利用基因槍獲得轉基因小麥的方法及其專用培養基的製作方法

2023-12-10 04:17:01 1

利用基因槍獲得轉基因小麥的方法及其專用培養基的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用基因槍獲得轉基因小麥的方法及其專用培養基。本發明以小麥幼胚為外植體，不經過預培養直接使用本發明所提供的高滲培養基進行高滲處理後進行基因槍轟擊，轟擊後再用本發明提供的專用培養基進行高滲處理、愈傷組織誘導、分化和生根培養，且在分化和生根階段使用篩選劑，在愈傷組織誘導階段不使用篩選劑，可明顯提高小麥的基因轉化效率，最高可達36%；且本發明還具有轉化周期短（從取幼胚至獲得具有根莖葉的再生植株僅需8—10周）、轉化穩定性和重複性高的優點。本發明為小麥遺傳改良產業化提供了一個有效途徑，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】利用基因槍獲得轉基因小麥的方法及其專用培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用基因槍獲得轉基因小麥的方法及其專用培養基。
【背景技術】
[0002]小麥是一種在世界各地廣泛種植的重要糧食作物，它關係到國家的經濟危機和糧食安全。中國是世界最大的小麥生產國。2010年繼玉米和水稻之後，小麥在中國的產量達到了 224萬噸。目前，通過常規育種手段提高小麥產量和品質的努力已是舉步維艱，尤其在挖掘畝產潛力、保證年產穩定性等方面。自1992年Vasil等將gus/bar基因導入小麥獲得首例轉基因小麥以來，遺傳改良育種在小麥上的研究有了長足的發展。2008年國家將小麥的遺傳改良加入重大轉基因專項，正在積極穩妥地推動實施轉基因小麥新品種的培育工作。小麥遺傳轉化常用的方法有基因槍法和農桿菌介導法。由於單子葉植物不是農桿菌的天然宿主，所以基因槍法一直是小麥轉化的主要方法。[0003]儘管到目前為止一些國外公司和實驗室能夠利用基因槍法獲得穩定遺傳的轉基因小麥，但普遍具有轉化效率低、轉化周期長、體細胞變異多、逃逸現象嚴重、僅適用於「Bobwhite」 「Fielder」等國外品種的技術缺陷和不足。1995年Zhou等用預培養5天的「Bobwhite」未成熟胚基因槍法導入gUS/cp4基因。整個轉化周期長達4-5個月，草銨膦陽性植株佔轟擊外植體的比例平均為0.15%，其中1/3的植株能夠表達gus基因。1996年Ortiz等用包裹含有gus/hpt基因的質粒轟擊預培養7-9天的「BuckOmbii」未成熟胚,僅愈傷篩選階段長達4-6周並且8個轉化植株中就有4個逃逸。2000年Jordan實驗室利用GFP輔助篩選大大提高了小麥基因槍轉化頻率，最高可達5%。2002年Hubert等藉助bar基因，GFP輔助篩選手段，使商品小麥品種「Combi」的轉化頻率達到了 4.93%，比常規愈傷轉化高出38倍。

【發明內容】

[0004]本發明的一個目的是提供一種獲得轉基因小麥的成套培養基，包含如下分別獨立包裝的四種培養基中的四種、任意三種、任意兩種或任意一種:培養基A、培養基B、培養基C和培養基D ；
[0005]所述培養基A (即高滲培養基)是由MS基本培養基、甘露醇、2，4-D、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基；所述甘露醇在所述培養基A中的濃度可為80-100g/L (如90g/L);所述2，4-D在所述培養基A中的濃度可為4.5—5.5mg/L (如5.0mg/L)；
[0006]所述培養基B (即誘導培養基)是由MS基本培養基、2，4-D、硫酸銅、水解酪蛋白、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基；所述2，4-D在所述培養基B中的濃度可為2.0-3.0mg/L (如
2.0mg/L)，所述硫酸銅在所述培養基B中的濃度可為0.5-0.7mg/L (如0.6mg/L)，所述水解酪蛋白在所述培養基B中的濃度可為0.4—0.6g/L (如0.5g/L)；
[0007]所述培養基C (即分化培養基)是由MS基本培養基、激動素、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基，或由MS基本培養基、激動素、蔗糖、凝固劑和篩選劑製成的固體培養基；所述激動素在所述培養基C中的濃度可為0.2—0.3mg/L (如0.2mg/L)；
[0008]所述培養基D (即生根培養基)是由1/2的MS基本培養基、乙磺酸、α-萘乙酸、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基，或由1/2的MS基本培養基、乙磺酸、α-萘乙酸、蔗糖、凝固劑和篩選劑製成的固體培養基；所述乙磺酸在所述培養基D中的濃度可為0.4—0.6g/L(如0.5g/L),所述α -萘乙酸在所述培養基D中的濃度可為0.4—0.6mg/L (0.5mg/L)；
[0009]所述MS基本培養基為表1所不的培養基。
[0010]在上述成套培養基中，所述蔗糖在所述培養基A、B、C和D中的濃度可為20— 40g/L (如 30g/L)；
[0011]和/或，所述凝固劑為植物凝膠，所述植物凝膠在所述培養基A、B、C和D中的濃度可為3g/L ；
[0012]和/或，所述培養基A、B、C和D的pH值可為5.6 — 5.8 (如5.8)。
[0013]本發明的另一個目的是提供一種利用基因槍獲得轉基因小麥的方法，包括如下步驟:
[0014]I)取小麥幼胚用所述培養基A進行培養；
[0015]2)使用基因槍對經步驟I)所述培養的小麥幼胚進行轟擊，將目的DNA導入所述小麥幼胚細胞中；
[0016]3)將經步驟2)所述轟擊的小麥幼胚用所述培養基A進行培養；
[0017]4)將經步驟3)所述培養的小麥幼胚用所述培養基B進行培養獲得愈傷組織；
[0018]5)將步驟4)獲得的愈傷組織用所述培養基C進行分化培養，獲得含目的DNA的轉基因小麥植株。
[0019]步驟4)中所述培養的時間具體可為14天；
[0020]步驟5)中所述分化培養的時間具體可為28天，每14天繼代一次。
[0021]在上述方法中，步驟I)中所述培養的時間為3—5小時(如4小時)；和/或，步驟3)中所述培養的時間為14—18小時(如16小時)。
[0022]在上述方法中，步驟2)中所述轟擊的次數為一次；每次所述轟擊的轟擊距離為6cm,轟擊壓力為IlOOpsi,轟擊直徑為2cm。
[0023]在上述方法中，所述轟擊使用金粉對待轉化DNA進行分散；每次所述轟擊中所述金粉的使用量為200 μ g，所述待轉化DNA為I μ g ;所述金粉的粒徑為0.6 μ m。
[0024]在上述方法中，所述分化培養後還包括生根培養的步驟，所述生根培養使用的培養基為所述培養基D ;所述生根培養的時間具體可為14一28天，每14天繼代一次。
[0025]在上述方法中，在所述分化培養時使用含篩選劑的所述培養基C ;和/或，在所述生根培養時使用含篩選劑的所述培養基D。
[0026]在上述方法中，所述篩選劑可為草銨膦，所述草銨膦在所述分化培養和生根培養中的濃度為5—10mg/L,具體可為5mg/L。
[0027]和/或，步驟2)中所述轟擊時所述目的DNA連接於環形質粒上。
[0028]在上述方法中，所述培養的溫度為22— 26°C，如22°C或24°C ；
[0029]和/或，所述分化 培養的光周期為每天24小時中16小時光照、8小時黑暗，光照強度為 150 μ mol/m2/s ;
[0030]和/或，所述生根培養的光周期為每天24小時中16小時光照、8小時黑暗，光照強度為 150 μ mol/m2/s0
[0031]和/或，步驟I)中所述小麥 幼胚為開花10—14天的小麥幼胚。
[0032]實驗證明，以小麥幼胚為外植體，不經過預培養直接使用本發明所提供的高滲培養基進行高滲處理後進行基因槍轟擊，轟擊後再用本發明提供的專用培養基進行高滲處理、愈傷組織誘導、分化和生根培養，且在分化和生根階段使用篩選劑，在愈傷組織誘導階段不使用篩選劑，可明顯提高小麥的基因轉化效率，最高可達36% ;且本發明還具有轉化周期短(從取幼胚至獲得具有根莖葉的再生植株僅需8 —10周)、轉化穩定性和重複性高的優點。本發明為小麥遺傳改良產業化提供了一個有效途徑，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為質粒pAHC20的物理圖譜。
[0034]圖2為本發明轉化小麥幼胚過程中的材料生長情況。其中，圖A為擺放在高滲培養基上的小麥幼胚待後續轟擊；圖B為經愈傷組織誘導培養2周後的愈傷生長狀況；圖(:為愈傷組織經分化培養兩周後的生長狀況；圖D為經生根培養2周後的抗性植株；圖E為將生根培養4周後的抗性植株；圖F為溫室生長2個月後的轉基因植株，均能正常結實。
[0035]圖3為小麥轉基因植株的Southern雜交檢測結果。其中，泳道I一 10為不同的Ttl代小麥轉基因單株，N為未進行基因轉化的小麥植株陰性對照，P為質粒PAHC20陽性對照。
【具體實施方式】
[0036]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0037]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038]下述實施例中所用的小麥品種和質粒的信息如下:
[0039]小麥品種石4185:文獻:付大平，蔡欣.冬小麥新品種冀審石4185.作物雜誌，1998年05期.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0040]小麥品種眾麥I號:文獻:趙躍榮.小麥新品種眾麥I號栽培技術.河南農業，2010年13期.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0041]小麥品種晉麥45號:文獻:郭世臣.晉麥45號.農業科技信息，1993年02期.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0042]小麥品種洛旱7號:文獻:高海濤.抗旱節水小麥新品種-洛旱7號.農家科
技，2008年10期.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0043]小麥品種揚麥19:文獻:祝尊友.揚麥19高產高效栽培技術.農技服務，2009年第08期.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0044]小麥品種科農199:文獻:趙慧，張瑋，王靜，紀軍，王志國，李俊明.冬小麥新品種「科農199」高產穩產特徵分析.中國生態農業學報.2011年，第05期.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0045]質粒pAHC20:文獻:吳愛忠，唐克軒.轉基因培育抗除草劑水稻.遺傳學報.2000年，第11期，992-998頁.公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0046]下述實施例中所用的MS基本培養基的溶劑為水，溶質及其濃度如表1所示。
[0047]表1.MS基本培養基
【權利要求】
1.一種利用基因槍獲得轉基因小麥的方法，包括如下步驟: 1)取小麥幼胚用權利要求9或10中所述培養基A進行培養； 2)使用基因槍對經步驟I)所述培養的小麥幼胚進行轟擊，將目的DNA導入所述小麥幼胚細胞中； 3)將經步驟2)所述轟擊的小麥幼胚用權利要求9或10中所述培養基A進行培養； 4)將經步驟3)所述培養的小 麥幼胚用權利要求9或10中所述培養基B進行培養獲得愈傷組織； 5)將步驟4)獲得的愈傷組織用權利要求9或10中所述培養基C進行分化培養，最終獲得含目的DNA的轉基因小麥植株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟I)中所述培養的時間為3—5小時；和/或，步驟3)中所述培養的時間為14一 18小時。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於:步驟2)中所述轟擊的次數為一次；每次所述轟擊的轟擊距離為6cm,轟擊壓力為IlOOpsi,轟擊直徑為2cm。
4.根據權利要求1一3中任一所述的方法，其特徵在於:所述轟擊使用金粉對待轉化DNA進行分散；每次所述轟擊中所述金粉的使用量為200 μ g，所述待轉化DNA為I μ g ;所述金粉的粒徑為0.6μπι。
5.根據權利要求1一4中任一所述的方法，其特徵在於:所述分化培養後還包括生根培養的步驟，所述生根培養使用的培養基為權利要求9或10所述的培養基D。
6.根據權利要求1一5中任一所述的方法,其特徵在於:在所述分化培養時使用含篩選劑的所述培養基C ;和/或，在所述生根培養時使用含篩選劑的所述培養基D。
7.根據權利要求1一6中任一所述的方法,其特徵在於: 所述篩選劑為草銨膦，所述草銨膦在所述分化培養和生根培養中的濃度為5 — IOmg/L ； 和/或，步驟2)中所述轟擊時所述目的DNA連接於環形質粒上。
8.根據權利要求1一7中任一所述的方法，其特徵在於: 所述培養的溫度為22— 26°C ； 和/或，所述分化培養的光周期為每天24小時中16小時光照、8小時黑暗，光照強度為150 μ mol/m2/s ； 和/或，所述生根培養的光周期為每天24小時中16小時光照、8小時黑暗，光照強度為150 μ mol/m2/s ； 和/或，步驟I)中所述小麥幼胚為開花10-14天的小麥幼胚。
9.一種獲得轉基因小麥的成套培養基，包含如下分別獨立包裝的四種培養基中的四種、任意三種、任意兩種或任意一種:培養基A、培養基B、培養基C和培養基D ； 所述培養基A是由MS基本培養基、甘露醇、2，4-D、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基；所述甘露醇在所述培養基A中的濃度為80— 100g/L ;所述2，4-D在所述培養基A中的濃度為4.5—5.5mg/L ； 所述培養基B是由MS基本培養基、2，4-D、硫酸銅、水解酪蛋白、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基；所述2，4-D在所述培養基B中的濃度為2.0—3.0mg/L,所述硫酸銅在所述培養基B中的濃度為0.5—0.7mg/L,所述水解酪蛋白在所述培養基B中的濃度為0.4—0.6g/L ； 所述培養基C是由MS基本培養基、激動素、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基，或由MS基本培養基、激動素、蔗糖、凝固劑和篩選劑製成的固體培養基；所述激動素在所述培養基C中的濃度為0.2—0.3mg/L ； 所述培養基D是由1/2的MS基本培養基、乙磺酸、α -萘乙酸、蔗糖和凝固劑製成的固體培養基，或由1/2的MS基本培養基、乙磺酸、α-萘乙酸、鹿糖、凝固劑和篩選劑製成的固體培養基；所述乙磺酸在所述培養基D中的濃度為0.4—0.6g/L，所述α -萘乙酸在所述培養基D中的濃度為0.4—0.6mg/L。
10.根據權利要求9所述的成套培養基，其特徵在於:所述蔗糖在所述培養基A、B、C和D中的濃度為20— 40g/L ； 和/或，所述凝固劑為植物凝膠，所述植物凝膠在所述培養基A、B、C和D中的濃度為3g/L ； 和/或，所述培養基A、B、C和D的pH值為5.6—5.8。
【文檔編號】C12N15/82GK103898155SQ201210570736
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優先權日:2012年12月25日
【發明者】高彩霞, 張康, 劉金星 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所