一種確定樣品中汞離子濃度的方法
2023-12-10 05:23:26 2
一種確定樣品中汞離子濃度的方法
【專利摘要】本發明提出了一種確定樣品中汞離子濃度的方法，其包括：（1）將生物素化核酸分子固定化至PCR反應容器的內表面；（2）將待測樣品與探針核酸分子在所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反應容器中，其中，在汞離子的作用下，所述探針核酸分子能夠與所述生物素化核酸分子特異性結合；（3）利用檸檬酸緩衝液對所述PCR反應容器進行清洗，以便除去未結合汞離子的核酸分子；（4）向所述PCR反應容器中添加擴增引物，以便對與汞離子特異性結合的核酸分子進行實時螢光定量PCR；以及（5）基於所述實時螢光定量PCR的Ct值，確定所述樣品中的汞離子濃度。該方法可以提出了一種全新的、簡單快速的、高選擇性、高靈敏性的生物傳感器，用以檢測樣品中汞離子的濃度。
【專利說明】一種確定樣品中汞離子濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及化學領域，更具體地，涉及一種確定樣品中汞離子濃度的方法。
【背景技術】
[0002]汞離子是一種主要的環境汙染物。它對人的身體健康危害特別大，特別是兒童，微量的汞離子就能給人的大腦、神經系統，腎臟等帶來很大的危害。為了滿足社會對實際樣品檢測的日益增加的需求，發展一種對汞離子簡單快速、低成本、高選擇性、高靈敏性的檢測新方法是十分必需的。
[0003]現代對汞離子的檢測技術主要有:原子吸收光譜法、冷蒸汽原子螢光光譜法、電感耦合等離子質譜法以及電化學方法(電勢、電流、電導)等。這些方法不僅需要大型的儀器設備，還需要比較繁雜的預處理過程，成本比較高，還需要專業人員操作，難以實現對汞離子的實時實地的檢測，難以實現現代社會對汞離子檢測日益增加的需求。
[0004]因而，目前的汞離子檢測方法仍有待改進。
【發明內容】
[0005]本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。
[0006]根據本發明的實施例，本發明提出了一種確定樣品中汞離子濃度的方法。根據本發明的實施例，該方法包括:(I)將生物素化核酸分子固定化至PCR反應容器的內表面，以便獲得表面固定有生物素化核酸分子的PCR反應容器；(2)將待測樣品與探針核酸分子在所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反應容器中，其中，在汞離子的作用下，所述探針核酸分子能夠與所述生物素化核酸分子特異性結合，以便獲得汞離子-核酸分子複合物；
(3)利用檸檬酸緩衝液對所述PCR反應容器進行清洗，以便除去未結合汞離子的核酸分子；
(4)向所述PCR反應容器中添加擴增引物，以便對與汞離子特異性結合的核酸分子進行實時螢光定量PCR ;以及(5)基於所述實時螢光定量PCR的Ct值，確定所述樣品中的汞離子濃度。
[0007]本發明是基於發明人利用金屬汞離子能夠與核酸中的兩個胸腺嘧啶鹼基(T)形成非常穩定的T-Hg2+-T配合物結構的特性，然後基於實時螢光定量PCR技術，開發了一種操作簡單、高選擇性、高靈敏性的生物傳感器，用以檢測水中汞離子的含量，極大地提高了汞離子的檢測限。實時螢光定量PCR技術是最近十幾年才發展起來的一種生物技術，該技術不僅實現了 PCR從定性到定量的飛躍，並且與常規PCR相比較，它具有更強的特異性，自動化程度非常高，還有效地解決了 PCR的汙染問題。所謂的實時螢光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後再通過標準曲線來對未知模板進行定量分析的方法。目前該技術已經在生物化學、生物技術等領域得到了廣泛的應用。根據本發明的實施例，可以利用本發明的方法進行檢測的樣品的類型並不受特別限制。根據本發明的具體實施例，可以為水溶液，例如飲用水、地下水、汙水等。由此，本發明的實施例提出了一種基於PCR技術的汞離子檢測新方法，可實現水中汞離子的簡單、快速、高靈敏檢測。
[0008]根據本發明的實施例，上述方法還可以具有下列附加技術特徵:
在本發明的一個實施例中，所述生物素化核酸分子具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，並且所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的3』末端被生物素修飾。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0009]在本發明的一個實施例中，所述探針核酸分子具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0010]在本發明的一個實施例中，在步驟(I)中，將生物素化核酸分子固定化與PCR反應容器的內表面進一步包括:用戊二醛溶液對所述PCR反應容器進行處理；用鏈黴親和素對所述PCR容器進行處理；向所述PCR反應容器中加入所述生物素化核酸分子，以便在所述PCR反應容器的內表面固定所述生物素化核酸分子。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0011 ] 在本發明的一個實施例中，在步驟(I)中，將生物素化核酸分子固定化與PCR反應容器的內表面進一步包括:用20微升0.8重量％的戊二醛溶液在37攝氏度下對所述PCR反應容器進行處理5小時，並利用超純水對所述PCR反應容器進行清洗；用20微升溶解鏈黴親和素的0.0lM碳酸緩衝液在37攝氏度下對所述PCR反應容器處理2小時，其中鏈黴親和素在所述PCR容器中的終濃度為12.5 ng/mL,並用PBST溶液進行清洗，其中，所述PBST溶液含有IOmM PBS, pH 7.2,0.05重量％ Tween-20 ;向所述PCR反應容器中加入20微升濃度為50nM的所述生物素化核酸分子，在37攝氏度下反應40分鐘，並且利用檸檬酸鈉緩衝液進行清洗，其中所述檸檬酸鈉緩衝液含有750mM NaCl, 75mM C6H5Na307。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0012]在本發明的一個實施例中，所述待測樣品中汞離子濃度不低於0.03ng/mL。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0013]在本發明的一個實施例中，所述待測樣品中汞離子濃度為0.05ng/mL?10 ng/mL。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0014]在本發明的一個實施例中，所述引物組由下列引物構成:
上遊引物:5，-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3，(SEQ ID NO:3)
下遊引物:5』-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3』 (SEQ ID NO:4)。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0015]在本發明的一個實施例中，所述探針核酸分子的濃度為200nM，並且所述探針核酸分子與所述待測樣品等體積混合。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0016]在本發明的一個實施例中，基於下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度:y=-l.1758x+6.6826，y為所述實時螢光定量PCR的Ct值，x為相應的汞離子濃度。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0017]根據本發明的實施例，基於所述實時螢光定量PCR的Ct值，確定所述樣品中的汞離子濃度是通過將所述實時螢光定量PCR的Ct值與標準曲線進行比較而完成的，其中，所述標準曲線是基於已知萊離子濃度分別為O ng/mL、0.05ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL>Ing/mL>5 ng/mL、10ng/mL。的標準樣品進行平行實驗而建立的。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0018]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
圖1顯示了根據本發明一個實施例，利用不同汞離子濃度標準樣品進行實時螢光定量PCR所得到的擴增曲線,其中萊離子濃度分別取O ng/mL、0.05ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、l ng/mL>5 ng/mL、10ng/mL。
[0020]圖2顯示了根據本發明一個實施例的汞離子標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0021]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發明。
[0022]實施例1
(1)設計與合成相應的寡核苷酸片段；
設計一段能夠對汞離子特異性識別且富含T鹼基的DNA片段，並在其3』段進行生物素化修飾。設計出探針DNA，並且根據該探針DNA核酸序列設計實時螢光定量PCR用的上下遊引物。DNA序列通過DNA合成儀製備。
[0023]生物素修飾DNA:5』 -TTCTTTCTTCTGGCGTAAAGGGAGCATCGG-生物素 _3，(SEQ ID NO:
1)
探針 DNA:5』 -GTTGTTTGTTAATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTAC-3』 (SEQ ID NO:2)
上遊引物:5，-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3，(SEQ ID NO:3)
下遊引物:5』 -GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3』 (SEQ ID NO:4)
(2)生物素修飾DNA的固定；
首先PCR管加入20微升，0.8%的戊二醛溶液在37° C處理5小時，然後用超純水清洗三次，其次用20微升溶解鏈黴親和素的0.01M碳酸緩衝液在37° C再次處理2小時，其中鏈黴親和素 12.5 ng/mL。處理完後緊接著用 PBST (IOmM PBS,pH 7.2,0.05% Tween-20)清洗。取生物素修飾DNA 20微升分別加入到PCR管中，其中生物素修飾DNA的濃度為50nM，並在37° C反應40分鐘。最後用檸檬酸鈉緩衝液(750mM NaCl, 75mM C6H5Na3O7)清洗3次。來去除沒有固定的DNA。
[0024](3) T-Hg2+-T雜交反應及標準曲線的建立；
T-Hg2+-T雜交反應:分別取200 nM的探針DNA各10微升加入到上述PCR管中，然後再依次加入萊離子10微升，使其最終濃度為O ng/mL、0.05ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、
1ng/mL、5 ng/mL、lOng/mL,並在37° C進行T-Hg2+-T雜交反應40分鐘,最後用檸檬酸鈉緩衝液清洗3次，來清洗去除沒有反應的DNA。最後依次向PCR管中加入PCR混合液10微升、上下遊引物各2微升、水6微升，做實時螢光定量PCR，圖1顯示了利用不同汞離子濃度標準樣品進行實時螢光定量PCR所得到的擴增曲線。
[0025]汞離子標準曲線的建立:利用實時螢光定量PCR儀測定不同汞離子濃度下擴增曲線的循環數，根據測定的不同汞離子濃度下擴增曲線的循環數，繪製汞離子濃度的標準曲線。圖2顯示了在本實施例中得到的汞離子標準曲線圖。發明人發現該標準曲線圖的線性範圍0.05-10ng/mL，檢測限為0.03ng/mL。標準曲線的線性方程為y=-l.1758x+6.6826，y為不同汞離子濃度下擴增曲線的循環數，X為相應汞離子的濃度，線性相關性>0.99。
[0026](4)汞離子的特異性測定；
取6個PCR管，重複步驟(2)後，加入200 nM的探針DNAlO微升，依次加10ng/mL Hg2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Fe2+各5微升。在37° C反應40分鐘，最後用檸檬酸鈉緩衝液清洗3次，來清洗去除沒有反應的DNA。最後向PCR管中加入PCR混合液10微升、上下遊引物各2微升、水6微升，做實時螢光定量PCR。由實驗結果得知這種基於PCR技術的汞離子檢測新技術具有很高的特異性。
[0027](5)實際添加樣品的測定；
向自來水樣品中分別添加0.1 ng/mL、0.5ng/mL、l ng/mL及5 ng/mL的萊離子,採用前面的方法確定自來水樣品中的汞離子濃度，結果如下:
表1自來水樣品添加汞離子的測定
【權利要求】
1.一種確定樣品中汞離子濃度的方法，其特徵在於，包括: (1)將生物素化核酸分子固定化至PCR反應容器的內表面，以便獲得表面固定有生物素化核酸分子的PCR反應容器； (2)將待測樣品與探針核酸分子在所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反應容器中，其中，在汞離子的作用下，所述探針核酸分子能夠與所述生物素化核酸分子特異性結合，以便獲得汞離子-核酸分子複合物； (3)利用檸檬酸緩衝液對所述PCR反應容器進行清洗，以便除去未結合汞離子的核酸分子; (4)向所述PCR反應容器中添 加擴增引物，以便對與汞離子特異性結合的核酸分子進行實時螢光定量PCR;以及 (5)基於所述實時螢光定量PCR的Ct值，確定所述樣品中的汞離子濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物素化核酸分子具有SEQID NO:I所示的核苷酸序列，並且所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的3』末端被生物素修飾。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述探針核酸分子具有SEQID N0:2所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟(1)中，將生物素化核酸分子固定化與PCR反應容器的內表面進一步包括: 用戊二醛溶液對所述PCR反應容器進行處理； 用鏈黴親和素對所述PCR容器進行處理； 向所述PCR反應容器中加入所述生物素化核酸分子，以便在所述PCR反應容器的內表面固定所述生物素化核酸分子。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，在步驟(1)中，將生物素化核酸分子固定化與PCR反應容器的內表面進一步包括: 用20微升0.8重量％的戊二醛溶液在37攝氏度下對所述PCR反應容器進行處理5小時，並利用超純水對所述PCR反應容器進行清洗； 用20微升溶解鏈黴親和素的0.01M碳酸緩衝液在37攝氏度下對所述PCR反應容器處理2小時，其中鏈黴親和素在所述PCR容器中的終濃度為12.5 ng/mL,並用PBST溶液進行清洗，其中，所述PBST溶液含有IOmM PBS，pH 7.2，0.05重量％ Tween-20 ； 向所述PCR反應容器中加入20微升濃度為50nM的所述生物素化核酸分子，在37攝氏度下反應40分鐘，並且利用檸檬酸鈉緩衝液進行清洗，其中所述檸檬酸鈉緩衝液含有750mM NaCl, 75mM C6H5Na3O70
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述待測樣品中汞離子濃度不低於0.03ng/mL。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述待測樣品中汞離子濃度為0.05ng/mT,~10 ng/mLο
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述引物組由下列引物構成: 上遊引物:5』-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3』 (SEQ ID NO:3) 下遊引物:5』-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3』 (SEQ ID NO:4)。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述探針核酸分子的濃度為200nM，並且所述探針核酸分子與所述待測樣品等體積混合。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，基於下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度:
y=-l.1758x+6.6826， I為所述 實時螢光定量PCR的Ct值，X為相應的汞離子濃度。
【文檔編號】G01N21/64GK103558202SQ201310588011
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】朱穎越, 王立梅, 朱益波, 鄧大慶, 齊斌 申請人:常熟理工學院