半夏多倍體植株的製備方法

2023-12-08 13:05:01

專利名稱：半夏多倍體植株的製備方法
技術領域：
本發明屬於植物細胞工程領域，具體涉及一種藥用植物半夏多倍體誘導的方法，是利 用植物組織培養技術和細胞懸浮培養相結合進行半夏多倍體植株誘導的方法。
背景技術：
半夏(P/從ffi"^p.)為天南星科半夏屬植物，主要進行無性繁殖，乾燥塊莖為常見的傳 統中藥。現代藥理學研究表明半夏具有燥溼化痰、降逆止咳、消痞散結，抗早孕、抗腫瘤 作用、降血脂，護肝和治療冠心病等多種功效。目前野生半夏資源由於人們的盲目挖掘逐 漸減少，而人工栽培半夏遺傳背景和倍性複雜多變，種質資源的不均一性限制了半夏產業 化的發展。同時，常規半夏品種對溫度敏感，容易出現高溫倒苗現象，影響藥材產量和質 量。半夏己被國家中醫藥管理局列為重點推薦發展的63種緊缺中藥材。
很多藥用植物以根、莖、葉和塊莖等器官作為收穫對象，而且大部分通過營養繁殖的 藥材在人工栽培過程中容易出現種質衰退以及二倍體和多倍體混雜的情況，進一步導致原
藥材品質混雜。研究發現多倍體藥用植物一般具有根、莖、葉、花和果的巨型性，抗逆 性強，藥用成分含量高等特性，這正是藥材優質高產品種選育所期望達到的目標。因此， 應用現代生物技術手段製備多倍體藥材，並通過人工篩選後擴繁有可能獲得適合現代生產 技術所需要的優質藥材新品種，為中藥材的產業化提供技術保障。開展半夏多倍體研究， 可能從根本上解決半夏產量低、抗逆性差和有效成分含量低等問題。
雖然多倍體的一些特性對生產有利，但自然界產生多倍體的過程相當漫長，因此人們 常用人工誘導的方法來獲得多倍體植株。人工誘導方法目前大致可分為物理方法、化學方 法和生物學方法，其中化學方法是最常用和最有效的方法，其誘導多倍體過程通常用秋水 仙鹼、富民隆、生物鹼和除草劑等化學藥劑處理正在分裂的細胞以誘導染色體加倍。該類 方法誘導多倍體常用萌動的種子、幼苗、芽、愈傷組織和莖尖組織等作為秋水仙素處理材 料，處理方法有浸漬、塗抹、滴液和注射等，但是這種活體條件下的染色體加倍誘導容易 受處理材料生理條件的幹擾，易產生嵌合體，並可能發生回復突變，從而增加變異植株篩 選的工作量和複雜程度。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種半夏多倍體植株的製備方法，採用該方法獲得的 半夏植株具有顯著的多倍體特徵，且篩選過程相對簡便，能夠確保半夏多倍體後代的純合 率。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種半夏多倍體植株的製備方法，通過懸浮培養 分離製備單細胞作為多倍體誘導的材料，包括以下步驟-
1 )、將幼嫩的半夏葉片經表面消毒後切成0.4-0.6 cm2的小塊接種到愈傷組織誘導培養 基中進行光照培養，獲得質地堅硬愈傷組織；
2) 、將質地堅硬愈傷組織轉接到愈傷組織繼代培養基中進行光照培養，獲得質地疏鬆 愈傷組織；
3) 、將質地疏鬆愈傷組織夾碎後接種到液體培養基中，然後置於光照條件下進行懸浮 振蕩培養，獲得細胞懸浮培養物；將細胞懸浮培養物用細胞篩過濾以除去大愈傷組織團塊， 獲得細胞濾液；
4) 、將細胞濾液過濾、離心後，棄上清，收集細胞；然後用單細胞液體培養基懸浮上 述細胞；
5) 、以步驟4)所得的懸浮單細胞為材料，採用秋水仙素溶液進行多倍體誘導；
6) 、將誘導處理後的細胞溶液採用離心和洗滌的方法去除秋水仙素；
7) 、將上述除去秋水仙素的單細胞用單細胞液體培養基進行光照條件下的液體淺層培
養；
8) 、當細胞團長到0.5 2mm時，將細胞團轉接到愈傷組織誘導培養基中進行光照培養；
9) 、待愈傷組織形成後轉移到叢生芽培養基中進行光照培養；
10) 、當所得的再生植株葉子完全展開時，轉接到生根培養基中進行光照條件下的生 根培養，獲得可栽培的半夏再生植株；
11) 、對半夏再生植株進行染色體倍性鑑定，從上述半夏再生植株中篩選出半夏多倍體 植株。
作為本發明的半夏多倍體植株製備方法的改進
步驟l)和步驟8)中的愈傷組織誘導培養基為MS培養基+6-節氨基嘌呤(6-BA) 0.5 2.0mgL"+a-萘乙酸(NAA) 0.01~0.05 mgL"+蔗糖25~35 gL.1， pH5.6 6.0;
即在每1L的MS培養基中加0.5 2.0 mg6-苄氨基嘌呤、0.01 0.05 mg的a-萘乙酸和25 35g蔗糖，並調節pH為5.6~6.0。
步驟2)中的愈傷組織繼代培養基為MS培養基+ 6-BA0.1 0.5 mg丄—'+激動素(KT) 0.3~1.0 mg.L-1 + 2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4陽D)1.0~2.5 1^'1/+庶糖25~35 g-I/11 ， pH 5.6~6.0;
步驟3)中的液體培養基為^18培養基+ 6-3八0.1~0.511^丄-1+ KT0.3 1.0mg-U1 + 2,4國D 1.0 2.5 mg.L" +蔗糖25 35 g.L-1， pH 5.2 5.8;
步驟4)和步驟7)中的單細胞液體培養基均為MS培養基+ 6-BA0.5 2.0mg'L—1 +NAA 0.0卜0.05mg.L"+水解酪蛋白(CH) 100~400 mg'L"+庶糖25~35 g.L.1， pH5.2 5.8;
步驟9)中的叢生芽培養基為MS培養基+6-BA0.5 2.0mg'L4+NAA0.1 0.5mg-L—1 +蔗糖25~35經丄-1， pH5.6 6.0;
步驟10)中的生根培養基為1/2 MS培養基+噴哚丁酸(IBA) 0.1~0.5 mg七—1 +NAA 0.05~0.3 mg丄"+蔗糖25~35 g'L" +活性炭3.0~4.0 g'I/1， pH 5.6~6.0;
作為本發明的半夏多倍體植株製備方法的進一步改進步驟5)的秋水仙素溶液中秋
水仙素質量濃度為0.001 % 0.01 %，誘導處理時間為12h 72h。
作為本發明的半夏多倍體植株製備方法的進一步改進秋水仙素溶液中秋水仙素質量
濃度為0.003%~0.005%，誘導處理時間為24 h~48 h。
在本發明的製備方法中光照培養均指光照(12h/d)和暗培養(12h/d)交替進行，
光照強度均為1500 k~2000 lx，培養溫度為22 28 。C。因此，步驟l) 3)和步驟7) 10)均滿足上述培養條件。步驟1)的培養時間為10~20d，步驟2)的培養時間為14~30d， 步驟3)的懸浮振蕩培養時間為7~12 d,步驟7)淺層培養時間為20 30d,步驟8)的培 養時間20 30d ，步驟9)的培養時間為10~20d，步驟IO)的培養時間為7 14d。 在本發明的製備方法中
步驟3):將質地疏鬆愈傷組織夾碎後接種到分裝有液體培養基的三角瓶中，接種量為
6 8 g質地疏鬆愈傷組織/100 ml液體培養基；然後置於搖床中光照條件下進行懸浮振蕩培 養，搖床轉速為60 100rpm;所用的細胞篩為80 100目細胞篩；
步驟4)中採用200目細胞篩過濾，離心條件為6CI0 1000rpm離心5 10min;
步驟6)為將誘導處理後細胞溶液60(K1000rpm離心5 10min，去上清液；然後再用
單細胞液體培養基清洗2 3次；該單細胞液體培養基同步驟4)中的單細胞液體培養基；
步驟7)中單細胞在單細胞液體培養基中的濃度為4 8xl5個/ml。 在本發明中，MS培養基配方例如為(單位mg/L)貝亡備液I: NH4N03， 33000; KN03， 38000; CaCl22H20， 8800; MgS047H20， 7400; KH2P04， 3400;其餘為去離了水。
C:備液II: KI， 166; H3B03， 1240; MnS044H20， 4460; ZnS04.7H20， 1720; Na2Mo04'2H20， 50; CuS04'5H20， 5; CoCl2.6H20， 5;其餘為去離子水。
貯備液III: FeS04'7H20， 5560; Na2.EDTA'2H20， 7460;其餘為去離子水。
貯備液IV:肌醇，20000;煙酸，100;鹽酸吡哆醇，100;鹽酸硫胺素，100;甘氨酸， 400;其餘為去離子水。
製備1LMS培養基，取50ml貯各液I， 5 ml貯備液II， 5 ml貯備液III， 5 ml f上備 液IV;其餘為去離子水。
1/2MS培養基是指溶液中所有物質的含量為MS培養基的一半。
本發明的半夏多倍體植株的製備方法，是通過半夏葉片誘導質地疏鬆愈傷組織，再將 其進行懸浮培養，分離半夏單細胞，然後將分離得到的單細胞用秋水仙素進行處理，洗去 秋水仙素後在單細胞培養基中進行培養，將形成的細胞團塊轉接到愈傷組織誘導培養基中 培養，愈傷組織形成後轉移到叢生芽培養基中培養，植株葉子完全展開後轉移到生根培養 基中進行生根培養，然後取根尖進行染色體觀察以確定植株倍性，從而得到半夏多倍體植 株。
將本發明所得的半夏多倍體植株用根尖進行染色體鑑定，以確定再生植株的倍性，具 體內容如下剪取0.5 2.0 cm根尖放入盛有0.001~0.005 mol'I/1 8-羥基喹啉的敞口小瓶中， 常溫下預處理4 5 h;取出預處理根尖，用蒸餾水清洗2 3遍，接著用卡諾氏固定液(乙 醇:冰醋酸體積比=3: l)常溫固定12 24 h;用蒸餾水將材料清洗2-3遍，轉入0.5 1.5 mol丄-1 的鹽酸中，在60 65'C恆溫水浴鍋甩離析10 15min;再用蒸餾水清洗根尖2~3遍，將其置 於改良苯酚品紅溶液中染色6 8 min，最後用解剖刀截取約0.1~0.5 cm左右長度的根尖進 行壓片染色體觀察。染色體鑑定結果顯示採用本發明方法獲得的變異植株的染色體數目 為2n=16x=208。
隨著植物懸浮培養技術的發展，使在離體條件下誘導單個細胞使染色體加倍成為可 能。它不僅能減少常規處理易產生嵌合體的幹擾，獲得同質的多倍體，而且能在人為控制 實驗條件下反覆多次試驗，從而提高誘變效率。因此本發明嘗試從單細胞開始進行染色體 加倍，設計探索懸浮培養條件，秋水仙素處理濃度、處理時間和單細胞再生培養條件，以 期獲得半夏多倍體植株。本發明所述的半夏多倍體誘導方法與傳統的秋水仙素誘導多倍體方法不同點在於傳 統方法主要以萌動種子、愈傷組織、幼苗、幼根或莖的生長點以及球莖或球根的萌動芽等 作為秋水仙素誘導的材料，這些材料的細胞生理狀態差別較大，而秋水仙素誘導多倍體時 只對處於有絲分裂前期和中期的細胞才起作用，所以在多倍體誘導過程中比較容易出現嵌 合體。為降低嵌合體的機率，獲得純合的多倍體半夏，本發明通過細胞懸浮培養，獲得了 大量生理狀態較均一的細胞，分離得到的單細胞同步化程度高，更有利於秋水仙素作用於 正在分裂的細胞。
本發明所述的半夏多倍體誘導方法與傳統的秋水仙素誘導多倍體方法相比優勢在於 從細胞水平進行染色體加倍，處理靶標準確，很好的排除了非秋水仙素作用時期細胞的幹 擾，確保變異植株為純合的多倍體，從而大大降低了嵌合體出現的機率，同時也大大減少 了變異植株篩選的工作量。
本發明獲得的變異植株(半夏多倍體植株)具有顯著的多倍體植株特徵葉片厚，顏 色深、葉柄粗壯，塊莖大；葉片表皮氣孔密度小等(見圖3，圖4)。染色體鑑定結果顯 示-變異植株的染色體數目是對照植株的染色體數目的兩倍，半夏多倍體的誘導率(誘導
率=多倍體半夏植株數/再生的半夏植株數><100%)最高達35.59%。而如果採用傳統方法利 用秋水仙素對半夏的葉片、葉柄、莖尖進行多倍體誘導，誘導率不超過15%。
綜上所述，本發明首次用懸浮培養後的單細胞為材料進行多倍體誘導，並成功獲得了 多倍體半夏，變異植株中嵌合體機率較低，性狀穩定。採用本發明方法獲得的半夏植株具 有顯著的多倍體特徵，且篩選過程相對簡便，能夠確保半夏多倍體後代的純合率。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖1為本發明的步驟2)所得的質地疏鬆愈傷組織； 圖2為本發明單細胞的培養過程圖2中，A:步驟4)所得的用於多倍體誘導的單細胞；
B:步驟5)誘導培養3 5d後正在分裂的單細胞； C:步驟7)培養7 14d後形成的細胞團；
D:步驟8)所用的0.5 2mm左右的細胞團；
E:步驟8)所得的愈傷組織； 圖3為普通植株和本發明植株的再生過程圖；圖3中，A:未經秋水仙素處理的再生芽； B:經秋水仙素處理後的再生芽；
C:未經秋水仙素處理的叢生芽； D:經秋水仙素處理後的叢生芽；
E:未經秋水仙素處理的正常植株；F:經秋水仙素處理後的變異植株；
圖4為八倍體和十六倍體(本發明)的離體塊莖對比圖4屮，A: 8倍體半夏組培苗的離體塊莖；B: 16倍體半夏組培苗的離體塊莖； 圖5為本發明所得的半夏多倍體植株與普通半夏植株的染色體對比圖； 圖5中，A:普通的8倍體半夏染色體數目2n=8x=104; B:本發明的16倍體半夏染 色體數目2n=16x=208。
具體實施例方式
實施例l、 一種桃葉型半夏多倍體植株的製備方法，依次進行以下步驟-1 )、將幼嫩的桃葉型半夏葉片用體積濃度75 %酒精浸泡30~45 s，然後用質量濃度0.1% 的HgCl2溶液消毒l-5 min，用無菌水衝洗5 10次；將消毒好的葉片切成0.5 cn^左右的 小塊接種到愈傷組織誘導培養基中光照培養14 16d，光照吋間為12h/d，光照強度1500 k 20001x，培養溫度為22 28'C，獲得黃綠色的質地堅硬愈傷組織；
愈傷組織誘導培養基配方為MS培養基+ 6-BA 1.0 mg丄"+NAA 0.02 mg七"+蔗糖 30g.L-1， pH 5.6-6.0。
2) 、將質地堅硬愈傷組織轉接到愈傷組織繼代培養基中進行光照培養，光照時間為12 h/d，光照強度1500 lx~2000 lx，培養溫度為22~28°C;每隔7~10 d繼代一次，繼代培養2 3 次，獲得乳白色的疏鬆愈傷組織；
愈傷組織繼代培養基為MS+6-BA0.2 mg七-i十KT0.5mg'L-1+ 2,4-D 1.5 mg-L-1 — 庶糖308丄-1， pH 5.6-6.0。
3) 、將上述生長旺盛、分散性好的疏鬆愈傷組織夾碎後，接種到分裝有50 ml液體培 養基的150 ml三角瓶中，接種量為7 g疏鬆愈傷組織/100 ml液體培養基；然後置於轉速為 80rpm的搖床中光照條件下進行懸浮振蕩培養，光照時間為12h/d，光照強度1500 lx~2000 lx，培養溫度為22 28'C,每4d更換一次新鮮培養基，培養時間為9 10d，得細胞懸浮培 養物；
液體培養基為MS + 6-BA 0.2 mg'L" + KT 0.5 mg'L"+2,4-D 1.5 mg七-1+蔗糖30g'L"， pH5.2~5.8。
再將上述細胞懸浮培養物用80 100目細胞篩過濾以除去大愈傷組織團塊，得細胞濾液；該細胞濾液作為分離單細胞的細胞懸液。
4) 、將上述細胞濾液用200目細胞篩過濾，收集篩網下的濾液，將濾液靜置15min， 用經滅菌處理的移液管小心移去一半上清液，然後800 rpm離心5 min，棄上清，收集單細 胞；再以單細胞液體培養基懸浮上述細胞；
單細胞液體培養基配方為MS+ 6-BA 1.0 mg'I/1 + NAA 0.02 mg'L"十CH 200 mg'L" + 蔗糖3(^1/1， pH5.2-5.8。
5) 、以上述懸浮的單細胞為材料進行多倍體誘導，多倍體誘導方法為使用質量濃度 為0.003%的秋水仙素溶液，於22 28'C誘導處理24h。得誘導處理後細胞溶液。
6) 、將秋水仙素誘導處理後細胞溶液採用800 rpm離心5 min，去上清液，然後用單細 胞液體培養基清洗2 3次，以去除秋水仙素；該單細胞液體培養基同步驟4)中的單細胞液 體培養基。
7) 、將上述除去秋水仙素後的單細胞用單細胞液體培養基調整細胞濃度，單細胞培養 的起始濃度為6xl0MVml，該單細胞液體培養基同步驟4)中的單細胞液體培養基；然後進 行液體淺層培養，培養時間為25d左右，培養溫度為22 28'C，光照時間為12h/d，光照強 度1500 lx 2000k。
8) 、此時，細胞團已生長到1.5mm左右，將上述細胞團轉接到愈傷組織誘導培養基中 培養，光照時間為12h/d，光照強度15001x 20001x，培養溫度為22 28t:，培養時間為25d 左右，獲得再生芽。
愈傷組織誘導培養基為MS+6-BA1.0mg L-1+NAA0.02mg L-1+蔗糖30g L-1， pH 5.6~6.0。
9) 、將所得的再生芽轉移到叢生芽培養基中培養，光照時間為12h/d，光照強度1500 lx 20001x，培養溫度為22 28'C，培養時間為17天左右，獲得叢生芽。
叢生芽培養基為MS+6-BA1.0mg■L-1+NAA0.2mg■L-1+蔗糖30g L-1， pH5.6~6.0。
10) 、此時，叢生芽葉子已完全展開，就轉接到生根培養基中進行生根培養10 12d， 光照時間為12h/d，光照強度15001x 2000k，培養溫度為22 28'C，獲得桃葉型半夏再生 植株。
生根培養基為1/2MS+IBA0.3mg丄"+NAA0.1 mg丄"+蔗糖30 g丄"+活性炭3.5 g-U1， pH5.6~6.0， 1/2MS即以MS培養基濃度的一半作為培養基。
11 )、剪取桃葉型半夏再生植株0.5-2.0 cm根尖放入盛有0.001~0.005 mol'L" 8-羥基喹
10啉的敞口小瓶中，常溫下預處理4 5 h;取出預處理材料，用蒸餾水清洗2 3遍，接著用 卡諾氏固定液(乙醇冰醋酸=3: 1)常溫固定12 24h;用蒸餾水將材料清洗2 3遍，轉 入0.5-1.5 mol丄"的鹽酸中，在60 65'C恆溫水浴鍋裡離析10-15 min;再用蒸餾水清洗根 尖2 3遍，將其置於改良苯酚品紅溶液中染色6 8 min，最後用解剖刀截取約0.1~0.5 cm 左右長度的根尖進行壓片染色體觀察。
染色體鑑定結果顯示對照桃葉型植株的染色體數目為211=8\=104，變異桃葉型植株的 染色體數目為2n-16x:208，桃葉型半夏多倍體的誘導率(誘導率=多倍體半夏植株數/再生 的半夏植株數x100。/。)高達35.59%。
經染色體鑑定為變異桃葉型半夏植株(即桃葉型半夏多倍體植株)長成後均具備以下
特徵葉片厚，顏色深、葉柄粗壯，塊莖大；葉片表皮氣孔密度小。
實施例2、以桃葉型半夏為材料進行多倍體誘導，具體步驟如實施例1所示，所不同
的是步驟5中秋水仙素的質量濃度為0.003%，處理時間為48h，誘導獲得的多倍體性狀與 實施例1一致，該處理的多倍體誘導率為31.43%。
實施例3、以桃葉型半夏為材料進行多倍體誘導，具體步驟如實施例1所示，所不同 的是步驟5中秋水仙素的質量濃度為0.005%，處理時間為24h，誘導獲得的多倍體性狀與 實施例1一致，該處理的多倍體誘導率為33.15%。
實施例4、以柳葉型半夏為材料進行多倍體誘導，具體步驟如實施例1所示，所不同 的是步驟5中秋水仙素的質量濃度為0.005%，處理時間為24h，誘導獲得的對照植株染色 體數目為2n=4x=52，多倍體植株染色體數目為2n=8x-104，多倍體誘導率為28.57%。
經染色體鑑定為變異柳葉型半夏植株(即柳葉型半夏多倍體植株)長成後均具備多倍 體植株的特徵。
實施例5、以柳葉型半夏為材料進行多倍體誘導，具體步驟如實施例4所示，所不同 的是步驟5中秋水仙素的質量濃度為0.007%，處理時間為12h，誘導獲得的對照植株染色 體數目為2n=4x=52,多倍體植株染色體數目為2n=8x=104，多倍體誘導率為20.69%。
實施例6、以芍藥葉型半夏為材料進行多倍體誘導，具體步驟如實施例1所示，所不 同的是步驟5中秋水仙素的質量濃度為0.005%，處理時間為48h，誘導獲得的對照植株染 色體數目為2n-6x-78，多倍體植株染色體數目為2n=8x=156，多倍體誘導率為28.58%。
經染色體鑑定為變異芍藥葉型半夏植株(即芍藥葉型半夏多倍體植株)長成後均具備 多倍體植株的特徵。實施例7、以芍藥葉型半夏為材料進行多倍體誘導，具體步驟如實施例6所示，所不 同的是步驟5中秋水仙素的質量濃度為0.007%，處理時間為24h，誘導獲得的對照植株染 色體數目為2n=6x=78，多倍體植株染色體數目為2n=8x=156，多倍體誘導率為26. 80%。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明 不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直 接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1、一種半夏多倍體植株的製備方法，其特徵在於通過懸浮培養分離製備單細胞作為多倍體誘導的材料，包括如下步驟1)、將幼嫩的半夏葉片經表面消毒後切成0.4～0.6cm2的小塊接種到愈傷組織誘導培養基中進行光照培養，獲得質地堅硬愈傷組織；2)、將上述質地堅硬愈傷組織轉接到愈傷組織繼代培養基中進行光照培養，獲得質地疏鬆愈傷組織；3)、將上述質地疏鬆愈傷組織夾碎後接種到液體培養基中，然後置於光照條件下進行懸浮振蕩培養，獲得細胞懸浮培養物；將所述細胞懸浮培養物用細胞篩過濾以除去大愈傷組織團塊，獲得細胞濾液；4)、將細胞濾液過濾、離心後，棄上清，收集細胞；然後用單細胞液體培養基懸浮上述細胞；5)、以步驟4)所得的懸浮單細胞為材料，用秋水仙素溶液進行多倍體誘導；6)、將誘導處理後的細胞溶液採用離心和洗滌的方法去除秋水仙素；7)、將上述除去秋水仙素的單細胞用單細胞液體培養基進行光照條件下的液體淺層培養；8)、當細胞團長到0.5～2mm時，將細胞團轉接到愈傷組織誘導培養基中進行光照培養；9)、待愈傷組織形成後轉移到叢生芽培養基中進行光照培養；10)、當所得的再生植株葉子完全展開時，轉接到生根培養基中進行光照條件下的生根培養，獲得可栽培的半夏再生植株；11)、對半夏再生植株進行染色體倍性鑑定，從上述半夏再生植株中篩選出半夏多倍體植株。
2、 根據權利要求1所述的半夏多倍體植株的製備方法，其特徵是所述步驟l)和步驟8)中的愈傷組織誘導培養基為MS培養基+6-節氮基嘌呤0.5-2.0 mg'i;1 + 01-萘乙酸0.01 ~0.05 mg-L1 +蔗糖25~35 g.L" ， pH 5.6~6.0;步驟2)中的愈傷組織繼代培養基為MS培養基+6-苄氨基嘌呤0.1-0.5 mg丄"+激動素 0.3~1.0 mg'L"十2， 4-二氯苯氧乙酸1.0~2.51^.1/1+蔗糖25~35經丄-1， pH 5.6~6.0;步驟3)中的液體培養基為MS培養基+6-苄氨基嘌呤0.卜0.5 mg丄"+激動素0.3 1.0 mg丄"十2， 4-二氯苯氧乙酸1.0~2.51^丄-1+蔗糖25~35§'1;1， pH5.2 5.8;步驟4)和步驟7)中的單細胞液體培養基均為MS培養基+6-苄氨基嘌呤0.5 2.0mg丄—1 +01-萘乙酸0.01~0.05 mg.L"+水解酪蛋白100~400 mg'L" +蔗糖25~35 g.L: pH 5.2~5.8;步驟9)中的叢生芽培養基為MS培養基+6-苄氨基嘌呤0.5-2.0 mg丄—1十a-萘乙酸0.1 0.5 mg'L-' +蔗糖25~35 g丄"，pH 5.6~6.0;步驟IO)中的生根培養基為1/2 MS培養基+照哚丁酸0.1~0.5 mg丄"+01-萘乙酸0.05-0.3 mg'L" +蔗糖25~35 g七"+活性炭3.0 4.0 g'L"， pH 5.6~6.0。
3、 根據權利要求2所述的半夏多倍體植株的製備方法，其特徵是所述步驟5)秋水仙素 溶液中秋水仙素質量濃度為O.OOl %~0.01 %，誘導處理時間為12 h~72 h。
4、 根據權利要求3所述的半夏多倍體植株的製備方法，其特徵是秋水仙素溶液中秋水 仙素質量濃度為0.003 %~0.005 %;誘導處理時間為24 h~48 h。
全文摘要
本發明公開了一種半夏多倍體植株的製備方法，通過半夏葉片誘導質地疏鬆愈傷組織，再將其進行懸浮培養，分離半夏單細胞，然後將分離得到的單細胞用秋水仙素進行處理，洗去秋水仙素後在單細胞培養基中進行培養，將形成的細胞團塊轉接到愈傷組織誘導培養基中培養，愈傷組織形成後轉移到叢生芽培養基中培養，植株葉子完全展開後轉移到生根培養基中進行生根培養，然後取根尖進行染色體觀察以確定植株倍性，從而得到半夏多倍體植株。採用該方法獲得的半夏多倍體植株具有顯著的多倍體特徵，且篩選過程相對簡便。
文檔編號A01H1/06GK101524050SQ20091009791
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月23日 優先權日2009年4月23日
發明者郭巧萍, 陳集雙 申請人:南京工業大學