豬源啟動子蛋白表達載體及其構建方法與應用的製作方法

2023-12-10 04:21:31

專利名稱：豬源啟動子蛋白表達載體及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種真核表達載體，尤其涉及一種豬源啟動子蛋白表達載體及其構建 方法，本發明還涉及該豬源啟動子蛋白表達載體在豬類細胞中表達外源蛋白的應用，屬於 真核表達載體的構建領域。
背景技術：
我國是養豬業大國，養豬業的發展也促進了對豬類生產、疾病預防與控制等領域 的研究，尤其是抗病育種逐漸被提到日程上來。由於目前尚缺少豬源啟動子的蛋白表達載 體，難以在豬類體內或細胞中進行高效表達其它外源基因。真核表達載體是分子生物學研究中最常用的表達載體之一。目前使用的真核表達 蛋白質粒構建表達外源基因質粒的過程中，是通過傳統的連接方法連接的，利用酶切位點， T4DNA連接酶將載體與目的片段連接成一個完整的質粒。傳統的這種酶切的連接方法存在 步驟比較煩瑣，成本高，連接效率較低等問題，PCR產物與載體都要通過反覆的酶切，電泳， 回收等步驟，才能進行進一步的連接。這樣既耗費時間，而且連接的效率不是很理想，有待 改進。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種豬源啟動子蛋白表達載體；本發明的目的之二是提供一種構建上述豬源啟動子蛋白表達載體的方法；本發明的目的之三是將上述豬源啟動子蛋白表達載體應用於表達外源蛋白；本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的一種豬源啟動子蛋白表達載體(pSP-Vector)，其為環狀載體，包含原核複製起點、 真核複製起點、篩選標記基因和外源基因表達盒，所述外源基因表達盒自上遊至下遊依次 由一個轉錄啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號組成；所述連接片段含有EcoRV識別 序列。其中，所述真核複製起點優選為SV40病毒複製起點。所述一個轉錄啟動子優選為Myosin light polypeptide 6 (MLP6)啟動子；所述多聚腺苷酸加尾信號優選為牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。更優選的，所述豬源啟動子蛋白表達載體的鹼基為SEQ ID NO 1所示。本發明還提供了一種線性的豬源啟動子蛋白表達載體。所述線性的載體是用EcoRV酶切豬源啟動子蛋白表達載體(pSP-Vector)而得到 的線性載體。本發明的另一個目的是提供一種環狀的豬源啟動子蛋白表達載體的構建方法。一種環狀的豬源啟動子蛋白表達載體(pSP-Vector)的構建方法，包括以下步驟(1)以pEGFP-Nl質粒為模板，用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3為引物進行PCR擴 增，得到片段A ；
(2)以pCDNA3. 0質粒為模板，以pCDNA3. 0質粒為模板，用SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5為引物進行PCR擴增，得到片段B ；(3)將片段A和片段B導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段A和片段 B連接，獲得重組載體I ；(4)以重組載體I為模板，用SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7為引物進行PCR擴增， 得到片段D;(5)以pEGFP-Nl質粒為模板，用SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9為引物進行PCR擴 增，得到片段C;(6)將片段C和片段D導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段C和片段 D連接，獲得重組載體II ；(7)以重組載體II為模板，用SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13為引物進行PCR擴 增，得到片段E;(8)以豬血液cDNA為模板，用SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11為引物進行PCR擴 增，得到片段F;(9)將片段E和片段F導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段E和片段 F連接，即得。本發明的豬源啟動子蛋白表達載體(pSP-Vector)可以在豬類細胞中高效表達外 源蛋白，而且此載體可以利用同源重組構建表達外源基因的重組載體，避免了傳統的酶切， 連接等環節，可以直接將純化的PCR產物與線性化的載體混均之後直接轉化感受態細胞， 然後挑菌鑑定陽性克隆。線性化的質粒末端含有與目的基因片段的PCR產物的末端同源 互補的序列，這種序列會使這兩個基因片段在感受態細胞中同源重組為一個完整的含有目 的基因的質粒。這種質粒在大腸桿菌中可以大量複製，整個構建過程中不使用任何內切酶 與連接酶，且比傳統的連接過程省略了 2-3個步驟，連接的效率也較理想。使用本發明的 pSP-Vector構建表達外源基因的重組載體的過程簡便、快速、經濟、高效，可以快速完成大 量外源基因的表達載體的構建。本發明的pSP-Vector含有一個真核複製起點，可以在表達 T抗原的細胞中大量增值，從而提高蛋白表達的水平。


圖 1 為 pSP-Vector 圖譜。圖2為綠色螢光蛋白的螢光顯微鏡觀察結果(100x) ；A為pSP-EGFP質粒轉染ST 細胞螢光結果B為陰性對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1、pSP-Vector的構建l)pSl 的構建
設計引物pSl Vector 1 上遊和 pSl Vector 1 下遊、pSl Vector2 上遊和 pSl Vector2 下遊，引物 pSl Vectorl 上遊和 pSl Vectorl 下遊、pSl Vector2 上遊和 pSl Vector2下遊的序列如下pSl Vectorl 上遊5' ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3『；pSl Vectorl 下遊5' GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3『。pSl Vector2 上遊5' CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC 3『(劃線部分為EcoR V酶識別位點)；pSl Vector2 下遊5' CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3『。以pEGFP-Nl (購自Invitrogen)質粒為模板，用引物pSl Vectorl上遊和pSl Vectorl下遊PCR擴增片段A，以pCDNA3. 0質粒(購自invitrogen公司)為模板，用引物 pSl Vector2上遊和pSl Vector2下遊PCR擴增片段B。PCR 反應體系10XPCR Buffer 5 ii L，上遊、下遊引物各 1 ii L，DNA 模板 1 ii L， MgC12 (25mM) 3 u L, dNTPs (各 2. 5mM) 3 u L, Pfu-Taq (5U/ u L)0. 5u L,最後補水至 50 u L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸6min，共30個 循環；72°C最後延伸lOmin。PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。50 ill感受態細胞中加入片段A和B後混勻，片段A和B質量比為100ng 500ng。 混勻後體系冰浴30min。42°C水浴熱激90秒，然後冰上放置3min，加入預熱的LB培養基 900iil，置於37°C下，180-200rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取 200ia重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37°C培養12-16h。挑取單克隆提取質粒， 該質粒命名為pA。2)pS2_Vector 的構建設計引物SV (40)上遊和 SV(40)下遊 pS2 Vector (1)上遊和 pS2 Vector (1)下遊， 序列如下SV(40)上遊5，GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3，；SV(40)下遊5，CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3，。pS2 Vector (1)上遊5，GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3，；pS2 Vector (1)下遊5，GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3，。以pEGFP-Nl質粒為模板，用引物SV(40)上遊和SV(40)下遊PCR擴增片段C ；以 pSl Vector質粒為模板，用引物pS2 Vector (1)上遊和pS2 Vector (1)下遊PCR擴增片段 D0PCR反應體系10XPCR Buffer 5 y L，上遊、下遊引物各1 y L，DNA模板1 y L， MgCl2 (25mM) 3 u L, dNTPs (各 2. 5mM) 3 u L, Pfu-Taq (5U/ u L)0. 5u L,最後補水至 50 u L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸6min，共30個 循環；72°C最後延伸lOmin。PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。50 ill感受態細胞中加入片段C和D後混勻，片段C和D質量比為100ng 500ng。 混勻後體系冰浴30min。42°C水浴熱激90秒，然後冰上放置3min，加入預熱的LB培養基 900 iil，置於37°C下，180-200rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取200 yl重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37°C培養12-16h。挑取單克隆提取質粒， 該質粒命名為PAP-SV40。3)pSP_Vector 的構建設計引物pSP上遊和pSP下遊、MLP6上遊和MLP6下遊，引物序列如下pSP 上遊GAGCCAAGCAGTCAAGTACGACTCACTATAGG ；pSP 下遊CCTATAGTGAGTCGTACTTGACTGCTTGGCTC。MLP6 上遊GGAGTTAGGGGCGGGAGAGACATACGTTTCC ；MLP6 下遊CCTATAGTGAGTCGTACTTGACTGCTTGGCTC。以pAP-SV40為模板，用引物pSP上遊和pSP下遊PCR擴增片段E ；以豬血液REVDNA 為模板，用引物MLP6上遊和MLP6下遊PCR擴增片段F。PCR反應體系10XPCR Buffer 5 y L，上遊、下遊引物各1 y L，DNA模板1 y L， MgCl2 (25mM) 3 u L, dNTPs (各 2. 5mM) 3 u L, Pfu-Taq (5U/ u L)0. 5u L,最後補水至 50 u L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸6min，共30個 循環；72°C最後延伸lOmin。PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。50 ill感受態細胞中加入片段E和F後混勻，片段C和D質量比為lOOng 500ng。 混勻後體系冰浴30min。42°C水浴熱激90秒，然後冰上放置3min，加入預熱的LB培養基 900 iil，置於37°C下，180-200rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取 200ia重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37°C培養12-16h。挑取單克隆提取質粒， 該載體命名為pSP-vector，pSP-vector圖譜如圖1所示。挑取單克隆提取質粒，將pSP-vector測序，測序結果表明，pSP-vector的核苷酸 序列如序列表中的SEQ ID NO 1所示，SEQ ID NO 1自5'末端第1-543位為MLP 6啟動 子，自5'末端第628-634位為EcoR V酶的識別序列，自5'末端第606-969位為BGH Ploy A，自 5'末端第 960-1141 位為 SV40 Origin,自 5'末端第 1160-1779 位為 C0IE1 Origin, 自5'末端第1780-2937位為氨苄青黴素抗性基因。SEQ ID N0:1的自5'端第631-646位 的核苷酸序列和SEQID N0:1的自5'端第647-662位的核苷酸序列為能與外源基因上的 PCR擴增產物發生同源序列重組的序列。試驗例1 pSP-vector表達蛋白的能力1)表達綠色螢光蛋白的pSP-EGFP-Vector的構建設計引物EGFP上遊和EGFP下遊，引物序列如下EGFP 上遊GGAATTCTGCAGATTCGCCACCATGGTGAG ；EGFP 下遊ATGCATGCTCGAGGATTTACTTGTACAGCTCG。 以pEGFP-Nl為模板，用引物EGFP上遊和EGFP下遊PCR擴增EGFP基因片段。反應體系10XPCR Buffer 5 u L, ±遊、下遊引物各1 P L，DNA模板1 y L， MgCl2 (25mM) 3 u L, dNTPs (各 2. 5mM) 3 u L, Pfu-Taq (5U/ u L)0. 5u L,最後補水至 50 u L。反應條件94°C熱變性5min ；94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，共30個 循環；72°C最後延伸lOmin。PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。pSP-Vector用EcorV內切酶酶切線性化，回收線性化的pSP-Vector。
6
酶切體系如下10XD buffer 10 u 1, BSA 1 u 1, EcoR V 2 u 1 (20U PROMEGA 公司購買)， pSP-Vector 50 u 1，補水至 100 u 1，37°C 酶切過夜。酶切產物在1 X TAE配製的瓊脂糖凝膠中電泳，120v,電泳30分鐘，DNA回收試劑 盒回收目的片段。回收產物-80°C保存備用。50 u 1感受態細胞中加入線性化的pSP-Vector和HA基因片段後混勻，線性化的 pSP-Vector和HA基因片段質量比為lOOng 500ng。混勻後體系冰浴30min。42°C水浴熱 激90秒，然後冰上放置3min，加入預熱的LB培養基900 yl，置於37°C下，180-200rpm振搖 90min,收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取200 yl重懸液塗布LB板上(含有氨苄青 黴素)，37°C培養12-16h。挑取單克隆提取質粒，該質粒命名為pSP-EGFP-Vector。2)綠色螢光蛋白的的檢測取 10ul lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司)加入到 250ul 的 0PTI-MEMI 培 養基(Invitrogen公司)中，室溫放置5分鐘，獲得溶液1 ；將5ug pSP-EGFP-Vector質粒 加入到250ul的0PTI-MEMI培養基中，獲得溶液2 ；將溶液1和2混合，室溫孵育20分鐘， 再加入500ul的0PTI-MEMI培養基，得到溶液3。將ST細胞置於6孔細胞板中培養，等待細胞長至60-80%時將細胞用PBS洗滌兩 次，然後加入溶液3，37°C孵育5個小時，吸出溶液3，加入新鮮的0PTI-MEMI培養基，繼續培 養。培養24h後，在螢光顯微鏡下觀察螢光蛋白的表達情況。螢光顯微鏡結果如圖2所示，表明pSP-Vector轉染後24小時ST細胞有較強的熒 光信號，而陰性對照組沒有螢光，說明pSP-Vector質粒可以在ST表達綠色螢光蛋白，具有 良好的蛋白表達能力，也說明MLP 6是一種良好的豬源啟動子，可以在豬類細胞中高效表 達外源蛋白。
權利要求
一種環狀的豬源啟動子蛋白表達載體，包含原核複製起點、真核複製起點、篩選標記基因和外源基因表達盒，所述外源基因表達盒自上遊至下遊依次由一個轉錄啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號組成；其特徵在於所述轉錄啟動子是MLP6啟動子。
2.按照權利要求1所述的豬源啟動子蛋白表達載體，其特徵在於所述連接片段含有 EcoR V識別序列。
3.按照權利要求1所述的豬源啟動子蛋白表達載體，其特徵在於所述真核複製起點 為SV40病毒複製起點。
4.按照權利要求1所述的豬源啟動子蛋白表達載體，其特徵在於所述多聚腺苷酸加 尾信號為牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
5.按照權利要求1-4任何一項所述的豬源啟動子蛋白表達載體，其特徵在於其鹼基 為 SEQ ID NO 1 所示。
6.一種線性的豬源啟動子蛋白表達載體，其特徵在於將權利要求1所述環狀的豬源 啟動子蛋白表達載體線性化而得到。
7.—種構建權利要求1-4任何一項豬源啟動子蛋白表達載體的方法，包括以下步驟(1)以pEGFP-Nl質粒為模板，用SEQID NO :2和SEQ ID NO :3為引物進行PCR擴增， 得到片段A ；(2)以pCDNA3.0質粒為模板，以pCDNA3. 0質粒為模板，用SEQ ID NO :4和SEQ ID NO: 5為引物進行PCR擴增，得到片段B ；(3)將片段A和片段B導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段A和片段B連 接，獲得重組載體I ；(4)以重組載體I為模板，用SEQID NO :6和SEQ ID NO :7為引物進行PCR擴增，得到 片段D;(5)以pEGFP-Nl質粒為模板，用SEQID NO 8和SEQ ID NO 9為引物進行PCR擴增， 得到片段C;(6)將片段C和片段D導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段C和片段D連 接，獲得重組載體II;(7)以重組載體II為模板，用SEQID N0:12和SEQ ID NO 13為引物進行PCR擴增， 得到片段E;(8)以豬血液cDNA為模板，用SEQID N0:10和SEQ ID NO :11為引物進行PCR擴增， 得到片段F;(9)將片段E和片段F導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段E和片段F連 接，即得。
8.權利要求1-4任何一項所述的豬源啟動子蛋白表達載體在表達外源蛋白中的應用。
9.權利要求6所述的豬源啟動子蛋白表達載體在表達外源蛋白中的應用。
全文摘要
本發明公開了豬源啟動子蛋白表達載體及其構建方法與應用。本發明表達載體為環狀，包含原核複製起點、真核複製起點、篩選標記基因和外源基因表達盒，所述外源基因表達盒自上遊至下遊依次由轉錄啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號組成；所述轉錄啟動子是MLP6啟動子。本發明表達載體可在豬類細胞中高效表達外源蛋白，因含有一個真核複製起點，可在表達T抗原的細胞中大量增值，從而提高蛋白表達水平。本發明利用同源重組構建表達外源基因的重組載體，避免了傳統的酶切，連接等環節，比傳統的連接過程省略了2-3個步驟。使用本發明載體構建表達外源基因的重組載體的過程簡便、快速、經濟、高效，可以快速完成大量外源基因的表達載體的構建。
文檔編號C12N15/85GK101948872SQ20101026104
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月24日 優先權日2010年8月24日
發明者劉珊珊, 劉芹防, 崔尚金, 張超範 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所