人血管內皮生長因子抗原表位及其表位疫苗的製作方法

2023-12-10 07:24:12

專利名稱：人血管內皮生長因子抗原表位及其表位疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及了一種人血管內皮生長因子的抗原表位，以及利用該抗原表位設計的人血管內皮生長因子表位疫苗，該表位疫苗可用於肝癌等實體瘤的治療。
背景技術：
血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)及其受體所介導的腫瘤新生血管生成在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用。抗腫瘤新生血管生成是目前抗腫瘤藥物研發的重要方向之一。迄今最成功的抗腫瘤血管生成藥物是羅氏公司生產的Avastin。Avastin是一種抗體藥物,其所識別的抗原分子就是人VEGF。目前，Avastin已被美國FDA批准用於治療晚期大腸癌、復發性神經膠質瘤和腎腫瘤等。
Avastin是通過哺乳動物細胞生產的，其生產成本高，作為一種抗體藥物，其臨床用量又較大，所以，用Avastin治療腫瘤的成本很高，一般人難以承受，因此，尋找、設計以人VEGF為靶標的價格低廉的新型抗腫瘤藥物具有現實意義。Avastin是一種人源化抗體,其人源程度約為95%,用Avastin抑制腫瘤生長是一種被動免疫治療方法。如果能夠設計一種人VEGF疫苗，誘導機體自身產生針對人VEGF的中和性抗體，則可以實現對腫瘤的主動免疫治療。但是，人VEGF由於是人體自身的分子，人體對其具有免疫耐受性，不能有效誘導人體產生抗體，因此，不能直接將人VEGF作為疫苗在人體內使用。合成肽疫苗(synthetical peptide vaccine)是用化學合成法人工合成的類似於抗原表位的小肽(約20 40個胺基酸)。合成肽疫苗一般由多個B細胞表位和T細胞表位共同組成。目前，合成肽疫苗的效果一般不理想，主要原因包括，難以準確模擬抗原分子中相應部位的三維結構，T、B細胞表位不能有效發揮協同作用，以及合成肽疫苗分子小、免疫原性差等。因此，分析人VEGF的抗原表位，設計、合成人VEGF多肽疫苗很難達到理想的免疫效果。若可以設計一種新型人VEGF重組表位疫苗，打破機體的免疫耐受性，讓機體能夠有效產生針對人VEGF的中和性抗體，就可以實現對腫瘤的主動免疫治療。給人體免疫人VEGF表位疫苗在體內誘導產生的具有中和活性的抗體將是完全人源抗體，與腫瘤患者自身具有完全的生物相容性。而重組表位疫苗一般可以通過大腸桿菌等原核表達系統進行生產，其製造成本較低，而且其臨床用藥次數少，用量低，所以，用重組的表位疫苗進行的主動免疫治療成本也較低。1989年，Ward等(Nature 1989，341 :544-546)首次製備了僅由抗體重鏈可變區(VH)結構域組成的基因工程抗體,並命名為單域抗體。1993年，Hamers-Casterman等(Nature 1993，363 :446-448)報導了在駱駝血清中大量存在一種天然缺失輕鏈的抗體，即重鏈抗體。重鏈抗體在駱駝的體液免疫中發揮著重要的作用。與一般抗體相比，重鏈抗體除了缺少輕鏈之外，重鏈抗體的重鏈可變區(variable domain of heavy chain of heavyantibody, VHH)還具有不同於一般抗體VH區的特徵，駱駝的VHH基因通過在幾個重要功能位點的選擇性進化維持了重鏈抗體的正常功能，也就是說重鏈抗體的重鏈可變區(VHH)能夠單獨摺疊形成穩定且完整的抗原結合位點。基於駱駝等動物重鏈抗體的重鏈可變區構建的單域抗體具有較好的結構穩定性，而將人源或鼠源抗體的重鏈可變區進行駱駝化改造後，也可以構建結構較穩定的單域抗體。單域抗體分子雖小，但結構相對穩定，特別是構建自駱駝、鯊魚等重鏈抗體的單域抗體。在單域抗體的三個抗原互補決定區(complementarity-determining region, Q)R)中，抗原互補決定區3(CDR3區)在與抗原的結合中發揮主要作用，CDR3的長度變化範圍較大，能夠形成豐富的構象以參與結合抗原，換一種角度看，也就是說CDR3區能夠展示不同長度的肽段，形成各種不同的構象，因此，單域抗體的CDR3應該是一種理想的抗原表位展示部位。基於以上思路，本發明首先預測了人VEGF的抗原表位，然後，利用單域抗體骨架的CDR3區展示該抗原表位，從而構建了一種人VEGF表位疫苗，該疫苗能夠誘導機體產生針對人VEGF的抗體，在體內能夠抑制腫瘤的生長。

發明內容
本發明的目的在於提供一種具有潛在醫學或藥學價值的新型人VEGF表位疫苗，從而實現對腫瘤的主動免疫治療，解決目前臨床上使用的抗人VEGF抗體藥物對腫瘤治療存在的抗體異源性、治療成本高等不足。為實現上述目的，本發明實施了以下技術方案。本發明提供了一種人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO : I所示的胺基酸序列。本發明還提供了一種人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列。本發明還提供了一種人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO :3所示的胺基酸序列。本發明還提供了一種人VEGF的抗原表位，其胺基酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發明還提供了一種包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白利用單域抗體為分子骨架，並將SEQ ID NO :1-3任一所述的人VEGF的抗原表位序列展示於所述單域抗體的CDR3 區。進一步，本發明還提供一種包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白利用單域抗體為分子骨架，並用SEQ ID NO :1-3任一所述的人VEGF的抗原表位序列替換所述單域抗體的CDR3區。所述的蛋白中所述單域抗體的FR2區的第9、10和12位的胺基酸分別被替換為穀氨酸、精氨酸和甘氨酸。本發明還提供一種包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述單域抗體構建自人抗體、駱駝重鏈抗體或鼠抗體。本發明還提供一種包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白的胺基酸序列包含SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 10 所示的序列。本發明還提供了製備上述蛋白的方法，當單域抗體來源於重鏈抗體的重鏈可變區時，所述製備表位疫苗的基本步驟包括(I)確定一種重鏈抗體的重鏈可變區的完整的胺基酸序列，以此序列作為單域抗體的胺基酸序列，並分析出其CDR3區的序列；(2)用SEQ ID NO :1_3任一人血管內皮生長因子的抗原表位序列替換所述單域抗體的CDR3區胺基酸序列，並將替換後的全長胺基酸序列轉換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，並將該全長基因序列克隆到表達載體中，得到重組質粒；(3)將得到的重組質粒轉化至相應的宿主細胞內，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白即為人VEGF表位疫苗蛋白；當所述單域抗體來源於含輕鏈抗體和重鏈抗體的常規抗體的重鏈可變區時，所述製備表位疫苗的基本步驟包括(I,)確定含輕鏈和重鏈的常規抗體的重鏈可變區的完整胺基酸序列，此序列即為單域抗體的基礎胺基酸序列，分析出其框架區2 (FR2)和CDR3區的序列，並將FR2區的第
9、10和12位的胺基酸分別替換為穀氨酸、精氨酸和甘氨酸；·(2)用SEQ ID NO :1_3任一人血管內皮生長因子的抗原表位序列替換所述單域抗體的CDR3區胺基酸序列，並將替換後的全長胺基酸序列轉換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，並將該全長基因序列克隆到表達載體中，得到重組質粒；(3)將得到的重組質粒轉化至相應的宿主細胞內，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白即為人VEGF表位疫苗蛋白；本發明還提供了一種人VEGF表位疫苗，所述表位疫苗包含上述的蛋白。本發明還提供了上述蛋白在製備用於治療或預防實體瘤的藥物中的用途。尤其是作為疫苗藥物的用途。本發明還提供了上述的人VEGF表位疫苗在實體瘤治療領域的應用。本發明的人VEGF表位疫苗表現出了較好的免疫原性，較好地抑制了肝癌腫瘤的生長，可發展成為一種治療肝癌等實體瘤的一種主動免疫治療藥物。本發明提供的上述人VEGF表位疫苗克服了合成多肽疫苗免疫原性差的缺點，表現出了較好的免疫原性，避免了目前抗人VEGF抗體類腫瘤治療藥物的異源性和治療成本高的不足。本發明的人VEGF表位疫苗在腫瘤患者體內誘導產生的抗體是完全人源抗體，與患者本身具有100%生物相容性，並且本發明的人VEGF表位疫苗是可以在大腸桿菌中實現高表達的，生產成本較低，其臨床使用量也低，所以，臨床治療成本將較低，這將會克服現有的在CHO等真核細胞中表達的抗體藥物生產成本很高、使用量大導致的臨床治療成本居高不下的問題。


為了使本發明的內容更容易被清楚地理解，下面根據本發明的具體實施例並結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中圖I 一種小鼠抗體重鏈可變區胺基酸序列；* :雙劃線部分為FR2區，斜體部分為⑶R3區；圖2用源於小鼠抗體重鏈可變區的單域抗體骨架展示「PHQGQ」抗原表位；* :單下劃線部分為FR2區，斜體部分為改造後的胺基酸殘基；雙下劃線部分為替換後的包含「PHQGQ」表位的序列；圖3展示「PHQGQ」抗原表位的小鼠單域抗體骨架重組蛋白編碼基因；* :單下劃線部分為酶切位點；
圖4展示「PHQGQ」表位的小鼠單域抗體骨架重組蛋白對小鼠的免疫效果；圖5用駱駝單域抗體骨架展示「PHQGQHI 」抗原表位；* :雙劃線部分為展示的抗原表位序列及兩側的附加序列；圖6展示「PHQGQHI 」抗原表位的駱駝單域抗體骨架的編碼基因；* :下劃線部分分別為BamHI和Xho I酶切位點；圖7用駱駝單域抗體骨架展示的「PHQGQHI」抗原表位在小鼠體內誘導產生抗人VEGF抗體；圖8駱駝化改造的人單域抗體的胺基酸序列；* :雙劃線部分為框架區2 (FR2)；加框部分為駱駝化改造後的胺基酸；單下劃線部分為⑶R3區； 圖9人VEGF表位疫苗胺基酸序列；* :雙劃線部分為人VEGF抗原表位的胺基酸序列；圖10人VEGF表位疫苗編碼基因序列；* :雙下劃線部分分別為BamHI和Xho I酶切位點；圖IIELISA法檢測人VEGF表位疫苗的免疫效果；圖12人VEGF表位疫苗免疫血清的中和活性分析；圖13人VEGF表位疫苗免疫組和對照組腫瘤重量比較。
具體實施例方式實施例I人VEGF抗原表位的分析、驗證蛋白質的抗原表位分析方法一般有合成肽驗證法、計算機輔助的程序預測法和基於蛋白質三維結構的分析法，但任何一種方法都存在局限性，其中基於蛋白質三維結構的抗原表位預測準確度最高。目前，一般是聯合運用兩種或兩種以上的分析方法來預測蛋白質的抗原表位，並且最終確定一個抗原表位是否是真正的抗原表位還必須通過實驗進行驗證。本發明採用計算機輔助的程序預測法和基於蛋白質三維結構的分析法預測最可能的人VEGF抗原表位，然後，通過實驗驗證該表位是否是真正的抗原表位。首先，用BepiPred(http://www. cbs. dtu. dk/services/BepiPred/)抗原表位預測程序初步分析人VEGF可能的抗原表位，預測候選抗原表位如下表I人VEGF表位預測
1 1起始位置終止位置表位肽段肽段長度~
~ ΠAPMAEGGGQNHΠ
3842EYPDE5
36675LECVPTEESN10
權利要求
1.一種人血管內皮生長因子的抗原表位，其特徵在於包含SEQ ID NO=USEQ ID NO:2或SEQ ID NO :3所示的胺基酸序列。
2.一種人血管內皮生長因子的抗原表位，其特徵在於其胺基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
3.一種包含有人血管內皮生長因子抗原表位的蛋白，其特徵在於，所述蛋白利用單域抗體為分子骨架，並將權利要求I或2所述的人血管內皮生長因子的抗原表位展示於所述單域抗體的⑶R3區。
4.根據權利要求3所述的蛋白，其特徵在於，所述蛋白利用單域抗體為分子骨架，並用權利要求I或2所述的人血管內皮生長因子的抗原表位替換所述單域抗體的CDR3區。
5.根據權利要求3所述的蛋白，其中所述單域抗體的FR2區的第9、10和12位的胺基酸分別被替換為穀氨酸、精氨酸和甘氨酸。
6.根據權利要求3或4或5所述的蛋白，其特徵在於所述單域抗體構建自人抗體、駱駝重鏈抗體或鼠抗體。
7.根據權利要求6所述的蛋白，其特徵在於所述蛋白的胺基酸序列包含SEQID NO5或SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 10所示的序列。
8.一種製備權利要求3-7任一所述的蛋白的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)確定一種重鏈抗體的重鏈可變區的完整的胺基酸序列，以此序列作為單域抗體的胺基酸序列，並分析出其CDR3區的序列； 或 (I,)確定含輕鏈和重鏈的常規抗體的重鏈可變區的完整胺基酸序列，此序列即為單域抗體的基礎胺基酸序列，分析出其框架區2 (FR2)和CDR3區的序列，並將FR2區的第9、10和12位的胺基酸分別替換為穀氨酸、精氨酸和甘氨酸； (2)用權利要求I或2所述的人血管內皮生長因子的抗原表位序列替換所述單域抗體的CDR3區胺基酸序列，並將替換後的全長胺基酸序列轉換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，並將該全長基因序列克隆到表達載體中，得到重組質粒； (3)將得到的重組質粒轉化至相應的宿主細胞內，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白即為權利要求3-7任一所述的包含有人血管內皮生長因子抗原表位的蛋白。
9.一種人血管內皮生長因子表位疫苗,其特徵在於,所述表位疫苗包含權利要求3-7任一所述的蛋白。
10.權利要求3-7任一所述的蛋白在製備用於治療或預防實體瘤的藥物中的用途。
11.根據權利要求10所述的用途，其中所述的藥物為疫苗。
全文摘要
本發明為一種人血管內皮生長因子抗原表位及其表位疫苗，屬於生物技術領域。本發明公開了一種人血管內皮生長因子的抗原表位，還公開了一種基於單域抗體骨架構建的人血管內皮生長因子表位疫苗，該表位疫苗能夠有效誘導動物產生針對人血管內皮生長因子的抗體，該表位疫苗在動物體內表現出較好的抗腫瘤生長效應，可用於腫瘤等實體瘤藥物之用。
文檔編號C07K7/08GK102936277SQ201110452570
公開日2013年2月20日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者高建恩, 羅時偉, 錢軍 申請人:北京五康新興科技有限公司