二烯單元的長鏈組成。天然橡膠由其中雙鍵為順式的聚異戊二烯組成。
[0003]當萜類經過化學改性(例如，通過氧化或碳骨架的重排)時，得到的化合物通常被稱作萜類化合物，其也被稱作類異戊二烯。類異戊二烯起許多重要的生物學作用，例如，作為電子傳遞鏈中的醌，作為膜組分，通過蛋白質異戊二烯化在亞細胞靶向和調節中起作用，作為光合色素(包括類胡蘿蔔素、葉綠素)，作為激素和輔因子，和作為植物防禦化合物(利用不同的單萜、倍半萜和二萜 )。它們在工業上可用作抗生素、激素、抗癌藥物、殺蟲劑和化學試劑。
[0004]通過異戊烯基焦磷酸(異戊烯基二磷酸或IPP)和它的異構體二甲基烯丙基焦磷酸(二甲基烯丙基二磷酸或DMAPP)的縮合，生物合成萜類。已知2個產生IPP和DMAPP的途徑，即真核生物的甲羥戊酸依賴性的(MEV)途徑和原核生物的獨立於甲羥戊酸的途徑或脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑。植物利用MEV途徑和DXP途徑。IPP和DMAPP又通過異戊二烯基二磷酸合酶(例如，分別為GPP合酶、FPP合酶和GGPP合酶)的作用而縮合成聚異戊二烯基二磷酸(例如，香葉基二磷酸或GPP、法呢基二磷酸或FPP、和香葉基香葉基二磷酸或GGPP)。
[0005]聚異戊二烯基二磷酸中間體被萜烯合酶轉化成更複雜的類異戊二烯結構。萜烯合酶屬於形成多種產物的大基因家族。萜烯合酶的例子包括倍半萜合酶，其將FPP轉化成倍半萜。倍半萜合酶的一個例子是金合歡烯合酶，其將FPP轉化成金合歡烯。已經廣泛地研究並充分地理解了萜烯合酶的反應機理。總體上，需要3個步驟才能將二磷酸底物諸如FPP轉化成它的類異戊二烯產物:a)形成酶-底物複合物(ES)，b)形成酶-結合的反應性的碳陽離子中間體，隨後重排，並形成產物(EP)，和c)從酶-產物複合物釋放出產物。對萜烯合酶催化的反應的體外動力學和前穩態動力學研究已經證實，所述反應的總限速步驟是產物的釋放(Cane 等人.(1997)Biochemistry, 36(27):8332-9,和 Mathis 等人.(1997)Biochemistry 36(27):8340-8)。職烯合酶的周轉率較低,通常在小於0.5s-1測得(Cane, D.C.(1990)Chem.Rev.90:1089-1103)。
[0006]萜烯合酶在通向類異戊二烯的途徑通量的調節中是重要的，因為它們在代謝分支點起作用，並經常與其它代謝酶競爭異戊二烯基二磷酸庫。例如，FPP是許多細胞分子(包括角鯊烯、多萜醇和輔因子血紅素)的前體。在希望在其中生產倍半萜(諸如金合歡烯)的經工程改造的微生物中，萜烯合酶在這類萜的高產量生產中起關鍵作用。但是，因為它們是慢速酶，萜烯合酶經常是代謝途徑的瓶頸。另外，它們可能具有其它缺點，諸如底物抑制，所述底物抑制會限制在經工程改造的微生物宿主中有效地生產萜類所需的動力學能力(Crock等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 94:12833-12838)。 [0007]因此，提高萜烯合酶的催化效率使得這些酶不再限制通向類異戊二烯的總代謝通量，具有潛在巨大的益處。以前已經描述了為改變的產物特異性而工程改造萜烯合酶的嘗試以及合理方案(諸如基於結構引導或適應進化的那些)的應用(Greenhagen等人.(2006)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 103:9826-9831;O』 Maille 等人.(2008)Nat.Chem.Biol.4:617-623; Yoshikuni 等人.(2006) Nature 440:1078-1082; Yoshikuni 等人.(2008)Chem.Biol.15:607-618)。但是，這些研究沒有在維持萜烯合酶的產物特異性的同時也提高萜烯合酶的動力學能力。另外，常規蛋白質工程策略(諸如定向進化)的應用已經迴避了萜烯合酶，主要因為缺少可利用的且有效的高通量篩選方法(Yoshikuni等人.(2008)(出處同上))。因此，需要用於提高萜烯合酶的催化效率的可靠的高通量方法，以及具有這樣的提高的催化效率的萜烯合酶變體。
【3.
【發明內容】
】
[0008]本公開內容涉及通過經工程改造的宿主細胞開發萜烯合酶變體的方法。具體地，本公開內容提供了開發具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的方法。所述方法也允許連續提高這些酶的體內性能。
[0009]在一個方面，本發明提供了具有提高的體內性能的倍半萜合酶變體的篩選方法，所述方法包括下述步驟:
[0010]a)將表達對照倍半萜合酶的宿主細胞工程改造成包含高水平的FPP，其中與不包含高水平的FPP的親本細胞相比，所述高水平的FPP會降低宿主細胞的生存力；
[0011]b)在所述宿主細胞中表達試驗倍半萜合酶而不是對照倍半萜合酶，其中所述試驗倍半萜合酶是對照倍半萜合酶的變體；和
[0012]c)通過與表達對照萜烯合酶的宿主細胞相比表達試驗倍半萜合酶的宿主細胞的生存力增加，將試驗倍半萜合酶鑑別為具有與對照倍半萜合酶相比提高的體內性能。
[0013]在某些實施方案中，將宿主細胞鋪板在瓊脂平板上，並通過菌落生長來鑑別包含具有提高的體內性能的試驗萜烯合酶變體的宿主細胞。在某些實施方案中，所述方法進一步包括選擇和/或分離具有提高的體內性能的試驗倍半萜合酶。
[0014]在某些實施方案中，在宿主細胞集合中表達倍半萜合酶變體集合。在某些實施方案中，所述倍半萜合酶變體集合包含2-5、5-10、10-50、50-100、100-500、500-1，000、I, 000-10，000、10，000-100，000、100，000-1，000，000、和更多種倍半萜合酶變體。
[0015]在某些實施方案中，以迭代方式使用篩選方法，其中在一個迭代中鑑別出的試驗倍半萜合酶用作下一個迭代的對照倍半萜合酶，且其中在一個迭代中的宿主細胞包含如此高水平的FPP:在有在前一個迭代中鑑別出的試驗倍半萜合酶存在下，與不包含高水平的FPP的親本細胞相比，所述宿主細胞具有降低的生存力。
[0016]在另一個方面，本文提供了包含2個細胞亞群的組合物，所述細胞亞群源自共同的包含高水平的FPP的宿主細胞群，其中:
[0017]a)第一亞群包含對照倍半萜合酶，其中與不包含高水平的FPP的親本細胞的生存力相比，所述高水平的FPP會第一亞群的細胞的生存力；和
[0018]b)第二亞群包含試驗倍半萜合酶，其中所述試驗倍半萜合酶是對照倍半萜合酶的變體。
[0019]在某些實施方案中，所述第二亞群的細胞的生存力大於第一亞群的細胞的生存力。
[0020]在另一個方面，本發明提供了用於鑑別具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的第二種篩選方法，所述方法包括下述步驟:
[0021]a)提供宿主細胞，其表達對照萜烯合酶且具有一定生長速率；
[0022]b)在所述宿主細胞中表達試驗萜烯合酶而不是對照萜烯合酶，其中所述試驗萜烯合酶是對照萜烯合酶的變體；和
[0023]c)通過與表達對照萜烯合酶的宿主細胞的生長速率相比表達試驗萜烯合酶的宿主細胞的生長速率的下降，將試驗萜烯合酶鑑別為具有與對照萜烯合酶相比提高的體內性倉泛。
[0024]在另一個方面，本發明提供了鑑別萜烯合酶變體的體內性能和/或將其排序的競爭方法，所述方法包括下述步驟:
[0025]a)將宿主細胞群分成對照群和試驗群；
[0026]b)在所述對照群中表達對照萜烯合酶和對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶可以將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第一萜烯，且其中所述對比萜烯合酶可以將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第二萜烯；
[0027]c)在所述試驗群中表達對比萜烯合酶和試驗萜烯合酶，其中所述試驗萜烯合酶是對照萜烯合酶的變體，且其中所述對比萜烯合酶在試驗群中和在對照群中以類似的水平表達；和
[0028]d)在試驗群中和在對照群中測量第一萜烯與第二萜烯之比。
[0029]在單獨的實施方案中，使用所述競爭方法來鑑別選自下述的萜烯合酶和/或對其排序:單萜合酶、二萜合酶、倍半萜合酶、二倍半萜合酶、三萜合酶、四萜合酶和多萜合酶。
[0030]在某些實施方案中，使用所述競爭方法來篩選突變體萜烯合酶文庫，其基礎是?與對照萜烯合酶相比，具有提高的體內性能的萜烯合酶變體能夠將更多通量從聚異戊二烯基二磷酸底物轉向它的職烯產物，從而產生更高的目標職烯/對比職烯之比(即，第一職烯/第二萜烯)。在這樣的實施方案中，重要的是，在試驗群中表達試驗萜烯合酶的水平與在對照群中表達對照萜烯合酶的水平類似。[0031]在其它實施方案中，使用所述競爭方法來鑑別所需強度的啟動子。在這樣的實施方案中，對照萜烯合酶和試驗萜烯合酶是相同的，並且對照群和試驗群的差別在於對照萜烯合酶的表達水平。
[0032]在另一個方面，本文提供了包含2個細胞亞群的組合物，所述細胞亞群源自共同的宿主細胞群，其中:
[0033]a)第一亞群包含對照萜烯合酶和對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶會將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第一萜烯，且其中所述對比倍半萜合酶會將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第二萜烯；和
[0034]b)第二亞群包含試驗萜烯合酶和對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶會將聚異戍二烯基二磷酸轉化成第一職烯，且其中所述試驗職烯合酶是對照職烯合酶的變體。
[0035]在某些實施方案中，第二亞群的第一萜烯與第二萜烯之比大於第一亞群。
[0036]在另一個方面，本文提供了分離的金合歡烯合酶變體和分離的核酸，所述核酸包含編碼這類金合歡烯合酶變體的核苷酸序列，所述β-金合歡烯合酶變體具有在在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含一個或多個在選自下述的位置處的胺基酸置換:SEQ ID N0:111 的位置2、3、4、6、9、11、18、20、24、35、38、50、61、72、80、89、105、115、144、196、211、251、280、288、319、348、357、359、369、371、385、398、423、433、434、442、444、446、460、467、488、495、505、526、531、556、572 和 575。
[0037]在另一個方面，本發明提供了一種遺傳修飾的宿主細胞，其包含:
[0038](a)異源金合歡烯合酶，其中所述異源金合歡烯合酶是由SEQ ID NO: 111編碼的β -金合歡烯合酶的變體；和
[0039](b) MEV途徑或DXP途徑酶；
[0040]其中與包含MEV途徑或DXP途徑酶和由SEQ ID NO: 111編碼的β -金合歡烯合酶的親本細胞相比，所述宿主細胞產生多了至少15%的β-金合歡烯。
[0041]在另一個方面，本文提供了一種生產金合歡烯的方法，所述方法包括下述步驟:
[0042](a)獲得多個遺傳修飾的宿主細胞，其包含:
[0043]i)第一異源核苷酸序列，其編碼由SEQ ID NO: 111編碼的β -金合歡烯合酶的變體；和
[0044]ii)第二異源核苷酸序列，其編碼MEV途徑或DXP途徑酶；
[0045](b)在適合生產金合歡烯的條件下，在包含碳源的培養基中，培養所述遺傳修飾的宿主細胞；和
[0046](C)從所述培養基回收β -金合歡烯。
【4.【專利附圖】
【附圖說明】】
[0047]當結合附圖閱讀時會最佳地理解本公開內容，所述附圖用於解釋優選實施方案。但是，應當理解，本公開內容不限於在附圖中公開的具體實施方案。
[0048]圖1A-Z提供了在本發明宿主細胞的製備中使用的幾種染色體整合構建體的圖
-1'TfeP曰。
[0049]圖2提供了用於基於FPP飢餓的選擇的幾個瓊脂平板的圖像，在所述瓊脂平板上塗布了包含有活性的和無活性的倍半萜合酶的大腸桿菌宿主細胞。
[0050]圖3提供了用於基於FPP毒性的生長選擇的2個瓊脂平板的圖像，在所述瓊脂平板上塗布了包含有活性的和無活性的倍半萜合酶的大腸桿菌宿主細胞。
[0051]圖4提供了通過大腸桿菌宿主細胞的GC分析得到的金合歡烯滴度，所述大腸桿菌宿主細胞包含不同的金合歡烯合酶編碼序列。[0052]圖5提供了用於基於FPP毒性的生長選擇的瓊脂平板的圖像，在所述瓊脂平板上塗布了包含有活性的和無活性的倍半萜合酶的釀酒酵母宿主細胞。
[0053]圖6提供了通過釀酒酵母宿主細胞的尼羅紅螢光分析得到的金合歡烯滴度，所述釀酒酵母宿主細胞包含染色體整合的或染色體外維持的金合歡烯合酶編碼序列。
[0054]圖7提供了通過倍半萜合酶競爭排序的、通過釀酒酵母宿主細胞的GC分析得到的金合歡糹布滴度。
[0055]圖8提供了通過釀酒酵母宿主細胞的GC分析得到的金合歡烯/曲古二烯(trichodiene)滴度比，所述釀酒酵母宿主細胞包含增加的拷貝數的金合歡烯合酶編碼序列。
[0056]圖9提供了通過倍半萜合酶文庫的大腸桿菌宿主細胞的GC分析相對於尼羅紅螢光分析得到的金合歡烯滴度對比。
[0057]圖10提供了通過大腸桿菌宿主菌株的GC分析得到的金合歡烯滴度，所述大腸桿菌宿主菌株從通過尼羅紅螢光篩選出的FS變體文庫中鑑別出。
[0058]圖11提供了通過釀酒酵母宿主菌株的尼羅紅螢光(A)和GC分析(B)得到的金合歡烯滴度，所述釀酒酵母宿主菌株從通過基於FPP毒性的生長選擇篩選出的FS變體文庫中鑑別出。
[0059]圖12提供了通過釀酒酵母宿主菌株的尼羅紅螢光分析得到的金合歡烯滴度，所述釀酒酵母宿主菌株從通過基於FPP毒性的生長選擇篩選出的FS變體文庫中鑑別出。
[0060]圖13提供了在本發明宿主細胞的製備中使用的不同表達質粒的圖譜。
[0061]圖14提供了通過釀酒酵母宿主菌株的GC分析得到的金合歡烯滴度，所述釀酒酵母宿主菌株包含FS變體編碼序列的單個染色體整合的拷貝。
[0062]圖15提供了用於生產IPP和DMAPP的MEV途徑的示意圖。
[0063]圖16提供了用於生產IPP和DMAPP的DXP途徑的示意圖。
[0064]圖17提供了通過釀酒酵母宿主細胞的GC分析得到的紫穗槐二烯(amorphadiene)/曲古二烯滴度比,所述釀酒酵母宿主細胞包含紫穗槐二烯合酶變體的編碼序列。
[0065]圖18提供了通過釀酒酵母宿主細胞的GC分析得到的檸檬烯/香葉烯(myrcene)滴度比，所述釀酒酵母宿主細胞包含檸檬烯合酶變體的編碼序列。
【5.【具體實施方式】】
[0066][5.1 定義】
[0067]在本文中使用的下述術語應當具有下面指出的含義。
[0068]本文中使用的術語「萜烯合酶變體」表示，與選定的萜烯合酶相比具有不同的核苷酸或胺基酸序列的萜烯合酶。例如，與選定的萜烯合酶的野生型序列相比，萜烯合酶變體可以包含可能導致或不導致對應胺基酸序列變化的核苷酸添加、缺失和/或置換。在某些其中核苷酸變化不會導致胺基酸序列變化的實施方案中，所述核苷酸變化仍然可能實現提高的合酶活性，例如，通過密碼子優化。在其它實施方案中，所述萜烯合酶變體包含胺基酸添加、缺失和/或置換。因此，本文中使用的術語「倍半萜合酶變體」表示，與選定的倍半萜合酶相比具有不同的核苷酸或胺基酸序列的倍半萜合酶。例如，與選定的倍半萜合酶相比，倍半萜合酶變體可以包含可能導致或不導致對應胺基酸序列變化的核苷酸添加、缺失和/或置換。在其它實施方案中，所述萜烯合酶變體包含胺基酸添加、缺失和/或置換。
[0069]本文中使用的術語「經工程改造的宿主細胞」表示，通過使用基因工程技術(SP，重組技術)遺傳修飾親本細胞而產生的宿主細胞。經工程改造的宿主細胞可以包含對親本細胞的基因組的核苷酸序列的添加、缺失和/或修飾。
[0070]本文中使用的術語「異源的」表示，在自然界中通常不存在的物質。術語「異源核苷酸序列」表示在自然界的給定細胞中通常不存在的核苷酸序列。這樣，異源核苷酸序列可以是:(a)對於它的宿主細胞而言是的外來(即，對於該細胞而言是「外源的」);(b)在宿主細胞中天然地存在(即，「內源的」)，但是在該細胞中以非天然量存在(即，比在宿主細胞中天然存在的量更大或更小)；或(C)在宿主細胞中天然地存在，但是位於它的天然基因座之外。
[0071]本文中使用的術語「天然存在的」表示在自然界中存在的物質。例如，這樣的萜烯合酶是天然存在的萜烯合酶:其存在於可從自然界來源分離出的生物體中，且其尚未在實驗室中進行人工故意修飾。相反，本文中使用的術語「天然地不存在的」表示在自然界中不存在、而是通過人工幹預產生的物質。
[0072]本文中使用的術語「生物合成酶」表示這樣的酶:其在生物合成途徑中起作用，從而導致天然存在的分子的產生。
[0073]本文中使用的術`語「體內性能」表示，當在宿主細胞中表達時，萜烯合酶的將聚異戊二烯基二磷酸底物轉化成萜烯的能力。因此，術語「提高的體內性能」表示，當在宿主細胞中表達時，萜烯合酶的將聚異戊二烯基二磷酸底物轉化成萜烯的能力增加。
[0074]本文中使用的術語「親本細胞」表示這樣的細胞:其具有與本文公開的宿主細胞相同的遺傳背景，但是其不包含升高的細胞內FPP水平或者不包含特定異源核苷酸序列，並且其充當引入所述升高的細胞內FPP水平或所述異源核苷酸序列的起始點，從而導致本文公開的宿主細胞的產生。
[0075]【5.2 —般概述】
[0076]本公開內容涉及通過經工程改造的宿主細胞開發萜烯合酶變體的方法。具體地，本公開內容提供了開發具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的方法。所述方法也允許連續提高這些酶的體內性能。
[0077]在一個方面，本發明提供了具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的篩選方法。在某些實施方案中，通過它們的解救經工程改造的宿主細胞免於細胞死亡的能力，鑑別出具有提高的體內性能的萜烯合酶變體。所述經工程改造的宿主細胞包含會造成升高的細胞內FPP水平的遺傳修飾。因為FPP對細胞具有高毒性並因此降低細胞生存力(Withers等人.(2007) Appl.Environ.Microbiol.73:6277-6283)，為了實現與不包含高水平的細胞內FPP的親本細胞相當的生存力，所述經工程改造的宿主細胞需要足夠活性的倍半萜合酶來降低細胞內FPP水平。
[0078]因此，本文提供的篩選方法包括下述步驟:
[0079]a)將表達對照倍半萜合酶的宿主細胞工程改造成包含高水平的FPP，其中與不包含高水平的FPP的親本細胞相比，所述高水平的FPP會降低宿主細胞的生存力；
[0080]b)在所述宿主細胞中表達試驗倍半萜合酶而不是對照倍半萜合酶，其中所述試驗倍半萜合酶是對照倍半萜合酶的變體；和
[0081]c)通過與表達對照倍半萜合酶的宿主細胞相比表達試驗倍半萜合酶的宿主細胞的生存力增加，將試驗倍半萜合酶鑑別為具有與對照倍半萜合酶相比提高的體內性能。
[0082]在某些實施方案中，所述方法進一步包括選擇和/或分離具有提高的體內性能的試驗倍半萜合酶。
[0083]如果宿主細胞中的高水平的FPP是可誘導的，那麼是最方便的。誘導可以響應於誘導劑或特定生長條件(例如，溫度)而發生。宿主細胞中高水平的FPP可以在比親本細胞的FPP水平高約10%到至少約1，000倍或更高的範圍內。
[0084]表達對照倍半萜合酶的宿主細胞與親本細胞相比降低的生存力可以是從降低的細胞生長至致死。因而，在某些實施方案中，與親本細胞相比，表達對照倍半萜合酶的宿主細胞會在液體培養物中或在瓊脂平板上產生減少數目的後代細胞。在其它實施方案中，與親本細胞相比，表達對照倍半萜合酶的宿主細胞在液體培養物中或在瓊脂平板上不產生後代細胞。因此，表達試驗倍半萜合酶(而不是對照倍半萜合酶)的宿主細胞的生存力的增加可以表現為:在液體培養 物中，更高數目的後代細胞；或者，在瓊脂平板上，與表達對照倍半萜合酶的宿主細胞產生的後代細胞的數目或菌落大小相比，更大的菌落大小。
[0085]通過改變宿主細胞中在FPP或其前體的生產中涉及的酶的表達和/或活性，可以實現宿主細胞中高水平的FPP。在某些這樣的實施方案中，改變MEV或DXP途徑的酶的表達和/或活性。在某些這樣的實施方案中，改變HMG-CoA還原酶和/或甲羥戊酸激酶的表達和/或活性。可替換地，通過改變宿主細胞中FPP或其前體的利用所涉及的酶的表達和/或活性，可以實現宿主細胞中高水平的FPP。在某些這樣的實施方案中，改變角鯊烯合酶的表達和/或活性。
[0086]所述對照倍半萜合酶可以是天然存在的倍半萜合酶或天然地不存在的倍半萜合酶。所述試驗倍半萜合酶與所述對照倍半萜合酶的差別可能在於，包含一個或多個胺基酸置換、缺失和/或添加。另外或可替換地，所述試驗倍半萜合酶可以包含與所述對照倍半萜合酶相同的胺基酸，但是編碼這些胺基酸的密碼子在所述試驗倍半萜合酶和所述對照倍半萜合酶之間可能是不同的。在某些這樣的實施方案中，所述密碼子為在宿主細胞中的使用經過優化。
[0087]在某些實施方案中，所述對照倍半萜合酶選自:β_金合歡烯合酶、α-金合歡烯合酶、曲古二烯合酶、廣藿香醇合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦倫烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶和努特卡酮合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照倍半萜合酶是黃花蒿(Artemisia annua)的β-金合歡烯合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照倍半職合酶具有在SEQ ID NOilll中給出的胺基酸序列。
[0088]為了能夠對比宿主細胞在有試驗倍半萜合酶存在下的生存力和宿主細胞在有對照倍半萜合酶存在下的生存力，必須確保所述對照倍半萜合酶和所述試驗倍半萜合酶在宿主細胞中的類似表達水平。這可以如下實現:將2種宿主細胞中編碼倍半萜合酶的核苷酸序列置於相同調節元件的控制下。
[0089]為了防止其中包含生長促進突變(而不是改進的倍半萜合酶變體)的快速生長的假陽性宿主細胞在宿主細胞培養物中佔優勢的競爭性生長情形，所述篩選方法的一個實施方案包含基於瓊脂平板的選擇系統。在該實施方案中，將宿主細胞鋪在瓊脂平板上，並通過菌落生長來鑑別包含具有提高的體內性能的試驗倍半萜合酶變體的宿主細胞。
[0090]本文公開的篩選方法的一個重大優點是，它的以迭代方式持續選擇越來越好的倍半萜合酶變體的能力，其中將在一個迭代中鑑別出的試驗倍半萜合酶用作後續迭代中的對照倍半萜合酶。因而，該方法可以與本領域已知的其它測定區分開，所述其它測定的目的是，僅僅鑑別特定倍半萜合酶在生物合成途徑中是否有活性，並且不尋求鑑別與對照(例如，親本合酶)相比具有提高的活性的合酶。在某些實施方案中，檢查宿主細胞中的FPP水平，並且所述FPP水平可能在每個迭代中增加(例如，通過增加或降低酶的表達水平，增加或減少酶，增加或降低基因的拷貝數，替代控制酶表達的啟動子，或通過基因突變而改變酶)至這樣的水平:當宿主細胞表達新對照倍半萜合酶(即，前一個迭代的試驗倍半萜合酶)時，其造成降低的生存力。可替換地或額外地，在每個迭代中，可以減少對照倍半萜合酶的表達(例如，通過減少對照倍半萜合酶轉錄物或多肽的表達，或通過使用更弱的啟動子，或通過降低對照倍半萜合酶轉錄物或多肽的穩定性)，以提供降低的對照倍半萜合酶活性。在下一個迭代中，然後可以鑑別這樣的試驗倍半萜合酶:與前一個迭代的試驗倍半萜合酶相比，其仍然具有增加的體內性能。
[0091]本文公開的篩選方法的另一個重大優點是，它的高通量實現的簡單性和能力。簡單地基於細胞生存力而鑑別出可以將經工程改造的宿主細胞中的細胞內FPP水平降低至無毒水平的倍半萜合酶變體，使得其它昂貴的和費時的篩選方法成為實際上非必需的。因而，在一個實施方案中，使用所述方法針對具有提高的體內性能的倍半萜合酶變體而篩選倍半萜合酶變體集合(例如，突變體倍半萜合酶文庫)。在這樣的一個實施方案中，不是在宿主細胞中表達單一試驗倍半萜合酶，而是在宿主細胞集合中表達試驗倍半萜合酶集合。然後可以在瓊脂平板上培養宿主細胞，並可以基於菌落生長而鑑別出表達具有提高的體內性能的倍半萜合酶變體的宿主細胞。在某些實施方案中，所述倍半萜合酶變體集合包含 2-5、5-10、10-50、50-100、100-500、500-1，000、1，000-10，000、10，000-100，000、100，000-1, 000, 000和更多的倍半萜合酶變體。
[0092]本文公開的篩選方法的另一個重大優點是，改進的倍半萜合酶的選擇是在體內(而不是在體外)進行。所以，可以獲得增強倍半萜合酶變體的體內性能的多種酶性能的提聞。
[0093]在另一個方面，本發明提供了用於鑑別具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的第二種篩選方法。在該第二種篩選方法中，通過它們的使聚異戊二烯基二磷酸(例如，FPP)的宿主細胞飢餓的能力，鑑別出具有提高的體內性能的萜烯合酶變體。在有高活性的萜烯合酶變體存在下，可以耗盡宿主細胞中它的聚異戊二烯基二磷酸底物的細胞內庫，從而造成細胞不能維持細胞存活所需的基礎細胞過程。
[0094]本文提供的第二種篩選方法因此包括下述步驟:
[0095]a)提供宿主細胞，其表達對照萜烯合酶且具有一定生長速率；[0096]b)在所述宿主細胞中表達試驗萜烯合酶而不是對照萜烯合酶，其中所述試驗萜烯合酶是對照萜烯合酶的變體；和
[0097]c)通過表達試驗萜烯合酶的宿主細胞與表達對照萜烯合酶的宿主細胞相比降低的生長速率，將所述試驗萜烯合酶鑑別為具有與對照萜烯合酶相比提高的體內性能。
[0098]所述對照萜烯合酶可以是單萜合酶、倍半萜合酶、二萜合酶、二倍半萜合酶、三萜合酶、四萜合酶或多萜合酶。在某些實施方案中，所述對照萜烯合酶是倍半萜合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照萜烯合酶是β_金合歡烯合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照職烯合酶是黃花蒿的β-金合歡烯合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照職烯合酶具有在SEQ ID NOilll中給出的胺基酸序列。
[0099]在有試驗萜烯合酶存在下在宿主細胞中被耗盡的聚異戊二烯基二磷酸底物可以是FPP。除了倍半萜以外，從FPP合成宿主細胞的生存力和生長所必需的許多其它化合物。這樣的化合物包括、但不限於:角鯊烯、羊毛固醇、麥角固醇、環阿屯醇、膽固醇、類固醇激素和維生素D。因而，在某些實施方案中，表達試驗萜烯合酶的宿主細胞可以在它的細胞膜中包含減少的量的膽固醇或麥角固醇。用於定量細胞中的膽固醇或麥角固醇的方法是本領域已知的(例如，Crockett 和 Hazel (2005) J.Experimental Zoology, 271 (3): 190-195; Arthington-Skaggs 等人.(1999) J Clin Microbiol.37 (10): 3332 - 3337; Seitz 等人.(1979)Physiol.Biochem.69:1202-1203)。在某些實施方案中，在有試驗萜烯合酶存在下在宿主細胞中不能維持的、細胞存活所需的基礎細胞過程是細胞膜的產生和/或維持。在其它實施方案中，在有試驗萜烯合酶存在下在宿主細胞中被耗盡的聚異戊二烯基二磷酸底物是GPP或 GGPP。
[0100]在另一個方面，本發明提供了鑑別萜烯合酶變體的體內性能和/或將其排序的競爭方法。所述競爭方法採用已知的萜烯合酶作為與萜烯合酶變體進行對比的對比酶。將對比萜烯合酶和每種萜烯合酶變體在宿主細胞中共表達，它們在所述宿主細胞中競爭相同的聚異戊二烯基二磷酸底物(例 如，GPP、FPP或GGPP)，以產生它們的對應萜類。由於對比酶的性能在宿主細胞中保持恆定，由對比萜烯合酶和萜烯合酶變體產生的萜烯產物的滴度比例的任何變化是萜烯合酶變體的活性的直接結果。結果，這樣的比例可以用於鑑別具有提高的體內性能的萜烯合酶變體，和/或針對它們將聚異戊二烯基二磷酸底物轉向萜類生產的體內動力學能力對萜烯合酶變體進行排序或定量對比。
[0101]因此，本文提供的競爭方法包括下述步驟:
[0102]a)將宿主細胞群分成對照群和試驗群；
[0103]b)在所述對照群中表達對照萜烯合酶和對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶可以將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第一萜烯，且其中所述對比萜烯合酶可以將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第二萜烯；
[0104]c)在所述試驗群中表達對比萜烯合酶和試驗萜烯合酶，其中所述試驗萜烯合酶是對照萜烯合酶的變體，且其中所述對比萜烯合酶在試驗群中和在對照群中以類似的水平表達；和
[0105]d)在試驗群中和在對照群中測量第一萜烯與第二萜烯之比。
[0106]值得注意的是，本文公開的競爭方法可以應用於多種萜烯合酶。因而，在單獨的實施方案中，使用所述競爭方法來鑑別選自下述的萜烯合酶和/或將其排序:單萜合酶、二萜合酶、倍半萜合酶、二倍半萜合酶、三萜合酶、四萜合酶和多萜合酶。因此，在單獨的實施方案中，所述第一萜烯和所述第二萜烯選自:單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和多萜.在某些這樣的實施方案中，所述第一萜烯或所述第二萜烯選自:3-金合歡烯、0-金合歡烯、曲古二烯、廣藿香醇、紫穗槐二烯、瓦倫烯、法尼醇、橙花叔醇、檸檬烯、香葉烯和努特卡酮。
[0107]所述對照萜烯合酶可以是天然存在的萜烯合酶或天然地不存在的合酶。所述試驗萜烯合酶可以包含與對照萜烯合酶相比的胺基酸置換、缺失或添加，或包含由編碼對照萜烯合酶和試驗萜烯合酶的核苷酸序列中的不同密碼子編碼的相同胺基酸。在某些實施方案中，所述對照萜烯合酶是倍半萜合酶。在某些這樣的實施方案中，所述倍半萜合酶選自:β -金合歡烯合酶、α -金合歡烯合酶、曲古二烯合酶、廣藿香醇合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦倫烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶和努特卡酮合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照倍半萜合酶是黃花蒿的β_金合歡烯合酶。在某些這樣的實施方案中，所述對照倍半萜合酶具有在SEQ ID NOilll中給出的胺基酸序列。
[0108]為了能夠對比對照群和試驗群的第一萜烯/第二萜烯之比，必須確保對比萜烯合酶的類似表達水平。這可以如下實現:將2個宿主細胞群中編碼對比萜烯合酶的核苷酸序列置於相同調節元件的控制下。在使用競爭方法來鑑別萜烯合酶變體的實施方案中，2個細胞群中的對照萜烯合酶和試驗萜烯合酶的表達水平也必須是類似的。在其中使用競爭方法例如鑑別提供所需表達水平的調節元件(例如，啟動子)的其它實施方案中，所述試驗萜烯合酶與所述對照萜烯合酶的差別不僅在於核苷酸或胺基酸序列，而且在於表達水平。在這樣的實施方案中，使用不同的調節元件來表達所述對照萜烯合酶和所述試驗萜烯合酶。
[0109]本文公開的競爭方法具有眾多實用性。在某些實施方案中，使用所述方法來篩選具有提高的體內性能的萜烯合酶變體(例如，從突變體萜烯合酶文庫中)，其基礎是:與對照萜烯合酶相比，具有提高的體內性能的萜烯合酶變體能夠將更多通量從聚異戊二烯基二磷酸底物轉向它的職烯產物，從而產生更高的目標職烯/對比職烯之比(即，第一職烯/第二萜烯)。在這樣的實施方案中，重要的是，在試驗群中表達試驗萜烯合酶的水平與在對照群中表達對照萜烯合酶的水平類似。
[0110]可以使用類似測定將一系列啟動子的強度排序(參見實施例16，例如，其中使用這樣的測定來鑑別適合用於在本文公開的第一種篩選方法中表達對照倍半萜合酶的啟動子)。在這樣的一個實施方案中，所述對照萜烯合酶和所述試驗萜烯合酶是基本上相同的，但是它們處於不同啟動子的調節控制下，使得對照群和試驗群的差別不在於試驗萜烯合酶的類型，而在於它們的試驗萜烯合酶的表達水平。在這樣的一個實施方案中，對比在試驗群中和在對照群中的第一萜烯與第二萜烯之比，會提供這樣的信息:所述信息不是關於試驗萜烯合酶的活性，而是關於驅動所述試驗萜烯合酶表達的啟動子的強度。
[0111]另外，該系統可以用於調控由不同細胞產生的2種或更多種萜烯產物的比例，使得具有確定比例的不同細胞的組合混合物具有商業上有用產品的期望性能。
[0112]本文公開的競爭方法的重大優點是，該方法消除了酶表達和活性的細胞之間的變異，該方法是穩健的，並且甚至在宿主細胞中的通向聚異戊二烯基二磷酸底物的總途徑通量有限時也可以使用該方法。後者是重要的，因為當通向聚異戊二烯基二磷酸底物的總途徑通量超過萜烯滴度時，基於絕對萜烯滴度測量的測定可以掩蔽酶活性的提高。[0113]可以對使用本文公開的篩選方法和/或競爭方法開發的酶進行額外的任選篩選方法，包括、但不限於，螢光篩選和/或通過氣相色譜法對萜烯產物的直接定量。更具體地，這包括:用於測量倍半萜(諸如金合歡烯)的產生的、基於尼羅紅的高通量螢光測定，和用於測量倍半萜(諸如金合歡烯)的滴度的、基於氣相色譜法(GC)的直接定量方法。通過基因工程方法諸如誘導突變等，也可以進一步改進所述改進的酶。所以，接連地完成了增強最終酶性能的多種酶性能的改進，並鑑別出最有效的酶變體。
[0114]本公開內容也涉及優良的金合歡烯合酶變體和包含這樣的金合歡烯合酶變體的宿主細胞。所述金合歡烯合酶變體使用本文中公開的方法開發出，並表現出體內性能的超過200%的提高。所述金合歡烯合酶變體具有提高的催化效率，即，它們能夠以更快的速率催化它們的反應。這樣，在高產量生產具有重大重要性的情況下，它們更適合用於倍半萜產品(諸如金合歡烯)的商業生產。
[0115]因而，在另一個方面，本文提供了分離的金合歡烯合酶變體和包含編碼這類β -金合歡烯合酶變體的核苷酸序列的分離的核酸，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含一個或多個在選自下述的位置處的胺基酸置換:SEQ ID Ν0:111 的位置 2、3、4、6、9、11、18、20、24、35、38、50、61、72、80、89、105、115、144、196、211、251、280、288、319、348、357、359、369、371、385、398、423、433、434、442、444、446、460、467、488、495、505、526、531、556、572 和 575。
[0116]在另一個方面，本發明提供了一種遺傳修飾的宿主細胞，其包含:
[0117](a)異源金合歡烯合酶，其中所述異源金合歡烯合酶是由SEQ ID NO: 111編碼的β -金合歡烯合酶的變體；和
[0118](b) MEV途徑或DXP途徑酶；
[0119]其中與包含MEV途`徑或DXP途徑酶和由SEQ ID NO: 111編碼的β -金合歡烯合酶的親本細胞相比，所述宿主細胞產生多了至少15%的β-金合歡烯。
[0120]在某些實施方案中，所述異源金合歡烯合酶包含一個或多個在選自下述的位置處的胺基酸置換:SEQ ID NO: 111 的位置 2、3、4、6、9、11、18、20、24、35、38、50、61、72、80、89、105、115、144、196、211、251、280、288、319、348、357、359、369、371、385、398、423、433、434、442、444、446、460、467、488、495、505、526、531、556、572 和 575。
[0121]在某些實施方案中，所述MEV途徑酶是HMG-CoA還原酶。在某些實施方案中，所述MEV途徑酶是甲羥戊酸激酶。在下面的部分5.4中提供了 MEV途徑的其它示例性酶。
[0122]在另一個方面，本文提供了一種生產金合歡烯的方法，所述方法包括下述步驟:
[0123](a)獲得多個遺傳修飾的宿主細胞，其包含:
[0124]i)第一異源核苷酸序列，其編碼由SEQ ID NO: 111編碼的β -金合歡烯合酶的變體；和
[0125]ii)第二異源核苷酸序列，其編碼MEV途徑或DXP途徑酶；
[0126](b)在適合生產金合歡烯的條件下，在包含碳源的培養基中，培養所述遺傳修飾的宿主細胞；和
[0127](C)從所述培養基回收β -金合歡烯。
[0128]在某些實施方案中，所述MEV途徑酶是HMG-CoA還原酶。在某些實施方案中，所述MEV途徑酶是甲羥戊酸激酶。在下面的部分5.4中提供了 MEV途徑的其它示例性酶。
[0129]【5.3選擇宿主細胞】
[0130]可用於實踐本發明的宿主細胞包括古細菌(archae)、原核細胞或真核細胞。
[0131]合適的原核宿主包括、但不限於多種革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或革蘭氏不定細菌中的任一種。例子包括、但不限於屬於下述屬的細胞:土壤桿菌屬(Agrobacterium)λ 脂環酸芽抱桿菌屬(AlicyclobaciIIus)Λ 魚渥藻屬(Anabaena)、組囊藍細菌屬(Anacystis)、節桿菌屬(Arthrobacter)、定氮菌屬(Azobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、產色菌屬(Chromatium)、梭狀芽抱桿菌屬(Clostridium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、大腸桿菌屬(Escherichia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)Λ 甲基桿菌屬(Methylobacterium)Λ 微桿菌屬(Microbacterium)、席藍細菌屬(Phormidium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、紅球菌屬(Rhodococcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、柵列藍細菌屬(Scenedesmun)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、葡萄球菌屬(Staphlococcus)、鏈黴菌屬(Strepromyces )、聚球藍細菌屬(Synnecoccus)和發酵單胞菌屬(Zymomonas)0原核菌株的例子包括、但不限於:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacines)、產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短桿菌(Brevibacterium immariophilum)、拜季林斯基梭菌(Clostridiumbeigerinckii)、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、大腸桿菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium 1ti)、銅綠假單抱菌(Pseudomonas aeru ginosa)、邁氏假單胞菌(Pseudomonas mevalonii)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudica)、莢膜紅桿菌(Rhodobacter capsulatus)、球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)、紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、宋氏志賀菌(Shigella sonnei)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
[0132]合適的古細菌宿主包括、但不限於屬於下述屬的細胞:氣火菌屬(Aeropyrum)、古球菌屬(Archaeglobus)、鹽桿菌屬(Halobacterium)、甲焼球菌屬(Methanococcus)、甲焼桿菌屬(Methanobacterium)、火球菌屬(Pyrococcus)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)和熱原體屬(Thermoplasma)。古細菌菌株的例子包括、但不限於:閃爍古球菌(Archaeoglobusfulgidus)、鹽桿菌屬(Halobacterium sp.)、詹氏甲焼球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養甲焼桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)、火山熱原體(Thermoplasma volcanium)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和敏捷氣火菌(Aeropyrumpernix)。
[0133]合適的真核宿主包括、但不限於:真菌細胞、藻細胞、昆蟲細胞和植物細胞。例子包括、但不限於屬於下述屬的細胞:麴黴菌屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、金孢屬(Chrysosporium)、隱球菌屬(Cryotococcus )、鐮孢屬(Fusarium)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、內生真菌屬(Neotyphodium)、脈抱菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penici 11 ium)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces )、木黴屬(Tricho derma)、子囊菌綱(Ascomycota)、擔子菌綱(Basidiomycota)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和法夫酵母屬(Xanthophyl1myces,以前稱作Phaffia)。真核菌株的例子包括、但不限於:巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、棟樹畢赤酵母(Pichia quercuum)、拍氏畢赤酵母(Pichiapijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母屬(Saccharomycessp.)、裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假絲酵母菌(Candida albicans)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、黑麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、拉氏金抱菌(Chrysosporium lucknowense)、鍵抱菌屬(Fusarium sp.)、禾赤鍵抱(Fusariumgramineum)、鍵抱黴(Fusarium venenatum)、粗糖鏈抱黴(Neurospora crassa)和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
[0134]在一個具體實施方案中，所述宿主細胞是大腸桿菌細胞。在另一個具體實施方案中，所述宿主細胞是釀酒酵母細胞。在某些實施方案中，所述宿主細胞是選自下述的釀酒酵母細胞:Baker 氏酵母、CBS7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Υ-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1。在某些實施方案中，所述宿主細胞是選自下述的釀酒酵母細胞:PE-2、CAT-1、VR-1、BG-UCR-1和SA-1。在一個具體實施方案中，所述宿主細胞是釀酒酵母菌株PE-2。在另一個具體實施方案中，所述宿主細胞是釀酒酵母菌株CAT-1。在另一個具體實施方案中，所述宿主細胞是釀酒酵母菌株BG-1。
[0135]在某些實施方案中，所述宿主細胞是適合用於工業發酵(例如，生物乙醇發酵)的細胞。在具體實施方案中，調節宿主細胞以在高溶劑濃度、高溫、擴大的底物利用、營養物限制、滲透性應激、酸度、亞硫酸鹽和細菌汙染或它們的組合(它們是工業發酵環境的公認應激條件)下存活。
[0136]【5.4升高的細胞內FPP水平的宿主細胞】
[0137]在某些實施方案中，與親本細胞相比，宿主細胞包含升高的細胞內FPP水平，其中所述升高的細胞內FPP水平會降低宿主細胞的生存力。
[0138]在某些實施方案中，基於每單位體積的細胞培養物，所述宿主細胞包含的細胞內FPP水平比親本細胞的細胞內FPP水平高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多。
[0139]在某些實施方案中， 基於每單位細胞乾重，所述宿主細胞包含的細胞內FPP水平比親本細胞的細胞內FPP水平高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多。
[0140]在某些實施方案中，基於酶單位時間內每單位體積的細胞培養物，所述宿主細胞包含的細胞內FPP水平比親本細胞的細胞內FPP水平高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多。 [0141]在某些實施方案中，基於每單位時間內的每單位細胞乾重，所述宿主細胞包含的細胞內FPP水平比親本細胞的細胞內FPP水平高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多。
[0142]在大多數實施方案中，宿主細胞中升高的細胞內FPP水平可被誘導化合物誘導。在沒有誘導化合物存在下，可以容易地操作這樣的宿主細胞。然後加入誘導化合物以誘導宿主細胞中高水平的FPP。在其它實施方案中，宿主細胞中升高的細胞內FPP水平可通過改變培養條件(例如，生長溫度)來誘導。可誘導的細胞內FPP水平的升高因而會提供宿主細胞的降低的生存力表型的開啟和關閉分子開關。
[0143]通過宿主細胞的靶向基因工程，可以實現細胞內FPP水平的升高。已知許多酶在FPP及其前體的產生和利用中起作用，可以操縱這些酶中的任一種來改變宿主細胞中FPP的水平。
[0144]在某些實施方案中，通過增加宿主細胞中細胞乙醯輔酶A的產生，增加宿主細胞中FPP的產生。
[0145]在某些實施方案中，通過增加宿主細胞中IPP和/或DMAPP的產生，增加宿主細胞中FPP的產生。在某些這樣的實施方案中，通過增加MEV途徑的一種或多種酶的活性，增加宿主細胞中IPP和DMAPP的產生。在圖15中描述了 MEV途徑的示意圖。一般而言，該途徑包括六個步驟。
[0146]在第一步中，兩分子的乙醯輔酶A經酶催化結合形成乙醯乙醯輔酶A。已知催化該步驟的酶是，例如，乙醯輔酶A硫解酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於以下GenBank登錄號以及該序列所源自的生物:(NC_000913 REGION:2324131..2325315 ;大腸桿菌)、(D49362 ;脫氮副球菌)和(L20428 ;釀酒酵母)。
[0147]在MEV途徑的第二步中，乙醯乙醯輔酶A與另一分子的乙醯輔酶A經酶催化縮合形成3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A(HMG-CoA)。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG-CoA合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(NCJ)Ol 145.補體19061..20536 ;釀酒酵母)、(X96617 ;釀酒酵母)、(X83882 ;擬南芥)、(AB037907 ;淺灰北裡孢菌)、(BT007302 ;智人)和(NC_002758，基因座標籤SAV2546、GeneIDl 122571 ;金黃色葡萄球菌)。
[0148]在第三步中，HMG-CoA經酶催化轉化成甲羥戊酸。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG-CoA還原酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(NM_206548 ;黑腹果蠅)、(NC_002758，基因座標籤 SAV2545、GeneID 1122570 ;金黃色葡萄球菌)、(NM_204485 ；原雞)、(AB015627 ;鏈黴菌屬KO 3988)、(AF542543 ;漸尖菸草)、(AB037907 ;淺灰北裡孢菌)、(AX128213，其提供的序列編碼截短的HMGR;釀酒酵母)和(NC_001145:補體(115734..118898 ;釀酒酵母)。
[0149]在第四步中，甲羥戊酸被酶催化磷酸化，形成甲羥戊酸5-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，甲羥戊酸激酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(L77688 ;擬南芥)和(X55875 ;釀酒酵母)。
[0150]在第五步中，第二個磷酸基團經酶催化添加到甲羥戊酸5-磷酸上，形成甲羥戊酸5-焦磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，磷酸甲羥戊酸激酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AF429385 ;巴西橡膠樹)、(NM_006556 ;智人)和(NC_001145.補體712315..713670 ;釀酒酵母)。[0151]在第六步中，甲羥戊酸5-焦磷酸被酶催化轉化成IPP。已知催化該步驟的酶是，例如，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(X97557 ;釀酒酵母)、(AF290095 ;屎腸球菌)和(U49260 ;智人)。
[0152]在其它這樣的實施方案中，通過增加DXP途徑的一種或多種酶的活性，增加宿主細胞中IPP和DMAPP的產生。在圖16中描述了 DXP途徑的示意圖。一般而言，DXP途徑包括七個步驟。
[0153]在第一步中，丙酮酸與D-甘油醛3-磷酸縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AF035440 ;大腸桿菌)、(NC_002947，基因座標籤PP0527 ;惡臭假單胞菌KT2440)、(CP000026，基因座標籤SPA2301 ;腸道副傷寒沙門氏菌、參見ATCC9150)、(NC_007493，基因座標籤 RSP_0254 ;球形紅桿菌 2.4.1)、(NC_005296，基因座標籤 RPA0952 ；沼澤紅假單胞菌CGA009)、(NCJKM556，基因座標籤TO1293 ;蒂梅丘拉苛養木桿菌I)和(NC_003076，基因座標籤AT5G11380 ;擬南芥)。
[0154]在第二步中，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸被轉化成2C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(ABO13300 ;大腸桿菌)、(AF148852 ;擬南芥)、(NC_002947,基因座標籤PP1597 ;惡臭假單胞菌KT2440)、(AL939124，基因座標籤SC05694 ;天藍色鏈黴菌A3⑵)、(NC_007493，基因座標籤RSP_2709 ;球形紅桿菌2.4.1)和(NC_007492，基因座標籤Pfl_1107 ;螢光假單胞菌PfO-1)。
[0155]在第三步中，2C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸被轉化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇。已知催化該步驟的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合成酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AF230736 ;大腸桿菌)、(NC_007493，基因座_標籤RSP_2835 ;球形紅桿菌2.4.1)、(NC_003071，基因座_標籤AT2G02500 ;擬南芥)和(NC_002947，基因座_標籤PP1614 ;惡臭假單胞菌KT2440)。
[0156]在第四步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇被轉化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇激酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AF216300 ;大腸桿菌)和(NC_007493，基因座_標籤RSP_1779 ;球形紅桿菌2.4.1)。
[0157]在第五步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸被轉化成2C-甲基-D-赤蘚醇2，4-環二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，2C-甲基-D-赤蘚醇2，4-環二磷酸合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AF230738 ;大腸桿菌)、(NC_007493，基因座_標籤RSP_6071 ;球形紅桿菌2.4.1)和(NC_002947，基因座_標籤PP1618 ;惡臭假單胞菌KT2440)。
[0158]在第六步中，2C-甲基-D-赤蘚醇2，4-環二磷酸被轉化成1-羥基_2_甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，1-羥基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AY033515 ;大腸桿菌)、(NC_002947，基因座_標籤PP0853 ;惡臭假單胞菌KT2440)和(NC_007493，基因座_標籤RSP_2982 ;球形紅桿菌 2.4.1)。
[0159]在第七步中，1-羥基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸被轉化成IPP或它的異構體DMAPP。已知催化該步驟的酶是，例如，異戊基/二甲基烯丙基二磷酸合酶.核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(AY062212 ;大腸桿菌)和(NC_002947，基因座_標籤PP0606 ；惡臭假單胞菌KT2440)。
[0160]在某些實施方案中，通過增加IPP向DMAPP的異構化，增加宿主細胞中FPP的產生。在某些這樣的實施方案中，通過增加IPP異構酶的活性，增加所述IPP向DMAPP的異構化。編碼IPP異構酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(NC_000913、3031087..3031635 ;大 腸桿菌)和(AF082326 ;雨生紅球藻)。
[0161]在某些實施方案中，通過增加生成FPP的IPP和DMAPP的縮合，增加宿主細胞中FPP的產生。在某些這樣的實施方案中，通過增加FPP合酶的活性，增加生成FPP的IPP和DMAPP的縮合或者IPP和香葉基焦磷酸(「GPP」)的縮合。編碼FPP合酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限於:(ATU80605 ;擬南芥)、(ATHFPS2R ;擬南芥)、(AAU36376 ;黃花蒿)、(AF461050 ;歐洲牛)、(D00694 ;大腸桿菌 K-12)、(AE009951，基因座 AAL95523 ;具核梭桿菌具核亞種ATCC25586)、(GFFPPSGEN ;藤倉赤黴菌)、(CP000009，基因座AAW60034 ；氧化葡糖桿菌621H)、(AF019892 ;向日葵)、(HUMFAPS ;智人)、(KLPFPSQCR ;乳酸克魯維酵母)、(LAU15777 ;白羽扇豆)、(LAU2O77I ;白羽扇豆)、(AF3O95O8 ;小家鼠)、(NCFPPSGEN ；粗糙鏈孢黴)、(PAFPS1 ;銀膠菊)、(PAFPS2 ;銀膠菊)、(RATFAPS ;褐家鼠)、(YSCFPP ;釀酒酵母)、0)89104 ;粟酒裂殖酵母)、(CP000003，基因座AAT87386 ;釀膿鏈球菌)、(CP000017,基因座AAZ51849 ;釀膿鏈球菌)、(NC_008022，基因座YP_598856 ;釀膿鏈球菌MGAS10270)、(NC_008023,基因座 YP_600845 ;釀膿鏈球菌 MGAS2096)、(NC_008024,基因座 YP_602832 ；釀膿鏈球菌 MGAS10750)、(MZEFPS ;玉米)、(ΑΕ000657，基因座 AAC06913 ;風產液菌 VF5)、(ΝΜ_202836 ;擬南芥)、(D84432，基因座ΒΑΑ12575 ;枯草芽孢桿菌)、(U12678，基因座AAC28894 ;大豆慢生根瘤菌USDA110)、(BACFDPS ;嗜熱脂肪土芽孢桿菌)、(NC_002940，基因座NP_873754 ;杜克雷嗜血桿菌35000HP)、(L42023，基因座AAC23087 ;流感嗜血桿菌Rd KW20)、(J05262;智人)、(YP_395294 ;清酒乳桿菌清酒亞種 23K)、(NC_005823，基因座YP_000273 ；問號鉤端螺旋體哥本哈根血清型Fiocruz株Ll-130)、(ΑΒ003187 ;藤黃微球菌)、(NC_002946，基因座 YP_208768 ;淋病奈瑟球菌 FA 1090)、(U00090，基因座 ΑΑΒ91752 ；根瘤菌屬NGR234)、(J05091 ;釀酒酵母)、(CP000031，基因座AAV93568 ;波氏矽桿菌DSS-3)、(ΑΕ008481，基因座 ΑΑΚ99890 ;肺炎鏈球菌 R6)和(NC_004556，基因座 NP 779706 ；
蒂梅丘拉苛養木桿菌I)。
[0162]在某些實施方案中，通過抑制使中間體從產生步驟轉向FPP形成的反應，增加宿主細胞中FPP的產生。這樣的反應包括、但不限於TCA循環的導致下述結果的副反應:脂肪酸生物合成、丙氨酸生物合成、天冬氨酸超途徑、糖原異生、血紅素生物合成、穀氨酸生物合成、以及乙醯輔酶A通過磷酸乙醯基轉移酶的作用向乙酸的轉化。
[0163]在某些實施方案中，通過減少宿主細胞中FPP的消耗，得到包含升高的細胞內FPP水平的宿主細胞。在某些這樣的實施方案中，通過降低可以將FPP轉化成角鯊烯的法呢基-二磷酸法呢基轉移酶或角鯊烯合酶的活性，減少宿主細胞中FPP的消耗。在其它這樣的實施方案中，通過降低宿主細胞中倍半萜合酶的活性，減少宿主細胞中FPP的消耗。
[0164]通過使用基因工程技術(即，重組技術)、經典的微生物學技術或這類技術的組合遺傳修飾親本細胞，可以產生包含升高的細胞內FPP水平的宿主細胞。所述宿主細胞也可以是天然存在的遺傳變體，其由於升高的細胞內FPP水平而在某些生長條件下是不可存活的。
[0165]通過將宿主細胞在固體培養基上的生長與不包含升高的細胞內FPP水平的親本細胞的生長進行對比，可以鑑別出包含這樣的升高的細胞內FPP水平的宿主細胞，其具有減少細胞生存力。與它的親本細胞相比，包含高水平的細胞內FPP的宿主細胞將在固體瓊脂培養基上產生更少的或更小的菌落。可以如下鑑別出僅在某些生長條件下生長的包含升高的細胞內FPP水平的宿主細胞:首先在特定條件下培養宿主細胞，在該條件下，所述宿主細胞不包含升高的細胞內 FPP水平，並且在該條件下，所述宿主細胞具有與它的親本細胞相同的生存力(「允許性生長條件」)，然後將所述宿主細胞影印平板，並在特定條件下進行培養，在該條件下，所述宿主細胞不包含升高的細胞內FPP水平(「限制性生長條件」)，以鑑別僅在限制性生長條件下具有降低的生存力、但是在允許性生長條件下不具有降低的生存力的宿主細胞。這樣的限制性生長條件可以包括、但不限於:特定營養物在培養基中的存在，特定水平的特定營養物在培養基中的存在，誘導化合物在培養基中的存在，抑制化合物在培養基中的存在，和特定生長溫度。
[0166]【5.5職烯合酶】
[0167]本文提供的方法聚焦於開發具有提高的體內性能的萜烯合酶變體。
[0168]在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體是天然存在的萜烯合酶的變體。在其它實施方案中，所述職烯合酶變體是天然地不存在的職烯合酶的變體。
[0169]在某些這樣的實施方案中，所述萜烯合酶變體與天然存在的萜烯合酶或與天然地不存在的萜烯合酶的差別在於一個或多個胺基酸置換、缺失和/或添加。在某些實施方案中，所述萜烯合酶與天然存在的萜烯合酶或與天然地不存在的萜烯合酶的差別在於，包含
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個額外胺基酸。在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體與天然存在的萜烯合酶或與天然地不存在的萜烯合酶的差別在於，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸置換。在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體與天然存在的萜烯合酶或與天然地不存在的萜烯合酶的差別在於，缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸。
[0170]在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體與天然存在的萜烯合酶或天然地不存在的萜烯合酶的胺基酸序列具有約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%_99%胺基酸序列同一性。
[0171]在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體包含共有胺基酸序列。如下衍生出共有胺基酸序列:對比3個或更多個胺基酸序列，並鑑別被所述序列中的至少2個共有的胺基酸。在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體包含源自2個或更多個天然存在的萜烯合酶的共有序列。
[0172]在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體是雜種萜烯合酶。雜種萜烯合酶包含得自2種或更多種不同萜烯合酶的連續胺基酸段。使用任意已知方法，包括、但不限於外顯子改組、結構域切換等(例如，Nixon等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:1069-1073;Fisch 等人.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93 (15):7761-7766)，可以製備雜種萜烯合酶。
[0173]在某些實施方案中，包含編碼萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸在嚴謹雜交條件下與編碼天然存在的萜烯合酶的核酸雜交。在另一個實施方案中，包含編碼萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸在中等雜交條件下與編碼天然存在的萜烯合酶的核酸雜交。在另一個實施方案中，包含編碼萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸在低嚴謹性雜交條件下與編碼天然存在的萜烯合酶的核酸雜交。
[0174]在某些實施方案中，從編碼天然存在的萜烯合酶的核苷酸序列改造編碼萜烯合酶變體的核苷酸序列，以反映特定宿主細胞的密碼子偏好(即，為在特定宿主細胞中的表達進行了密碼子優化)。特定宿主細胞的優選密碼子的使用通常會增加核苷酸序列的翻譯可能性，並因此增加其表達`可能性。可以得到許多生物的密碼子選擇表，其總結了特定生物使用特定密碼子來編碼特定胺基酸的次數的百分比，並且可以在設計合適的核苷酸序列時用作參照。在某些實施方案中，改變編碼萜烯合酶的核苷酸序列，以反映釀酒酵母的密碼子偏好(參見，例如，Bennetzen和 Hall (1982) J.Biol.Chem.257(6): 3026-3031)。在某些實施方案中，改變編碼萜烯合酶的核苷酸序列，以反映大腸桿菌的密碼子偏好(參見，例如，Gouy和 Gautier(1982)Nucleic Acids Res.10(22):7055-7074;Eyre-ffalker (1996)Mol.Biol.Evol.13(6):864-872; Nakamura 等人.(2000) Nucleic Acids Res.28(1):292) ?
[0175]使用多種已知的重組技術中的任一種和合成操作，可以得到包含編碼萜烯合酶的核苷酸序列的核酸。所述核酸可以從基因組DNA、cDNA或RNA (它們都可以從細胞直接提取)製備，或者可以通過不同的擴增方法(包括、但不限於PCR和rt-PCR)重組產生。直接化學合成方法也是本領域眾所周知的。
[0176]使用多種已知方法中的任一種，可以得到包含編碼萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸。例如，核酸可以分離自用化學誘變劑或輻射處理過的細胞，或者分離自具有DNA修復缺陷的細胞。合適的化學誘變劑包括、但不限於:甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亞硝基脲(ENU)、N-甲基-N-硝基-N』-亞硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、二乙基硫酸鹽、苯並芘、環磷醯胺、博來黴素、三乙基三聚氰胺、丙烯醯胺單體、氮芥、長春新鹼、二環氧烷烴(例如，二環氧丁烷)、ICR-170、甲醛、鹽酸丙卡巴肼、環氧乙烷、二甲基亞硝胺、7，12 二甲基苯並蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷醯胺、白消安(bisulfan)和Π丫唳染料(參見,例如Thomas
D.Brock, Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第 2 版(1989)Sinauer Associates,Inc., Sunderland, Mass.,或 Deshpande Mukund V., Appl.Biochem.Biotechnol.36，227(1992))。合適的輻射暴露包括、但不限於:紫外輻射(任選地與化學劑(例如，三甲基補骨脂素)暴露相組合)、Y-輻照、X-射線和快速中子轟擊。適用於將DNA修復缺陷引入細胞中的方法包括、但不限於突變型DNA修復酶的表達，該酶會在細胞的基因組中產生高頻突變(在約I個突變/100個基因至約I個突變/10，000個基因的量級)。編碼DNA修復酶的基因的例子包括、但不限於:Mut H、Mut S、Mut L和Mut U以及它們在其它物種中的同系物(例如，MSH1-6、PMS 1-2、MLH 1、GTBP和ERCC-1)。用於得到包含編碼萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸的其它方法包括:無細胞的體外系統的操作(例如，使用用於擴增核酸的易出錯的PCR)，易變DNA元件(例如，轉座元件)在細胞基因組中的隨機或靶向插入，或體外DNA改組(例如，外顯子改組、結構域切換等；參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley 和 Sons, New York(最近版)；和 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001))。
[0177]在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體是選自下述的倍半萜合酶的變體:β -金合歡烯合酶、α -金合歡烯合酶、曲古二烯合酶、廣藿香醇合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦倫烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶和努特卡酮合酶。
[0178]在某些實施方案中，所述萜烯合酶變體是金合歡烯合酶變體。在某些這樣的實施方案中，所述β_金合歡烯合酶變體源自黃花蒿的β_金合歡烯合酶。以前已經描述了黃花蒿的β_金合歡烯合酶的序列(Picaud,等人，(2005)Phytochemistry66(9):961-967)。黃花蒿的β -金合歡烯合酶的核苷酸序列在GenBank登錄號AY835398和如本文提供的SEQ ID NO: 112下保藏。黃花蒿的β -金合歡烯合酶的胺基酸序列在GenBank登錄號ΑΑΧ39387和如本文提供的SEQ ID NO: 111下保藏。
[0179]在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID Ν0:111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置2處的從絲氨酸至天冬氨酸的胺基酸置換(S2D突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置3處的從蘇氨酸至天冬醯胺的胺基酸置換(Τ3Ν突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置4處的從亮氨酸至絲氨酸的胺基酸置換(L4S突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置6處的從異亮氨酸至蘇氨酸的胺基酸置換(Ι6Τ突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置9處的從纈氨酸至天冬氨酸的胺基酸置換(V9D突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置11處的從苯丙氨酸至絲氨酸的胺基酸置換(Fl IS突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置20處的從纈氨酸至穀氨酸的胺基酸置換(V20E突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置24處的從纈氨酸至天冬氨酸的胺基酸置換(V24D突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置35處的從蛋氨酸至蘇氨酸的胺基酸置換(Μ35Τ突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置38處的從天冬醯胺至絲氨酸的胺基酸置換(N38S突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置50處的從天冬氨酸至天冬醯胺的胺基酸置換(D50N突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置61處的從亮氨酸至穀氨醯胺的胺基酸置換(L61Q突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置72處的從穀氨酸至賴氨酸的胺基酸置換(Ε72Κ突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置72處的從穀氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(E72V突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置80處的從天冬醯胺至天冬氨酸的胺基酸置換(N80D突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置89處的從異亮氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(I89V突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置105處的從穀氨酸至天冬氨酸的胺基酸置換(ElOro突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置115處的從異亮氨酸至蛋氨酸的胺基酸置換(Ι115Μ突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置115處的從異亮氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(I115V突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ IDNO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置144處的從苯丙氨酸至酪氨酸的胺基酸置換(F144Y突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID Ν0:111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置196處的從蘇氨酸至絲氨酸的胺基酸置換(T196S突變)。在某些實施方案中，所述 β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置211處的從絲氨酸至蘇氨酸的胺基酸置換(S211T突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置251處的從亮氨酸至蛋氨酸的胺基酸置換(L251M突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置280處的從亮氨酸至穀氨醯胺的胺基酸置換(L280Q突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置288處的從酪氨酸至苯丙氨酸的胺基酸置換(Y288F突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置319處的從蘇氨酸至絲氨酸的胺基酸置換(T319S突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQID NOilll中給出的胺基酸序列，但是包含在位置357處的從穀氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(E357V突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置359處的從穀氨酸至蘇氨酸的胺基酸置換(Ε359Τ突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置369處的從纈氨酸至亮氨酸的胺基酸置換(V369L突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置371處的從亮氨酸至蛋氨酸的胺基酸置換(L371M突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置385處的從蘇氨酸至丙氨酸的胺基酸置換(Τ385Α突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置398處的從異亮氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(I398V突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置423處的從纈氨酸至異亮氨酸的胺基酸置換(V423I突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置433處的從蛋氨酸至異亮氨酸的胺基酸置換(Μ433Ι突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ IDNO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置434處的從異亮氨酸至蘇氨酸的胺基酸置換(Ι434Τ突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID Ν0:111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置442處的從甘氨酸至丙氨酸的胺基酸置換(G442A突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置442處的從甘氨酸至天冬氨酸的胺基酸置換(G442D突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置444處的從異亮氨酸至亮氨酸的胺基酸置換(I444L突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置446處的從蘇氨酸至天冬醯胺的胺基酸置換(Τ446Ν突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置460處的從異亮氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(I460V突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置467處的從纈氨酸至異亮氨酸的胺基酸置換(V467I突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置488處的從絲氨酸至苯丙氨酸的胺基酸置換(S488F突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQID NOilll中給出的胺基酸序列，但是包含在位置495處的從穀氨酸至甘氨酸的胺基酸置換(E495G突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置505處的從穀氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(E505V突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置526處的從蘇氨酸至絲氨酸的胺基酸置換(T526S突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置531處的從脯氨酸至絲氨酸的胺基酸置換(P531S突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置556處的從丙氨酸至纈氨酸的胺基酸置換(A556V突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置572處的從蛋氨酸至賴氨酸的胺基酸置換(Μ572Κ突變)。在某些實施方案中，所述金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置575處的從終止密碼子至賴氨酸的胺基酸置換(stop575K突變)。在某些實施方案中，所述β-金合歡烯合酶變體具有在SEQ ID NO: 111中給出的胺基酸序列，但是包含在位置348處的從精氨酸至賴氨酸的胺基酸置換(R348K突變)。在某些實施方案中，所述β -金合歡烯合酶變體具有在SEQID NOilll中給出的胺基酸序列，但是包含在位置18處的從亮氨酸至異亮氨酸的胺基酸置換(L18I突變)。
[0180]【5.6遺傳工程改造宿主細胞】
[0181]本文提供的方法包括獲得宿主細胞，所述宿主細胞被遺傳工程改造成包含升高的細胞內FPP水平或表達萜烯合酶或萜烯合酶變體。這樣的遺傳工程改造的宿主細胞可以以特定方式包含核苷酸的插入、缺失或修飾，從而提供升高細胞內FPP水平或表達萜烯合酶或萜烯合酶變體的期望效應。這樣的遺傳修飾可以導致特定酶的拷貝數或活性的下降或增加或改變。
[0182]例如，通過改變編碼酶的基因的轉錄，可以改變宿主細胞中酶的拷貝數。這可以如下實現:例如，通過改變編碼酶的核苷酸序列的拷貝數(例如，通過使用更高或更低拷貝數的包含核苷酸序列的表達 載體，或通過將額外的核苷酸序列拷貝引入宿主細胞基因組中，或通過刪除或破壞宿主細胞基因組中的核苷酸序列)，通過改變操縱子的多順反子mRNA上的編碼序列的次序或將操縱子分解成各自具有它自己的控制元件的單個基因，或通過增加核苷酸序列與其可操作地連接的啟動子或操縱基因的強度。可替換地或另外，通過改變編碼酶的mRNA的翻譯水平，可以改變宿主細胞中酶的拷貝數。這可以如下實現:例如，通過改變mRNA的穩定性，改變核糖體結合位點的序列，改變核糖體結合位點和酶編碼序列的起始密碼子之間的距離或序列，改變位於酶編碼區的起始密碼子的「上遊」或5』側附近的整個順反子間區域，使用髮夾和專門序列穩定化mRNA轉錄物的3』-末端，改變酶的密碼子選擇，改變在酶的生物合成中使用的稀有密碼子tRNA的表達，和/或增加酶的穩定性，例如，通過它的編碼序列的突變。
[0183]可以以許多方法改變宿主細胞中酶的活性，所述方法包括、但不限於:表達在宿主細胞中表現出增加的或降低的溶解度的改變形式的酶，表達缺少用於抑制酶活性的結構域的改變形式的酶，表達對底物具有更高或更低Kcat或更低或更高Km的改變形式的酶，或表達或多或少受該途徑中的其它分子的反饋或前饋調節的改變形式的酶。
[0184]本文提供的方法進一步包括下述步驟:在不天然地表達這樣的職烯合酶或職烯合酶變體的宿主細胞中，表達萜烯合酶或萜烯合酶變體。可以如下實現萜烯合酶或萜烯合酶變體在宿主細胞中的表達:向所述宿主細胞中引入包含編碼萜烯合酶或萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸，其處於允許在宿主細胞中表達的調節元件的控制下。在某些實施方案中，所述核酸是染色體外質粒。在其它實施方案中，所述核酸是染色體整合載體，其可以將所述核苷酸序列整合進宿主細胞的染色體中。
[0185]在某些實施方案中，萜烯合酶或萜烯合酶變體在2個或更多個宿主細胞中的表達水平必須是類似的。這可以使用在相同調節元件控制下的包含編碼萜烯合酶或萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸來實現。這樣的核酸可以用作染色體外表達載體，或者用於將編碼萜烯合酶或萜烯合酶變體的核苷酸序列和調節元件整合進宿主細胞的染色體中。可比較的表達水平還可以如下實現:將包含編碼萜烯合酶或萜烯合酶變體的核苷酸序列的核酸靶向2個或更多個宿主細胞中的相同位置，從而將所述核苷酸序列置於相同內源調節元件控制下。除了使用類似的調節元件以外，可比較的表達水平還可以取決於2個或更多個宿主細胞中的類似拷貝數的核苷酸序列。可以如下控制拷貝數:通過在染色體外表達載體中使用類似的或相同的複製起點，或者通過使用類似類型和數目的染色體整合構建體將所述核苷酸序列整合進2個或更多個宿主細胞的染色體中。核酸的許多其它特徵可以影響編碼的萜烯合酶或職烯合酶變體的表達水平(例如，蛋白或mRNA穩定性,核糖體結合位點序列，核糖體結合位點和起始密碼子之間的距離，上遊和下遊序列、髮夾和其它專門序列的性質，以及密碼子選擇)，並且可以改變所有這些以確保類似的表達水平(當在提供的方法中需要時)。[0186]通過本領域技術人員已知的任意方法(但不限於此)，可以將核酸引入微生物中(參見，例如，Hinnen 等人.(1978) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1292-3; Cregg等人.(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385;Goeddel 等人.，編,1990, Methods in Enzymology,第185 卷,Academic Press, Inc.，CA;Krieger, 1990，Gene Transfer and Expression—ALaboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook 等人.，1989, Molecular Cloning—ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY ;和 Ausubel 等人.，編，最近版,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates andWiley Interscience, NY) ?示例性的技術包括、但不限於:原生質球化(spheroplasting)、電穿孔、PEG 1000介導的轉化、以及醋酸鋰或氯化鋰介導的轉化。
[0187]在某些實施方案中，用於遺傳修飾宿主細胞的核酸包含一個或多個選擇標記，所述選擇標記可用於選擇轉化的宿主細胞和用於將選擇壓力施加於宿主細胞以維持外源DNA。
[0188]在某些實施方案中，所述選擇標記是抗生素抗性標誌物。抗生素抗性標誌物的示例性例子包括、但不限於:BLA、NATl、PAT、AUR1-C、PDR4、SMRl、CAT、小鼠 dhfr、HPH、DSDA,KANe和SH BLE基因產物。得自大腸桿菌的BLA基因產物會賦予對β -內醯胺抗生素(例如，窄譜頭孢菌素類、頭黴素類和碳青黴烯類(厄他培南)、頭孢孟多和頭孢哌酮)的抗性和對除了替莫西林以外的所有抗革蘭氏陰性細菌青黴素的抗性；得自諾爾斯氏鏈黴菌的NATl基因產物會賦予對諾爾絲菌素的抗性；得自綠色產色鏈黴菌Tu94的PAT基因產物會賦予對雙丙氨膦(bialophos)的抗性；得自釀酒酵母的AURl-C基因產物會賦予對短梗黴素A(AbA)的抗性；H)R4基因產物會賦予對變藍菌素的抗性；SMR1基因產物會賦予對甲嘧磺隆的抗性；得自Tn9轉座子的CAT基因產物會賦予對氯黴素的抗性；小鼠dhfr基因產物會賦予對甲氨蝶呤的抗性；肺炎克雷伯菌的HPH基因產物會賦予對潮黴素B的抗性；大腸桿菌的DSDA基因產物允許細胞在含有D-絲氨酸作為唯一氮源的平板上生長；Tn903轉座子的KANe基因會賦予對G418的抗性；並且得自印度斯坦鏈異壁菌的SH BLE基因產物會賦予對Zeocin(博來黴素)的抗性。在某些實施方案中，在分離本文公開的遺傳修飾的宿主細胞以後，刪除抗生素抗性標誌物。
[0189]在某些實施方案中，所述選擇標記會解救遺傳修飾的微生物中的營養缺陷體(例如，營養的營養缺陷體)。在這樣的實施方案中，親本微生物包含一種或多種基因產物的功能破壞，所述基因產物在胺基酸或核苷酸生物合成途徑中起作用，並且當無功能時會使親本細胞不能在沒有添加一種或多種營養物的培養基中生長。這樣的基因產物包括、但不限於:酵母中的HIS3、LEU2、LYSl、LYS2、MET15、TRPl、ADE2和URA3基因產物。然後可以通過用編碼被破壞的基因產物的功能拷貝的表達載體或染色體整合構建體轉化親本細胞來解救營養缺陷型表型，並且可以基於親本細胞的營養缺陷型表型的喪失來選擇產生的遺傳修飾的宿主細胞。URA3、TRP1和LYS2基因作為選擇標記的應用具有顯著的優點，因為陽性和陰性選擇是可能的。陽性選擇通過URA3、TRP1和LYS2突變的營養缺陷型互補進行，而陰性選擇是基於特異性的抑制劑，即，分別為5-氟-乳清酸(FOA)、5-氟鄰氨基苯甲酸和α-氨基己二酸(aAA)，它們會阻止原營養型菌株的生長，但是分別允許URA3、TRPl和LYS2突變體的生長。
[0190]在其它實施方案中，所述選擇標記會解救通過已知選擇方法可鑑別的其它非致命缺陷或表型。
[0191]【5.7培養宿主細胞】
[0192]本發明提供了用於開發具有提高的體內性能的萜烯合酶變體的方法和用於生產萜類的方法。所述方法通常包括:在合適的條件下在合適的包含碳源的培養基中培養宿主細胞。
[0193]用於培養微生物的合適條件和合適培養基是本領域眾所周知的。在某些實施方案中，所述合適培養基補充了一種或多種其它試劑，例如，誘導化合物(例如，當一個或多個編碼基因產物的核苷酸序列處於誘導型啟動子控制下時)、抑制化合物(例如，當一個或多個編碼基因產物的核苷酸序列處於可抑制型啟動子控制下時)、或選擇劑(例如，用於選擇包含遺傳修飾的微生物的抗生素)。
[0194]在某些實施方案中，所述碳源是單糖(monosaccharide, simple sugar)、二糖、多糖、不可發酵的碳源、或其中的一種或多種的組合。合適的單糖的非限制性例子包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖和它們的組合。合適的二糖的非限制性例子包括:蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖和它們的組合。合適的多糖的非限制性例子包括:澱粉、糖原、纖維素、甲殼質和它們的組合。合適的不可發酵的碳源的非限制性例子包括乙酸鹽和甘油。
[0195]在一個方面，本發明提供了基於包含試驗萜烯合酶的宿主細胞的生長速率來鑑別具有提高的體內性能的萜烯合`酶的方法。可以如下確定宿主細胞的生長速率:例如，在液體培養基中培養宿主細胞確定的時間段，然後將全部培養物或培養物的等分試樣鋪在瓊脂平板上，最後對在瓊脂平板上形成的菌落數評分。可替換地，通過在確定的時間段以後測量培養物的生物量來確定宿主細胞的生長速率。可以如下測量生物量:通過確定液體培養物的密度，例如通過紫外光譜測定法，或通過定量生物量指標分子諸如己糖胺和麥角固醇(Frey等人.(1992)Biol.Fertil.Soils 13:229-234;Newell (1992)第 521 - 561 頁.G.C.Carroll和 D.T.Wicklow(編),The fungal community:1ts organization and role in theecosystem,第 2 版Marcel Dekker Inc., New York)。
[0196]【5.8生產萜類】
[0197]本發明提供了用於生產萜類的方法。
[0198]在某些實施方案中，以大於約10克/升發酵培養基的量生產萜烯。在某些這樣的實施方案中，以每升細胞培養物約10至約50克、超過約15克、超過約20克、超過約25克、或超過約30克的量生產職烯。
[0199]在某些實施方案中，以大於約50毫克/克細胞乾重的量生產萜烯。在某些這樣的實施方案中，以每克細胞乾重約50至約1500毫克、超過約100毫克、超過約150毫克、超過約200毫克、超過約250毫克、超過約500毫克、超過約750毫克、或超過約1000毫克的量
生產職烯。
[0200]在某些實施方案中，基於每單位體積的細胞培養物，以與不包含第一個異源核苷酸序列的宿主細胞生產的萜烯量相比高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多的量生產萜烯。
[0201]在某些實施方案中，基於每單位細胞乾重，以與不包含第一個異源核苷酸序列的宿主細胞生產的萜烯量相比高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多的量生產萜烯。
[0202]在某些實施方案中，基於酶單位時間內每單位體積的細胞培養物，以與不包含第一個異源核苷酸序列的宿主細胞生產的萜烯量相比高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多的量生產職烯。
[0203]在某些實施方案中，基於每單位時間內的每單位細胞乾重，以與不包含第一個異源核苷酸序列的宿主細胞生產的萜烯量相比高了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約4 00倍、至少約500倍、或至少約1，000倍或更多的量生產萜烯。
[0204]【5.9提取和定量萜類】
[0205]使用本領域已知的任意合適的分離和純化方法，可以從發酵液中分離由本發明的遺傳修飾的宿主細胞生產的萜烯。
[0206]在某些實施方案中，通過離心從發酵液中分離出包含萜烯的有機相。在其它實施方案中，包含萜烯的有機相自發地從發酵液中分離出。在其它實施方案中，通過向發酵反應物中加入破乳劑和/或成核劑，使包含萜烯的有機相從發酵液中分離出。破乳劑的示例性例子包括絮凝劑和促凝劑。成核劑的示例性例子包括職烯自身和有機溶劑(諸如十二燒、肉豆蘧酸異丙酯和油酸甲酯)的微滴。
[0207]在某些實施方案中，使萜烯與可能存在於有機相中的其它產物分離。在某些實施方案中，使用吸附、蒸餾、氣液萃取(汽提)、液-液萃取(溶劑萃取)、超濾和標準色譜技術實現分離。
[0208]在某些實施方案中，所述萜烯是純的，例如，至少約40%純、至少約50%純、至少約60%純、至少約70%純、至少約80%純、至少約90%純、至少約95%純、至少約98%純或超過98%純，其中在萜烯的背景下使用的「純的」表示不含有其它萜類或汙染物的萜烯。
[0209]使用本領域已知的眾所周知的方法，可以容易地定量萜烯產生，所述方法包括、但不限於:氣相色譜法(GC)、氣相色譜法-質譜法(GC/MS)、核磁共振(匪R)、拉曼光譜法、光吸收(UV/VIS)、紅外光譜法(IR)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜法-質譜法(LC/MS)、離子色譜法-質譜法、薄層色譜法、脈衝電流計檢測和紫外-可見光光譜測定法。
[0210]使用多種方法中的任一種，可以回收由宿主細胞產生的萜類，所述方法包括、但不限於色譜法、萃取、溶劑萃取、膜分離、電滲析、反滲透、蒸餾、化學衍生化和結晶。
[0211]改善萜烯定量或分離的其它處理步驟包括、但不限於:破碎宿主細胞。合適的方法包括、但不限於:渦旋、聲處理和使用玻璃珠。其它處理步驟可以包括離心，以從上清液中除去不希望的細胞碎片。
[0212]【實施例】
[0213]下述具體實施例意圖例證本公開內容，且不應解釋為限制權利要求的範圍。
[0214]【實施例1】[0215]本實施例描述了製備DNA構建體的方法，所述DNA構建體可用於製備和表徵萜烯合酶變體。
[0216]通過將MevT66操縱子插入載體pAM36中，製備了表達質粒pAM36_MevT66。通過從PACYC184載體(GenBank登錄號X06403)中除去tet抗性基因並向其中加入含有Asc1-Sfil-AsiS1-Xho1-Pac1-FsIl-Pmel 限制位點的寡核苷酸盒，製備了載體 pAM36。MevT66操縱子編碼MEV途徑酶集合，所述酶一起將普遍存在的前體乙醯輔酶A轉化成(R)-甲羥戊酸，即乙醯乙醯輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶。合成地製備了MevT66操縱子，且其包含:為在大腸桿菌中表達經過密碼子優化的大腸桿菌的atoB基因(GenBank登錄號NC_000913REG10N: 2324131..2325315 ;編碼乙醯乙醯輔酶A硫解酶)，為在大腸桿菌中表達經過密碼子優化的釀酒酵母的ERG13基因的編碼序列(GenBank登錄號X96617, REGION: 220..1695 ;編碼HMG-CoA合酶)，和為在大腸桿菌中表達經過密碼子優化的釀酒酵母的HGMl基因的截短編碼序列(GenBank登錄號M22002，REGION: 1777..3285 ;編碼截短的HMG-CoA還原酶)。將合成地製備的MevT66操縱子克隆進克隆載體(諸如標準的PUC或pACYC起源載體)中，再從它用側接SfiI和AsiSI限制位點進行PCR擴增，使用SfiI和AsiSI限制性內切核酸酶消化擴增的DNA片段，對包含MevT66操縱子的大約4.2kb DNA片段進行凝膠純化，並將純化的DNA片段插入pAM36載體的SfiI和AsiSI限制位點中，從而產生表達質粒pAM36-MevT66。
[0217]通過將MevB操縱子插入pBBRlMCS-Ι載體中，製備表達質粒pMevB-Cm。MevB操縱子編碼一起將(R)-甲羥戊酸轉化成IPP的酶集合，即甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸羧化酶。從釀酒酵母基因組DNA，PCR擴增:ERG12基因的編碼序列(GenBank登錄號X55875，REGION:580..1911 ;編碼甲羥戊酸激酶)、ERG8基因的編碼序列(GenBank登錄號Z49939，REG10N:3363..4718 ;編碼磷酸甲羥戊酸激酶)和MVDl基因的編碼序列(GenBank登錄號X97557，REGION: 544..1734 ;編碼甲羥戊酸焦磷酸羧化酶)。通過選擇適當的引物序列，在PCR擴增過程中將ERG12和ERG8編碼序列的終止密碼子從TAA變成TAG，以引入核糖體結合位點。通過序列重疊延伸(S0E;Ho，等人，1989)，將PCR產物一起剪接進MevB操縱子中。在添加3』 A突出端後，將MevB操縱子連接進TA克隆載體pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。通過用PstI限制性內切核酸酶消化克隆構建體，再次切離MevB操縱子，並對包含MevB操縱子的大約4.2kb DNA片段進行凝膠純化，並將純化的DNA片段連接進載體pBBRlMCS-Ι的PstI限制位點中(Kovach等人，Gene166 (I): 175-176 (1995))，從而產生表達質粒 pMevB-Cm。
[0218]通過將MBI操縱子插入pBBRlMCS-3載體中，製備表達質粒pMBI。MBI操縱子編碼與MevB操縱子相同的酶，以及催化IPP向DMAPP的轉化的異戊烯基焦磷酸酶異構酶。通過使用含有在它們的5'末端處的XmaI限制位點的引物從大腸桿菌基因組DNA中PCR擴增idi基因的編碼序列(GenBank登錄號AF119715)，製備MBI操縱子。使用XmaI限制性內切核酸酶消化PCR產物，對包含idi編碼序列的0.5kb DNA片段進行凝膠純化，並將純化的DNA片段插入表達質粒pMevB-Cm的XmaI限制位點中，將idi置於MevB操縱子的3丨末端處。然後將MBI操縱子亞克隆進載體pBBRlMCS-3的SalI和SacI限制位點中(Kovach等人，Gene 166 (I): 175-176 (1995))，從而產生表達質粒 pMBI。
[0219]通過將ispA基因插入表達質粒pMBI中，製備表達質粒pMBIS。ispA基因編碼法呢基焦磷酸合酶，該酶催化IPP和DMAPP縮合成FPP。使用具有SacII限制位點的正向引物和具有SacI限制位點的反向引物，從大腸桿菌基因組DNA中PCR擴增ispA基因的編碼序列(GenBank登錄號D00694，REGION: 484..1383)。使用SacII和SacI限制性內切核酸酶消化擴增的PCR產物，對包含ispA編碼序列的0.9kb DNA片段進行凝膠純化，並將純化的DNA片段連接進pMBI的SacII和SacI限制位點中，將ispA編碼序列置於idi和MevB操縱子的3』側，從而產生表達質粒pMBIS。
[0220]通過將MevT66操縱子插入pAM29載體中，製備表達質粒pAM25。通過將pl5A複製起點和得自PZS24-MCS1載體的賦予卡那黴素抗性的基因(Lutz和Bujard(1997)NuclAcids Res.25:1203-1210)與寡核苷酸製備的lacUV5啟動子一起裝配，製備pAM29載體。使用EcoRI和Hind III限制性內切核酸酶消化包含MevT66操縱子的DNA合成構建體(參見上面關於pAM36-MevT66的描述)，對包含MevT66操縱子的大約4.2kb DNA片段進行凝膠純化，並將純化的DNA片段連 接進pAM29的EcoRI和HindIII限制位點，從而產生表達質粒pAM250
[0221]通過用mvaA基因的編碼序列(其編碼金黃色葡萄球菌HMG-CoA還原酶)(GenBank登錄號BA000017, REGION: 2688925..2687648)替換表達質粒pAM25中的HMGl基因的截短編碼序列(其編碼截短形式的釀酒酵母HMG-CoA還原酶)，製備表達質粒pAM41。使用包含SpeI限制位點的引物，從金黃色葡萄球菌金黃亞種(ATCC 70069)基因組DNA中PCR擴增mvaA基因的編碼序列，使用SpeI限制性內切核酸酶消化PCR產物，並對包含mvaA編碼序列的大約1.3kb DNA片段進行凝膠純化。使用HindIII限制性內切核酸酶消化表達質粒PAM25，使用T4 DNA聚合酶將末端突出端鈍化，使用SpeI限制性內切核酸酶部分地消化線性載體骨架，並對缺少截短的HMGl編碼序列的大約4.8kb DNA片段進行凝膠純化。連接純化的DNA片段，從而產生表達質粒pAM41。
[0222]通過將MBIS操縱子插入表達質粒pAM36_MevT66中，製備表達質粒pAM43。使用包含5』XhoI限制位點和3』PacI限制位點的引物，從pMBIS PCR擴增MBIS操縱子，使用XhoI和PacI限制性內切核酸酶消化擴增的PCR產物，對包含MBIS操縱子的大約5.4kb DNA片段進行凝膠純化，並將純化的DNA片段連接進表達質粒pAM36-MevT66的XhoI PacI限制位點中，從而產生表達質粒PAM43。
[0223]通過將lacUV5啟動子插入在表達質粒pAM43的MBIS和MevT66操縱子的前面，製備表達質粒PAM45。從寡核苷酸合成包含編碼lacUV5啟動子的核苷酸序列的DNA片段，並插入PAM43的AscI SfiI和AsiSI XhoI限制位點中，從而產生表達質粒pAM45。
[0224]通過用mvaS基因的編碼序列(其編碼金黃色葡萄球菌HMG-CoA合酶)(GenBank登錄號BA000017, REGION: 2689180..2690346)替換表達質粒pAM41中ERG13基因的編碼序列(其編碼釀酒酵母HMG-CoA合酶)，製備表達質粒pAM52。從金黃色葡萄球菌金黃亞種(ATCC 70069)基因組DNA PCR擴增mvaS基因的編碼序列，並根據Geiser等人的方法(BioTechniques 31:88-92(2001))將擴增的DNA片段用作PCR引物來替換pAM41中的HMGl基因的編碼序列，從而產生表達質粒PAM52。
[0225]通過用表達質粒pAM52的(atoB(opt):mvaS:mvaA)操縱子替換表達質粒pAM45中的MevT66操縱子，製備表達質粒pAM97。使用AsiSI和SfiI限制性內切核酸酶消化表達質粒pAM45，並對缺乏MevT66操縱子的大約8.3kb DNA片段進行凝膠純化。使用包含SfiI和AsiSI限制位點的引物PCR擴增pAM52的(atoB(opt):mvaS:mvaA)操縱子，使用SfiI和AsiSI限制性內切核酸酶消化PCR產物，並對包含(atoB(opt):mvaS:mvaA)操縱子的大約3.8kb DNA片段進行凝膠純化。連接純化的DNA片段，從而產生表達質粒pAM97。
[0226]通過用mvaKl基因的編碼序列(其編碼金黃色葡萄球菌甲羥戊酸激酶)(GenBank登錄號AAG02424)替換表達質粒pAM97中的ERG12基因的編碼序列(其編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶)，製備表達質粒PAM765。金黃色葡萄球菌甲羥戊酸激酶對FPP的反饋抑制不太敏感(Voynova等人.(2004) J.Bacteriol.186:61-67),所以與表達質粒pAM97相比,表達質粒pAM765可以在宿主細胞中造成FPP的更大量產生。從表達質粒PCR擴增mvaKl基因的編碼序列，並對大約0.9kb PCR產物進行凝膠純化。從pAM97 PCR擴增PMK-PMD-1di_ispA操縱子，並對大約4.1kb PCR產物進行凝膠純化。將純化的PCR產物連接到一起，並對連接產物進行凝膠純化。使用XhoI和SacI限制性內切核酸酶消化純化的連接產物和pAM97，對消化的DNA片段進行凝膠純化，並連接純化的DNA片段，從而產生表達質粒pAM765 (SEQ IDNO:1)。
[0227]通過將載體pAM471的P^fERGZCU^u-tHMGR插入片段插入載體pAM466中，製備質粒 PAM489。通過將 DNA 片段 PucrERGZCU^u-tHMGR 插入 Τ0Ρ0 Zero Blunt II 克隆載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)中來製備載體 pAM471，所述 DNA 片段 PGAU(l-ERG20_PGAU-tHMGR包含:釀酒酵母的ERG20基因的編碼序列(ERG20核苷酸位置I至1208 ；ATG起始密碼子的A是核苷酸I) (ERG20)、含有釀酒酵母的趨異GALl和GALlO啟動子的基因組基因座(GAL1核苷酸位置-1至-668) (Pgal)和釀酒酵母的HMGl基因的截短的編碼序列(HMG1核苷酸位置 1586 至 3323) (tHMGR)。通過將 DNA 片段 TRPr856 5+548 插入 Τ0Ρ0 TA pCR2.1 克隆載體(Invitrogen, q Carlsbad, CA)中來製備載體 pAM466,所述 DNA 片段 TRPl 856 5+548 包含釀酒酵母的野生型TRPl基因座的一段，該段從核苷酸位置-856延伸至位置548並攜帶在鹼基-226和-225之間的非天然內部XmaI限制位點。通過如表1所描繪的PCR擴增，製備 DNA 片段 PucrERGZiU^u-tHMGR 和 TRP1-856 5+548。為了構建 pAM489，使用 XmaI 限制性酶(New England Biolabs, Ipswich, MA)完全消化 400ng pAM471 和 IOOng pAM466,對與PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR插入片段相對應的DNA片段和線性化的pAM466載體進行凝膠純化，並將4摩爾當量的純化的插入片段與I摩爾當量的純化的線性化載體連接，從而產生PAM489。圖1R 顯示了 pAM489 的 TRPlP^crERGZiU^u-tHMGRJ'RP 插入片段的圖譜，SEQID NO:2顯示了其核苷酸序列。
[0228]
【權利要求】
1.一種試驗萜烯合酶變體的提高的體內性能的方法，所述方法包括下述步驟:Ca)將宿主細胞群分成對照群和試驗群；(b)在所述對照群中表達對照萜烯合酶和對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶能夠將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第一萜烯，且其中所述對比萜烯合酶能夠將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第二萜烯；(c)在所述試驗群中表達試驗職烯合酶和所述對比職烯合酶，其中所述試驗職烯合酶是所述對照萜烯合酶的變體，且其中所述對比萜烯合酶在所述試驗群中和在所述對照群中以類似的水平表達；和(d)在所述試驗群中和在所述對照群中測量所述第一萜烯與所述第二萜烯之比。
2.根據權利要求1所述的方法，其中通過所述試驗群中的所述第一萜烯與所述第二萜烯之比相對於所述對照群中的所述第一萜烯與所述第二萜烯之比的增加，將所述試驗群鑑別為包含萜烯合酶變體，所述萜烯合酶變體具有比所述對照萜烯合酶提高的體內性能。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述對照萜烯合酶、對比萜烯合酶和所述試驗萜烯合酶是倍半萜合酶，且所述聚異戊二烯基二磷酸是法呢基二磷酸(FPP)。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述對比萜烯合酶是曲古二烯合酶。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述對照萜烯合酶和試驗萜烯合酶是具有金合歡烯合酶活性的合酶。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述對照萜烯合酶、對比萜烯合酶和所述試驗萜烯合酶是單萜合酶，且所述聚異戊二烯基二磷酸是香葉基二磷酸(GPP)。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞包含MEV途徑的一種或多種異源酶。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述MEV途徑的一種或多種異源酶選自:ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19 和 HMGl。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述試驗萜烯合酶與所述對照萜烯合酶相差1-10個胺基酸。
10.根據權利要求2所述的方法，其中所述第一萜烯與所述第二萜烯之比是至少1.3。
11.根據權利要求1所述的方法，其中試驗萜烯合酶在所述試驗群中的表達水平與所述對照萜烯合酶在所述對照群中的表達水平類似。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述對照萜烯合酶和所述試驗萜烯合酶是相同的，但是在所述對照群和所述試驗群中以不同的水平表達。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞群是酵母細胞群。
14.一種包含2個細胞亞群的組合物，所述2個細胞亞群源自共同的宿主細胞群，其中:(a)所述第一亞群包含對照萜烯合酶和對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第一萜烯，且其中對比倍半萜合酶將聚異戊二烯基二磷酸轉化成第二萜烯；(b)所述第二亞群包含試驗萜烯合酶和所述對比萜烯合酶，其中所述對照萜烯合酶將聚異戊二烯基二磷酸轉化成所述第一萜烯，且其中所述試驗萜烯合酶是所述對照萜烯合酶的變體。
15.根據權利要求14所述的組合物，其中在所述第二亞群中的所述第一萜烯與所述第二萜烯之比大於在所述第一亞群中的所述第一萜烯與所述第二萜烯之比。
16.—種鑑別具有提高的體內性能的倍半萜合酶變體的方法，所述方法包括下述步驟:(a)將表達對照倍半萜合酶的宿主細胞工程改造成包含高水平的FPP，其中與不包含所述高水平的FPP的親本細胞相比，所述高水平的FPP降低所述宿主細胞的生存力；(b)在所述宿主細胞中表達試驗倍半萜合酶而不是對照倍半萜合酶，其中所述試驗倍半萜合酶是所述對照倍半萜合酶的變體；和(C)通過與表達所述對照倍半萜合酶的宿主細胞相比表達所述試驗倍半萜合酶的宿主細胞的生存力增加，將所述試驗倍半萜合酶鑑別為具有與所述對照倍半萜合酶相比提高的體內性能。
17.根據權利要求16所述的方法，其中步驟(a)至(c)在至少2個循環中進行，其中每個循環包括步驟(a)至(C)，且其中在第一個循環以後的每個循環的步驟(a)中，所述對照倍半萜合酶是在前一個循環中鑑別出的具有提高的體內性能的倍半萜合酶變體。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述高水平的FPP是可誘導的。
19.根據權利要求16所述的方法，其中表達所述試驗倍半萜合酶而不表達所述對照倍半萜合酶的宿主細胞的生存力是表達所述對照倍半萜合酶的宿主細胞的生存力的至少2倍。
20.根據權利要求16所 述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
21.根據權利要求16所述的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌細胞。
22.根據權利要求16所述的方法，其中所述宿主細胞包含MEV途徑的一種或多種異源酶。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述MEV途徑的一種或多種異源酶選自:ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19 和 HMGl。
24.根據權利要求22所述的方法，其中所述宿主細胞包含異源IPP異構酶。
25.根據權利要求22所述的方法，其中所述宿主細胞包含異源FPP合酶。
26.根據權利要求16所述的方法，其中所述宿主細胞生長在瓊脂平板上。
27.根據權利要求16所述的方法，其中所述對照倍半萜合酶是金合歡烯合酶。
28.根據權利要求16所述的方法，其中所述試驗倍半萜合酶與所述對照倍半萜合酶相差ι-?ο個胺基酸。
29.—種包含2個細胞亞群的組合物，所述2個細胞亞群分自包含高水平的FPP的宿主細胞群，其中:Ca)所述第一亞群包含對照倍半萜合酶，其中與不包含所述高水平的FPP的親本細胞的生存力相比，所述高水平的FPP降低所述第一亞群的細胞的生存力；和(b)所述第二亞群包含試驗倍半萜合酶，其中所述試驗倍半萜合酶是所述對照倍半萜合酶的變體。
30.根據權利要求29所述的組合物，其中所述第二亞群的細胞的生存力大於所述第一亞群的細胞的生存力。
【文檔編號】C12N9/88GK103608454SQ201280011458
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年2月1日 優先權日:2011年2月2日
【發明者】趙立山, 徐嵐, P·韋斯特法爾, A·邁恩 申請人:阿邁瑞斯公司