基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器及其製備方法
2023-12-10 05:14:01 1
基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及生物傳感器【技術領域】，特別涉及基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器。為了解決以上現有技術中檢測氨苄青黴素的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題。一種基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器，在電極上依次修飾有capture probe層、HAP和MB probe層。製備方法：對電極進行預處理；將capture probe層修飾到電極表面；將HAP和MB probe層修飾到電極表面。利用了核酸適配體的特異型識別，利用氨苄青黴素的適體作為識別物質實現了對目標物氨苄青黴素的高特異性檢測；利用聚合酶的聚合作用，實現了目標物的循環利用，起到了信號放大的作用。
【專利說明】基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物傳感器【技術領域】，特別涉及基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器，還涉及其製備方法。
【背景技術】
[0002]氨苄青黴素是一種廣譜半合成青黴素，抗菌譜與青黴素相似。現已被廣泛應用於醫藥和農業中來治療細菌感染。他可以有效的治療很多細菌，例如:流感嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌等。然而在畜牧業中濫用氨苄青黴素造成的食品和農產品中的藥物殘留以及由於這些殘留引發的疾病，如:過敏反應，呼吸困難和癲癇發作等。因此，確定食品及農產品中的氨苄青黴素的殘留量已經變得至關重要。目前包括美國食品和藥物管理局(FDA)，食品添加劑聯合委員會(JECFA)，日本健康與福利等機構都建立了確定食品中氨苄青黴素是否超標的檢測體系。
[0003]目前，主要用來檢測氨苄青黴素的方法包括微生物法和高效液相色譜法(HPLC)。但是這兩種方法都存在自身不可避免的缺點與限制。微生物分析法的特異性和靈敏度都比較低，而HPLC需要較為昂貴的樣品預處理。因此，目前急需建立一種快速，準確，靈敏且高特異性的檢測方法來檢測食品中氨苄青黴素的殘留。
【發明內容】
[0004]為了解決以上現有技術中檢測氨苄青黴素的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題，本發明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器。還涉及其製備方法
本發明還提供了基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器的製備方法。
[0005]本發明是通過以下步驟得到的:
本發明中一共用到了 3條DNA鏈，其序列分別是:
HAP: 5』 -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3>
MB probe: 5， -Methylene blue_GCGGGCGAAC_3，
capture probe: 5』 -GTTCGCCCGC-SH-3』
其中髮夾結構的序列HAP中，5』端畫橫線的部分為目標物氨苄青黴素的適配體，可以與目標物特異性的識別並緊密結合。由於該鏈兩端的鹼基是完全互補的，因此可以雜交形成穩定的髮夾形二級結構。
[0006]MB probe的5』端修飾有亞甲基藍，他可以一定的電位下發生氧化還原反應，我們就是通過檢測該氧化還原信號來達到定量的檢測目標物的目的。
[0007]capture probe的3』端修飾有巰基(_SH),可以與金電極形成穩定的Au-S鍵,從而將capture probe固定在電極表面。
[0008]本發明中用到了兩種酶:Phi 29 DNA聚合酶和Nt.AlwI內切酶。Phi 29 DNA聚合酶同時具有鏈延伸和置換功能，核酸內切酶可以在特異性位點實現對DNA雙鏈的特異性切割，其特異性的切割識別序列是:GGATCNNNNN，切割位點是最後兩個鹼基之間。
[0009]本發明中氨苄青黴素的檢測是在均相溶液中實現的，通過兩步循環的方式來實現信號的放大，從而實現氨苄青黴素的高靈敏檢測，並獲得較低的檢測下限。
[0010]均相中發生的反應主要有:髮夾結構的DNA中有目標物的適配體，在有目標物存在的情況下，該適配體序列能夠特異性的識別目標物並與之結合，發生構型轉變，從而將髮夾結構的DNA鏈打開。此時均相中的MB probe就可以與打開的髮夾結構的3』端發生互補配對，從而將MB probe與HAP固定到一起。此時在Phi 29 DNA聚合酶與dNTP的共同作用下，以髮夾DNA為模板、以MB probe為引物發生鏈延長,最後長成一條完全雜交互補的雙鏈，並釋放目標物。此時目標物成游離的狀態，並可進一步結合別的為打開的髮夾結構，從而實現第一次循環放大，即目標物誘導的循環放大。在第二步循環放大中，利用了第一步產生的雜交雙鏈，因為該鏈中含有核酸內切酶Nt.AlwI的識別切割位點，形成的雙鏈可以被特異性的識別並切割，切斷相鄰兩個鹼基之間的磷酸二酯鍵。由於本發明中使用的聚合酶Phi 29 DNA具有鏈置換功能。因此在聚合酶與dNTP的共同作用下，被核酸內切酶切割的鏈會以原有的鏈為模板，繼續生長成新的雜交雙鏈，從而替換下amplificat1n probe (酶切循環放大):5』-GTTCGCCCGC-3』單鏈。該酶切循環放大探針的序列與MB probe完全互補，因為可以形成雜交的雙鏈。而經過鏈置換生成的新的雙鏈中又包含了新的內切酶識別切割位點，從而繼續新一輪的循環放大，即第二步的循環放大。
[0011]在均相反應中，兩步放大的反應條件均為37°C，反應時間是2h。
[0012]一種基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器，在電極上依次修飾有capture probe 層、HAP 和 MB probe 層；
capture probe 層中 capture probe:為 5，-GTTCGCCCGC-SH-3，；
HAP和MB probe層中含有HAP、MB probe、聚合酶、核酸內切酶和dNTP，
HAP 為 5』 -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3>
MB probe 為 5， -Methylene blue-GCGGGCGAAC-3，。
[0013]所述的生物傳感器，capture probe層的厚度大約為10±2nm、HAP和MB probe層的厚度約為15±2nm。
[0014]所述的生物傳感器，HAP和MB probe層中HAP (摩爾)、MB probe (摩爾)、聚合酶(活性)、核酸內切酶(活性)和dNTP (活性)的摩爾與活性的比為1:1:250:250:250。
[0015]所述的生物傳感器的製備方法，包括以下步驟:
(1)對電極進行預處理；
(2)將captureprobe層修飾到電極表面；
(3)將HAP和MBprobe層修飾到電極表面。
[0016]所述的製備方法,優選將capture probe層修飾到電極表面的操作步驟如下:將10 μ M的capture probe 10 μ L滴加到經過預處理的電極表面,在25°C下孵育2h。
[0017]所述的製備方法，優選將HAP和MB probe層修飾到電極表面的操作步驟如下:
(1)將滅菌水，10X的buffer緩衝液、HAP和待測目標物加入離心管中，震蕩30s，放入37 °C的恆溫箱中孵育2h ；
(2)向離心管中加入MBprobe、聚合酶、核酸內切酶和dNTP，震蕩30s，放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
(3)將孵育好的混合溶液滴加到修飾好capture probe層的電極上，將電極繼續放在37 0C的恆溫箱中孵育2h，清洗。
[0018]所述的製備方法，優選對電極進行預處理操作為電極在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水衝洗。
[0019]所述的製備方法，優選所述電極為金電極。
[0020]該發明的檢測方式是電化學檢測，利用傳統的三電極體系。Ag/AgCl為參比電極，鉬絲為對電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過Au-S鍵將capture probe固定到電極表面。然後將反應後的均相溶液修飾到電極表面，然後在37°C孵育2h使均相中的MB probe與電極表面的capture probe完成雜交反應,從而將MB probe固定到電極表面。然後用三電極工作體系檢測MB的氧化還原峰。以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為O到-0.5 V，脈衝寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，採用差分脈衝伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測待測目標物。
[0021]本發明基於核酸適配體與目標物的特異性識別，具有鏈置換功能的DNA聚合酶的鏈延伸和置換作用，核酸內切酶在特異性位點對核酸鏈的切割作用以及亞甲基藍的氧化還原特性構建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優點，可以彌補氨苄青黴素現有檢測方法的缺陷與不足，實現對其快速，準確的定量檢測。
[0022]本發明的有益效果:
1、利用了核酸適配體的特異型識別，利用氨苄青黴素的適體作為識別物質實現了對目標物氨苄青黴素的高特異性檢測；
2、利用聚合酶的聚合作用，實現了目標物的循環利用，起到了信號放大的作用；
3、利用核限制性核酸內切酶對特異性序列的識別和切割作用，結合聚合酶的鏈置換作用，實現了第二步循環放大。信號的兩次循環放大實現了對目標物的高敏檢測，提高了檢測的靈敏度；
4、該傳感器的反應條件溫和，反應速度快；
5、由於使用金電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用；
6、檢測原理的主要過程均是在均相中實現的，提高的反應速度，降低了操作的複雜程度，實現了目標物的快速，簡單，靈敏的檢測；
7、製備方法簡單，性能穩定，電極的重複性好，適用於食品安全中氨苄青黴素的檢測和生物傳感器產業化的實際應用；
8、製作電極的工藝成本低，適用於產業化中價廉的要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為該實驗的原理圖；
圖2為實施例1 HAP濃度優化檢測結果圖；
圖3為實施例2 MB probe濃度優化檢測結果圖；
圖4為實施例3 capture probe濃度優化檢測結果圖；
圖5為實施例4檢測不同濃度目標物的DPV圖；
圖6為基於圖5做的該生物傳感器的工作曲線，該圖的橫坐標為目標物的濃度，縱坐標為檢測的電流值。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。
[0025]實施例1
電極修飾過程的主要步驟如下:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反覆衝洗；
b、將10μL的capture probe( 10 μ Μ)滴加到電極表面,在室溫下(25°C )孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發生的反應，均相反應中的主要步驟:
a、將滅菌水，1X的緩衝液(buffer)，Iμ L髮夾結構的DNA鏈(濃度分別為20 μ Μ，10 μ Μ, 5 μ Μ, 2 μ Μ, I μ Μ)和目標物加入到預先準備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然後將混勻的混合液放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
b、繼續向a步的離心管中加入MBprobe (10 μ M)，聚合酶(I μ L)，核酸內切酶(I μ L)和dNTP (I μ L)。震蕩30s，然後將混勻的混合液繼續放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應後的溶液(10μ L)滴加到預先修飾好capture probe的電極上。然後將電極繼續放在37 1:的恆溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0026]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為O到-0.5 V，脈衝寬度0.05V，掃描速率0.06 S，採用差分脈衝伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測目標物。
[0027]結果見圖2，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著HAP的濃度在0-10μΜ區間內增大而增大，當濃度超過10 μ M後，電流趨於穩定。所以HAP的最佳濃度為10 μ Mo
[0028]上述過程中用到的溶液的製備方法:
1、PBS 緩衝液是由方法配製=Na2HPO4 (1mM), NaH2PO4 (1mM), NaCl (140mM), KCl(ImM)，MgCl2 (ImM), CaCl2 (ImM),最終溶液的 pH 值為 7.4。
[0029]2、10X的緩衝液(buffer)是隨聚合酶一起買來的,可直接使用。
[0030]3、配置的PBS緩衝液與超純水均需進行高溫滅菌處理。具體方法是，將PBS和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然後用錫箔紙和報紙進行封口。在高壓滅菌鍋中在120°C的溫度下滅菌20 min。
[0031]實施例2
一種本發明所述電化學生物傳感器的製備方法:
電極修飾過程的主要步驟如下:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反覆衝洗；
b、將10μ L的capture probe (10 μ Μ)滴加到電極表面,在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發生的反應，均相反應中的主要步驟:
a、將滅菌水，1X的緩衝液(buffer)，髮夾結構的DNA鏈(10μ Μ)和目標物加入到預先準備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然後將混勻的混合液放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
b、繼續向a步的離心管中加入Iμ L不同濃度的MB probe (濃度分別是20 μ M, 10 μ Μ,5 μ Μ，2 μ Μ，I μ Μ)，聚合酶(I μ L)，核酸內切酶(I μ L^PdNTP (IyL)0震蕩30s，然後將混勻的混合液繼續放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應後的溶液(10μ L)滴加到預先修飾好capture probe的電極上。然後將電極繼續放在37 1:的恆溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0032]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為O到-0.5 V，脈衝寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，採用差分脈衝伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測目標物。
[0033]結果見圖3，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著MB probe的濃度在0-10 μ M區間內增大而增大，當濃度超過10 μ M後，電流趨於穩定。所以MB probe的最佳濃度為10 μ Μ。
[0034]實施例3
一種本發明所述電化學生物傳感器的製備方法:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反覆衝洗；
b、將10 μ L 的不同濃度的 capture probe (20 μ M，10 μ M，5 μ M，2 μ M，I μ Μ)滴力口至Ij電極表面，在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發生的反應，均相反應中的主要步驟:
a、將滅菌水，10X的緩衝液(buffer)，髮夾結構的DNA鏈(10μ Μ)和目標物加入到預先準備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然後將混勻的混合液放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
b、繼續向a步的離心管中加入MBprobe (10 μ M)，聚合酶(I μ L)，核酸內切酶(I μ L)和dNTP (I μ L)。震蕩30s，然後將混勻的混合液繼續放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應後的溶液(10μ L)滴加到預先修飾好capture probe的電極上。然後將電極繼續放在37 1:的恆溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0035]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為O到-0.5 V，脈衝寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，採用差分脈衝伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測目標物。
[0036]結果見圖4,從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著capture probe的濃度在0-10 μ M區間內增大而增大，當濃度超過10 μ M後，電流趨於穩定。所以capture probe的最佳濃度為10 μ M0
[0037]實施例4
一種本發明所述電化學生物傳感器的製備方法:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反覆衝洗；
b、將10μ L的capture probe (10 μ Μ)滴加到電極表面,在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發生的反應，均相反應中的主要步驟:
a、將滅菌水，1X的緩衝液(buffer)，髮夾結構的DNA鏈(10μ Μ)和I μ L不同濃度的目標物(ΙΟΟρΜ，500pM, InM, 5nM, 1nM, 50nM, 10nM, 500nM, I μ M)加入到預先準備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然後將混勻的混合液放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
b、繼續向a步的離心管中加入MBprobe (10 μ M)，聚合酶(I μ L)，核酸內切酶(I μ L)和dNTP (I μ L)。震蕩30s，然後將混勻的混合液繼續放入37°C的恆溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應後的溶液(10μ L)滴加到預先修飾好capture probe的電極上。然後將電極繼續放在37 1:的恆溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0038]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為O到-0.5 V，脈衝寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，採用差分脈衝伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測目標物。
[0039]檢測結果如圖5所示，a到i為待測目標位濃度分別為10pM (IX 10_16 mol，括號中為待測目標物的實際的量)，500pM(5Xl(T16 mol),lnM(lX10_15 mol), 5nM(5X 10_15 mol),1nM (I X 1(T14 mol), 50nM (5X 1(T14 mol), 10nM (I X 1(T13 mol), 500ηΜ (5X 1(Γ13 mol)，I μ M(1Χ10_12 mol)。圖中我們可以看到，在氨苄青黴素的濃度在10pM到I μΜ時，氨苄青黴素濃度的對數與電流大小成正比關係，擬合曲線:1=0.887+0.38IgC (I是電流，C是氨苄青黴素的濃度)，同時，我們在10pM的濃度基礎上繼續向更低的濃度檢測，經檢測當濃度低於10pM時，電流與濃度的關係恰好不再符合擬合曲線規律，即圖中的電流最低點因此可得到該方法的檢測下限為lX10_16mol。
[0040]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受實施例的限制，其它任何未背離本發明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種基於核酸適配體檢測氨苄青黴素的生物傳感器，其特徵在於在電極上依次修飾有 capture probe 層、HAP 和 MB probe 層；
capture probe 層中 capture probe:為 5，-GTTCGCCCGC-SH-3，； HAP和MB probe層中含有HAP、MB probe、聚合酶、核酸內切酶和dNTP，
HAP 為 5， -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3，
MB probe 為 5， -Methylene blue-GCGGGCGAAC-3，。
2.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特徵在於captureprobe層的厚度為10±2nm、HAP 和 MB probe 層的厚度為 15±2nm。
3.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特徵在於HAP和MBprobe層中HAP、MBprobe、聚合酶、核酸內切酶和dNTP的摩爾活性比為I:1:250:250:250。
4.一種權利要求1-3中任一項所述的生物傳感器的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)對電極進行預處理； (2)將captureprobe層修飾到電極表面； (3)將HAP和MBprobe層修飾到電極表面。
5.根據權利要求4所述的製備方法,其特徵在於將captureprobe層修飾到電極表面的操作步驟如下:將10 μ M的capture probe 10 μ L滴加到經過預處理的電極表面,在25°C下孵育2h。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於將HAP和MBprobe層修飾到電極表面的操作步驟如下: (1)將滅菌水，1X的buffer緩衝液、HAP和待測目標物加入離心管中，震蕩30s，放入37 °C的恆溫箱中孵育2h ； (2)向離心管中加入10μΜ的MBprobe、l μ L的聚合酶、I μ L的核酸內切酶和IyL的dNTP，震蕩30s，放入37°C的恆溫箱中孵育2h ； (3)將孵育好的混合溶液滴加到修飾好captureprobe層的電極上，將電極繼續放在37 0C的恆溫箱中孵育2h，清洗。
7.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述電極為金電極。
8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為O到-0.5 V，脈衝寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，採用差分脈衝伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測待測目標物。
【文檔編號】G01N33/573GK104459130SQ201410504740
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】黃加棟, 王虹智, 王玉, 劉素, 崔敏, 李 傑, 徐偉, 郭玉娜, 許穎, 崔傑, 邱婷婷 申請人:濟南大學