一種抗凝肽重組分子、其製備方法及應用與流程
2023-12-05 22:53:46 4
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組分子，一種抗凝肽重組分子、其製備方法及應用。
背景技術：
Xa因子(fXa)是一種絲氨酸蛋白酶，在內源性凝血途徑和外源性凝血途徑的交匯處發揮作用，激活凝血素變為凝血酶。凝血酶依次激活血小板並將可溶的血漿纖維蛋白原轉化為不溶的血栓纖維蛋白基質。然而，在鈣離子存在的情況下Xa因子在凝血瀑布中的功能需要在複雜的輔助因子、Va因子和磷酸酯膜等的幫助下發揮。Xa因子在血液凝固中的核心作用表明Xa因子抑制劑可能具有抗凝劑的治療功效。
鉤蟲抗凝肽又名線蟲抗凝蛋白或抗凝肽(NAPs)，是從鉤蟲上發現的主要抗凝血分子。NAPs能夠通過抑制fVIIa/TF(凝血的啟動因素)或Xa因子(外源性凝血途徑和內源性凝血途徑的交集)來阻止宿主凝血級聯反應。在實驗模型中，通過單一皮下注射rNAP5來抑制凝血系統中的Xa因子水平，獲得了有效的抗血栓作用。
可見，天然Xa因子抑制劑如蜱蟲和線蟲抗凝肽最初分別從非洲鈍緣蜱(TAP)和犬鉤蟲(AcAP，NAP)中分離而來，它們對血小板聚集的均有抑制作用，但並沒有雙重功能。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種抗凝肽重組分子、其製備方法及應用，所述抗凝肽重組分子即可以抗Xa又可以抗血小板凝聚，具有雙功能活性，將具有廣泛的應用前景。
為達到此發明目的，本發明採用以下技術方案：
第一方面，本發明提供了一種抗凝肽重組分子，所述重組分子的胺基酸序列為SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列。
胺基酸序列如下：
SEQ ID NO.1：KAYPECGENEWLDDCGTQKPCEAKCNEEPPEEEDPICRSRGCLLPPACVCKDGFYRDTVIGDCVREEECDQHEIIHVGGGGPGPGGGPGGRICYNHLGTKPPTTETCQEDSCYKNIWTFDNIIRRGCGCFTARGDMPGPYCCESDKCNL。
第二方面，本發明提供一種DNA片段，其包含編碼如第一方面所述多肽的核苷酸序列。
第三方面，本發明提供一種重組載體，所述重組載體含有至少一個拷貝的如第二方面所述的DNA片段。
第四方面，本發明提供一種重組細胞，所述重組細胞含有如第三方面所述的表達載體。
第五方面，本發明提供一種如第一方面所述的抗凝肽重組分子的製備方法，包括如下步驟：
(1)根據已知NAP和Mambin序列設計引物
(2)分別以NAP和Mambin為模板進行擴增，得到替換了酶切位點的兩個基因片段；
(3)分別用同一個酶切位點酶切後連接得到所述抗凝肽重組分子。
本發明中，所述酶切位點為HandIII。
優選地，所述引物為SEQ ID NO.2-3所示的核苷酸序列。
上遊引物(SEQ ID NO.2)：5』-gggatccttgtcccgcgtaaagcttacccggaa-3』；
下遊引物(SEQ ID NO.3)：5』-tcatcacgagaattctcaaaggttgca-3』。
優選地，所述酶切位點為HandIII。
第六方面，本發明提供一種如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的DNA片段，如第三方面所述的重組載體或如第四方面所述的重組細胞在抗Xa因子和抗血小板聚集的藥物中的應用。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
(1)本發明通過將RGD插入到天然的NAP序列中，本發明抑制劑有很好的抑制活性，對Xa因子有抑制作用，對ADP和骨膠引起的血小板凝聚也有抑制作用，抑制效果相比於現有技術中的藥效果更明顯；
(2)本發明製備的抗凝肽重組蛋白是以天然蛋白為基礎的抑制劑，在體外試驗中可抑制Xa活性和血小板聚集，能夠用來開發抗Xa因子和抗血小板聚集的藥物。
附圖說明
圖1為Xa因子活性抑制結果圖，其中，圖1(A)為天然NAP對Xa因子活性的抑制，圖1(B)為本發明抗凝肽重組蛋白對Xa因子活性的抑制；
圖2為ADP引起的血小板凝聚的抑制結果圖，其中，圖2(A)為天然曼巴蛇對ADP引起的血小板凝聚的抑制，圖2(B)為本發明抗凝肽重組蛋白對ADP引起的血小板凝聚的抑制；
圖3為注射本發明製備的抗凝肽重組蛋白30min內兔血漿中對Xa因子活性抑制結果圖；
圖4為靜脈注射本發明製備的抗凝肽重組蛋白60min內兔血漿中對ADP和膠原引起的血小板凝聚的抑制結果圖，其中，黑色表示ADP引起的血小板凝聚，灰色表示骨膠引起的血小板凝聚。
具體實施方式
下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1本發明抗凝肽重組分子的製備
1)重組載體的構建
(1)根據已知NAP和Mambin序列設計引物：
上遊引物(SEQ ID NO.2)：5』-gggatccttgtcccgcgtaaagcttacccggaa-3』；
下遊引物(SEQ ID NO.3)：5』-tcatcacgagaattctcaaaggttgca-3』。
以NAP和Mambin為模板進行擴增，進行PCR擴增。
PCR擴增反應體系如下：
；
反應條件如下：
得到了替換了酶切位點的兩個基因片段，所獲得兩個PCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定並用膠回收試劑盒回收純化，得到的兩個PCR產物用HandIII酶切後進行連接，將連接的基因片段連接到pGEX-3X載體中。
(3)將重組載體轉化DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序驗證。
2)重組蛋白的表達
(1)提取序列正確的重組表達載體質粒，轉化到表達菌BL21(DE3)大腸桿菌中，得到含有抗凝肽重組分子基因序列的陽性表達菌；
具體地，本發明使用構建好的重組載體和空載體轉化表達宿主菌，並篩選陽性克隆，測序確認表達框的正確性。挑選單克隆，接種於50mL 2×YT/氨苄液體培養基中，37℃震蕩搖床中培養12-16小時，然後以1：100的比例接種200mL2×YT/氨苄液體培養基中，37℃培養至OD＝0.5-0.7後加入IPTG，使終濃度達到0.1mM，繼續30℃培養4小時。4℃，4000rpm，離心15分鐘，收集菌體，超聲波破碎，再用HPLC純化可得重組抗凝肽的蛋白，得到的重組抗凝肽的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示：KAYPECGENEWLDDCGTQKPCEAKCNEEPPEEEDPICRSRGCLLPPACVCKDGFYRDTVIGDCVREEECDQHEIIHVGGGGPGPGGGPGGRICYNHLGTKPPTTETCQEDSCYKNIWTFDNIIRRGCGCFTARGDMPGPYCCESDKCNL。
實驗例2Xa因子醯胺水解活性抑制的驗證
將濃度為2.1nM的Xa因子在37℃預先孵育15min，分別在無(對照組)或有抑制劑的情況下，即加入本發明製備的抑制劑(SEQ ID NO.1)、Integrilin、Repro、曼巴蛇蛇毒蛋白、天然TAP和天然NAP，加20mM Tris-HCl調pH值為8.0，添加5μL 8mM S-2765(終濃度為0.2mM)總量達到195μL，置於96孔板37℃進行顯色分析。Xa因子產生的pNA量可通過酶標儀在405nm處檢測獲得，結果如表1和圖1(A)-圖1(B)所示，本發明抗凝肽重組分子對Xa因子有抑制作用。
實驗例3血小板聚集的驗證
(1)從健康人群獲取檸檬酸鹽人血，通過200g離心15min獲得富血小板血漿(PRP)；
(2)本發明製備的抑制劑(SEQ ID NO.1)、Integrilin、Repro、曼巴蛇、天然TAP和天然NAP與PRP在37℃共孵育30s；
(3)血小板聚集活性用Payton雙通道血小板凝聚計連接到一個圖形記錄器上，通過光透射的增加來檢測得到，加入10μM ADP用於激活實驗，溫育於320μL(300μl PRP and 20μl ADP)，其中放入磁力攪拌器，不斷攪拌，測量OD的變化，結果如表1和圖2(A)-圖2(B)所示，本申請的抗凝肽重組分子對血小板凝聚的抑制作用比現有技術中的藥物效果好，也比單獨的曼巴蛇的抑制效果好。
表1
註：Integrilin和Repro都是FDA批准的藥物。
實施例4動物實驗
將實驗兔子中注入1mg/mL的本發明製備的抗凝肽重組分子NM16，30min內多次抽取血漿，取2min、5min、10min、20min的血漿進行檢測其Xa因子的抑制效果，結果如圖3所示，可以看出，NM16在小兔體內也可抑制Xa因子，抑制效果隨著時間推移不斷降低，到20min時仍有55％。
60min內多次抽取血漿，取2min、10min、20min、50min的血漿進行檢測其對ADP和骨膠引起的血小板凝聚的抑制效果，如圖4所示，可以看出，NM16在小兔體內也可抑制ADP和骨膠引起的血小板凝聚，對ADP引起的血小板凝聚從50％下降到20％，並不再下降，對骨膠引起的血小板凝聚從開始的75％，到20min後的30％，再到60min後的沒有抑制效果，可見隨著時間的推移，對骨膠起的血小板凝聚作用會消失，而對ADP引起的血小板凝聚雖然會下降，但仍能保持在20％。
綜上所述，NAP是一種天然的Xa抑制劑，可用於開發抗血栓藥物，本發明製備的抗凝肽重組蛋白是一種有效的雙功能分子，在體外試驗中可抑制Xa活性和血小板聚集。結果顯示本發明製備的抗凝肽重組蛋白是以天然蛋白為基礎的抑制劑，能夠用來開發抗Xa因子和抗血小板聚集的藥物。
本發明製備的抗凝肽重組蛋白在動物實驗中半衰期短，可能是某些蛋白酶降解導致，這個缺點可以用PEG修飾劑來攻克，進一步要面臨的問題是免疫原性，這個問題可以通過對分子的修飾來解決。
申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的工藝方法，但本發明並不局限於上述工藝步驟，即不意味著本發明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
SEQUENCE LISTING
河南省華隆生物技術有限公司
一種抗凝肽重組分子、其製備方法及應用
2016
3
PatentIn version 3.3
1
149
PRT
人工合成序列
1
Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly
1 5 10 15
Thr Gln Lys Pro Cys Glu Ala Lys Cys Asn Glu Glu Pro Pro Glu Glu
20 25 30
Glu Asp Pro Ile Cys Arg Ser Arg Gly Cys Leu Leu Pro Pro Ala Cys
35 40 45
Val Cys Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Asp Thr Val Ile Gly Asp Cys Val
50 55 60
Arg Glu Glu Glu Cys Asp Gln His Glu Ile Ile His Val Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Pro Gly Pro Gly Gly Gly Pro Gly Gly Arg Ile Cys Tyr Asn His
85 90 95
Leu Gly Thr Lys Pro Pro Thr Thr Glu Thr Cys Gln Glu Asp Ser Cys
100 105 110
Tyr Lys Asn Ile Trp Thr Phe Asp Asn Ile Ile Arg Arg Gly Cys Gly
115 120 125
Cys Phe Thr Ala Arg Gly Asp Met Pro Gly Pro Tyr Cys Cys Glu Ser
130 135 140
Asp Lys Cys Asn Leu
145
2
33
DNA
人工合成序列
2
gggatccttg tcccgcgtaa agcttacccg gaa 33
3
27
DNA
人工合成序列
3
tcatcacgag aattctcaaa ggttgca 27