基於特異性寡核苷酸和納米金的汞離子(Ⅱ)檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-12-10 05:28:56 1

專利名稱：基於特異性寡核苷酸和納米金的汞離子(Ⅱ)檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測技術領域，涉及利用汞離子特異性寡核苷酸探針和納米金構建一種快速比色檢測水中汞離子的納米生物傳感器方法及其試劑盒。
背景技術：
汞離子的檢測長期以來一直受到研究人員的高度關注。自工業革命起，汞被運用到生產生活中，環境裡的汞含量日益增長，汞汙染範圍也逐年擴大。據統計，汞在全球水體中的含量比數年前已增加了三倍左右，工業區附近汞的含量則更高。由於汞汙染具有高遷移性和持久性，可通過甲基化、生物富集以及食物鏈放大作用，會對環境以及人類健康造成極大的危害。傳統的汞離子檢測方法包括原子吸收光譜、質譜法等，往往需要大型儀器，成本昂貴，操作複雜耗時，且需要 熟練人員操作。近年來，國內外已發展了許多汞離子檢測方法，其中利用汞離子可使胸腺嘧啶(Thymine，T)之間形成特異的錯配結合(T-Hg2+-T)這一特性構建的一系列納米金方法尤為突出。納米金是指顆粒尺寸為納米數量級的金微小顆粒，通常在水溶液中以膠體的形態存在，故又稱膠體金。納米金的最大吸收波長與納米金的粒徑和彼此間距離相關，納米金粒徑從小到大的變化過程中，其顏色由紅色變為藍色；同樣地，納米金的聚集會使吸收峰產生明顯的紅移而變為藍色。此外，單鏈DNA能夠以很高的親和性自發吸附到未加修飾的帶負電荷的納米金顆粒上，而雙鏈DNA的吸附則較弱。因此，在一定濃度的鹽離子條件下，有單鏈DNA吸附的納米金在單鏈DNA的保護下較為穩定，在鹽溶液中保持良好的分散性而仍然呈紅色，而雙鏈DNA溶液中的納米金粒子會因為聚集而呈現由紅變紫的顏色變化。利用DNA-納米金這種距離-顏色效應的光學性質，研究者們發展了很多基於納米金的聚集、分散狀態變化的Hg2+檢測方法。2007年初，Mirkin課題組設計了兩段寡核苷酸探針，序列分別為 5，HS-C10-A10-T-A103』 和 5，HS-C10-T10-T-T103』。而當溶液中有 Hg2+存在時，T-T 錯配之間因Hg2+而形成特異的鍵合，使得兩探針之間的Tm值明顯升高，從而定量分析Hg2+。但該方法需要嚴格的溫度控制，不易於推廣使用。Xuejia Xue等人通過改良組裝到納米金表面的寡核苷酸探針，並引入了第三段序列linkerDNA，使linker DNA能與兩個探針序列同時雜交。該檢測方法在室溫下即可進行，但需要三條寡核苷酸探針，其中兩條仍需要經過巰基修飾，繁瑣耗時且價格昂貴。Lihua Wang等報導利用一條聚T寡核苷酸探針，通過Hg2+特異性穩定T-T錯配形成莖環結構，使與聚T寡核苷酸探針結合的納米金失去保護而在高鹽條件下聚集，並產生紅色-藍色的顏色變化，實現對Hg2+的快速便捷分析，但靈敏度有待提聞。

發明內容
本發明要解決的技術問題是針對現有的汞離子檢測方法存在的不足，提供一種利用優化的汞離子特異性寡核苷酸探針和納米金快速比色檢測水中汞離子的納米生物傳感器方法及其試劑盒。本發明的第一個目的是公開一種新型的納米生物傳感器，以及利用此傳感技術進行快速檢測汞離子的方法。這種新方法可包括以下步驟(I)將待檢測水溶液和汞離子寡核苷酸探針混合，室溫反應；(2)將納米金加入到上述溶液中，室溫反應；(3)最後加入NaNO3,觀察顏色變化，並進行可見光光譜檢測。本發明的第二個目的是提供一種基於納米生物傳感器的汞離子快速檢測試劑盒， 它含有(I)納米金,其粒徑約15nm,濃度約為2. 97nmol/L ；(2)兩種汞離子寡核苷酸探針,最適濃度都為10iimol/L ； (3) NaNO3 溶液，最適濃度為 0. 5mol/L ；(4)陽性對照溶液和陰性對照溶液；(5)說明書。試劑盒中的納米金、汞離子寡核苷酸探針和NaNO3溶液等可以是濃縮液。我們對已有汞離子寡核苷酸探針的進行了優化設計，去除非特異的環部分(4bp)， 截取兩端的莖部分(9bp)，經試驗成功獲得信噪比更高的汞離子特異性核苷酸探針。原因可能是單鏈DNA吸附於納米金的效率與序列的長度有關，即短序列比長序列吸附效率更高， 從而能使納米金在高鹽條件下更穩定，這與Huixiang Li等人報導一致。我們在此基礎上成功構建了一種可以快速比色檢測Hg2+的納米生物傳感器。該納米生物傳感器通過兩條截短MSO吸附的納米金顏色變化和A65tlA522的改變實現對Hg2+的初步檢測。相對於現有技術，本發明提供的條兩截短的汞離子特異性核苷酸探針(9bp)，寡核苷酸探針序列更短、無需標記；納米生物傳感器方法和試劑盒在不使用任何特殊儀器條件下就可以實現對Hg2+可視化便捷分析，操作簡便，檢測時間短，靈敏度較高，特異性強，對很多非特異性金屬離子的響應都非常小，特別適合野外現場大批量樣本檢測。


下面結合附圖對本發明做進一步說明。圖IMSO優化設計圖2NaN03濃度優化圖3A65Q/A522值隨時間變化曲線圖4Hg2+檢測靈敏度分析圖5Hg2+檢測特異性評價圖6汞離子納米生物傳感器的TEM圖(注a圖為陰性對照(X 100000) ；b圖為陽性對照(X 100000)。圖7比色檢測混合溶液圖8比色檢測河水模擬標本
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。以下是部分本發明實施例中所用的儀器和設備，其他未註明的實驗條件按照常規或以其製造廠商所建議的條件Varioskan Flash多功能讀數儀(美國Thermo Scientific 公司)；透射電子顯微鏡H-7500(日本日立株式會)；加熱磁力攪拌器DF-IOlS(鞏義予華儀器責任有限公司)；紫外-可見光光譜分光光度計U-3010 (日本日立株式會)；5417R小型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);PURELAB Classic超純水儀(英國ELGA Labffater 公司)。實施例IMSO優化設計本研究選用的MSO序列見表1，其中MSO1為Lihua Wang等人報導的汞離子特異性寡核苷酸探針(莖環結構)。為了能夠提高汞離子檢測的靈敏度，並降低DNA的合成成本，對MSO1進行優化設計，去除非特異的環部分(4bp)，截取兩端的莖部分(9bp)，分別標記為 MSO2 和 MSO3。表I汞離子特異性寡核苷酸
MSQ序列(5』-3，)長度(bp)來源
1TTCTTTCTTCCCCTTGnTGTT22Lihua Wang 等人鵬
2TTCTTTCTT 9 本發明 _3_TTGTTTGTT_9_本發明_分別取3. LMS0(10iimol/L MSO1^O u mol/L MSO2,20 u mo I/L MSO3 或者 MSO2 和 MSO3各10 ii mol/L混合液)，加入3. 5 u LHg2+(100 u mol/L)用超純水補齊至總體積20 u L， 室溫反應5分鐘，然後加入100 U L納米金，室溫反應5分鐘，最後加入13 u LNaNO30觀察顏色變化，並用Varioskan Flash多功能酶標儀記錄每孔的A65tl和A522 ,同時每組都以超純水做空白對照，計算不同MSO檢測Hg2+的S/N(signal-to-noise,信噪比)。結果如圖I =MSO1 檢測Hg2+的S/N為2. 06 + 0. 23 ;經過優化設計後的MSO2、MSO3和MS02+3檢測Hg2+的S/N都明顯比MSO1升高，其中以MS02+3效果最佳。實施例2NaN03濃度優化分別取13 ii L不同濃度(0. 25，0. 5，l，2mol/L)的NaNO3，用上述優化設計的MSO進行比色檢測，用Varioskan Flash多功能酶標儀記錄每孔的A65tl和A522 ,同時每組都以超純水做空白對照，計算不同NaNO3濃度下檢測Hg2+的S/N。圖2中我們可以看到NaNO3濃度從
0.25增加至IJ 0. 5mol/L,納米生物傳感器檢測Hg2+的S/N也隨之增加，達到6. 83 + 0. 08。但繼續增加NaNO3, S/N反而下降，可能是過高的鹽濃度會使空白對照也發生顏色變化，因此選擇0. 5mol/L的硝酸鈉為最佳濃度。實施例3比色檢測Hg2+ 我們將汞離子納米生物傳感器分別與Hg2+(ImmoVL)和超純水反應，繪製A65(l/A522 隨時間變化曲線。如圖3所示，加入NaNO3後短短5秒，汞離子納米生物傳感器就可以成功地區分Hg2+和超純水溶液。且隨著時間延長，Hg2+(lmmol/L)組的A65tlA522也隨之增大，在 15分鐘時達到平衡(A65tlA522 = I. 13);而超純水組仍僅有0. 16左右，可以認為幾乎沒有變化。為了進一步分析該納米生物傳感器檢測的靈敏度，本研究對一系列不同濃度的Hg2+進行檢測。肉眼目測20 y mol/L時納米金顏色開始變化，濃度越大，變化越明顯；經比色分析計算，最低可以檢測到10 U mol/L(如圖4，3倍空白標準差)，與Lihua Wang等人報導結果(50 ii mol/L)相比，靈敏度提高了 5倍。利用該納米生物傳感器對 500 U mol/L K+、Na+、Li+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+ 和IOOy mol/L Hg2+等進行重複檢測3次，都可以顯著地將較低濃度的Hg2+與較高濃度的其它離子區分開來，且A65tlA522均只有Hg2+的25%左右，見圖5。說明我們製備的納米生物傳感器與測試的其他金屬離子均不會發生交叉反應或非特異性反應。
透射電鏡掃描觀察，圖6a為陰性對照，是汞離子納米生物傳感器與Zn2+作用後所得的TEM圖，可見納米金分散性良好；圖6b為陽性對照，是汞離子納米生物傳感器與Hg2+作用後所得的TEM圖，可見納米金大量聚集。實施例4比色檢測模擬標本在Hg2+的檢測中，其它金屬離子的幹擾常常是影響檢測特異性和靈敏度的一個重要問題。因此在本研究中，我們又用汞離子納米生物傳感器檢測了混合溶液和加Hg2+河水等模擬實際標本。配製三組混合溶液1組為鹼土金屬Ca2+，Mg2+，Ba2+的混合溶液；11組為 Cu2+，Zn2+，Cd2+的混合溶液；111組為一價金屬離子K+，Na+，Li+的混合溶液，各離子濃度為 500 u mol/L。配置加Hg2+河水在河水中加入終濃度為100 u mol/L的Hg2+。如圖7所示， 混合溶液1、11和III組的顏色與未加任何離子的H2O組一致，都未變色，仍為紅色，相對應的可見吸收光譜圖也幾乎重疊在一起；而Hg2+(K)Oil mol/L)組顏色發生明顯改變，從紅色轉變為藍色，同時在650nm處的吸光度也明顯升高。另外,如圖8所示,溶液a(空白對照組)和溶液b (河水組)顏色一致,仍為紅色， 相對應的可見吸收光譜圖也幾乎重疊在一起；而溶液c (加Hg2+河水組)從紅色轉變為藍色，同時在650nm處的吸光度也明顯升高，計算相應的A65(l/A522為0. 68，與上述靈敏度分析試驗裡的100 u mol/L Hg2+計算所得的A65tlA522 (0. 67±0. 02) 一致。表明無論是濃度為Hg2+ 濃度50倍的其它金屬離子混合液還是實際的河水溶液，都不能使汞離子納米生物傳感器顏色產生變化，不會干擾其對Hg2+的檢測。由此可見，該納米生物傳感器具有較高的選擇性。
權利要求
1.一種利用寡核苷酸和納米金檢測汞離子的比色檢測法，其特徵在於該方法包括一下步驟(1)將寡核苷酸加入到待檢測水溶液，寡核苷酸與汞離子特異性結合所形成的穩定的 T-Hg2+-T配位化合物；(2)將納米金加入到上述溶液中進行反應；(3)最後加入NaNO3,納米金顆粒相互聚集，表面等離子吸收峰發生紅移，通過顏色的變化即可檢測溶液中的汞離子。
2.根據權利要求I所述的利用寡核苷酸和納米金檢測汞離子的比色檢測法，其特徵在於，步驟(I)所述的特異性汞離子寡核苷酸探針鹼基組成為5』 -TTGTTTGTT-3』和 5』 -TTCTTTCTT-3』，濃度都為10 y mol/L，室溫反應時間為5分鐘。
3.根據權利要求I所述的利用寡核苷酸和納米金檢測汞離子的比色檢測法，其特徵在於，步驟(2)所述納米金溶液配製方法將IOOmL的0. 01%的氯金酸水溶液加熱至劇烈沸騰後，劇烈攪拌下快速加入3. 5mL的I %檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱攪拌20min後，停止加熱，繼續攪拌30min後靜置,室溫自然冷卻，用.0. .22 y m濾膜過濾。
4.根據權利要求I所述的利用寡核苷酸和納米金檢測汞離子的比色檢測法，其特徵在於，步驟⑵所述納米金的粒徑約15nm，濃度約為2. 97nmol/L，室溫反應時間為5分鐘。
5.根據權利要求I所述的利用寡核苷酸和納米金檢測汞離子的比色檢測法，其特徵在於，步驟(3)所述NaNO3的濃度為0. 5mol/L。
6.根據權利要求I所述的利用寡核苷酸和納米金檢測汞離子的比色檢測法，其特徵在於，步驟(3)所述NaNO3加入後的最佳反應時間為15分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種基於汞離子特異性寡核苷酸探針和納米金的快速比色檢測水中汞離子的檢測方法和試劑盒，利用T-T鹼基對對Hg2+的特異性識別形成穩定的T-Hg2+-T配位化合物，以及納米金對單雙鏈DNA吸附能力的差異性測實現了Hg2+的特異性檢測。該納米生物傳感器在不使用任何特殊儀器條件下就可以實現對Hg2+可視化便捷分析，操作簡便，檢測時間短，靈敏度較高，特異性強，對很多非特異性金屬離子的響應都非常小，特別適合野外現場大批量樣本檢測，易於推廣使用。
文檔編號G01N21/31GK102621088SQ20121008527
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月19日 優先權日2012年3月19日
發明者呂建新, 姚小豔, 泮婷婷, 洪小蘭, 熊雋, 項序武 申請人:溫州醫學院