小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基和其編碼基因及應用的製作方法
2023-12-10 04:04:06
小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基和其編碼基因及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了從普通小麥品種中國春中分離到的三個Waxy蛋白亞基編碼基因的全長編碼序列，對應的編碼序列與其編碼的蛋白亞基的胺基酸序列如序列表SEQ?ID?NO1-SEQ?ID?NO6所示。相應的，本發明公開了上述編碼序列的克隆和體外表達方法；最後，本發明還公開了所述蛋白亞基在提高麵粉品質中的應用。
【專利說明】小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基和其編碼基因及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種小麥蛋白的表達及其應用，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]普通小麥籽粒胚乳中含有分子量分別為62.8kD、56.7kD和58.7kD3種Waxy蛋白亞基，即 Wx-AUWx-Bl 和 Wx-Dl，由位於 7AS、4AL 和 7DS 的基因 Wx-7A、Wx_4A 和 Wx_7D 編碼(Ainsworth和Clark，1993)。普通小麥品種，如中國春至今都未能分離到完整且準確的編碼序列。
[0003]由於小麥籽粒直鏈澱粉含量與Waxy蛋白的含量高度正相關(姚大年，1999)，直鏈澱粉含量是影響麵條品質的重要因素，本領域多年來均集中於研究Waxy蛋白通過對直鏈澱粉含量等性狀的影響，對於Waxy蛋白對品質的貢獻率影響尚無研究。
[0004]Waxy蛋白含有13個半胱氨酸殘基，不能配對的單獨殘基可能參與了高低分子量谷蛋白骨架的形成，半胱氨酸殘基是構成蛋白質分子內和分子間二硫鍵的結構基礎(徐國恆，2010)，二硫鍵數目及位置會影響到麵團的黏彈性，而黏彈性是影響小麥加工品質的重要因素(魏慧等，2012)。因此，對Waxy蛋白的二硫鍵等分子特性深入研究將對小麥品質改良及對澱粉性狀及麵條 品質改良具有重要意義。目前，本領域已經有研究體外微量摻入高分子量谷蛋白亞基配粉功能檢測的方法，通過將基礎麵粉從35g、10g、5g和2g等不同規模進行配粉揉混分析試驗，對一些亞基進行了體外功能鑑定。
[0005]迄今為止,關於中國春Waxy編碼基因的體外表達、Waxy表達蛋白的純化以及該蛋白對麵團品質效應的研究尚未見報導。
【發明內容】
[0006]本發明公開了小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基和其編碼基因及應用，通過使用E.coli體外表達系統，對分離自小麥品種中國春的三個完整Waxy編碼序列進行表達獲得目的蛋白亞基，再通過氧化-還原反應將純化的蛋白整合到基礎麵粉中，從而提高了小麥加工產物的品質，為小麥品種中國春的基因遺傳改良提供依據。
[0007]為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的:
[0008]首先，本發明公開了三種來源自中國春這-小麥品種的Waxy蛋白亞基，均從同樣的普通小麥品種-中國春中獲得，三種蛋白亞基的胺基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列分別為胺基酸序列為SEQ ID NOl ;其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N02 ;胺基酸序列為SEQ ID N03 ;其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N04 ;胺基酸序列為SEQ ID N05 ;其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N06。
[0009]在上述基礎上，本發明公開了所述小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基編碼基因的克隆方法，是以中國春的cDNA為模版，採用下述引物進行PCR克隆:
[0010]上遊引物5，-ATGGCGGCTCTGGTCACGT-3，；
[0011]下遊引物5 』 -TCAGGGAGCG GCGACGTT-3 』。[0012]其中，所述中國春cDNA既可以由試劑公司進行合成，也可自行採用中國春小麥籽粒粉碎後提取總RNA並相應合成cDNA。目前在市場上有多種在售的試劑盒來實現上述操作的快捷簡化和高效準確。
[0013]上述的PCR克隆採用本領域常規的PCR體系和條件即可。
[0014]在完成上述克隆後，對所得PCR產物進行回收以獲得純化的目的片段，通常回收和純化操作採用DNA純化回收試劑盒進行，以提高成功率。具體的操作參考試劑盒的說明書即可。
[0015]通過利用引物擴增小麥品種中國春的cDNA，將獲得的目的片段經回收連接和轉化，測序後得到3個序列，分別為Wx-Al、Wx-BU Wx-Dl，每個序列包含一個完整的編碼區基因，分別編碼下述三種蛋白亞基:Waxy-A蛋白亞基，Waxy-B蛋白亞基和Waxy-D蛋白亞基(以下簡稱為 Waxy-A, Waxy-B 和 Waxy-D)。
[0016]基於上述獲得的純化的目的片段，本發明還公開了所述小麥品種中國春Waxy蛋白亞基的表達方法,包括構建重組表達質粒和重組質粒進行誘導表達的步驟,從而高效表達所需蛋白。
[0017]具體的，構建重 組表達質粒包括如下步驟:將上述獲得的目的片段用表達載體連接，然後連接產物轉化入感受態細胞，在塗有氨苄青黴素的LB平板上篩選陽性克隆。
[0018]作為優選的技術方案，所述表達載體為pEASY-Fl，所述感受態細胞為大腸桿菌DH5a。
[0019]作為本領域常用的其它表達載體，也是本領域技術人員可以理解的，例如表達載體可以為pET_28a。
[0020]上述的感受態細胞既可以從試劑公司購買，市面上有多家生物試劑公司均銷售感受態細胞成品，也可在實驗室自行製備，通常是採用常規的CaC12方法製備E.coli DH5 α感受態細胞，具體的操作為本領域廣泛所知，此處不予贅述。
[0021]其中，重組質粒的誘導表達包括如下步驟:將篩選出的陽性克隆質粒轉化到表達宿主細胞，篩選高效表達Waxy蛋白亞基的菌株，擴大培養細胞及誘導表達，通過純化獲得重組蛋白。
[0022]其中，所述表達宿主細胞為E.coli BL21，為了保證最優的表達能力，優選為E.coli Rosettagami B(DE3)。
[0023]作為本領域常用的其它表達宿主，也是本領域技術人員可以理解的，例如Rosetta-gami B> Rosetta-gami B (DE3) pLysS、Rosetta-gami B (DE3) pLacI2 等。
[0024]在上述表達後,還包括對重組蛋白進行SDS-PAGE及Western blot分析的步驟,從而確保重組蛋白的表達效果。
[0025]其中，所用的純化步驟採用本領域常用方法，作為一種優選的技術方案，所述純化包括以下步驟:取離心收集菌體加入破碎緩衝液，超聲破碎，離心取沉澱，加入平衡緩衝液攪拌溶解，將離心的上清液過His-Trap HP蛋白純化凝膠柱，用平衡緩衝液平衡，用平衡緩衝液、洗脫緩衝液洗滌，收集洗脫液，透析後低溫冷凍乾燥保存待用。
[0026]最後，本發明深入研究了上述蛋白的功能，對純化蛋白進行微量摻粉試驗，發現本發明的Waxy蛋白三個亞基均對小麥加工品質具有顯著的正向效應，因此本發明還公開了中國春小麥的Waxy蛋白亞基在提聞麵粉品質中的應用。[0027]通過上述改進，本發明實現了如下效果；
[0028]I，成功分離到三個Waxy基因的全長編碼序列；
[0029]2，成功實現了小麥品種中國春的三個Waxy基因進行體外表達、純化、測序；
[0030]3,成功發現了小麥品種中國春籽粒中的三個Waxy蛋白亞基對小麥加工品質的促進效應，有利於小麥加工品質的改良、品質的分子育種、種質資源的發掘與利用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1為小麥品種中國春cDNA的PCR產物電泳分析結果，其中M為DNA MarkerDL2000 ；1 為 Wx-Al 產物；2 為 Wx-Bl 產物；3 為 Wx-Dl 產物；
[0032]圖2為三種編碼序列進行E.col1.誘導表達產物的SDS-PAGE檢測結果，其中M為蛋白marker ;箭頭指向I為Waxy-A表達產物；2為Waxy-A陰性對照；3為Waxy-B表達產物；4為Waxy-B陰性對照；5為Waxy-D表達產物；6為Waxy-D陰性對照；
[0033]圖3為表達產物的Western blot分析,其中M為蛋白分子量Marker ;從I到3依次為Waxy-A蛋白亞基，Waxy-B蛋白亞基和Waxy-D蛋白亞基；
[0034]圖4為純化產物的SDS-PAGE檢測結果，其中M為蛋白分子量Marker ；1為誘導表達產物未純化樣品；從2到4分別為Waxy-A，Waxy-B和Waxy-D蛋白亞基；
[0035]圖5為三條 蛋白亞基序列的差異位點差異對照組，其中帶有下劃線的黑體字部分為差異胺基酸位點；
[0036]圖6為Waxy蛋白亞基對麵粉品質的影響粉質曲線，其中基礎麵粉CS添加
0.5ug.mL-lDTT 溶液 0.25ml 和 0.2ug.mL_K103 溶液 0.25ml_l ；同時分別添加 50mg 的Waxy蛋白亞基；DVT:麵團形成時間；ST ;穩定時間；DS，弱化度；MTI，公差指數；BDT，斷裂時間；FQN,粉質質量數；
[0037]圖7為添加外源蛋白亞基與對照麵粉之間粉質曲線差異柱狀圖，其中，DvT:麵團形成時間；ST ;穩定時間；DS，弱化度；MTI，公差指數；BDT，斷裂時間；FQN，粉質質量數。
【具體實施方式】
[0038]在下述實施例中，使用了如下材料和試劑、實驗儀器:
[0039]花後20天的幼嫩小麥品種中國春杆粒用液氣取回至於-80 C冰箱備用；成熟的小麥品種中國春磨粉後過100目篩制粉。
[0040]PROTEMANII XI SYSTEM 型電泳系統；PTC_220 基因擴增儀；美國 Thermol_15K 型臺式高速冷凍離心機；上海一恆科技有限公司的DK-8D電熱恆溫水槽；上海一恆科技有限公司的DHP-9052型電熱恆溫培養箱；哈爾濱東聯電子技術開發有限公司的Dir-1N型超級潔淨工作檯；1.5ml離心管，2.0ml離心管，移液器，槍頭，燒杯，量筒，磨樣機，水浴箱，臺式高速離心機、搖床等儀器設備及用具。
[0041 ] 實施例1:小麥品種中國春籽粒總RNA提取與cDNA合成
[0042]按照EasyPureTM Plant RNA Kit說明書提取中國春小麥籽粒的總RNA，按EasyScriptTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(全式金生物技術有限公司，北京)合成cDNA。
[0043]具體的操作方法參照其儀器操作說明即可。[0044]實施例2:引物的設計及目的基因的擴增和純化
[0045]根據已知的小麥Waxy序列，設計克隆引物，上遊引物為5』 -ATGGCGGCTCTGGTCACGT-3』 (SEQ IDN07),下遊引物為 5』 -TCAGGGAGCGGCGACGTT-3』 (SEQID N08)，上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0046]PCR體系為:cDNA100ng、0.1ymol *L_1 的 F/R各 I μ L、IA Taq DNA聚合酶0.25 μ L、
0.05mmol.L-1dNTP mixl2.5 μ L，加 ddH20 至反應體積 25 μ L。
[0047]PCR 反應程序為:95°C 5min ；94°C 40s，68°C 8min，35 次循環；72°C 8min ;10°C保存。
[0048]採用DNA純化回收試劑盒(天根生化(北京)有限公司，離心柱型DP214)進行擴增產物回收，經電泳檢測後備用。
[0049]實施例3:目的片段連接與轉化
[0050]首先用pEASY-El載體連接回收的目的片段，然後連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，在塗有氨苄青黴素(AMP)的LB平板上篩選陽性克隆。具體採用的連接反應體系如下表1所示:
[0051]表1連接反應體系
[0052]
【權利要求】
1.小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基，其特徵在於胺基酸序列為SEQID NOl ;其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N02。
2.小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基，其特徵在於胺基酸序列為SEQID N03 ;其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N04。
3.小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基，其特徵在於胺基酸序列為SEQID N05 ;其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N06。
4.小麥品種中國春Waxy蛋白亞基編碼基因的克隆方法，其特徵在於小麥品種中國春小麥的cDNA為模版，採用下述引物進行PCR克隆: 上遊引物 5 』 -ATGGCGGCTCTGGTCACGT-3，； 下遊引物 5』 -TCAGGGAGCGGCGACGTT-3』。
5.小麥品種中國春Waxy蛋白亞基的表達方法，其特徵在於包括構建重組表達質粒和重組質粒進行誘導表達的步驟。
6.根據權利要求5所述的表達方法，其特徵在於構建重組表達質粒包括如下步驟:將PCR克隆得到的產物回 收的目的片段用表達載體連接，然後連接產物轉化入感受態細胞，在塗有氨苄青黴素的LB平板上篩選陽性克隆。
7.根據權利要求7所述的表達方法，其特徵在於所述表達載體為pEASY-El，所述感受態細胞為大腸桿菌DH5 α。
8.根據權利要求5所述的表達方法，其特徵在於重組質粒的誘導表達包括如下步驟:將篩選出的陽性克隆質粒轉化到表達宿主細胞，篩選高效表達Waxy蛋白亞基的菌株，擴大培養細胞及誘導表達，通過純化獲得重組蛋白。
9.根據權利要求8所述的表達方法，其特徵在於所述表達宿主細胞為E.coliRosettagami B (DE3)。
10.小麥品種中國春的Waxy蛋白亞基在提聞麵粉品質中的應用。
【文檔編號】C07K14/415GK104031130SQ201410193398
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】陳其皎, 高翔, 孟敏, 董劍, 趙萬春 申請人:西北農林科技大學