抗pd－1抗體及其用途的製作方法

2023-11-06 09:10:22

專利名稱：抗pd－1抗體及其用途的製作方法
技術領域：
技術領域涉及受程序性死亡1(PD-1)受體調控的免疫應答的調節。
背景技術：
適應性免疫應答包括稱為T細胞和B細胞的兩大類淋巴細胞的激活、選擇和克隆增殖。在遭遇抗原之後，T細胞增殖並分化為抗原特異性效應細胞，而B細胞增殖並分化為抗體分泌性細胞。
T細胞激活是需要T細胞和呈遞抗原細胞(APC)之間的數個信號傳導事件的多步過程。為使T細胞激活發生，必須將兩類信號遞送給靜息T細胞。第一類是由抗原特異性T細胞受體(TcR)介導的，並賦予免疫應答特異性。第二種共刺激類型，調控著應答的量級並且是通過T細胞上的輔助受體遞送的。
初級共刺激信號是通過活化CD28受體經與其配體B7-1或B7-2的接合而遞送的。相反，抑制性CTLA-4受體與相同的B7-1或B7-2配體的接合，則導致T細胞應答的削弱。從而，CTLA-4信號拮抗由CD28所介導的共刺激。在高抗原濃度下，CD28共刺激勝過CTLA-4的抑制效應。CD28和CTLA-4表達的時序調節維持了激活和抑制信號之間的平衡，並確保了有效免疫應答的形成，而同時預防了自身免疫性的發展。
最近業已鑑定了CD28和CTLA-4及其B-7樣配體的分子同系物。ICOS為CD28-樣共刺激受體。PD-1(程序性死亡1)為抑制性受體和CTLA-4的相似物。本發明公開內容涉及由PD-1受體所介導的免疫應答的調節。
PD-1為50-55kDa的I型跨膜受體，其最初是在經歷激活誘導的細胞凋亡的T細胞系中鑑定的。PD-1表達於T細胞、B細胞和巨噬細胞之上。PD-1的配體為B7家族成員PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。
PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族成員，在其胞外區含有單個Ig V-樣結構域。PD-1胞漿結構域含有兩個酪氨酸，其中最接近於膜的酪氨酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位於ITIM(基於免疫受體酪氨酸的抑制基序)之內。PD-1上ITIM的存在預示著該分子通過募集胞漿磷酸酶發揮作用以削弱抗原受體的信號傳導。人和鼠PD-1蛋白共有大約60％的胺基酸同一性，具有保守的四個潛在的N-糖基化位點以及限定Ig-V結構域的殘基。胞漿區中的ITIM以及羧基末端酪氨酸(人和小鼠中的TEYATI)周圍的ITIM-樣基序在人和鼠直向同源物(orthologue)之間也是保守的。
PD-1表達於激活的T細胞、B細胞和單核細胞之上。實驗數據暗示了PD-1與其配體在下調中央和外周免疫應答中的相互作用。特別是，野生型T細胞中而非PD-1缺陷型T細胞中的增殖在PD-L1的存在下受到抑制。另外，PD-1缺陷型小鼠表現出自身免疫表型。C57BL/6小鼠中的PD-1缺陷導致慢性進行性狼瘡樣腎小球腎炎和關節炎。在Balb/c小鼠中，PD-1缺陷由於心組織特異性自身反應性抗體的存在而引起嚴重的心肌病。
一般而言，存在著提供用於免疫紊亂的安全且有效的治療方法的需要，所述免疫紊亂例如自身免疫病、炎性疾病、變態反應、移植物排斥、癌症、免疫缺陷症以及其它免疫系統相關紊亂。這些紊亂中所涉及的免疫應答的調節可通過操縱PD-1途徑而實現。
發明概述本發明公開內容提供了可作為PD-1激動劑和/或拮抗劑起作用，由此調節受PD-1調控的免疫應答的抗體。本發明公開內容還提供了包含新的抗原結合片段的抗-PD-1抗體。本發明的抗-PD-1抗體能夠(a)特異性結合於PD-1，包括人PD-1；(b)阻斷PD-1與其天然配體的相互作用；或(c)發揮兩種功能。此外，所述抗體可能擁有免疫調節性質，即，它們可能有效地調節與PD-1相關的免疫應答的下調。依賴於使用方法和期望效果，抗體可用於增強或者抑制免疫應答。
所述抗體的非限制性舉例說明性實施方案有PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-3 5和PD1-F2。其它實施方案包括PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35或PD1-F2中Fv片段的VH和/或VL結構域。更多的實施方案包括這些VH和VL結構域中任一個的一個或多個互補決定區(CDR)。其它實施方案包括PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35或PD1-F2中VH結構域的H3片段。
本發明公開內容也提供了包含PD-1抗體的組合物，及其在調節免疫應答的方法中的用途，包括治療人或動物的方法。在特別的實施方案中，通過增強或減弱由TcR/CD28介導的T細胞應答，抗-PD-1抗體可用於治療或預防免疫紊亂。對本發明組合物的治療敏感的紊亂包括但不限於類風溼關節炎、多發性硬化、炎性腸病、Crohn氏病、系統性紅斑狼瘡、I型糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主疾病、過度增生性免疫紊亂、癌症以及傳染病。
另外，抗-PD-1抗體可在診斷上用於檢測生物學樣品中的PD-1或其片段。所檢測的PD-1的量可能與PD-1的表達水平相關，其依次又與受試者中免疫細胞(如激活的T細胞、B細胞和單核細胞)的激活狀態相關。
本發明公開內容也提供了分離的核酸，其包含編碼來自PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35或PD1-F2的Fv片段的VH或VL結構域的序列。同樣提供的有這樣的分離核酸，其包含編碼來自本發明公開的VH和VL結構域中任一個的一個或多個CDR的序列。本發明公開內容也提供了包含此類核酸的載體和宿主細胞。
本發明公開內容還提供了生產新的VH和VL結構域和/或功能性抗體的方法，所述功能性抗體包括衍生自PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35或PD1-F2的VH或VL結構域的此類結構域的全部或一部分。
本發明公開內容的另外方面將在下面的說明中部分闡明，並且部分地將會由於所述說明而顯而易見，或者可通過實施本發明而了解。本發明示於所附的權利要求書中並在其中特別指出，且本發明公開內容不應當解釋為以任何方式限制權利要求的範圍。以下詳述包括本發明多種實施方案的例示性代表，它們並非用於限制所請求保護的發明。附圖構成本說明書的一部分，並且，連同所述說明，僅用於舉例說明多種實施方案而非限制本發明。引述參考文獻並非認可這些參考文獻是本發明的現有技術。
附圖簡述

圖1A和1B顯示了如通過噬菌體ELISA所測定的scFv抗體與人PD-1的反應性。
圖2A-2C顯示了如通過ELISA所測定的IgG-轉化的抗體與人或小鼠PD-1的反應性。
圖3顯示了ELISA結果，證明所選的PD-1抗體抑制PD-L1與PD-1的結合。
圖4顯示了ELISA結果，證明免疫調節性PD-1抗體與PD-1上的不同位點結合，如通過交叉阻斷ELISA分析所測定的那樣。
圖5顯示了T細胞增殖測定的結果，證明由TcR和抗-PD-1抗體PD1-17或PD-L1.Fc進行共接合使增殖下降。由TcR和抗-PD-1 J110進行共接合對增殖沒有影響。
圖6證明可溶形式的PD1-17促進的原代T細胞的增殖。
詳述定義如本發明公開內容所用，術語「抗體」是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，並且涵蓋包含抗原結合位點的任何多肽，而不論其是在體外或是在體內生產的。該術語包括但不限於多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜交的、突變的以及移植的抗體。除非如「完整抗體」中那樣由術語「完整」另行修飾，為了本發明公開內容的目的，術語「抗體」也包括抗體片段如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb，以及保留抗原結合功能即特異性結合PD-1能力的其它抗體片段。一般地，此類片段將包含抗原結合結構域。
術語「抗原結合結構域」、「抗原結合片段」以及「結合片段」是指抗體分子的一部分，其包含負責抗體和抗原之間特異性結合的胺基酸。在抗原大的情況下，抗原結合結構域可能僅與抗原的一部分結合。抗原分子中負責與抗原結合結構域特異性相互作用的部分被稱為「表位」或「抗原決定簇」。
抗原結合結構域一般地包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)，不過，它並非必需兩者都包含。例如，所謂的Fd抗體片段僅由VH結構域組成，但仍保留了完整抗體的一些抗原結合功能。
術語「所有組成成分(repertoire)」是指遺傳上多樣性的核苷酸集合，其全部或部分地衍生自編碼所表達的免疫球蛋白的序列。所述序列是通過例如H鏈的V、D和J區段以及例如L鏈的V和J區段的體內重排產生的。備選地，所述序列可通過體外刺激而由細胞系產生，響應於該刺激發生重排。備選地，部分或所有序列可通過核苷酸合成、隨機誘變以及其它方法，如美國專利No.5,565,332中所公開的那樣，通過將未重排的V區段與D和J區段組合而獲得。
術語「特異性相互作用」和「特異性結合」是指兩分子形成在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合以高親和力以及低度到中度的結合量為特徵，這有別於通常具有低親和力與中度到高度的結合量的非特異性結合。一般地，當親和常數KA高於106M-1或更優選高於108M-1時，認為結合是特異性的。如必要，可通過改變結合條件降低非特異性結合而基本上不影響特異性結合。熟練技術人員可利用常規技術優化合適的結合條件，如抗體的濃度、溶液的離子強度、溫度、允許結合的時間、封閉劑(如血清清蛋白、乳酪蛋白)的濃度等。舉例說明性的條件示於實施例1、2、4、6和7中。
短語「基本上如…中所示」意味著本發明相關的CDR、VH或VL結構域在指定區域(如CDR)上與所示序列完全相同或者僅具有不重要的區別。不重要的區別包括次要的胺基酸變化，例如在指定區域的序列中取代任意5個胺基酸中的1個或2個。
術語「PD-1活性」是指與PD-1相關的一種或多種免疫調節活性。例如，PD-1為TcR/CD28介導的免疫應答的負調節物。體內和體外評估PD-1活性的操作在實施例8、9和10中描述。
術語「調節」、「免疫調節的」及其同源詞是指因與抗-PD-1抗體的相互作用所致的與T細胞應答下調相關的PD-1活性的下降或上升，其中所述下降或上升是相對於不存在相同抗體下的PD-1活性而言的。活性的下降或上升優選為至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。當PD-1活性下降時，術語「調節的」及「調節」與術語「抑制的」及「抑制」是可互換的。當PD-1上升時，術語「調節的」及「調節」與術語「激活的」及「激活」是可互換的。PD-1的活性可利用如實施例8和9中所描述的T細胞增殖測定來定量確定。
術語「治療」和「治療方法」既指治療性治療又指預防/預防性措施。需要治療的那些個體可包括早已患有特殊醫學紊亂的個體，以及可能最終患有所述紊亂的那些個體(即需要預防性措施的那些個體)。
術語「有效量」是指足以降低PD-1活性的劑量或量，以實現患者症狀的改善或達到期望的生物學結果，例如提高T細胞的溶細胞活性、誘導免疫耐受、降低或提高與T細胞介導的免疫應答的負調控相關的PD-1活性等。
術語「分離的」是指基本上脫離其天然環境的分子。例如，分離的蛋白基本上不含來自得到它的細胞或組織源的細胞材料或其它蛋白。術語「分離的」也指其中分離的蛋白足夠純以至於能夠作為藥物組合物施用的製劑，或者至少70-80％(w/w)純，更優選至少80-90％(w/w)純，甚至更優選90-95％純，並且最優選至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)純。
抗-PD-1抗體本發明公開內容提供了包含新型抗原結合片段的抗-PD-1抗體。
一般而言，例如，可利用傳統的雜交瘤技術(Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-499)、重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)或由抗體文庫實施的噬菌體展示(Clackson等(1991)Nature，352624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581-597)製備抗體。關於其它抗體生產技術，也參見AntibodiesALaboratory Manual，Harlow等編，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本發明不局限於任何特定的來源、起源物種、生產方法。
完整抗體，也稱為免疫球蛋白，一般是四聚體糖基化蛋白，由兩條大約各25kDa的輕(L)鏈以及兩條大約各50kDa的重(H)鏈組成。抗體中發現了兩類輕鏈，命名為λ鏈和κ鏈。依賴於重鏈恆定結構域的胺基酸序列，免疫球蛋白可分配為5大類A、D、E、G和M，並且其中有數種可進一步劃分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
不同類型免疫球蛋白的亞基結構和三維構象是本領域眾所周知的。關於抗體結構的綜述，見Harlow等，同前。簡言之，每條輕鏈由N-末端可變結構域(VL)和恆定結構域(CL)組成。每條重鏈由N-末端可變結構域(VH)、三或四個恆定結構域(CH)、以及鉸鏈區組成。最接近於VH的CH結構域被命名為CHl。VH和VL結構域由四個具有相對保守序列的區域組成，稱為構架區(FR1、FR2、FR3和FR4)，它們構成三個高變序列區域的支架，所述高變序列區域稱為互補決定區(CDR)。CDR含有大多數負責與抗原特異性相互作用的殘基。三個CDR被稱為CDR1、CDR2和CDR3。重鏈上的CDR組分被稱為H1、H2和H3，而輕鏈上的CDR組分被相應地稱為L1、L2和L3。CDR3，並且特別是H3，是抗原結合結構域內分子多樣性的最大來源。例如，H3可短至2個胺基酸殘基或者多於26個。
Fab片段(抗原結合片段)由通過恆定區之間的二硫鍵共價連接的VH-CH1和VL-CL結構域組成。為克服在宿主細胞中共表達時Fv中非共價連接的VH和VL結構域解離的傾向，可構建所謂的單鏈(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性且足夠長的多肽或者將VH的C-末端連接於VL的N-末端，或者將VL的C-末端連接於VH的N-末端。最常見地，利用15個殘基的(Gly4Ser)3肽作為接頭，但其它接頭也是本領域公知的。
抗體多樣性是編碼可變區的多個種系基因組合裝配以及多種體細胞事件的結果。體細胞事件包括V基因區段與D和J基因區段重組以製備完整VH區，以及V和J基因區段重組以製備完整VL區。重組過程本身是不精確的，導致V(D)J接合處胺基酸的丟失或添加。這些多樣化機制出現在抗原暴露之前的發育B細胞之中。抗原刺激後，B細胞中表達的抗體基因經歷體細胞突變。
根據種系基因區段的估計數、這些區段的隨機重組以及隨機VH-VL配對，可生產最多1.6×107個不同的抗體(FundamentalImmunology，第3版，Paul編，Raven Press，New York，NY，1993)。若考慮有助於抗體多樣性的其它過程(如體細胞突變)，則認為可潛在地產生1×1010以上的不同抗體(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等編，Academic Press，San Diego，CA，1995)。由於這許多過程參與抗體的多樣性，獨立產生的抗體在CDR區將具有完全相同或者甚至基本上相似的胺基酸序列是非常不可能的。
本發明公開內容提供了新的來源於人免疫球蛋白基因文庫的CDR。攜帶CDR的結構通常將是抗體重鏈或輕鏈或其部分，其中CDR位於對應於天然存在的VH及VL的CDR的位置上。例如，免疫球蛋白可變結構域的結構和定位可如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，No.91-3242，National Institutes ofHealth Publications，Bethesda，MD，1991中所述確定。
抗-PD-1抗體、其scFv片段、VH和VL結構域及CDR的DNA和胺基酸序列示於序列表之中，並如表1中所列的那樣列舉。抗體特別的非限制性舉例說明性的實施方案被稱為PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35和PD1-F2。舉例說明性實施方案的VH和VL結構域內每一個CDR的位置列於表2和3中。
表1VH和VL結構域以及CDR的DNA和胺基酸(AA)序列
表2重鏈CDR的位置
表3輕鏈CDR的位置
抗-PD-1抗體也任選地包含抗體恆定區或其部分。例如，VL結構域可在其C末端附著有抗體輕鏈恆定結構域，包括人Cκ或Cλ鏈。類似地，基於VH結構域的特異性抗原結合結構域可附著有全部或部分免疫球蛋白重鏈，所述重鏈來源於任何抗體同種型如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同種型亞類，包括但不限於IgG1和IgG4。在例示性的實施方案中，PD1-17、PD1-28、PD1-33和PD1-35抗體包含人IgG1λ重鏈和輕鏈的C-末端片段，而PD1-F2包含人IgG1κ重鏈和輕鏈的C-末端片段。C-末端片段的DNA和胺基酸序列是本領域眾所周知的(參見如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，No.91-3242，National Institutes of Health Publications，Bethesda，MD，1991)。非限制性的例示性序列示於表4。
表4
某些實施方案包括來自PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35和PD1-F2的Fv片段的VH和/或VL結構域。另外的實施方案包括任何這些VH和VL結構域的至少一個CDR。包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQID NO14、SEQ ID NOs16-40、SEQ ID NO47或SEQ ID NO49中所示的至少一個CDR序列的抗體涵蓋在本發明的範圍之內。例如，一實施方案包括選自PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35和PD1-F2中至少之一的抗體的VH結構域的H3片段。
在某些實施方案中，VH和/或VL結構域可被種系化(germlined)，也就是利用常規的分子生物學技術突變這些結構域的構架區(FRs)，以匹配由種系細胞產生的那些結構域。在其它實施方案中，構架序列保持與共有的種系序列趨異。
在某些實施方案中，抗體特異性結合位於人PD-1胞外結構域內的表位。推定的胞外結構域由SEQ ID NO41(Swissport登錄號Q15116)中從大約胺基酸21到大約胺基酸170的序列組成。在某些其它實施方案中，抗體特異性結合位於小鼠PD-1胞外結構域內的表位，親和力大於107M-1，並且優選大於108M-1。小鼠PD-1的胺基酸序列示於SEQ ID NO56(登錄號NM_008798)，並且總體上與其人對應物有大約60％的同一性。在另一些實施方案中，本發明的抗體結合於PD-1的PD-L-結合結構域。
預期本發明的抗體也與其它蛋白結合，例如，包括包含全部或部分PD-1胞外結構域的重組蛋白。
本領域普通技術人員將會認識到本發明的抗體可用於檢測、測量和抑制稍微不同於PD-1的蛋白。預期抗體將保留結合特異性，只要靶蛋白包含與SEQ ID NO41所示序列中任何至少100、80、60、40或20個鄰接胺基酸的序列具有至少大約60％、70％、80％、90％、95％或更高同一性的序列。同一性百分比是由標準比對算法確定的，例如Altshul等(1990)J.Mol.Biol.，215403-410中所示的BasicLocal Alignment Tool(BLAST)，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.，48444-453的算法或者Meyers等(1988)Comput.Appl.Biosci.，411-17的算法。
除了序列同源性分析之外，可進行表位作圖(參見如EpitopeMapping Protocols，ed.Morris，Humana Press，1996)以及二級和三級結構分析，以鑑定所公開的抗體及其與抗原的複合物所採取的特定3D結構。此類方法包括但不限於X射線晶體學(Engstom(1974)Biochem.Exp.Biol.，117-13)以及本文所公開抗體的實際表現的計算機建模(Fletterick等(1986)Computer Graphics andMolecular Modeling，in Current Communications in MolecularBiology，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
衍生物本發明公開內容也提供了用於獲得特異於PD-1的抗體的方法。此類抗體中的CDR並不局限於表1中所鑑定的VH和VL的具體序列，並且可包括保留了特異性結合PD-1能力的這些序列的變體。此類變體可由熟練技術人員利用本領域眾所周知的技術由表1中所列的序列得到。例如，可在FRs和/或CDRs中進行胺基酸取代、缺失或添加。儘管FRs中的變化通常被設計用於改善抗體的穩定性和免疫原性，但CDRs中的變化一般被設計用於提高抗體對其靶的親和力。FRs變體也包括天然存在的免疫球蛋白同種異型。此類提高親和力的變化可通過常規技術憑經驗確定，所述技術包括改變CDR並測試抗體對其靶的親和力。例如，可在所公開的任一CDR內進行保守胺基酸取代。可依據Antibody Engineering，第2版，Oxford University Press，Borrebaeck編，1995中描述的方法進行各種改變。這些包括但不限於通過取代序列內編碼功能上等同的胺基酸殘基的不同密碼子而改變了的核苷酸序列，由此產生「沉默」變化。例如，非極性胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電荷的(鹼性)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。序列內的胺基酸取代可選自該胺基酸所屬類別的其它成員(見表5)。此外，多肽中的任何天然殘基也可用丙氨酸取代(參見如MacLennan等(1998)Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等(1998)Adv.Biophys.351-24)。
本發明抗體的衍生物和類似物可通過本領域眾所周知的各種技術生產，包括重組及合成法(Maniatis(1990)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，以及Bodansky等(1995)The Practiceof Peptide Synthesis，第二版，Spring Verlag，Berlin，德國)。
表5
在一個實施方案中，用於製備作為本發明VH結構域的胺基酸序列變體的VH結構域的方法包括在本文所公開的VH結構域的胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個或多個胺基酸的步驟，任選地將如此提供的VH結構域與一個或多個VL結構域組合，並測試VH結構域或VH/VL組合或多個VH/VL組合對PD-1的特異性結合，或者，並任選地測試此抗原結合結構域調節PD-1活性的能力。VL結構域可具有完全相同於或基本上如根據表1所示的胺基酸序列。
可採用類似的方法，其中將本文公開的VL結構域的一個或多個序列變體與一個或多個VH結構域組合。
本發明公開內容的另一方面提供了製備與PD-1特異性結合的抗原結合片段的方法。所述方法包括(a)提供編碼VH結構域的起始核酸所有組成成分，其中VH結構域包括將要被取代的CDR3或者缺失CDR3編碼區；
(b)將所述所有組成成分與編碼基本上如本文所示的VHCDR3(即H3)胺基酸序列的供體核酸組合，從而將供體核酸插入到所述所有組成成分的CDR3區，以提供編碼VH結構域的核酸的產物所有組成成分；(c)表達產物所有組成成分的核酸；(d)選擇特異於PD-1的結合片段；和(e)回收該特異性結合片段或編碼它的核酸。
再次地，可採用類似的方法，其中將本發明的VLCDR3(即L3)與編碼VL結構域的核酸所有組成成分組合，其中VL結構域包括將要被取代的CDR3或者缺失CDR3編碼區。供體核酸可選自編碼基本上如SEQ ID NO17-40或SEQ ID NO50-55中所示胺基酸序列的核酸。
可利用重組DNA技術將編碼本發明CDR(如CDR3)的序列引入到缺失各自CDR(如CDR3)的可變結構域所有組成成分中，例如使用由Marks等(Bio/Technology(1992)10779-783)描述的方法學。特別地，指向或鄰近於可變結構域區域5′端的共有引物可與人VH基因的第三構架區的共有引物聯合使用，以提供缺失CDR3的VH可變結構域所有組成成分。可將所述所有組成成分與特定抗體的CDR3組合。利用類似的技術，衍生自CDR3的序列可與缺失CDR3的VH或VL結構域所有組成成分改組，並將改組的完整VH或VL結構域與同源的VL或VH結構域組合，以製備本發明的PD-1特異性抗體。然後所述所有組成成分可在合適的宿主系統如噬菌體展示系統中展示，例如在WO92/01047中所描述的，從而可選擇合適的抗原結合片段。
類似的改組或組合技術也由Stemmer(Nature(1994)370389-391)公開，他描述了與β-內醯胺酶基因有關的技術，但評論說該途徑可用於產生抗體。
在另一實施方案中，利用一個或多個所選VH和/或VL基因的隨機誘變，人們可產生攜帶衍生自本文所公開的序列的一個或多個序列的新型VH或VL區。一種這樣的技術即易錯PCR由Gram等(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)893576-3580)描述。
可使用的另一種方法是直接誘變VH或VL基因的CDRs。此類技術由Barbas等(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)913809-3813)以及Schier等(J.Mol.Biol.(1996)263551-567)公開。
類似地，可將一個或多個、或者所有三個CDRs移植到VH或VL結構域所有組成成分中，然後篩選特異於PD-1的抗原結合片段。
免疫球蛋白可變結構域的一部分將包含至少一個基本上如本文所示的CDRs，和任選地來自如本文所示的scFv片段的間插構架區。所述部分可包括FR1和FR4中任一或兩者的至少大約50％，50％為FR1C-末端的50％和FR4 N-末端的50％。可變結構域基本部分N-末端或C-末端另外的殘基可以是通常不與天然存在的可變結構域區結合的那些殘基。例如，通過重組DNA技術構建抗體可能導致引入由接頭編碼的N-或C-末端殘基，引入所述接頭是為了易化克隆或其它操作步驟的。其它操作步驟包括引入接頭以將可變結構域連接於另一蛋白序列，包括免疫球蛋白重鏈恆定區、其它可變結構域(例如，在微型雙功能(diabody)抗體的生產中)、或者如下文更為詳細討論的蛋白標記。
儘管實施例中舉例說明的實施方案包括VH和VL結構域的「匹配」配對，熟練技術人員將會認識到備選的實施方案可包括僅含來自VL或VH結構域的單個CDR的抗原結合片段。可利用兩者中的任一單鏈特異性結合結構域篩選互補結構域，其能夠形成能夠與例如PD-1結合的兩結構域特異性抗原結合片段。篩選可利用WO 92/01047中公開的所謂的等級雙組合方法通過噬菌體展示篩選法完成，其中利用含H或L鏈克隆的個體菌落感染編碼另一鏈(L或H)的完整克隆文庫，並按照所述的噬菌體展示技術對所得的兩鏈特異性結合結構域進行選擇。
可將本文描述的抗-PD1抗體連接於另一個功能分子，如另一個肽或蛋白(清蛋白、另一個抗體等)、毒素、放射性同位素、細胞毒性劑或細胞抑制劑。例如，可通過化學交聯或通過重組方法連接抗體。也可將抗體連接於多種非蛋白聚合物的一種，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其中以美國專利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所示的方式進行。抗體可通過與聚合物共價綴合而化學修飾，例如，以提高其循環半衰期。例示性的聚合物以及附著它們的方法也顯示在美國專利No s.4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546中。
也可改變所公開的抗體以使之具有不同於天然模式的糖基化模式。例如，可缺失一個或多個碳水化合物部分和/或向原始抗體中添加一個或多個糖基化位點。向本文公開的抗體中添加糖基化位點可通過改變胺基酸序列，以使之含有本領域公知的糖基化位點共有序列來完成。增加抗體上的碳水化合物部分數目的另一種手段是通過將糖苷化學或酶促偶聯於所述抗體的胺基酸殘基。此類方法描述在WO87/05330和Aplin等(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22259-306中。從抗體中除去任何碳水化合物部分可化學或酶促完成，例如，如由Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem.Biophys.，25952；和Edge等(1981)Anal.Biochem.，118131以及由Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.，138350所述的那樣。抗體也可用可檢測或功能性標記予以標記。可檢測標記包括放射性標記如131I或99Tc，它們也可利用常規化學附著於抗體。可檢測標記也包括酶標記如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶。可檢測標記還包括化學部分如生物素，它可介由與特異性同源的可檢測部分如標記的抗生物素蛋白予以檢測。
其中CDR序列僅不顯著地有別於SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NOs16-40、SEQ ID NO47或SEQ ID NO49中所示那些的抗體涵蓋在本發明的範圍之內。一般地，胺基酸由具有相似電荷、疏水性或立體化學特徵的相關胺基酸取代。此類取代將落入技術人員的普通技術之內。與CDRs中不同，在FRs中可進行更多的基本變化，而不會不利地影響抗體的結合性質。FRs的變化包括但不限於人源化非人來源的，或工程改造某些對於抗原接觸或對於穩定結合位點重要的構架殘基，例如，改變恆定區的類或亞類，改變可能變更效應子功能如Fc受體結合的特定胺基酸殘基，例如美國專利Nos.5,624,821和5,648,260以及Lund等(1991)J.Immun.1472657-2662和Morgan等(1995)Immunology 86319-324中所描述的那樣，或者改變可產生恆定區的物種。
本領域技術人員將會認識到上文所述的修飾並非是詳盡無遺的，並且在本發明公開內容的教導下，許多其它修飾對熟練技術人員而言將會是顯而易見的。
核酸、克隆和表達系統本發明公開內容還提供了編碼所公開的抗體的分離的核酸。所述核酸可包括DNA或RNA，並且可以是全部或部分合成或重組的。提及的如本文所示的核苷酸序列涵蓋了具有指定序列的DNA分子，並且涵蓋了具有指定序列且其中U取代了T的RNA分子，除非上下文另有要求。
本文提供的核酸包括本文公開的CDR、VH結構域和/或VL結構域的編碼序列。
本發明公開內容也提供了質粒、載體、噬菌粒、轉錄盒或表達盒形式的構建體，其包含編碼本文公開的CDR、VH結構域和/或VL結構域的至少一種核酸。
本發明公開內容還提供了包含上述一種或多種構建體的宿主細胞。
同樣提供的有編碼任何CDR(H1、H2、H3、L1、L2或L3)、VH或VL結構域的核酸，以及製備所述編碼產物的方法。所述方法包括由所述編碼核酸表達所述編碼產物。表達可通過在合適的條件下培養含所述核酸的重組宿主細胞實現。通過表達生產後，可利用任何合適的技術分離和/或純化VH或VL結構域或特異性結合成員，然後適當地使用。
抗原結合片段、VH和/或VL結構域、以及編碼核酸分子和載體可以以基本上純或均質的形式，由其天然環境中分離和/或純化，或者在核酸的情況下，除了編碼具有所需功能的多肽的序列之外，不含或基本上不含其他來源的核酸或基因。
用於在多種不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統是本領域眾所周知的。有關適合於生產抗體的細胞，見Gene Expression Systems，Academic Press，Fernandez等編，1999。簡言之，合適的宿主細胞包括細菌、植物細胞、哺乳動物細胞以及酵母和杆狀病毒系統。本領域可獲得的用於表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠骨髓瘤細胞等等。常見的細菌宿主為大腸桿菌(E.coli)。可利用任何與本發明相容的蛋白表達系統生產所公開的抗體。合適的表達系統包括Gene ExpressionSystems，Academic Press，Fernandez等編，1999中所描述的轉基因動物。
可選擇或構建合適的載體，從而它們含有合適的調控序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因以及其它適當的序列。載體可以是質粒或病毒，如適當的噬菌體或噬菌粒。有關更多細節，參見例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989。許多用於核酸操作的已知技術和方案在CurrentProtocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等編，JohnWiley Sons，1992中有詳細描述，例如，製備核酸構建體、誘變、測序、將DNA引入到細胞中和基因表達，以及蛋白分析。
本發明公開內容的另一方面提供了包含如此處所公開的核酸的宿主細胞。又在另一方面提供了包括將此核酸引入到宿主細胞中的方法。所述引入可採用任何可獲得的技術。對於真核細胞，合適的技術可包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質體介導的轉染以及使用逆轉錄病毒或其它病毒轉導，例如痘苗病毒，或者對昆蟲細胞而言使用杆狀病毒。對於細菌細胞，合適的技術可包括氯化鈣轉化、電穿孔以及使用噬菌體轉染。在將核酸引入到細胞中之後，可通過例如在基因表達的條件下培養宿主細胞而使得或允許由所述核酸表達。
使用方法所公開的抗-PD-1抗體能夠調節與PD-1相關的免疫應答的下調。在特別的實施方案中，所述免疫應答是由TcR/CD28介導的。所公開的抗體可作為PD-1的激動劑或拮抗劑起作用，這依賴於其使用方法。抗體可用於預防、診斷或治療哺乳動物尤其是人的醫學紊亂。本發明的抗體也可用於分離PD-1或表達PD-1的細胞。此外，所述抗體可用於治療處於紊亂危險之中或易感、或具有與異常PD-1表達或功能相關的紊亂的受試者。
本發明的抗體可用在用以誘導對特定抗原(如治療蛋白)的耐受的方法之中。在一個實施方案中，耐受是針對特定抗原通過共施用抗原和本發明的抗-PD-1抗體誘導的。例如，頻繁接受因子VIII的患者產生此蛋白的抗體；本發明的抗-PD-1抗體聯合重組因子VIII的共施用預期將導致針對此凝血因子的免疫應答的下調。
本發明的抗體能夠在可能期望免疫應答水平下降的情形下使用，例如，在某些類型的變應性或變態反應(如通過抑制IgE生產)，自身免疫病(如類風溼關節炎、I型糖尿病、多發性硬化、炎性腸病、Crohn氏病以及系統性紅斑狼瘡)，組織、皮膚和器官移植物排斥，以及移植物抗宿主疾病(GVHD)中。
當期望免疫應答減小時，本發明的抗-PD-1抗體可用作為PD-1激動劑，以增強與PD-1相關的免疫應答的弱化。在這些實施方案中，需要正信號(即由抗原受體如TcR或BcR介導的)和負信號(即PD-1)之間的共呈遞和物理鄰近性。優選的距離小於或與天然存在的呈遞抗原細胞的大小相當，也就是小於大約100μm；更優選地，小於大約50μm；並且最優選地，小於大約20μm。
在有些實施方案中，正(激活)和負(抑制)信號是由固定於固體支持物基質或載體上的配體或抗體提供的。在多種不同的實施方案中，固體支持物基質可由聚合物組成，如活化瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)。備選地，固體支持物基質可以是以矽石或塑料聚合物為基礎，如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯等。
可將所述基質植入到患者脾中。備選地，所述基質可用於離體溫育由患者獲得的T細胞，然後分離T細胞並植回到患者之中。所述基質也可由可生物降解的材料製成，例如聚乙醇酸、聚羥基鏈烷酸酯、膠原或明膠，從而它們能夠被注射到患者的腹膜腔中，並在注射後經過一段時間溶解。可對所述載體塑形以模擬細胞(如珠子或小球體)。
在有些實施方案中，正信號是由T細胞活化的結合TcR的抗-CD3抗體遞送的。活化抗-CD3抗體是本領域公知的(參見例如美國專利Nos.6,405,696和5,316,763)。活化TcR信號和負PD-1信號之間的比率是利用本領域公知的常規操作、或如實施例8、9和10中所述通過實驗確定的。
在某些情形下，可能期望引發或增強患者的免疫應答，以治療免疫紊亂或癌症。由所公開的方法治療或預防的紊亂包括但不限於微生物(如細菌)、病毒(如全身性病毒感染如流感、病毒性皮膚病如皰疹或帶狀皰疹)或寄生物感染；以及癌症(如黑素瘤和前列腺癌)。
用抗-PD-1抗體刺激T細胞激活增強了T-T細胞應答。在此類情況下，所述抗體作為PD-1拮抗劑起作用。從而，在有些實施方案中，可利用所述抗體抑制或降低與PD-1相關的下調活性，也就是與TcR/CD28介導的免疫應答的下調相關的活性。在這些實施方案中，所述抗體並不偶聯於正信號如TcR介導的刺激，例如所述抗體為其可溶、未結合支持物的形式。如實施例中所證明的那樣，阻斷PD-1/PD-L與拮抗性抗-PD-1抗體的相互作用導致增強的T細胞增殖應答，這與PD-1途徑在T-T相互作用中的下調作用一致。在各種實施方案中，所述抗體抑制PD-L與PD-1的結合，IC50小於10nM，並且更優選小於5nM，並且最優選小於1nM。PD-L結合的抑制可如實施例6中所述或使用本領域公知的技術測量。
本發明的抗體或抗體組合物以治療有效量施用。一般地，治療有效量可能隨受試者的年齡、狀況和性別、以及受試者醫學狀況的嚴重度而不同。抗體的治療有效量在從大約0.001到大約30mg/kg體重的範圍內變動，優選從大約0.01到大約25mg/kg體重，從大約0.1到大約20mg/kg體重，或者從大約1到大約10mg/kg。所述劑量可根據需要調整，以滿足所觀察到的治療效果。合適的劑量是由治療醫師根據臨床指徵選擇的。
所述抗體可作為大丸劑施用，以便在施藥後最大時間長度內使得抗體的循環水平最大化。在大丸劑施用後也可使用連續輸注。
也可從患者中分離免疫細胞(如激活的T細胞、B細胞或單核細胞)，並與本發明的抗體離體(ex vivo)溫育。在有些實施方案中，免疫應答可通過從受試者中取出免疫細胞，將所述免疫細胞與本發明的抗-PD-1抗體體外接觸，同時伴有免疫細胞的活化(如通過抗TcR和/或BcR抗原受體的抗體)進行抑制。在此類實施方案中，所述抗-PD-1抗體應當以多價的形式使用，從而免疫細胞表面上的PD-1分子經與此類抗體結合而成為「交聯的」。例如，可將所述抗-PD-1抗體結合到固體支持物如珠子上，或者介由第二抗體交聯。然後可利用本領域公知的方法分離免疫細胞並再植入到患者中。
在另一個方面，本發明的抗體可用作為靶向劑用於將另一種治療劑或細胞毒性劑(如毒素)遞送給表達PD-1的細胞。所述方法包括施用偶聯於治療劑或細胞毒性劑的抗-PD-1抗體，或在允許所述抗體與PD-1結合的條件下施用。
本發明的抗體也可用於檢測生物學樣品中PD-1的存在。所檢測的PD-1的量可能與PD-1的表達水平相關，其依次又與受試者中免疫細胞(如激活的T細胞、B細胞和單核細胞)的激活狀態相關。
採用抗體的檢測法是本領域眾所周知的，並且包括，例如，ELISA、放射免疫測定、免疫印跡、蛋白印跡、免疫螢光、免疫沉澱。所述抗體可在診斷試劑盒中提供，所述試劑盒合併了一種或多種這些技術以檢測PD-1。此種試劑盒可含有其它組分、包裝、說明書或其它材料，以輔助檢測所述蛋白。
當抗體旨在用於診斷目的時，可能期望修飾它們，例如用配體基團(例如生物素)或可檢測的標記基團(例如螢光基團、放射性同位素或酶)修飾。如果需要，可利用常規技術標記本發明的抗體。例如，合適的可檢測標記包括例如螢光團、發色團、放射性原子、電子密試劑、酶以及具有特異性結合配偶體的配體。酶一般通過其活性予以檢測。例如，辣根過氧化物酶可通過其將四甲聯苯胺(TMB)轉化為可由分光光度計定量的藍色色素的能力予以檢測。關於檢測，合適的結合配偶體包括但不限於生物素與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，IgG與蛋白A，以及本領域公知的眾多受體-配體對。其它改變和可能性對本領域普通技術人員將會是非常顯而易見的，並認為是本發明範圍內的等同物。
本發明的抗體可在篩選方法中用於鑑定能有效作為治療劑的PD-1途徑的抑制劑。在此篩選測定中，通過組合PD-1和本發明的抗體形成第一結合混合物；並測量所述第一結合混合物中的結合量(M0)。也通過組合PD-1、抗體、以及待篩選化合物或試劑形成第二結合混合物，並測量所述第二結合混合物中的結合量(M1)。待測化合物可以是另一種抗-PD-1抗體，如實施例中所舉例說明的那樣。然後比較所述第一及第二結合混合物中的結合量，例如，通過計算M1/M0比率進行比較。如果觀察到第二結合混合物中的結合與第一結合混合物相比下降，則認為所述化合物或試劑能夠調節與PD-1相關的免疫應答的下調。結合混合物的配製和優化落在本領域技術水平之內，此類結合混合物也可以含有必要的緩衝液和鹽以增強或優化結合，並且另外的對照測定可包含在本發明的篩選測定中。這樣可鑑定發現使PD-1抗體結合降低至少約10％(即，M1/M0＜0.9)、優選大於約30％的化合物，然後，如果需要，如下文所述在其它測定或動物模型中對其進行改善紊亂能力的第二次篩選。PD-1與抗體之間的結合強度可利用以下技術測量，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)，基於表面等離子體共振的技術(如Biacore)，這些全部都是本領域眾所周知的技術。
然後可如實施例中所述或在動物模型(一般地參見ImmunologicDefects in Laboratory Animals，Gershwin等編，Plenum Press，1981)中體外測試所述化合物，例如，如以下的動物模型SWR×NZB(SNF1)轉基因小鼠模型(Uner等(1998)J.Autoimmune.11(3)233-240)，KRN轉基因小鼠(K/B×N)模型(Ji等(1999)Immunol.Rev.169139)；SLE模型NZB×NZW(B/W)小鼠(Riemekasten等(2001)Arthritis Rheum.，44(10)2435-2445)；多發性硬化模型小鼠實驗性自身免疫性腦炎(EAE)(Tuohy等(1988)J.Immunol.1411126-1130，Sobel等(1984)J.Immunol.1322393-2401，以及Traugott，Cell Immunol.(1989)119114-129)；糖尿病NOD小鼠模型(Baxter等.(1991)Autoimmunity，9(1)61-67)等等)。
例如根據動物試驗所確定的初步劑量以及用於人類施用的劑量比例換算是根據本領域公認的操作進行的。毒性和療效可通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥學操作確定。由細胞培養物測定或動物研究獲得的數據可用於配製用於人的劑量範圍。在一個實驗動物模型中所達到的治療有效劑量可利用本領域公知的換算因子予以換算以用於另一個動物，包括人(參見如Freireich等(1966)CancerChemother.Reports，50(4)219-244)。
藥物組合物和施用方法本發明公開內容提供了包含抗-PD-1抗體的組合物。此類組合物可能適合於製藥用途以及向患者施用。所述組合物一般包括一種或多種本發明的抗體以及藥學上可接受的賦形劑。短語「藥學上可接受的賦形劑」包括與藥物施用相容的任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑以及吸收延遲劑等。此類介質和試劑對藥學活性物質的用途是本領域眾所周知的。所述組合物也可以含有其它提供補充的、附加的或增強的治療功能的活性化合物。所述藥物組合物也可連同施用說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。
本發明的藥物組合物被配製為與其期望的施用途徑相容。實現施用的方法是本領域普通技術人員公知的。例如，施用可以是靜脈內、腹膜內、肌內、腔內、皮下或經皮。也有可能獲得可局部或口服施用、或能夠跨黏膜輸送的組合物。
用於真皮內或皮下應用的溶液或懸浮液一般包括一種或多種如下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑如苄醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩衝液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調整張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或鹼調節，例如鹽酸或氫氧化鈉。此類製劑可封裝在由玻璃或塑料製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
適合於注射的藥物組合物包括無菌水溶液或分散體，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。對於靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、制菌水、Cremophor EL(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。在所有情況下，所述組合物必需是無菌的，並且應當是存在容易的可注射性程度的流體。它在製造和貯藏條件下應當是穩定的，並且必需抗微生物如細菌和真菌的汙染作用加以保存。微生物作用的預防可通過多種抗細菌劑和抗真菌劑實現，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，組合物中將優選包括等滲劑，例如糖，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇以及氯化鈉。載體可以是溶劑或分散介質，例如，含有水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及它們合適的混合物。例如，合適流動性可通過使用塗層如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑和/或通過使用表面活性劑得以維持。可注射組合物的延遲吸收可通過將延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠包含到組合物中實現。
口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食載體。可將它們封裝到明膠膠囊中或壓縮成片劑。為口服施用，可將抗體與賦形劑組合，並以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。藥學上相容的結合劑和/或佐劑材料可作為組合物的一部分包括在內。所述片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可含有如下任一成分或具有相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑如澱粉或乳糖；崩解劑如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化矽；增甜劑如蔗糖或糖精；或調味劑如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑(orange Havoring)。
全身性施用也可以是通過跨黏膜或經皮手段。為了跨黏膜或經皮施用，製劑中使用與待穿過的屏障相稱的滲透劑。此類滲透劑通常是本領域公知的，並且包括，例如去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。例如，跨黏膜施用可通過使用糖錠、鼻腔噴霧、吸入劑或栓劑完成。例如，在抗體包含Fc部分的情況下，組合物可能(如美國專利No.6,030,613中所述介由FcRn受體介導的途徑)能夠跨腸、口或肺黏膜輸送。對於經皮施用，可將活性化合物配製成如本領域普遍公知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏。為了通過吸入施用，可以氣霧劑噴霧的形式由壓縮容器或分配器遞送抗體，所述容器或分配器含有合適的推進劑例如氣體如二氧化碳或霧化器。
在某些實施方案中，本文公開的抗體與將會保護該化合物防止由體內迅速消除的載體一起製備，例如緩釋製劑，包括植入物和微囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。用於製備此類製劑的方法對本領域技術人員將會是顯而易見的。含有本文公開的抗體的脂質體懸浮液也可用作為藥學上可接受的載體。這些可根據本領域技術人員公知的方法製備，例如，如美國專利No.4,522,811中所述的那樣。
以劑量單位形式配製口服或腸胃外組合物可能是有利的，以易化施用和劑量的一致性。如本文所用的術語「劑量單位形式」是指適合作為待治療受試者的單位劑量的物理上不連續的單位；每個單位含有預定量的經計算與所需藥物載體相結合產生期望療效的活性化合物。
本發明組合物的毒性和療效可通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥學方法確定，例如用以確定LD50(對50％群體致死的劑量)和ED50(在50％群體中治療有效的劑量)的方法。毒性和療效之間的劑量比率是治療指數，且其可表達為LD50/ED50比率。優選呈現出大治療指數的組合物。
對於本發明中所用的任何組合物，治療有效劑量最初可由細胞培養物測定來估計。合適的生物測定的實例包括DNA複製測定、細胞因子釋放測定、基於轉錄的測定、PD-1/PD-L1結合測定、肌酸激酶測定、 基於前脂肪細胞(pre-adipocyte)分化的測定、基於脂肪細胞中葡萄糖吸收的測定、免疫學測定、其它例如實施例中所描述的測定。由細胞培養物測定和動物研究獲得的數據可用於配製用於人的劑量範圍。可在動物模型中配製劑量，以獲得包括IC50(即實現半數最大症狀抑制的抗體濃度)的循環血漿濃度範圍。例如，可通過高效液相層析測量血漿中的循環水平。可通過合適的生物測定監控任何特定劑量的效力。劑量優選處於具有少許毒性或無毒性的循環濃度的範圍內。劑量可依賴於所採用的劑型和所使用的施用途徑而變。
以下實施例並非以任何方式限制本發明的範圍。本領域普通技術人員將會認識到能夠進行眾多修改和變動而不會改變本發明的精神或範圍。此類修改和變動涵蓋在本發明的範圍之內。特此將本申請通篇所引述的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的全部內容併入作為參考。
實施例實施例1結合PD-1的ScFv的選擇利用擴大形式的由Vaughan等(Nature Biotech.(1996)14309-314)描述的1.38×1010文庫的scFv噬菌粒文庫選擇特異於人PD-1的抗體。將可溶性PD-1融合蛋白(20μg/ml的磷酸緩衝鹽水(PBS)溶液)或對照融合蛋白(50μg/ml的PBS溶液)塗覆到微量滴定板孔中，4℃過夜。孔在PBS中洗滌並在MPBS(3％奶粉的PBS溶液)中於37℃封閉1小時。將純化的噬菌體(1012轉導單位(tu))在終體積100μl的3％MPBS中封閉1小時。添加封閉的噬菌體到封閉的對照融合蛋白孔，並溫育1小時。然後將封閉且去選擇(deselect)的噬菌體轉移到塗覆有PD-1融合蛋白的封閉的孔中，並溫育另外一個小時。孔用PBST(含0.1％v/v Tween 20的PBS)洗滌5次，然後用PBS洗滌5次。洗脫結合的噬菌體顆粒，並用於感染10ml指數生長的大腸桿菌TG1。使感染的細胞在2TY液體培養基中於37℃生長1小時，然後塗布到2TYAG板上，並於30℃溫育過夜。將菌落從板上刮到10ml2TY液體培養基中，並加入15％甘油於-70℃貯存。
用輔助噬菌體超感染來自第一輪淘選的甘油原種培養物，並進行拯救(rescue)以產生表達scFv抗體的噬菌體顆粒，用於第二輪淘選。以這種方式總共進行兩輪淘選用於PD1-17的分離，除了在第二輪淘選中使用20μg/ml對照蛋白進行去選擇。在三輪選擇之後選到了克隆PD1-28、PD1-33和PD1-35。第二和第三輪的去選擇是利用10μg/ml對照融合蛋白進行的。
鼠PD-1抗體是利用終濃度為100nM的生物素化鼠PD-1融合蛋白通過可溶性選擇進行選擇的。使用了如上文所述的scFv噬菌粒文庫。對1ml 3％MPBS中的純化的scFv噬菌體(1012tu)封閉30分鐘，然後加入生物素化的抗原，並於室溫下溫育1小時。將噬菌體/抗原添加到250μl Dynal M280鏈黴抗生物素蛋白磁珠中，並室溫下再溫育15分鐘，所述磁珠業已在1ml 3％MPBS中於37℃封閉1小時。珠子利用磁架捕獲，並在1ml 3％MPBS/0.1％(v/v)Tween 20中洗滌4次，緊接著在PBS中洗滌3次。在末次PBS洗滌後，將珠子重懸於100μl PBS中，並用於感染5ml指數生長的大腸桿菌TG-1細胞。使感染的細胞於37℃溫育1小時(30分鐘靜止，30分鐘於250rpm振蕩)，然後塗布到2TYAG板上，並於30℃溫育過夜。將長出的菌落從板上刮下，並如上文所述拯救噬菌體。如上所述進行第二輪可溶性選擇。
實施例2通過噬菌體ELISA確定抗體對PD-1的特異性為確定抗體對PD-1的特異性，針對PD-1融合蛋白和對照蛋白進行了噬菌體ELISA。將來自選擇產物的個體大腸桿菌菌落挑取到每孔含100μl 2TYAG培養基的96孔板中。向指數生長的培養物中添加感染複數(moi)為10的M13K07輔助噬菌體，並將板於37℃溫育另外1小時。將板在臺式離心機中以2000rpm離心10分鐘。除去上清，並將細胞沉澱重懸於100μl 2TYAK中，並於30℃振蕩溫育過夜。第二天，將板、2000rpm離心10分鐘，並將來自各孔的含噬菌體的上清液轉移到新的96孔板中。在ELISA前，將噬菌體樣品在終濃度為3％的MPBS中封閉。
將溶於PBS的0.5-2.5μg/ml人或小鼠PD-1融合蛋白和對照融合以及非融合蛋白於4℃過夜塗覆到96孔微量滴定板上。塗覆後，從孔中除去溶液，並使板在3％MPBS中封閉1小時。用PBS衝洗板，然後向各孔添加50μl預封閉的噬菌體。將板溫育1小時，然後用PBST洗滌3次，緊接著用PBS洗滌3次。向各孔中加入50μl抗-M13-HRP綴合物(Pharmacia，Peapack，NJ)的1∶5000稀釋液，並將板溫育40-60分鐘。各板用PBST洗滌3次，然後用PBS洗滌3次。向各孔添加50μl TMB底物，並溫育樣品直至顯色。反應通過添加25μl 0.5M H2SO4終止。所產生的信號通過使用微量滴定板讀數器在450nm處讀取吸收度測量。表現出對PD-1融合蛋白而非對照融合蛋白的特異性結合的克隆從而得以鑑定和確認。
PD1-17scFv的特異性數據示於圖1A。PD1-28、PD1-33和PD1-35scFv與人PD-1的反應性示於圖1B(IgG1對照並不結合PD-1)。
實施例3抗體克隆的鑑定將結合PD-1的scFv的大腸桿菌克隆劃線到2TYAG板上，並於30℃溫育過夜。通過使用pCANTAB6載體序列寡核苷酸(oligos)擴增來自scFv克隆的VH和VL區對來自這些板的菌落進行測序。如實施例4中所述，測定了中和PD-L1與PD-1結合的獨特的結合PD-1的克隆。scFv和IgG形式之間的序列差異歸因於在由scFv轉化為IgG期間由PCR引物所引入的變化。
實施例4生化結合抑制測定和篩選通過向指數生長的培養物中添加1mM IPTG並於30℃溫育過夜來誘導ScFv生產。通過對來自過夜誘導的細菌沉澱進行滲透壓休克獲得粗製含scFv的周質提取物。將沉澱重懸於20％(w/v)蔗糖，50mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，並在冰上冷卻30分鐘。通過離心除去細胞碎片，並通過層析純化scFv，和將緩衝液交換成PBS。在96孔微量滴定板測定中測試了純化的scFv(PD1-17、PD1-28、PD1-33和PD1-35)抑制生物素化的PD-L1融合蛋白與固定在塑料上的人PD-1融合蛋白結合的能力。生物素化的PD-L1融合蛋白的結合是用AMDEX鹼性磷酸酶檢測的，並且所產生的信號是通過使用微量滴定板讀數器在405nm處讀取吸收度測量的。數據表達為總結合百分比，並試驗了scFv濃度的滴定以建立作為計算的IC50值的克隆效價(clone potency)。scFv和IgG抗體的克隆效價數據示於表5。
PD1-F2 scFv如上文所述生產和純化。以10s細胞/孔向聚-D-賴氨酸塗覆的96孔微量滴定板中加入終體積為100μl的表達鼠PD-1的細胞。將細胞離心，並在PBS中洗滌兩次，然後用300μl溶於PBS的1％BSA室溫下封閉1小時。封閉的細胞在PBST中洗滌三次，之後添加25μl/孔測定緩衝液(0.05％BSA，0.05％Tween 20，溶於Dulbecco氏PBS中)或樣品，接著是25μl 300ng/ml的生物素化鼠PD-L1融合蛋白。生物素化的PD-L1融合蛋白的結合是用Amdex鹼性磷酸酶檢測的，並且信號如上所述進行讀取。PD1-F2 scFv和IgG的效價示於表6。
表6抗-PD-1 ScFv和IgG抗體的效價
實施例5ScFv向IgG的轉化來自scFv克隆的重鏈和輕鏈V區是利用克隆特異性引物通過PCR擴增的。PCR產物用合適的限制酶消化並亞克隆到含人IgG1重鏈恆定結構域的載體中(Takahashi等(1982)Cell 29,671)或含人λ或κ輕鏈恆定結構域的載體中(Hieter等.(1982)Nature 294,536)。根據VH和VL區段的種系確定是否利用κ或λ輕鏈恆定結構域進行轉化(表7)。
表7PD-1抗體克隆VH和VL區的種系
質粒中V區結構域的插入是通過來自個體大腸桿菌菌落的質粒DNA的測序驗證的。通過標準技術由大腸桿菌培養物製備質粒，並利用標準技術將重鏈和輕鏈構建體共轉染到真核細胞中。利用A蛋白瓊脂糖凝膠(Pharmacia)純化分泌的IgG，並將緩衝液交換成PBS。
抗-小鼠PD1抗體PD1-F2的結合親和力是藉助表面等離子體共振(SPR)系統(BIAcore 3000)(Biacore，Piscataway，NJ)利用固定在CM5傳感晶片上的鼠PD-1融合物確定的。流動細胞中PD1-F2的濃度範圍從7.81到125nM變動，而抗-小鼠PD1抗體J43(eBioscience，San Diego，CA)的濃度範圍從25nM到500nM變動。PD1-F2的平衡常數KD是6.7×10-9M(KA＝1.5×108M-1)，而J43的KD是3.8×10-7M(KA＝2.6×106M-1)。
抗-PD-1 IgG結合人或鼠PD-1的能力測定如下。將ELISA板與2.5μg/ml人PD-1/IgG嵌合體溫育過夜。用PBS/1％BSA洗滌板，並與測試抗體的系列稀釋液在室溫(RT)下溫育2小時。洗滌後，添加飽和濃度的HRP綴合的山羊抗人抗體或HRP綴合的兔抗鼠抗體，並在室溫下溫育樣品1小時。未結合的山羊和兔抗體利用PBS/1％BSA洗滌。測定利用TBM顯色。結果表達為OD 405吸收度值，並示於圖2A-2C。鼠抗人PD-1抗體J110是商業上可獲得的(eBioscience，San Diego，CA)，並包含在內用於比較。
實施例6所選的PD-1抗體抑制PD-L1與PD-1的結合進行抑制測定以評估抗體阻斷PD-L1對PD-1的結合的能力。ELISA如實施例2中所述進行，並有改動。在與第一抗體抗-PD-1抗體室溫下溫育2小時後，添加固定濃度(1μg/ml)的生物素綴合的PD-L1-Ig，且樣品於室溫下再溫育1小時。洗滌後，添加飽和濃度的抗生物素蛋白-HRP，並在室溫下溫育1小時。未結合的抗生物素蛋白-HRP利用PBS/1％BSA洗滌。測定利用TMB顯色。
將結果與由J110獲得的結果進行比較，如圖3所示。抗人PD-1抗體J110和PD1-30並不抑制PD-L1與PD-1的結合。抗人抗體PD1-17、PD1-28、PD1-33和PD1-35以及抗小鼠抗體PD1-F2阻斷PD-1/PD-L1相互作用。
實施例7PD-1抗體識別PD-1上不同的位點進行抑制測定以對由多種人抗人PD-1抗體所識別的位點進行作圖。ELISA如實施例6中所述進行，並稍加改動。在與第一抗體室溫下溫育2小時後，添加固定濃度(0.25μg/ml)的生物素綴合的抗-PD-1抗體J110，且樣品於室溫下再溫育1小時。洗滌後，添加飽和濃度的抗生物素蛋白-HRP，並在室溫下溫育1小時。未結合的抗生物素蛋白-HRP利用PBS/1％BSA洗滌。測定利用TMB顯色。
如圖4所示，抗人PD-1抗體(J110、J116、PD1-17、PD1-28、PD1-33和PD1-35)的結合限定了PD-1上至少兩個不同的位點。交叉阻斷結果顯示J110和J116與完全相同或重疊的位點結合，而PD1-17、28、33和35與另一不同的位點結合。J116或J110對PD-1的結合阻斷了J110的結合。相反，PD1-17、PD1-28、PD1-33和PD1-35的結合併不阻斷J110的結合。這提示所測試的抗-PD-1抗體與至少兩個不同的表位結合一個被J110和J116識別，而另一個被PD1-17、PD1-28、PD1-33和PD1-35識別。
實施例8PD-1接合導致T細胞應答下降CD4+T細胞(5×104細胞/孔)用塗覆有抗hCD3+/-PD-L1-Fc或抗-PD-1(PD1-17或J110)的甲苯磺醯珠(Dynal，Great Neck，NY)刺激。融合蛋白的濃度或抗體效價如圖5的X軸所示。72小時後，通過3H-胸苷摻入測定增殖。摻入的放射性利用LKB1205板讀數器測定。
如圖5所示，抗-PD-1抗體PD1-17或PD-L1.Fc對PD-1的接合導致T細胞增殖下降。從而，PD1-17能夠模擬PD-1配體並遞送抑制信號。如下文所討論的那樣(實施例9)，該抑制信號導致T細胞增殖和IL-2生產下降。抗體PD1-28、PD1-33和PD1-35具有與PD1-17相同的效應。所述效應是劑量依賴性的，因為在存在漸增濃度的PD1-17或PD-L1.Fc時細胞的激活導致T細胞增殖下降。對照抗-PD-1抗體J110(圖5)或J116(數據未顯示)並不抑制T細胞應答，並且提高J110的濃度對T細胞增殖具有極微的影響。為了比較，數值表示為抗-CD3應答的百分比。「100％」表示當細胞由抗-CD3/鼠IgG塗覆的小球體激活時所獲得的CPMs。總而言之，這些結果表明有些但並非所有識別PD-1的抗體都可作為PD-1途徑的激動劑起作用。
進行了更多的實驗以弄清楚PD-1對T細胞應答的下調是否需要TcR/PD-1協同接合到單個(順式(CIS))或不同(反式(TRANS))的細胞表面上。製備了兩組小球體一組含有抗-CD3和PD-L1.Fc(順式)，另一組含有抗-CD3或PD-L1.Fc(反式)。僅僅在PD-1和TcR兩者都在相同表面(順式)上被配體接合的條件下觀察到通過PD-1的抑制。在測試的所有珠細胞比率下，在TCR和PD-1信號被遞送到不同的表面(反式)的條件下沒有觀察到抑制。
為排除反式實驗中的空間位阻，利用抗-CD3抗體和B7.2.Fc設置了相似的測定。在這些測定中，在順式和反式條件下都觀察到T細胞應答的B7共刺激。總而言之，這些發現證明接近於TCR的PD-1是對T細胞激活的受體調節功能所必需的。因此，為調節T細胞應答，激活和抑制信號必須都由相同表面發出，無論所述表面是細胞的表面或是珠子的表面。
實施例9抗體對PD-1接合的阻斷導致增殖提高為評估可溶性抗-PD-1抗體對增殖的影響，用抗-CD3/抗-CD28塗覆的珠子預活化CD4+T細胞48小時，收穫，並在PD1-17、J110或對照IgG的存在下用所示濃度的PHA加10ng/ml IL-2再刺激。在開始培養時，以多種濃度添加各抗體。在72小時測量增殖。
結果證明PD1-17(圖6)和PD1-35(數據未顯示)促進了原代T細胞的增殖。對照抗體J110並不促進體外T細胞應答。所選的抗-PD1抗體，如由PD1-17和PD-35所例示的那樣，抑制PD-1與其天然配體的相互作用，由此阻斷負信號的遞送。負信號的阻斷也導致增殖和IL-2生產提高。
實施例10紊亂的治療由PD-1調控的免疫應答的調節可用於期望免疫抑制效果或免疫應答增強的情形。本實施例描述了PD-1抗體作為PD-1激動劑或拮抗劑用於治療分別處於疾病發作或具有確定的免疫紊亂或癌症的受試者的用途。
可能需要免疫應答增強的、處於癌症危險之中或患有癌症的受試者將會得益於PD-1拮抗劑的治療，例如可溶形式的本發明的抗-PD-1抗體。最常見的，在門診病人的環境下，以每周一次通過緩慢靜脈內輸注施用大約0.1-10mg/kg劑量的抗體。拮抗劑合適的治療有效劑量是由治療醫師選擇的，並且將在大約從1μg/kg到20mg/kg、從1μg/kg到10mg/kg、從1μg/kg到1mg/kg、從10μg/kg到1mg/kg、從10μg/kg到100μg/kg、從100μg到1mg/kg，以及從500μg/kg到5mg/kg的範圍內變動。
也利用所述抗體預防和/或減輕涉及異常或不期望的免疫應答的疾病或狀況的嚴重度和/或症狀，例如在下文所例示的自身免疫紊亂中。
多發性硬化(MS)是中樞神經系統疾病，它以髓鞘的炎症和喪失為特徵。在用於多發性硬化的實驗性自身免疫性腦炎(EAE)小鼠模型中(Tuohy等(J.Immunol.(1988)1411126-1130)，Sobel等(J.Immunol.(1984)1322393-2401)，以及Traugott(Cell Immunol.(1989)119114-129)，在誘發EAE之前(並且是連續地)用PD-1激動劑治療小鼠預期將預防或延遲MS的發作。
關節炎是以關節中的炎症為特徵的疾病。在用於類風溼關節炎的膠原誘發的關節炎(CIA)小鼠模型中(Courtenay等(Nature(1980)283666-628)和Williams等(Immunol.(1995)84433-439))，用PD-1激動劑治療預期將預防或治療類風溼關節炎(RA)或其它關節炎疾病。
系統性紅斑狼瘡(SLE)是以自體抗體的存在為特徵的自身免疫病。本發明的抗體和組合物可用作PD-1激動劑抑制自體反應性T細胞和B細胞的活性，並預防或治療NZB×NZW小鼠(SLE小鼠模型)(Immunologic Defects in Laboratory Animals，Gershwin等編，Plenum Press，1981)或人的SLE或相關疾病。
預期本發明的PD-1抗體在離體治療中將以每月一次或更低的頻率作為PD-1激動劑施用。治療持續時間將在一個月和數年之間的範圍內變動。
為測試人體內所述抗體的臨床功效，鑑定了患有黑素瘤、前列腺癌、RA、SLE、MS、I型糖尿病的個體並隨機化到治療組中。治療組包括安慰組和一到三個用PD-1激動劑(不同劑量)治療的組。預期將對個體隨訪1至3年。預期接受治療的個體將表現出改善。
根據本說明書內所引述的參考文獻的教導，本說明書得到了最為徹底的理解，特此將它們全部全文併入作為參考。本說明書內的實施方案提供了本發明的實施方案的舉例說明，而不應當解釋為限制本發明的範圍。熟練技術人員認識到許多其它實施方案為所請求保護的發明所涵蓋，並期望本說明書和實施例僅僅被認為是例示性的，而本發明真正的範圍和精神是由如下權利要求表示的。
序列表110Collins，Mary et al.
120抗PD-1抗體及其用途13008702.6098-0000016058170PatentIn version 3.12101211384212DNA213智人(Homo sapiens)4001caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga gtggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60acctgcgcta tttctggtgg ctccatcggc tctggtggct ccatcagaag tactaggtgg 120tggagttggg tccgccagtc cccagggaag gggctggagt ggataggcga aatctatcat 180agtgggagca ccaactacaa cccgtccctc aagagtcgcg tcaccatatc actagacaag 240tctaggaatc acttctccct gaggctgaac tctgtgaccg ccgcggacac ggccgtttat 300tactgtgcga gacaggacta cggtgactcc ggcgactggt acttcgatct gtggggcaag 360gggacaatgg tcaccgtctc ctca3842102211128212PRT213智人(Homo sapiens)4002Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Lys Pro Ser Gly1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Gly
20 25 30Gly Ser Ile Arg Ser Thr Arg Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro35 40 45Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr50 55 60Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Val Thr Ile Ser Leu Asp Lys65 70 75 80Ser Arg Asn His Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp85 90 95Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asp Tyr Gly Asp Ser Gly Asp100 105 110Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120 1252103211330212DNA213智人(Homo sapiens)4003aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactctg tgcagtggta ccagcagcgc 120ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac cgtctctgga 240ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt ctgatagcag cgctgtggta 300ttcggcagtg ggaccaagct gaccgtccta 3302104211110212PRT213智人(Homo sapiens)
4004Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys1 5 10 15Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn20 25 30Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val35 40 45Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly65 70 75 80Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Asp Ser85 90 95Ser Ala Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 1102105211357212DNA213智人(Homo sapiens)4005gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtc 60tcctgcaagg cttctggtta cagatttacc agctacggca tcagctgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactac 180gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgaa cacagcctac 240atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagacgcg 300gattatagta gtgggtctgg gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca3572106211119212PRT
213智人(Homo sapiens)4006Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr20 25 30Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ala Asp Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1152107211324212DNA213智人(Homo sapiens)4007tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60acctgttctg gagatgcatt gccaaagcaa tatgcttatt ggtaccagca gaagccaggc 120caggcccctg tgatggttat atataaagac actgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180ttctctggct ccagctcagg gacaaaagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240gacgaggctg actattattg tcaatcagca gacaacagta ttacttatag ggtgttcggc 300ggagggacca aggtcaccgt ccta324
2108211108212PRT213智人(Homo sapiens)4008Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala20 25 30Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Met Val Ile Tyr35 40 45Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Thr Lys Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Asn Ser Ile Thr Tyr85 90 95Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu100 1052109211357212DNA213智人(Homo sapiens)4009caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaaac ctggggcctc agtgagggtt 60tcctgcaagg catctggata caccctcacc agttactata ttcactgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gaggtgccac cataagctac 180gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag tacagtctac 240atggaactga gaaacttgaa atctgaggac acggccctgt attactgtgc tactgcaggc 300
atctatggtt ttgactttga ctactggggc agaggaaccc tggtcaccgt ctcctca 35721010211119212PRT213智人(Homo sapiens)40010Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr20 25 30Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Asn Pro Arg Gly Ala Thr Ile Ser Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Thr Ala Gly Ile Tyr Gly Phe Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser11521011211333212DNA213智人(Homo sapiens)40011cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctgggcagtc gatcaccatc 60tcctgcactg gaaccagtaa tgacgttggt ggttataatt atgtctcctg gtaccaacat 120
cacccaggca aagcccccaa actcatcatt tatgatgtca ctaaccggcc ctcaggggtt 180tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240ctggctgagg acgagggtga ttattactgc agctcataca caattgttac caatttcgag 300gttcttttcg gcggagggac caagctgacc gtc 33321012211111212PRT213智人(Homo sapiens)40012Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Ile Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phc50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Leu Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ile Val85 90 95Thr Asn Phe Glu Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val100 105 11021013211381212DNA213智人(Homo sapiens)40013caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgctt attactggag ctggatccgc 120cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacaatgg gaacacgtac 180tacaacccgt ccctcaggag tctagttacc atatcagtag acgcgtctaa gaaccagttc 240tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgagagcg 300tctgattacg tttggggggg ttatcgttat atggatgctt ttgatatctg gggccgggga 360accctggtca ccgtctcctc a 38121014211127212PRT213智人(Homo sapiens)40014Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Arg Ser Leu Val Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Ala Ser Asp Tyr Val Trp Gly Gly Tyr Arg Tyr Met Asp100 105 110Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser115 120 125
21015211336212DNA213智人(Homo sapiens)40015cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60tcttgttctg gaagcaactc caacatcgga agtaattctg taaactggta ccagcagctc 120ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat ggtaataatc agcggccctc aggggtccct 180gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240tctgagaatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtccggta 300ttcggccgag ggaccaaggt caccgtccta ggtgag 33621016211112212PRT213智人(Homo sapiens)40016Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn20 25 30Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asn Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Glu100 105 1102101721112212PRT213智人(Homo sapiens)40017Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Thr Arg Trp Trp Ser1 5 102101821116212PRT213智人(Homo sapiens)40018Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 152101921113212PRT213智人(Homo sapiens)40019Gln Asp Tyr Gly Asp Ser Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Leu1 5 102102021113212PRT213智人(Homo sapiens)40020Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Ser Val Gln1 5 1021021
2117212PRT213智人(Homo sapiens)40021Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser1 5210222119212PRT213智人(Homo sapiens)40022Gln Ser Ser Asp Ser Ser Ala Val Val1 5210232115212PRT213智人(Homo sapiens)40023Ser Tyr Gly Ile Ser1 52102421117212PRT213智人(Homo sapiens)40024Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln1 5 10 15Gly2102521110212PRT213智人(Homo sapiens)
40025Asp Ala Asp Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Tyr1 5 102102621111212PRT213智人(Homo sapiens)40026Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr1 5 10210272117212PRT213智人(Homo sapiens)40027Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser1 52102821111212PRT213智人(Homo sapiens)40028Gln Ser Ala Asp Asn Ser Ile Thr Tyr Arg Val1 5 10210292115212PRT213智人(Homo sapiens)40029Ser Tyr Tyr Ile His
1 52103021117212PRT213智人(Homo sapiens)40030Ile Ile Asn Pro Arg Gly Ala Thr Ile Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly2103121110212PRT213智人(Homo sapiens)40031Ala Gly Ile Tyr Gly Phe Asp Phe Asp Tyr1 5 102103221114212PRT213智人(Homo sapiens)40032Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser1 5 10210332117212PRT213智人(Homo sapiens)40033Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser1 5
2103421112212PRT213智人(Homo sapiens)40034Ser Ser Tyr Thr Ile Val Thr Asn Phe Glu Val Leu1 5 10210352117212PRT213智人(Homo sapiens)40035Ser Gly Ala Tyr Tyr Trp Ser1 52103621116212PRT213智人(Homo sapiens)40036Tyr Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser1 5 10 152103721117212PRT213智人(Homo sapiens)40037Ala Ser Asp Tyr Val Trp Gly Gly Tyr Arg Tyr Met Asp Ala Phe Asp1 5 10 15Ile21038
21113212PRT213智人(Homo sapiens)40038Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Asn1 5 10210392117212PRT213智人(Homo sapiens)40039Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser1 52104021111212PRT213智人(Homo sapiens)40040Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val1 5 1021041211288212PRT213智人(Homo sapiens)40041Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln1 5 10 15Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp20 25 30Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val50 55 60Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala65 70 75 80Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg85 90 95Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg100 105 110Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu115 120 125Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val130 135 140Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro145 150 155 160Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly165 170 175Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys180 185 190Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro195 200 205Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly210 215 220Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro225 230 235 240Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly245 250 255Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg260 265 270Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu275 280 285
21042211320212DNA213智人(Homo sapiens)40042gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120cctggaaggc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac 180aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt 240cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300cccctacaga atgttcatag 32021043211106212PRT213智人(Homo sapiens)40043Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser1 5 10 15Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp20 25 30Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro35 40 45Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn50 55 60Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys65 70 75 80Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser100 10521044211960212DNA213智人(Homo sapiens)40044cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 720tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 96021045211330
212PRT213智人(Homo sapiens)40045Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu225 230 235 240Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr245 250 255Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 33021046211366212DNA213智人(Homo sapiens)40046ggcgcgcact ccgaggtgca gctggtgcag tctgggggag gcgtggttca gcctgggagg 60tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga ttcaccttta gtagctattg gatgagctgg 120gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 180agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caattccaag 240aacacgctgt atctgcaaat gaacagccta agagccgagg acacggccgt atattactgt 300gcgaaagaga actggggatc gtacttcgat ctctgggggc aagggaccac ggtcaccgtc 360tcctca36621047
211125212PRT213智人(Homo sapiens)40047Gly Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val1 5 10 15Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr20 25 30Phe Ser Ser Tyr Trp Cys Asp Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro35 40 45Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser50 55 60Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp65 70 75 80Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu85 90 95Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Asn Trp Gly Ser Tyr Phe100 105 110Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 12521048211332212DNA213智人(Homo sapiens)40048ggcgtgcact ccgacatcgt gatgacccag tctccttcca ccctgtctgc atctgtagga 60gacagagtca ccatcacttg ccgggccagt cagggtatta gtagctggtt ggcctggtat 120cagcagaaac cagggagagc ccctaaggtc ttgatctata aggcatctac tttagaaagt 180ggggtcccat caaggttcag cggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 240
agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac tactgtcaac agagttacag taccccgtgg 300acgttcggcc aggggaccaa gctggaaatc aa 33221049211112212PRT213智人(Homo sapiens)40049Gly Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser1 5 10 15Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly20 25 30Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro35 40 45Lys Val Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr85 90 95Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110210502116212PRT213智人(Homo sapiens)40050Ser Ser Tyr Trp Met Ser1 5
2105121117212PRT213智人(Homo sapiens)40051Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly210522119212PRT213智人(Homo sapiens)40052Glu Asn Trp Gly Ser Tyr Phe Asp Leu1 52105321111212PRT213智人(Homo sapiens)40053Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10210542117212PRT213智人(Homo sapiens)40054Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser1 5210552119
212PRT213智人(Homo sapiens)40055Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr1 521056211288212PRT213Murine40056Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln1 5 10 15Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp20 25 30Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala35 40 45Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met50 55 60Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala65 70 75 80Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln85 90 95Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp100 105 110Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu115 120 125His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val130 135 140Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala165 170 175Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val180 185 190Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp195 200 205Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala210 215 220Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro225 230 235 240Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly245 250 255Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln260 265 270Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu275 280 28521057211321212DNA213智人(Homo sapiens)40057actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgtta g 321
21058211108212PRT213智人(Homo sapiens)40058His Met Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp1 5 10 15Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn20 25 30Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu35 40 45Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp50 55 60Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr65 70 75 80Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser85 90 95Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 10權利要求
1.抗體，其包含如SEQ ID NO19、SEQ ID NO25、SEQ ID NO31、SEQ ID NO37或SEQ ID NO52中所示的胺基酸序列。
2.權利要求1的抗體，其包含基本上如SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO47或SEQ ID NO49中所示的胺基酸序列。
3.權利要求1的抗體，其包含選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO47和SEQ ID NO49的胺基酸序列。
4.權利要求1的抗體，其中抗體與這樣的胺基酸序列特異性結合，所述胺基酸序列與任何選自SEQ ID NO41和SEQ ID NO56的至少一個序列的至少100個鄰接胺基酸的序列具有至少95％的同一性。
5.權利要求1的抗體，其中抗體與PD-1的胞外結構域特異性結合，其親和常數大於107M-1。
6.權利要求4的抗體，其中抗體抑制PD-L與PD-1的結合，其IC50低於10nM。
7.權利要求1的抗體，其中抗體是人的。
8.權利要求1的抗體，其中抗體為IgG1或IgG4。
9.權利要求8的抗體，其中抗體為IgG1λ或IgG1κ。
10.權利要求1的抗體，其中抗體為PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35或PD1-F2。
11.藥物組合物，其包含權利要求1的抗體。
12.治療方法，其包括施用有效劑量的權利要求11的藥物組合物。
13.權利要求12的方法，其中向這樣的受試者施用所述藥物組合物，所述受試者需要治療或預防選自自身免疫紊亂、針對移植物的免疫應答、變態反應和癌症的紊亂。
14.權利要求12的方法，其中受試者是人。
15.抗體，其包括人構架區以及用於與PD-1特異性結合的部件，其中所述抗體能夠阻斷PD-1和PD-L1之間的結合。
16.權利要求15的抗體，其中所述部件包括衍生自PD1-17、PD1-28、PD1-33、PD1-35或PD1-F2的CDR。
17.分離的核酸，其編碼權利要求1的抗體。
18.表達載體，其包含權利要求17的核酸。
19.宿主細胞，其包含權利要求18的載體。
20.權利要求19的宿主細胞，其中宿主細胞選自大腸桿菌、中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞和NSO細胞。
21.權利要求17的核酸，其中核酸編碼SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO47或SEQ ID NO49中所示的胺基酸序列。
22.權利要求21的核酸，其中核酸包含選自SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO46和SEQ ID NO48的核苷酸序列。
23.製備與PD-1特異性結合的抗體的方法，該方法包括(a)提供編碼可變結構域的起始核酸所有組成成分，其中可變結構域包括將要被取代的CDR3或者缺失CDR3編碼區；(b)將所述所有組成成分與編碼基本上如SEQ ID NO19、SEQ IDNO25、SEQ ID NO31、SEQ ID NO37或SEQ ID NO52中所示的胺基酸序列的供體核酸組合，從而將供體核酸插入到所述所有組成成分的CDR3區，以提供編碼可變結構域的核酸的產物所有組成成分；(c)表達產物所有組成成分的核酸；(d)選擇特異於PD-1的抗原結合片段；和(e)回收該特異性抗原結合片段或者編碼該結合片段的核酸。
24.通過權利要求23的方法生產的抗體。
25.調節適應性免疫應答的方法，包括使淋巴細胞與抗-PD-1抗體接觸。
26.權利要求25的方法，其中淋巴細胞為T細胞、B細胞或單核細胞。
27.權利要求25的方法，其中抗體如權利要求1中所述。
28.權利要求25的方法，其中抗體如權利要求24中所述。
29.權利要求25的方法，其中抗體固定在支持物基質上或者是交聯的。
30.權利要求25的方法，其中支持物基質包括選自瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、PVDF、矽石、尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚羥基鏈烷酸酯、膠原和明膠的一種或多種材料。
31.權利要求25的方法，其中抗-PD-1抗體調節由抗原受體介導的免疫細胞應答。
32.權利要求31的方法，其中抗原受體信號和抗-PD-1抗體一起共呈遞。
33.權利要求31的方法，其中抗原受體信號和抗-PD-1抗體間隔不大於100μm。
34.權利要求31的方法，其中抗原受體信號是通過抗-CD3抗體遞送的。
全文摘要
本發明公開內容提供了能夠作為PD－1(程序性死亡1)激動劑和/或拮抗劑的抗體和抗原結合片段，由此總體調節免疫應答，特別是由TcR和CD28介導的那些免疫應答。所公開的組合物及方法可用於例如治療自身免疫病、炎性疾病、變態反應、移植物排斥、癌症以及其它免疫系統紊亂。
文檔編號A61K39/395GK1753912SQ200380109929
公開日2006年3月29日 申請日期2003年12月22日 優先權日2002年12月23日
發明者M·科林斯, C·伍德, B·卡雷諾, V·瓦爾格-阿切爾, D·盧克森伯格, J·朱西夫, C·拉塞爾, L·L·卡特, F·本內特, J·安德魯斯 申請人:惠氏公司, 劍橋抗體科技有限公司