用於甜瓜枯萎病抗性鑑定的功能性分子標記一及其用途的製作方法

2023-12-10 03:18:36 2

專利名稱：用於甜瓜枯萎病抗性鑑定的功能性分子標記一及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於蔬菜抗病分子標記育種技術領域，具體涉及一種甜瓜枯萎病抗性基因 Fom-2功能性分子標記及其應用，從而為甜瓜枯萎病抗性的標記輔助選擇提供一種新型分子標記。
背景技術：
甜瓜(Cocumis melo L.)作為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物中一種重要的園藝作物，具有較高的商業品價值和經濟價值，是我國重要的經濟作物之一。近年來隨著甜瓜種質資源商品化和種植面積的不斷擴大，病蟲害發生日益嚴重，迫使生產上大量使用化學試劑，嚴重影響了甜瓜的產量和品質(Sherf and MacNab 1986)。其中甜瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌導致的一種世界範圍內毀滅性的土傳病害，導致甜瓜90%以上的經濟損失 (Leach JG1938 ；Martyn RD 1987)。目前已經鑑定分離得到4種枯萎病菌生理小種，分別為生理小種0，1，2和1-2。遺傳分析表明，2個獨立的基因Fom-I和Fom-2分別控制對生理小種 0，2 和 0，1 的抗性(Risser et al. 1976 ；Risser and Mas 1965 ；Robinson et al. 1976)。其中！^0111-2基因已經通過圖位克隆的方法得到分離(Joobeur et al. 2004)。 Fom-2 基因屬於 NBS-LRR 類的 R 基因，這類基因編碼 NBS (nucleotide binding site, NBS) 和LRRdeucine-rich repeat, LRR)兩個比較保守的結構域。通常植物專化抗性是由於宿主對抗性蛋白產生的無毒基因的識別，進而引發一個信號級聯反應和防禦反應(Hammond Kosack and Jones 1997 ；Martin et al. 2003)。植物的R基因不斷變化來識別產生變異的無毒基因，這有利於人們在分子水平上發現和認識自然選擇。現在人們已從許多物種中克隆得到R基因，並驗證了它們在抗性和不抗材料間的功能多樣性。許多研究表明擬南芥和其他幾個物種R基因存在序列的多態性，這種種間或種內影響表型的基因序列多態性的識別有利於功能性分子標記的發展(Andersen and Lubberstedt，2003)。目前培育優良抗枯萎病甜瓜品種成為解決甜瓜枯萎病害問題的有效途徑之一，分子輔助選擇(MAQ手段的發展能大大縮短甜瓜枯萎病抗性育種進程。但目前抗病育種過程中所使用的分子標記與目標基因存在一定遺傳距離，易發生重組交換而分離，從而影響選擇的準確性。功能性分子標記是與表型相關的功能基因基序中功能性單核苷酸多態性位點開發而成的新型分子標記，功能性分子標記的開發首先需要鑑定出群體中與表型相關的功能基因的功能性基序的序列。AS-PCR和CAPS方法已成功應用於基於SNPs的一系列功能性分子標記的開發(Chiapparino et al. 2004 ；Kim et al. 2006 ；Yeam et al. 2005)。功能性分子標記不需要複雜昂貴的儀器設備或繁瑣的操作步驟，因此非常適合應用於分子育種過程。隨著越來越多的功能基因及其等位基因的分離和注釋，功能性分子標記已成為一類新型分子標記，可以大大提高標記的效率。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種與甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2相關的功能性分子標記，其適用於甜瓜的抗枯萎病的輔助選擇。為了解決上述技術問題，本發明提供一種用於甜瓜枯萎病抗性鑑定的功能性分子標記，該分子標記所採用的CAPS引物序列為以下任意一種CAPSl 正向引物為 5，-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3， (SEQ ID NO 3)反向引物為 5，-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3， (SEQ ID NO 4),CAPS2 正向引物為 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3， (SEQ ID NO 5)反向引物為 5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3， (SEQ ID NO 6),CAPS3 正向引物為 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，(SEQ ID NO 7)反向引物為 5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，(SEQ ID NO 8)；或者，該分子標記所採用的AS-PCR引物序列為AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3， (SEQ ID NO 9)反向引物為 5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，(SEQ ID NO :10)。本發明還同時提供了上述功能性分子標記的用途用於甜瓜枯萎病的分子輔助育
種，或者用於鑑定甜瓜枯萎病抗性基因。發明人發現了甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2在抗病與感病種質的LRR區域有3個 SNP位點，甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。枯萎病抗性和感病材料在序列表SEQ ID NO 1的^lbp處有一個A-G的鹼基突變，在1075bp處有一個A-G的鹼基突變，在1216bp處有一個T-C的鹼基突變(圖1)。突變後的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所述。根據上述SEQ ID NO 1的序列的SNP特徵，分別設計引物，開發FMs，所述的CAPS 和AS-PCR方法的引物對分別為CAPSl 正向引物為 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，反向引物為 5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，；CAPS2 正向引物為 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，反向引物為 5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，；CAPS3 正向引物為 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，反向引物為 5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，。AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，反向引物為 5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，。該CAPS及AS-PCR引物對能成功鑑定出甜瓜抗病及感病種質(圖2、3)，並且在F2
世代中呈單基因遺傳分離規律(表1、2)，應用上述兩種方法可以成功鑑定出甜瓜種質對枯萎病抗性的基因型(表3)。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是本發明的甜瓜抗病及感病種質i^om-2基因LRR區域SNP位點圖；圖1中fom-2-R代表枯萎病抗病基因型，Fom-2-S代表枯萎病感病基因型；圖2是CAPS方法鑑定甜瓜抗病及感病種質對比圖；圖2中FF為抗病純合基因型，Ff為抗病雜合基因型，ff為感病純合基因型，M為 DNA分子量標準；圖3是AS-PCR方法鑑定甜瓜抗病及感病種質對比圖；圖3中FF為抗病純合基因型，Ff為抗病雜合基因型，ff為感病純合基因型，M為 DNA分子量標準。
具體實施例方式實施例1、本發明的主要步驟和內容為根據資料庫中甜瓜枯萎病抗性基因i^m-2 設計引物，以甜瓜抗病及感病種質及它們Fp F2世代基因組DNA為模板，鏈式聚合酶反應 (PCR)方法擴增目的片段、測序，然後應用生物信息學然間對序列進行分析。採用CAPS和 AS-PCR兩種方法開發枯萎病抗性相關的FMs，並在F1J2世代驗證其有效性和可靠性。應用上述兩種標記方法，提取生產上應用的不同甜瓜種質基因組DNA，鑑定其枯萎病抗性的基因型。具體步驟如下(1)在NCBI資料庫(http://WWW· ncbi. nlm. nih. gov/)中找到甜瓜枯萎病抗性基因!^0111-2的序列信息，Fom-2基因登錄號為AY583855。！^111-2基因屬於NBS-LRR類的R基因，編碼NBS和LRR兩個比較保守的結構域。(2)設計引物併合成，在i^om-2基因LRR區兩端設計引物，引物序列如下
Fom-2 正向引物GAGTCTATTGTTTCGCTTC反向引物TGCTCGTCTCTGGGTCACCTTC。(3)基因組DNA的提取(a)分別取0. 5g上述甜瓜抗病(Cantaloupe，高抗枯萎病材料)和感病種質(仙果027-5，高感枯萎病材料)、Fp F2的不同甜瓜種質嫩葉於研缽中，液氮狀態下研磨，加入 600 μ 1 65°C預熱的2 X CTAB (30 μ 1巰基乙醇混勻)，轉移到離心管中，65°C保溫1小時。(b)加入600 μ 1的氯仿異戊醇(24/1的體積比)輕輕搖勻，4°C，13000rpm離心， 10分鐘。(C)取上清，重複(b)步驟一次。(d)取步驟(C)所得的上清於另一離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，顛倒混勻，靜置5分鐘，13000rpm，離心10分鐘。(e)倒去上清，加入700 μ 1 Wash Buffer漂洗DNA沉澱，離心，重複一次。(f)加 15 μ ITE-Rnase, 37°C保溫 1 小時。(g)力口入 2mol/L NaCl 100 μ 1+100 % 乙醇 250 μ 1 混勻，-20 °C 靜置 30min， 13000rpm離心10分鐘。(h)倒去上清，加入500 μ 1 70% (體積比)乙醇，漂洗，倒去乙醇，重複一次，常溫晾乾。
⑴加入30-50 μ 1 ddH20或TE,回溶，_20°C保存備用。注2XCTAB配方CTAB 4gIM Tris-HCl (pH8. 0) 20mlEDTA 1. 488gNaCl 16. 352g先用70ml ddH20溶解，再定容至200ml滅菌，冷卻後0. 2_1%2_巰基乙醇000 μ 1) 氯仿-異戊醇04 1)先加96ml氯仿，再加細1異戊醇，搖勻即可。TE-Rnase :15 μ 1 TE 力口入 1/100 體積的 Rnase0Wash Buffer IOmmol/L 乙酸氨75% (體積比)乙醇(4)鏈式聚合酶反應(PCR)的試劑與條件首先將下列試劑混和在一起
IOxTaq DNA聚合酶緩衝液5 μ
模板DNA1 μ
正向引物(1.25昭/1)0.4 μ
反向引物(1.25昭/1)0.4 μ
脫氧核苷酸混合物(dNTP)1 μ
Taq DNA 聚合酶0.4 μ
滅菌水41.8 μ
總體積50 μ PCR反應條件為94°C預變性:3min後，94 °C變性30s，50°C退火45s，72 °C延伸 1. 5min，35個循環後72°C延伸lOmin。PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。對目的條帶進行克隆測序，具體方法如下(a)連接反應，離心管順序加入以下各組分H2O 2 μ 1T4DNALigase IOXBuffer 1 μ 1pUCM-T 載體1 μ 1PCR 產物4 μ 1PEG4000 1 μ 1T4DNALigase 1 μ 1 ；(b)感受態細胞的製備(CaCl2法製備感受態細胞):①挑取新活化的E. coli DH5a單菌落，接種於5ml LB液體培養基中，37°C下振蕩培養1 左右，直至對數生長後期。②將菌液以1 100-1 150的比例(重量比)接種於IOOml LB液體培養基中， 37°C下振蕩培養2h左右，至0D600 = 0. 5左右。
③將培養液轉入離心管中，冰上放置lOmin，然後於4°C下IOOOOrpm離心lOmin。④棄上清，用預冷的0. lmol/L的CaC12溶液30ml輕輕懸浮細胞，冰上放置IOmin 後，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。重複操作一次。⑤棄上清，加3ml預冷的含15% (體積比)甘油的0. lmol/L的CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰上放置5min後，即成感受態細胞，分裝成200 μ 1的小份，置於_70°C保存備用。(c)熱激法轉化大腸桿菌DH5 α ①取上述(b)步驟製備的感受態細胞懸浮液200 μ 1，搖勻後加入4μ 1上述(a)步驟的連接產物，用槍頭輕輕吹打均勻，冰浴30分鐘； ②42 °C保溫90秒，迅速放入冰中，冰浴5分鐘；③加入37°C預熱的Iml LB液體培養基(Amp_)，混勻，37 °C保溫1個小時，使細胞恢復正常生長狀態；④ 3000rpm 離心 10 分鐘；⑤棄去上清，餘下的200 μ 1用槍頭輕輕吹打均勻，使細菌充分懸浮後均勻塗布於含 15 μ 1 X-Gal (20mg/ml)禾Π 100 μ 1 IPTG (24mg/ml)的 LB 篩選平板培養基上(Amp+)；⑥37°C正面向上放置半個小時後，倒置培養8-12小時，觀察。LB培養基配方IOOrnl體系中加入以下各組分蛋白腖(Typtone)Ig酵母提取物(YeastExtract) 0. 5gNaCl IgNaOH (lmol/L) 100 μ 1先用70ml ddH20溶解，再定容至100ml，高壓高溫滅菌後4°C保存。(5)質粒純化(a)在超淨工作檯中用無菌槍頭挑取單個白色菌落，接種於含50μ g/ml Amp的 5mlLB培養液中，37°C培養過夜。(b)取 l_2ml 菌液於 Epeendorf 管中，12000rpm 離心 1 分鐘；(c)加入100 μ 1 Solution I，用槍頭充分懸浮菌液；(d)加入 200 μ 1 Solution II，顛倒 Epeendorf 管，冰浴 3 分鐘；(e)加入 150 μ 1 預冷的 Solution III，顛倒 Epeendorf 管，冰浴 5 分鐘；(f) 40C，12000rpm離心5分鐘，上清液加入等體積的苯酚/氯仿混勻；(g) 40C，12000rpm離心5分鐘，上清液加入2倍體積的乙醇，室溫放置5分鐘；(h)4°C，12000rpm離心5分鐘，用70%乙醇漂洗一下，涼幹沉澱，50 μ 1 TE融解沉澱，-20°C保存備用。其中Solution I :100ml 體系lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0) 2.5ml0. 5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0ml20% Glucose (1. llmol/L) 4.5mldH20 91ml0108]高溫高壓滅菌後4°C保存。
0109]SolutionII :100ml 體系
0110]10% SDS IOml
0111]2mol/LNaOH IOml
0112]加滅菌水至100ml，充分混勻，室溫保存，最好現用現配。
0113]SolutionIII :100ml 體系
0114]KOAc 29. 4g
0115]CH3COOH 11.5ml
0116]加滅菌水至IOOml，高溫高壓滅菌後4°C保存。
0117]序列測定與分析序列測定由上海英駿生物技術有限公司完成。將所得序列在
Genebank及分子生物學軟體DNAMAN、Clustalff等分析，得到SNP位點信息(圖1)。￠) CAPS 方法採用dCAPS 2. 0(http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps. html)軟體設計引物， 引物序列如下
0120]CAPS 1 正向引物 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，
0121]反向引物 5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，
0122]CAPS2 正向引物 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，
0123]反向引物 5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，
0124]CAPS3 正向引物 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，
0125]反向引物為 5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，
0126]反應體系和條件同上，PCR產物分別採用AccI，EcoRI和)(baI限制性內切酶進行
酶切，三種內切酶均採用20 μ 1的反應體系如下反應體系
PCR 產物5-10μ1
0.1% BSA2μ1
IOxbuffer2μ1
酶5U補充dd H2O 至 20μ 1 ；將混合溶液置於37 °C，TaqI體系置於65 °C條件下各保溫4小時，產物採用 HDA-GT 12TM(eGene，USA)毛細管電泳系統進行檢測。利用CAPS標記分析F2群體遺傳規律，3個SNP位點均呈1:2:1的分離比例 (表1)，符合孟德爾單基因遺傳規律，因此CAPS方法可以有效區分抗性和敏感植株。表1、CAPS方法鑑定的SNP位點在F2世代中遺傳分離
權利要求
1.用於甜瓜枯萎病抗性鑑定的功能性分子標記一，其特徵是 所述分子標記一所採用的引物序列為CAPSl 正向引物為 5』 -TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3』反向引物為 5』 -GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3』。
2.如權利要求1所述的功能性分子標記一的用途，其特徵是用於甜瓜枯萎病的分子輔助育種，或者用於鑑定甜瓜枯萎病抗性基因。
全文摘要
本發明公開了用於甜瓜枯萎病抗性鑑定的功能性分子標記一，該分子標記一所採用的引物序列為CAPS1正向引物為5』-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3』，反向引物為5』-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3』。該功能性分子標記一用於甜瓜枯萎病的分子輔助育種，或者用於鑑定甜瓜枯萎病抗性基因。
文檔編號C12N15/11GK102399885SQ20111037795
公開日2012年4月4日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者張明方, 楊景華, 王士偉 申請人:浙江大學