攜帶人胸腺素β4基因的重組質粒的製作方法

2023-12-10 04:27:56 1

專利名稱：攜帶人胸腺素β4基因的重組質粒的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因治療領域，具體的說，就是以人胸腺素β4基因插入到一真核表達啟動子下，構建成的一種重組質粒。該質粒能進入橫紋肌細胞，且在細胞內利用細胞本身的蛋白合成系統，合成Tβ4，且分泌到胞外，從而加速傷口的癒合，以及阻止細胞的死亡。
二.
背景技術：
免疫系統是人體的防禦系統。參與免疫反應的主要細胞有T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞。而胸腺是T淋巴細胞發育、分化的免疫中樞器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴細胞發育分化所需的一系列必需物質，其中胸腺素β4(Tβ4)是現已結構和功能較為明確的一種主要的胸腺因子。正如用Tβ4(一種涉及正在發育的胚胎中細胞遷移和存活的蛋白)的活性所做的一項研究所表明的那樣，「胸腺素-貝塔4」增強組織培養物中胚胎及出生後心肌細胞的存活能力，在大鼠冠狀動脈結紮後腹膜內注射該蛋白，能成功刺激心臟修復和激活Akt「存活激酶」。這些結果說明，「胸腺素-貝塔4」對於急性冠狀動脈閉塞是一個可能的治療目標。德克薩斯州大學的研究人員發現一種在心臟發育過程中製造的蛋白質(胸腺素β-4)在心臟病發作後能夠幫助心臟器官的自我修復。這些在大鼠實驗中獲得的發現最終可能導致新的心臟病療法的出現並且可能改變醫護人員對心臟病的處理方式。
胸腺素β-4是一種胚胎在心臟發育過程中表達的蛋白，它能促進心臟細胞的遷移並影響這些細胞的生死存亡。新研究表明這種蛋白能夠在實驗誘導的心臟病發作後防止細胞的死亡並限制疤痕組織形成的程度。胸腺素β-4已經被用於臨床試驗，以促進皮膚創傷的痊癒。研究人員相信不久的將來這種蛋白將會進入心臟病治療的臨床試驗階段。
Tβ4是Goldstein等最早從小牛胸腺中提取的胸腺素組分5(TF5)中分離出來的一種多肽，含43個胺基酸，分子量4.963KD，無二硫鍵與糖基化。
目前，臨床上使用的Tβ4主要是來源於化學合成或基因重組得到的蛋白形式。由於Tβ4蛋白形式在體內的半衰期很短，這就使得臨床病人必須在一定時間段內多次使用Tβ4。所以只需一到兩次使用，就可在體內一段時間內表達Tβ4對受損組織起作用的基因治療類Tβ4藥物將會大大降低各項成本。但目前用於攜帶Tβ4作為基因治療的載體主要有腺病毒載體(AV)、腺相關病毒載體(AAV)，在這兩種載體中，AAV使用較多，主要是由於它們的病毒特性，使得轉染率很高，易於攜帶基因進入人體細胞，然而正是由於它們的病毒特性，使得基因治療的安全性成為倍受關注的問題。與AV與AAV相比，重組質粒由於其無生命形式，除非進入細胞，否則很快消失，使得基因治療的安全性大大提高。
三.

發明內容
本發明首先是提供一種利用裸質粒作為載體，運輸Tβ4基因到細胞內去合成、分泌Tβ4蛋白，並通過此蛋白對周圍組織中受損細胞起作用，阻止細胞死亡的重組裸質粒基因治療用Tβ4，尤其是針對冠心病、頑固性皮膚潰瘍等疾病。目前的研究已證明Tβ4是一種在人體組織受損時起重要作用的蛋白，它能刺激表面細胞與角質細胞的遷移，調節層粘連蛋白的表達，以及刺激血管的生成，甚至於阻止細胞的死亡，所以，人們已經開始把Tβ4用於臨床，比如美國的RegenRx公司就用Tβ4治療表皮受傷的病人，現在更發現Tβ4在心臟病上的效果也很好，但以上所述的臨床治療時都是使用的Tβ4的蛋白形式，這種方式是目前疾病治療的常用方式，但是它的缺點是Tβ4蛋白在體內的半衰期短，病人要在一段時間內多次用藥，這就大大增加了病人的治療成本，要解決這個問題，本發明想到了基因治療，基因治療中最簡單有效的方法，就是選擇病毒載體來攜帶Tβ4進入細胞並表達蛋白，但正是由於病毒載體的特性，使得此種方法的安全性成為了很大的問題，特別是怕載體進入生殖細胞、幹細胞等重要細胞。選用質粒載體目前大家都認為安全性比較高，但是它進入細胞很困難，人們常常得選用病毒外殼、基因槍、脂質體等外部條件協助質粒進入細胞。這就使得操作複雜，且目的蛋白的表達效果不理想，本發明構建出一種帶有Tβ4基因的質粒載體，該重組質粒載體是裸質粒載體，不含病毒外殼與脂質體，在使用時也不使用基因槍，僅把質粒注射到病灶部位的肌肉內即可產生Tβ4蛋白並對受損組織起作用。
本發明其次是提供一種重組質粒載體pNL-Tβ4，該質粒的第一個特徵是含有Tβ4全長胺基酸序列對應的核酸序列；第二個特徵是該質粒含有大腸桿菌內的自我複製區ColEI序列，人巨細胞病毒啟動子p(CMV)序列，卡那黴素抗性基因序列，牛生長激素基因的polyA信號轉錄終止序列；第三個特徵是該質粒具備上述兩個特徵後，大小沒有超過4kb，使得pNL-Tβ4能利用橫紋肌細胞的細胞表面的溝回結構進入肌細胞，再利用蛋白表達系統合成Tβ4，分泌到胞外對周圍組織的受損細胞起作用。
在實驗研究中，發現注射了pNL-Tβ4的心肌肉組織中一個月內持續分泌Tβ4，而Tβ4與其它兩種蛋白一起，通過激活Akt/蛋白激酶B來促進心肌細胞的遷移和存活。在研究了培養的細胞活性後，本發明將20隻成年大鼠的冠狀動脈結紮模擬心臟病發作，從而創造出大鼠模型。接著給10隻大鼠局部注射胸腺素Tβ4 250ug/只，給10隻大鼠局部注射鹽水200uL作為空白對照。注射pNL-Tβ4的大鼠一月後受損心臟中的細胞很少死亡，並在心臟病發後數周改善了心臟功能。而對照組大鼠受損心臟的細胞大量死亡。試驗結果表明質粒pNL-Tβ4進入肌細胞，並使肌細胞分泌出Tβ4，Tβ4能夠改變細胞的代謝並創造出更強大的心肌細胞，這些細胞能夠抵抗心臟病發後的低氧狀況。如果這種蛋白對人類同樣有效，那麼這種蛋白將會成為一種強有力的心臟病治療藥物。
四.


圖1是pNL-Tβ4的結構圖譜。
圖2是pNL-Tβ4的純化後的Agarose純度電泳圖譜。
圖3是對大鼠模型注射pNL-Tβ4後，對大鼠心臟壁厚度的影響結果。
圖4是對大鼠模型注射pNL-Tβ4後，對大鼠心臟壁纖維化程度的影響結果。
圖5是對小鼠模型注射pNL-Tβ4後，Tβ4蛋白在體內的表達情況。
五.
具體實施例方式
以下實例僅是為了對本發明的說明，而不會對本發明造成任何的限制。
一)、裸質粒pNL-Tβ4的構建首先通過全基因合成擴增出胸腺素β4的全基因序列GCT AGC ATG TCT GGT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GATAAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCCAAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG目的片段經NdeI、XhoI雙酶切後分別回收小片段，質粒pNL經XhoI和EcoR I雙酶切後回收大片段，18℃在T4連接酶體系中三段目的基因片斷進行連接，經篩選得到的重組質粒命名為pNL-Tβ4(具體結構見圖1)。然後用CaCl2法轉化大腸桿菌DH5a，塗布在含有50ug/ml卡那黴素的LB平板，挑選陽性菌落在LK中培養至OD600為1.5時離心收集菌體，用鹼裂解法提取質粒，經1％Agarose電泳鑑定，表達量大於1mg質粒/克菌體。經NdeI、XhoI雙酶切檢定，切出150bp片斷。所獲得的的工程菌命名為pNL-Tβ4/DH5a。
二)、裸質粒pNL-Tβ4的生產1.發酵1).搖瓶表達含胸腺素β4基因的pNL-Tβ4/DH5a，在含50μg/ml卡那黴素的LB培養基中搖瓶過夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接種含有50μg/ml卡那黴素的LB培養基中，37℃培養10小時，收集菌體經1％Agarose電泳分析，表達量約為1mg pNL-Tβ4/克菌。
2)發酵工藝a.培養基a)種子液培養基(LK)胰蛋白腖10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、卡那黴素50微克/毫升。
b)種養基(15升)磷酸氫二鈉315克、磷酸二氫鉀100克、氯化鈉10.05克、氯化銨50克、胰蛋白腖90克。
以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨滅菌後加入發酵罐。
硫酸鎂15克、葡萄糖450克、補料(500克/升)葡萄糖
b.發酵過程1.種子培養從已鑑定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200轉/分、8小時後將這50毫升種子液轉接到700毫升LC中，36度、200轉/分，過夜。
2.發酵過程將培養好的種子液(OD600＝3-4)加入罐中，調好各參數，36度、150轉、溶氧100％，開始發酵；7小時後開始以2.5速流加3小時，約加入1500毫升補料，收集菌體。
2.前處理與層析(1)前處理採用鹼裂解法破菌，離心並用0.45um的濾膜過濾後，準備上層析。
(2)凝膠過濾層析上一步的澄清破菌液上Sepharose 6 Fast Flow層析柱，平衡液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，2M(NH4)2SO4，pH7.0，260nm監測，收集前峰。
(3)親和層析採用Plasmidselect層析介質，平衡液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，2M(NH4)2SO4，pH7.0，上一步的樣品直接上樣，洗脫液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，2M(NH4)2SO4，1.4M NaCl，pH7.0，收集洗脫峰。
(4)離子交換層析採用Source30Q層析介質，平衡液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.4M NaCl，pH7.0，上一步的樣品用水稀釋5倍上樣，洗脫液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，1MNaCl，pH7.0，收集洗脫峰，即為pNL-Tβ4質粒的純品。
得到的pNL-Tβ4通過Agarose純度檢測和反相HPLC檢測，純度大於95％(見圖2)。
三)、裸質粒pNL-Tβ4對大鼠心臟缺血模型的治療效果評價1、病態動物模型的製作與試驗方法為了評價裸質粒pNL-Tβ4的藥物有效性，建立了急性心肌梗塞的病態動物模型——大鼠冠狀動脈左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全乾燥後鋪無菌手術巾，暴露手術部位，在完全無菌狀態下進行手術。切開大鼠前胸壁皮膚，切斷第3到第6肋骨，露出胸腔，將肺推向一側，打開心囊，露出心臟。從冠狀動脈左前降支起點到3mm處，用6-0聚丙烯(polypropylene)結紮絲與NELATON結紮血管，1小時後再灌注。確認無出血後，將切斷的肋骨與胸骨縫合，再縫合皮膚。手術後肌肉注射慶大黴素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2、利用超聲心動圖比較左心室前壁厚度建立大鼠心臟缺血模型後，注射陰性對照物(生理鹽水)，試驗物質(裸質粒PNL-Tβ4)。注藥後第14、28、56天利用心臟超聲心動圖(Live 3D Echo 7500)與探針(probe 15-16L)，測定各組左心室前壁厚度。
基礎值(第0天，給藥前)，生理鹽水組0.2352±0.0332，裸質粒pNL-Tβ4組0.2413±0.025，各組之間無顯著性差異。
給藥第14天生理鹽水組0.1265±0.0021，裸質粒pNL-Tβ4組0.1278±0.014，各組之間無顯著性差異。
給藥第28天，生理鹽水組0.1221±0.0125，裸質粒pNL-Tβ4組0.1295±0.009，各組之間無顯著性差異。
給藥56天，生理鹽水組0.1189±0.0135，裸質粒pNL-Tβ4組0.1574±0.008，裸質粒pNL-Tβ4組心臟左心室前壁厚度增加(p＜0.05)。
這些結果顯示，裸質粒pNL-Tβ4能有效恢復心肌梗塞引起的左心室壁厚度的減少(見圖3)。
3、利用組織學圖片比較在心室纖維化程度上述試驗動物第56天，取心臟，以乳頭狀肌肉為準，橫切心臟，做成切片。用1％福馬林浸泡24小時，製造石臘組織切片及玻片，進行Masson’trichrom染色。各組之間比較採用了Image-pro PLUS ver.4.1(Media Cybernetics)方法。
心肌纖維化部分佔全左心室心肌的比率為，生理鹽水組28.13±2.1％，pN L-Tβ4組22.91±2.3％(P＜0.05)；生理鹽水組、裸質粒pNL-Tβ4組之間有顯著性差異。這些結果表明心肌注射裸質粒pNL-Tβ4能有效減少心肌梗塞引起的心肌損傷和心肌纖維化(見圖4)。
4、Tβ4蛋白體內表達的測定4.1動物標本的制定4.1.1取4周齡雄性小鼠，飼養一周，淘汰一般狀況不好的小鼠。
4.1.2用乙醚麻醉小鼠，用胰島素注射器緩慢肌注(5-10/秒)藥物0.1ml，針頭深度為3-5mm，注射完等5秒鐘再撥針，撥針後壓5秒。
4.1.3分別於0，1，2，3，4，5，6，7，8天取肌肉組織(在兩側肌腱處切斷，取完整的一塊肌肉)檢測。(如圖5)4.2 Tβ4蛋白量的測定4.2.1取肌肉組織和臟器，稱體重，並記下體重4.2.2裝在1.5ml試管(conical tube)內，-80℃保存(液氮冰凍)4.2.3常溫下解凍，裝肌肉的試管內放入500μl細胞緩衝液，用勻漿器製成勻漿(手動)4.2.4 4℃放置16小時4.2.5 4℃5000rpm離心30分鐘，取上清液。
4.2.6測上清液的總蛋白4.2.7按HGF測定盒說明測定上清液有Tβ4蛋白量(ELISA方法)4.2.8將測定出來的Tβ4蛋白量換算成每100mg肌肉內的Tβ4蛋白量，換算方法如下100mg肌肉的Tβ4蛋白＝ELISA方法測得的蛋白量÷(100/肌肉體重mg×總蛋白量)ELISA方法測得的蛋白單位為pg/ml，應換算成ng/ml，1000pg＝1ng。
權利要求
1.一類通過質粒載體介導的基因治療載體組合物，特徵為該質粒能進入橫紋肌細胞，且在肌細胞內合成、分泌人胸腺素β4；合成的胸腺素β4胺基酸序列為Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。
2.能編碼出權利要求1所述的人胸腺素β4胺基酸序列的基因序列。
3.包含權利要求2所述基因的重組質粒。
4.權利要求3所述的重組質粒，尤其是pNL-Tβ4。
5.用權利要求4的載體轉化的微生物。
6.權利要求5的微生物，尤其是經權利要求4中質粒轉化的TOP10F』、DH5α。
7.以權利要求4所述的重組質粒為組合物成分，用於治療或預防肢體潰瘍、糜爛。
8.以權利要求4所述的重組質粒為組合物主要成分，用於治療或預防心臟疾病。
全文摘要
本發明涉及基因治療領域，具體的說，就是以人胸腺素β4基因插入到一真核表達啟動子下，構建成的一種重組質粒。該質粒能進入橫紋肌細胞，且在細胞內利用細胞本身的蛋白合成系統，合成Tβ4，且分泌到胞外，從而加速傷口的癒合，以及阻止細胞的死亡，可用於皮膚、心臟損傷的修復。
文檔編號A61P17/00GK1940075SQ20051010579
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月29日 優先權日2005年9月29日
發明者馬素永, 聶李亞, 許松山, 文美玉 申請人:北京諾思蘭德生物技術有限責任公司