一種短肽及其製備方法和在診斷或治療與pacap、vip相關疾病中的應用的製作方法

2023-11-06 06:10:22 1

專利名稱：一種短肽及其製備方法和在診斷或治療與pacap、vip相關疾病中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有藥理作用的多肽，具體涉及一種短肽及其製備 方法和在診斷或治療與PACAP、 VIP相關疾病中的應用。
背景技術：
垂體腺苷酸環化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)是1989年發現的，由腦垂體分泌的具有重要生物學功 能的神經多肽，屬於是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。
PACAP在動物進化過程中相當保守，脊椎動物青蛙和人的PACAP只有2 個胺基酸的差異，顯示PACAP執行關鍵的生理學功能。PACAP及其受體 (PAC1、 VPAC1和VPAC2)在機體分布及其廣泛，不僅分布於中樞神經系統、 周圍神經系統，而且在非神經組織內也廣泛存在，如腦、睪丸、卵巢、呼吸道、 肺、胰腺、脂肪組織等。
目前已證實PACAP具有神經遞質/調質、保護神經細胞；促進激素分泌， 調節內分泌平衡；調節性腺功能和生殖細胞的產生；參與消化活動，調節能量 代謝平衡；參與調節免疫系統等生物學功能。
體內的PACAP有兩種形式PACAP27和PACAP38， PACAP27是PACAP38 的N端27個胺基酸。體內PACAP在二基肽酶(dipeptidylpeptidase， IVDPP IV)的 作用下失去N端的五個胺基酸——His-Ser-Asp-Gly-Ile形成的PACAP(6—27) 和PACAP(6—38)是PACAP的拮抗劑。因此PACAP的N端五個胺基酸組成的短肽(His-Ser-Asp-Gly-Ile)對於維持PACAP的活性和功能是非常重要的。目前 尚未有用線性五肽His-Ser-Asp-Gly-Ile調控PACAP以及VIP活性的報導。
與PACAP有高度同源性的血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP) 也具有和PACAP相似的N端，而且VIP同PACAP—樣都受到二基肽酶的降解從 而成為自身的拮抗劑，因此His-Ser-Asp-Gly-Ile也具有調控體內VIP活性的作 用。
然而線性五肽在體內非常不穩定，相反環肽主鏈呈環狀結構，具有一定的 構象約束作用，其構象相對線型肽有一定的穩定性，其抗酶解能力比線型肽強， 所以可以考慮將His-Ser-Asp-Gly-Ile環化後提高其在體內的穩定性以及抗酶解 能力。目前尚未有將His-Ser-Asp-Gly-Ile環化後調控PACAP以及VIP活性的報導。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種能有效幹預體內 PACAP、 VIP等神經肽的活性，逆轉PACAP(6-27)或PACAP(6-38)的拮抗功會巨， 從而協助體內的PACAP、 VIP發揮多種重要生物學功能的，構象穩定且抗酶 解能力強的短肽。
本發明的另一個目的是提供將上述短肽製成穩定性好的環七肽。 本發明的另一個目的在於提供上述環七肽的製備方法。 本發明的進一步目的在於提供上述短肽或環七肽在診斷或治療與 PACAP、 VIP相關的疾病中的應用。
本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的
本發明經過大量的研究發現，短肽組氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸(His-Ser-Asp-Gly-Ile)對於維持APCAP、 VIP的活性和功能是非常重要的， 然而這五肽的線性結構使得其在體內非常不穩定。為了在克服該問題，本發明 通過在該五肽的兩端設計一些胺基酸或基團(如半胱氨酸或甲基)，使得生成 後的肽鏈為環肽結構，則不但能起到調節APCAP、 VIP活性的作用，又能保證 肽鏈在體內的構象穩定，以及較強的抗酶解能力。
本發明優選半胱氨酸對五肽進行環化，實現從線性多肽到環肽結構的轉 換。在His-Ser-Asp-Gly-Ile的兩端分別添加半胱氨酸Cys，首尾兩個半胱氨酸的 巰基形成分子內二硫鍵，從而生成構象穩定且能有效抵抗氨肽酶和羧肽酶酶解 的環七肽。其結構式為環-(半胱氨酸-組氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨 酸-半胱氨酸)cyclo- (Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys)。
在多肽合成中，每生成一個肽鍵，都需要經過官能團保護、縮合、去保護 等操作步驟，加上每一步產物的分離純化，操作相當複雜而且費時，因此現在 多釆用固相合成法進行多肽的合成。
固相合成法有兩種，即Fmoc和tBoc，由於Fmoc比tBoc存在更多優勢，所 以大多又採用Fmoc法合成多肽。
本發明環七肽的合成採用固相合成法，優選Fmoc法。
本發明環七肽的合成方法包括如下步驟
(1) 以Fmoc胺基酸為原料，採用固相合成法，獲得直鏈肽；
(2) 直鏈肽的環化；
(3) 用切割試劑切割脫離樹脂得到粗產品，反相高效液相色譜純化得到環 七肽。
上述步驟(1)中，固相合成法所採用的縮合劑為TBTU/HOBT/DIEA複合縮合劑；TBTU: 0-(7-偶氮苯並三氮唑-l-氧)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
HOBT: N-羥基苯並三唑；DIEA: N，N'-二異丙基乙胺；該TBTU/HOBT/DIEA
複合縮合劑為Fmoc法中常用的縮合劑，其配方以及用量均為本領域技術人員 共知的，此處的Fmoc法也是本領域的通用方法，其操作方法可參考相關教科 書。
上述步驟(2)中，直鏈肽的環化是剪切前在樹脂上進行的，如直鏈 Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys的環化就是在剪切前，對Fmoc保護的巰基進行樹 脂上的氧化，從而將線性五肽轉變成環七肽結構；氧化劑可以為任意一種氧化 劑，如12、 H202、 Hg"鹽、K3Fe(CN)6、三氟乙酸鉈T"tfa)3、氯矽烷-碸類氧化 劑或二甲基亞碸DMSO等。
上述步驟(2)， (3)中的直鏈肽環化，切割試劑切割以及反向高相液相色 譜RP-HPLC純化等步驟均為本領域的常規技術。
動物實驗結果表明本發明的環七肽能有效幹預體內PACAP的活性，提 高PACAP介導的生物學功能，還可以與天然拮抗劑PACAP(6-27)或PACAP(6-3 8) 互補，逆轉其拮抗作用，促進激動作用，提高體內PACAP對受體的激動力和 作用時效，目前還沒有類似作用機制的報導。
由於血管活性腸肽VIP與PACAP具有高度同源性，並且具有相似的N端， 所以本發明的環七肽也具有調控體內VIP活性的作用。
因此，本發明的環七肽可以用於診斷以及治療與PACAP、 VIP相關的疾病， 由於PACAP、 VIP在生物進化過程中非常保守，具有廣泛而重要的生物功能， 所以本發明環七肽可能治療的疾病覆蓋神經系統、內分泌系統、消化與能量代 謝、心血管循環、生殖系統與免疫系統，如糖尿病(包括I型、II型)、肥胖、肥胖相關疾病、代謝障礙、代謝相關綜合症、腦損傷、腦缺血、防止神經細胞 死亡、受損神經細胞保護及再生、抗炎、男性陽痿、性冷淡、不孕不育、女性 性功能障礙，神經痛、神經病、神經混亂、焦慮症、精神病，記憶損傷、痴呆、 認知混亂、中樞神經系統疾病、偏頭痛、神經畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖 維化、動脈硬化、肌畏縮症、胃潰瘍、高血壓、內毒性休克、血栓症、視網膜 病變、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭、腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞增殖等。 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1. 本發明的環七肽，包括His-Ser-Asp-Gly-Ile序列，從而能夠特異地調節體 內PACAP、 VIP的活性，同時也可逆轉體內的PACAP(6-38)及PACAP(6-27)的拮
抗作用，具有廣闊的應用前景和較高的應用價值；
2. 本發明的環七肽，採用在His-Ser-Asp-Gly-Ile序列的兩端添加胺基酸或基 團，如在兩端分別添加半胱氨酸，利用半胱氨酸的分子間二硫鍵形成環狀結構， 從而保證了整個環七肽在體內構象的穩定，以及有效的抗酶解能力，也保證了 His-Ser-Asp-Gly-Ile活性肽在體內穩定地發揮其調節PACAP、 VIP的活性的功 能；
3. 本發明的環七肽採用固相合成法，最初反應物和產物都是連接在固相載 體上，因此可在一個反應容器中進行所有的反應，便於自動化操作，加入過量 的反應物可以獲得高產率的產物，同時產物很容易分離；
4. 本發明的環七肽能夠有效補償和逆轉PACAP(6-3 8)和PACAP(6-27)對 PACAP的拮抗作用，變拮抗作用為激動作用；因此可有效幹預體內PACAP的 整體作用和代謝水平。目前還沒有類似作用機制的報導。
5. 本發明的環七肽能夠用於診斷以及治療與PACAP、 VIP相關的疾病，鑑於PACAP、 VIP在生物進化過程非常保守，而且具有廣泛而重要的生物功能，
因此環七肽的醫用價值高，而且該環七肽通過操作簡單的固相合成法即可以獲
得，因此具有很廣闊的市場前景。


圖1為環七肽CHC的質譜圖2為環七肽CHC的HPLC檢測圖3為環七肽CHC對血糖的瞬時影響曲線圖4為環七肽CHC幹預糖耐量實驗的血糖濃度曲線圖5為環七肽CHC幹預糖耐量實驗的血糖濃度積分其中，*表示？<0.01;
圖6為環七肽CHC對STZ誘導的糖尿病的幹預效果柱狀其中，A為Buffer+生理鹽水，B為STZ+生理鹽水，C為STZ+PACAP38，
D為STZ+HSDGI， E為STZ+環七肽CHC， A表示PO.01 (B組vs. A組)，
承表示P0.01 (D組vs.B組，E組vs.B組)；
圖7為環七肽CHC逆轉PACAP(6-38)拮抗神經生長作用的柱狀圖； 其中，A為空白對照，B為PACAP38， C為PACAP (6-38)， D為CHC +
PACAP (6-38)， E為PACAP (6-38)+ PACAP38， F為CHC+ PACAP (6-38)+
PACAP38， A表示PO.01 (B組vs.E組)，*表示PO.01 (D組vs. C組)，**
表示PO.Ol (F組vs.E組)。
具體實施例方式
實施例1環七肽(CHC)的製備
本實施例的環七肽採用固相合成法製備，其具體步驟如下(1) 按常規Fmoc固相合成法合成線性七肽以Fmoc胺基酸為原料， 採用固相合成法，經TBTU/HOBT/DIEA複合縮合劑催化合成直鏈肽Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys;
(2) 固相環化接完最後一個胺基酸後，暫不脫除最後一個胺基酸Cys的 Fmoc保護基團，加入含氧化劑I2的環化溶液(稱取2.6 g I2溶於85 mL甲 醇與15 mL 二甲基甲醯胺DMF混合液中，配成0.1mol/Ll2溶液)，混勻加 入反應容器中，吹氮氣反應6h，氧化一SH生成二硫鍵一S — S — ，成環；
(3) 按10 mL/0.5 mL/0.25 mL/0.5 mL/0.75 g的比例加入三氟乙酸TFA/ 苯甲硫醚/巰基乙醇/水/苯酚配成的切割試劑，用該切割試劑切割脫離樹脂得到 粗產品，用RP-HPLC純化該粗產品得至U環七肽cyclo-
(Cys-His-Ser-Asp畫Gly-Ile畫Cys)，簡稱CHC。
對上述環七肽進行飛行質譜MALDI-MS檢測。
本實施例的環七肽採用固相合成法，避免了液相環化的二聚體或多聚體的 產生，而且反應濃度高，成本低。本實施例環七肽的分子量為732.3，產率可 以達到19%,純化後純度達96%以上，合成所得環七肽的質譜和HPLC檢測如 圖1、圖2所示。
實施例2環七肽(CHC)對血糖的瞬時影響 清潔級(SPF級)NIH雄性小鼠(使用許可證號粵檢證字2002—2009; 合格證號粵檢證字2003A076),由第一軍醫大學實驗動物中心提供，體重 25±5g，按體重隨機分2組，每組10隻，分別腹腔注射500IX g/kg CHC環七 肽和生理鹽水(0.9質量％ NaCl)，在Omin， 10min， 20min， 30 min， 45min 和60mhi測定血糖，結果如圖3所示，CHC環七肽具有瞬時調節血糖的活性，和PACAP的活性相吻合。
實施例3環七肽(CHC)對糖耐受的調節
清潔級(SPF級)NIH雄性小鼠，由第一軍醫大學實驗動物中心提供，體 重25士5g，按體重隨機分組，每組10隻。稱重，編號，禁食18h，按體重腹 腔注射1.8mmo1葡萄糖/kg+500 u g/kg環七肽CHC，以1.8mmo1葡萄糖/kg屮 生理鹽水(Saline)作為對照，於Omin， 15min， 30min， 45min和60min測定 血糖濃度，血糖濃度曲線圖如圖4所示，同時圖5為CHC環七肽幹預糖耐量 實驗的血糖濃度積分圖，通過圖4和圖5可以看出環七肽CHC對糖耐量有顯 著的促進作用，CHC環七肽能有效提高機體清除高糖的能力(PO.Ol)。
實施例4環七肽(CHC)對STZ誘導糖尿病小鼠的幹預
清潔級昆明雄性小鼠，體重26-30克，適應性飼養5d,禁食16h後,尾部靜 脈取血用血糖儀測量空腹血糖,選用血糖值小於6 mol/L的小鼠進入試驗。按 體重隨機分5組，每組10隻小鼠，禁食16h後，腹腔注射以下五組藥物
組A:擰檬酸緩衝液(Buffer)+生理鹽水(0.9質量％ NaCl);
組B: 50mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)十生理鹽水(0.9質量％NaCl);組C:
50mg/kg STZ+500 u g/kg PACAP38;
組D: 50mg/kg STZ+500ug/kg HSDGI線性五肽(HSDGI線性五肽是
His-Ser-Asp-Gly-Ile直鏈肽)；
組E: 50mg/kgSTZ+500ug/kgCHC環七肽。
連續注射5天，7天後測定各組的空腹血糖。
結果如圖6所示與注射Buffer+生理鹽水的空白對照組相比，STZ+生 理鹽水組血糖顯著升高(PO.Ol)，說明STZ誘導糖尿病模型成功；STZ+PACAP38組的血糖上升收到輕微抑制，但沒有統計學意義；STZ+CHC環七 肽及STZ+HSDGI組均有效(PO.Ol)抑制了血糖的上升，顯示CHC環七肽 和HSDGI線性肽均能抵抗STZ對胰島細胞的損傷，而且CHC環七肽比HSDGI 線性肽的作用更好些。 實施例5環七肽(CHC)逆轉PACAP(6"38)拮抗神經生長的作用
培養PC12細胞(PC-12細胞是一個常用的神經細胞株，市售)，培養液 為含5 %新生牛血清和10 %馬血清的DMEM，置37 °C、體積分數為0.05 C02 培養箱中培養。
將l xl07 /L的PC 12細胞接種在塗有多聚左旋賴氨酸poly—L一lysine 的96孔塑料培養板中,每孔100 (il ,待細胞貼壁後,將細胞隨機分為6組 A:空白對照； B: PACAP38;
C、 PACAP(6-38);
D、 CHC+PACAP(6-38);
E 、 PACAP (6隱3 8)+ PACAP3 8;
F 、 CHC+ PACAP (6-3 8)+ PACAP3 8 。
培養72h，觀察細胞突起生長情況。規定細胞突起長度大於或等於胞體直 徑1倍者，為突起生長陽性細胞。隨機數150 200個細胞,計算突起生長陽 性細胞的百分比。每組數據來自兩次實驗。
結果如圖7所示，PACAP(6-38)本身對體外培養神經細胞沒有明顯作用， 但CHC+PACAP(6-38)有效促進PC12突起生長(*p<0.01 )，起到和PACAP38 類似的作用，提示CHC能有效補償PACAP(6-38)的功能。而PACAP(6-38)本身抑制PACAP38的促神經突起的作用(ApO.Ol)，但 加入CHC後，抑制作用轉化為促進作用，CHC+PACAP(6-38) +PACAP38組 比PACAP38組的神經突起百分比更高(**p<0.01)。
以上結果說明CHC環七肽具有有效的補償和逆轉PACAP(6-38)作用的功
權利要求
1、一種短肽，其胺基酸序列為組氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸。
2、 一種含有權利要求l所述短肽的環七肽，其結構式為環-(半胱氨酸-組 氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸)。
3、 根據權利要求2所述環七肽，其特徵在於該環七肽的環化方式為第l位 半胱氨酸和第7位半胱氨酸之間形成二硫鍵，從而成為一個環狀結構。
4、 一種製備權利要求2所述環七肽的方法，其特徵在於該方法是固相合成法。
5、 權利要求l所述短肽在診斷或治療與垂體腺苷酸環化酶激活多肽、血管 活性腸肽相關疾病中的應用。
6、 權利要求2所述環七肽在診斷或治療與垂體腺苷酸環化酶激活多肽、血 管活性腸肽相關疾病中的應用。
7、 根據權利要求5或6所述任一項的應用，其特徵在於所述疾病為糖尿病、 肥胖、肥胖相關疾病、代謝障礙、代謝相關綜合症、腦損傷、腦缺血、防止神 經細胞死亡、受損神經細胞保護及再生、抗炎、男性陽痿、性冷淡、不孕不育、 女性性功能障礙、神經痛、神經病、神經混亂、焦慮症、精神病、記憶損傷、 痴呆、認知混亂、中樞神經系統疾病、偏頭痛、神經畏縮、心肌缺血、心肌梗 死、心肌纖維化、動脈硬化、肌畏縮症、胃潰瘍、高血壓、內毒性休克、血栓 症、視網膜病變、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭、腫瘤細胞凋亡或腫瘤細胞增 殖。
全文摘要
本發明公開一種短肽及其製備方法和在診斷或治療與PACAP、VIP相關疾病中的應用，該短肽序列為組氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-異亮氨酸，通過在短肽的首尾添加兩個半胱氨酸，兩個半胱氨酸的巰基形成二硫鍵從而環化成環七肽。本發明的環七肽，包括His-Ser-Asp-Gly-Ile序列，從而能夠特異地調節體內PACAP、VIP的活性，同時也可逆轉體內的PACAP(6-38)及PACAP(6-27)的拮抗作用，具有廣闊的應用前景和較高的應用價值。本發明的環七肽能夠用於診斷以及治療與PACAP、VIP相關的疾病，醫用價值高，而且環七肽通過操作簡單的固相合成法即可以獲得，因此具有很廣闊市場前景。
文檔編號C07K1/20GK101434649SQ20081021988
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月12日 優先權日2008年12月12日
發明者餘榕捷 申請人:餘榕捷