魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途的製作方法

2023-12-08 00:13:31

專利名稱：：魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種魚精多肽成分的用途，特別涉及一種魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途。
背景技術：
：魚精蛋白(Protamine)也稱精蛋白，是一種鹼性蛋白質，主要存在於魚類(鮭魚、鯡魚、鱒魚)的成熟精子細胞中。其分子量較小，一般在10KDa左右。人們已將它作為天然防腐劑應用於食品保鮮和儲藏。同時，魚精蛋白是目前體外循環心臟手術中唯一用於拮抗肝素的藥物，對其作用機理和手術中的不良反應都有大量的報導。另外，發現魚精蛋白對腫瘤血管的形成有抑制作用，通過阻止毛細血管內皮細胞的移動從而影響血管形成；也能抑制血管炎症的發生。紫外線，離子輻射，化學反應等過程產生的活性氧自由基能引起一系列的病理反應，如DNA損傷，癌變和細胞降解等。在需氧生物體內，自由基的產生不可避免。其中超氧陰離子自由基和羥自由基是兩種最具代表性的自由基。它們很不穩定，能與體內的各種物質發生反應，從而導致細胞或組織損傷和死亡。抗氧化劑具有清除自由基和延緩脂質過氧化反應的發生。另外，抗氧化劑也能通過保護脂質成分的氧化降解來保留食物的質量。因此，尋找抗氧化劑，特別是食物來源的天然氧化劑具有非常重要的意義。近些年來，來源於食物蛋白酶解產物的生物活性肽受到越來越多的關注。目前許多來自食物蛋白酶解產物的自然活性肽具有抗氧化作用。Chen等人發現大豆多肽能有效延緩脂質過氧化反應，且這些多肽的一級結構與它們的活性間有重要的聯繫。Li等人從豬膠原酶解產物中獲得了具有抗氧化和自由基清除活性的多肽序列。另外，人們從魚業加工副產品中提取獲得很多具有抗氧化活性的多肽，如黃鰭金槍魚魚皮明膠酶解產物，黃鰭金槍魚骨架蛋白酶解產物，阿拉斯加雪魚魚皮明膠酶解產物以及codframe蛋白酶解產物。魚精是一種主要由魚精蛋白和DNA組成的混合物，在漁業加工過程中一般作為副產物而丟棄。其中魚精蛋白是一種陽離子多肽，在醫學中可用作注射用胰島素的載體，肝素拮抗劑等。近來，魚精蛋白經常被用作食品的抗菌成分。隨著經濟的發展和資源的不斷匱乏，魚精蛋白和魚精蛋白酶解產物受到越來越多的重視。由於魚精蛋白(Protamine)來源於魚白--這種漁業加工過程中通常被拋棄的副產物，被胰酶酶解後形成魚精多肽(Protaminehydrolysate)。目前，對於酶解形成的多肽及其多肽產品，其中大多有效成分不明確，作用機理不清楚，包括其特定的生物學功能、水解後各種多肽片斷的分子量和胺基酸殘基數等。相關的研究報導都非常少。因此，如何深入研究其機理及其新用途，用以開發新品適應市場需求，充分利用天然資源造福於人類，是該領域科研技術人員不斷研究開發的新課題之一。
發明內容本發明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備藥物、保健品或化妝品中的新用途。實際上，本發明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能藥物中的應用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分並配以其它輔料。涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備治療或預防性功能障礙藥物中的應用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分並配以其它輔料。涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能保健食品中的應用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分並配以其它輔料。還涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗衰老和美白化妝品中的應用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分並配以其它輔料。通過凝膠色譜、離子交換色譜和反相HPLC等色譜分離方法，將獲得的一系列抗氧化性的多肽組分，根據液質聯用和NCBI資料庫搜尋，具有最高抗氧化活性的多肽被鑑定為Pro-Arg，處於魚精蛋白序列中1-2和16-17殘基部位。這個合成的新二肽不僅具有強的清除羥自由基活性，而且能明顯降低胞內氧自由基的產生，從而保護人二倍體成纖維細胞免受氧化損傷。本發明的有益效果是經研究，魚精多肽(Protaminehydrolysate)是魚精蛋白由酶水解作用後形成的多肽片段，其胺基酸組成的最大特點就是鹼性胺基酸佔有較大比例，因此其鹼性很強，可溶於水和稀酸，熱穩定性較好。同時還具有低抗原性和免疫原性等特點。魚精多肽不僅具有魚精蛋白中和肝素等作用，還具有很高的營養價值和多種生理功能，易消化吸收，在抗氧化、抗疲勞、性功能都有明顯作用。魚精多肽不僅在體外具有較強的羥自由基、DPPH和超氧陰離子清除活性，而且也能明顯提高Wistar大鼠的抗疲勞和抗氧化能力。通過凝膠色譜、離子交換色譜和反相HPLC等色譜分離方法，我們最終獲得了一系列抗氧化性的多肽組分。根據液質聯用和NCBI資料庫搜尋，具有最高抗氧化活性的多肽被鑑定為Pro-Arg，處於魚精蛋白序列中1-2和16-17殘基部位。這個合成的新二肽不僅具有強的清除羥自由基活性，而且能明顯降低胞內氧自由基(ROS)的產生，從而保護人二倍體成纖維細胞免受氧化損傷。通過體內體外抗氧化模型，篩選活性多肽有效組分或成分，揭示其作用機理。其目的意義在於(1)為開發新產品打下堅實的基礎，為開發一系列新的多肽產品提供思路和方法，同時為研究和開發多肽的新功效作用提供數據；(2)通過其作用機理的研究，不僅在研究理論角度揭示了活性多肽的作用機理，而且也為宣傳和推銷公司產品提供理論依據，將為市場營銷帶來明顯的經濟效應；(3)也將為活性肽的研究提供數據和理論依據，推動多肽產品的研究和開發，有助於滿足人們日益提高的生活水平需要。通過D-gal誘導的亞急性衰老的大鼠模型，我們研究發現魚精多肽除具有基本營養功能外，在體內具有明顯的抗氧化活性。魚精多肽能明顯提高大鼠血清，腦和肝組織中的SOD活力，並明顯降低MDA的含量。在這項研究中，我們研究了魚精多肽在對於羥自由基，DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除活性，並通過層析方法並主要以羥自由基作為篩選指標分離獲得具有抗氧化活性的多肽，通過液質聯用、NCBI資料庫搜索和蛋白序列分析，對其一級結構進行了分析和鑑定。總之，本發明對今後開發利用魚精多肽中的抗氧化二肽提純物質進行藥品、保健品及化妝品等各種產品的大規模生產奠定了基礎。具體實施例方式以下結合較佳實施例，對依據本發明提供的具體實施方式詳述如下實施例1本發明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備藥物、保健品或化妝品中的新用途。實際上，本發明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能藥物中的應用。易吸收消化性和營養功能蛋白質在小腸內經過各種消化酶的作用形成水解產物包括游離胺基酸(freeaminoacid，FAA)和大量的寡肽(01igopeptide，OP)。寡肽進入小腸絨毛刷狀緣，在氨基肽酶作用下以二肽、三肽(SmallPeptide,SP)的形式完整地進入血液循環而被組織利用。Newey等研究證實了完整雙甘肽的轉運過程，並首次提出蛋白質消化產物中的二肽、三肽可被完整吸收的觀點。Bamba等研究發現小肽作為腸腔的吸收底物，不僅增加刷狀緣氨基肽酶的活性，而且提高二肽酶和胺基酸載體的活性及數目。魚精多肽是魚精蛋白的水解產物，是由許多寡肽和游離胺基酸組成，其胺基酸的組成幾乎完全與魚精蛋白一樣。不僅具有良好的溶解性，而且在受熱或在偏酸偏鹼的條件下，都有較強的穩定性；即使在高濃度條件下，仍有較好的流動性；並具有良好的保溼性。因此，直接補充多肽可加速體內胺基酸的吸收、提高機體對氮的利用率，提供人體生長、發育所需要的營養物質。同時，魚精多肽具有低的抗原性和免疫原性，這一性質不僅在臨床上有實用價值，而且可以給易引起食物過敏的人們提供一種比較安全的蛋白食品。抗疲勞功能Loon等在實驗中發現男性自行車運動員運動後補充小麥蛋白水解物及其與碳水化合物(CHO)的混合物後，血液胰島素分別增加了52%和107%(與只補充CHO比較)，並發現血漿中可利用的胺基酸水平明顯提高。Nikawa等研究發現，對跑臺運動大鼠補充大豆蛋白水解物(SPI)可顯著提高運動能力，減輕肌肉蛋白降解，明顯抑制血清肌酸激酶(CK)活性的升高。我們利用Wistar大鼠D—半乳糖衰老模型來研究魚精多肽的抗疲勞功能。把Wistar大鼠分為四組(對照組、投藥組、衰老模型對照組和衰老模型保護組)，投藥組和衰老模型保護組分別用魚精多肽灌胃56天後，進行爬杆實驗，結果發現，大鼠的爬杆時間投藥組是對照組的1.8倍，衰老模型保護組是衰老模型對照組的2.23倍，這說明魚精多肽能明顯提高了Wistar大鼠的抗疲勞能力。運動員在劇烈運動初期，首先消耗體內儲存的三磷酸腺苷(ATP)和肌酸磷酸(CP)，然後分解糖原，經苯丙酸至乳酸，在這期間還產生ATP又可作為能源。ATP、CP糖原在體內的儲存量與肌肉的產能量成比例關係，而我們的結果也證明魚精多肽的確能明顯提高肌糖原的含量。運動員劇烈運動後，需要加強恢復，尤其需要修復運動所致的骨骼肌細胞微細損傷。這時需要將大量的氮轉運進入肌肉細胞，而補充多肽不僅吸收快，而且保氮力強，能促進肌肉合成代謝。抗氧化功能Chen等^發現大豆蛋白酶解物具有抗亞油酸脂質過氧化作用，並且從中分離得到了6種抗氧化活性肽，其中分子量最小的是一個5肽(Leu-Leu-Pro-His-His)。我們以甘露醇為對照191，進行魚精多肽對Fenton體系產生，OH的清除試驗，多肽在試驗濃度(l-80mg/ml)範圍內對。H均有較強的清除作用，並隨著濃度增加清除率增大。在l-20mg/ml濃度範圍內，隨著濃度增加，清除率增加很快，呈劑量線性關係，其對，OH的半數抑制濃度(IC5Q)值為11.79mg/ml，研究發現魚精多肽對OH的清除效果明顯比對照甘露醇好。魚精多肽富含供氫體，具有提供氫質子的能力，'使具有高度氧化性的自由基還原，從而達到終止自由基連鎖反應，起到清除或抑制自由基的目的。許多天然抗氧化劑的抗氧化活性與加入量不呈線性關係，加入量過大或過小之後，可能變為助氧化劑。如a-生育酚和Y-生育酚在濃度超過500mg/kg，S-生育酚在濃度超過1000mg/kg時，都將產生助氧化效果；維生素C和半胱氨酸在低濃度時也表現出助氧化效果。在魚精多肽所試驗的各個濃度下，均沒有出現助氧化作用。體外的抗氧化實驗我們進行了魚精多肽對Fenton體系產生，OH的清除試驗，DPPH自由基的清除試驗，PMS-NADH體系產生超氧陰離子的清除試驗，結果如表6，魚精多肽在體外反應體系均表現出明顯的抗氧化活性；同時我們進一步把魚精多肽這一酶解得到的不同分子片段的多肽混合物，通過凝膠柱G-35分離純化，收集得到三個組分G1、G2和G3(254nm下不同吸收峰收集)，.OH清除實驗等的結果顯示，在較低的濃度下，組分G3仍然表現出高的清除活性，遠遠高於對照的清除活性。在清除羥自由基的反應體系中以甘露醇為對照，D-甘露醇是自然界中廣泛存在的一種活性物質，具有良好的抗氧化活性，有報導表明不同劑量的D-甘露醇對組織具有很好的保護作用。而魚精多肽粗品對OH清除作用比陽性對照甘露醇的效果好，這表明魚精多肽具有良好的抗氧化活性。許多天然抗氧化劑的抗氧化活性與加入量不呈線性關係，加入量過大或過小之後，可能變為助氧化劑。如a-生育酚和"生育酚在濃度超過500mg/kg，S-生育酚在濃度超過1000mg/kg時，都將產生助氧化效果；維生素C和半胱氨酸在低濃度時也表現出助氧化效果。在魚精多肽所試驗的各個濃度(l-80mg/ml範圍)下，沒有出現助氧化作用。正常生理條件下，機體內自由基的產生與消除處於動態平衡，這種平衡一旦被破壞，會導致過量自由基產生。因此，造成組織細胞中生物大分子化學結構的破壞性變化，包括損害生物膜，導致衰老，基因突變與癌變。魚精多肽的抗氧化機理可能類似於肌肽、大豆肽和玉米肽，富含供氫體，具有提供氫質子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，終止自由基連鎖反應，從而起到清除或抑制自由基的目的。本實驗採用較高劑量的多肽灌胃Wistar大鼠，以考察魚精多肽對大鼠體力的影響。結果發現(表l)，藥物組大鼠的爬杆時間是對照組的1.8倍，而且有統計學上的極顯著差異(戶O.001);藥物組的肌糖原含量是對照組的2倍，結果也有顯著差異；而肝糖原的含量結果表明對照組和藥物組沒有明顯差異。在運動中，機體運動能力的降低是由於體力性疲勞的出現所致，因而延緩體力性疲勞的出現有助於機體運動能力的保持。在劇烈運動初期，首先消耗體內儲存的三磷酸苷(ATP)和肌酸磷酸(CP)，然後分解糖原，經苯丙酸至乳酸，在這期間還產生ATP又可作為能源，ATP、CP糖原在體內的儲存量與肌肉的產能量成正比關係，而魚精多肽被吸收進入體內有助於肌糖原的積累。另一方面，在劇烈運動後，需要加強恢復，尤其需要修復運動所致的骨骼肌細胞微細損傷。這時需要將大量的氮轉運進入肌肉細胞，而快速吸收的多肽能提供大量氮源，從而促進肌肉的合成代謝。Newey等MI的研究證實了完整雙甘肽的轉運過程，並首次提出蛋白質消化產物中的二肽，三肽可被完整吸收的觀點。魚精多肽不僅吸收快，而且保氮力強，吸收進入體內後，能促進肌肉合成代謝，具有調整體內代謝和快速加強體質恢復的作用，從而延緩體力性疲勞的出現，增強大鼠的體能。表l.爬杆實驗數據組別爬杆時間肌糖原肝糖原(s)(mg/g)(mg/g)對照組108±80.35±0.19.6±4.4藥物組194±23"*0.70±0.1**8.1±2.6與對照組相比，*(屍<0.05)，**(屍<0.01)，***(屍<0.001)。本實驗通過考察藥物組大鼠SOD活性和MDA含量的變化，研究魚精多肽在體內的抗氧化作用。結果如表2、表3，結果表明藥物組大鼠的血清SOD活性較對照組有明顯升高，上升了14%;而MDA含量則下降了30。/。。藥物組肝組織的SOD活力較對照組有明顯升高，約為對照組的1.5倍，而MDA含量則略有下降，這與血清SOD活力和MDA含量結果相似；藥物組腦組織的MDA含量較對照組明顯降低，而SOD活力基本沒有明顯變化。表2.血清中SOD活力和MDA含量tableseeoriginaldocumentpage9與對照組相比，*(屍<0.05)，**(屍O.Ol)，***(屍O.OOl)。大鼠在補充魚精多肽後，血清、腦組織和肝組織MDA含量都明顯降低，丙二醛(MDA)作為一種脂質過氧化產物，它的高低反應了機體內脂質過氧化的程度，從而間接反應了細胞受損傷的程度。這說明魚精多肽在體內能有效的抵抗自由基對於機體的損傷，而SOD活力的升高也可能是防止機體損傷的一個重要原因。魚精多肽富含精氨酸…NO的前體物，大量的精氨酸的吸收易導致機體內NO水平的升高；同時，我們測定了血清中NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性，結果發現藥物組的NO含量和NOS活性明顯高於對照組。而NO作為體內傳遞信息的第二信使，廣泛地參與各種免疫反應，可通過與細胞內外的靶部位結合，產生不同的生物學效應。NO不僅可激活多種保護性蛋白的作用；也可抑制中性粒細胞的超氧陰離子產生，並與其結合形成無毒的代謝產物N03，從而使機體避免反應性氧中間產物的損害。實施例2涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備治療或預防性功能障礙藥物中的應用。*通過分析迄今發現的各類魚精多肽的胺基酸序列，精氨酸一般佔三分之二以上，這是一種鹼性非必需胺基酸，是Kossel最早在1896年從魚精蛋白的水解液中發現的。魚精多肽在體內起生理作用的主要是L-精氨酸，精氨酸在人體多個器官系統中都具有重要作用。W44年Holt和Albanesi證實了精氨酸的缺乏和睪丸功能的損傷有關，精氨酸不僅提高附睪精子的發生，並以磷酸精氨酸的形式作為精子運動的能源。Patel等通過對精氨酸刺激山羊附睪精子糖酵解的NMR研究，探討了精氨酸在精子代謝活動中的機制，證實其具有催化劑的作用。在對比實驗中，精氨酸在適宜濃度下使代謝率提高了23倍。同時，精氨酸不僅能提高精子的發生和代謝，而且也能提高ATP水平，這對精子的運動是必須的。Funahashi對精氨酸和一氧化氮合酶誘導公豬精子獲能和頂體反應的機制進行了研究，發現精氨酸可誘導精子獲能和頂體反應，並提高細胞外的一氧化氮(NO)的量。精氨酸在治療男性不育症方面的臨床應用在國外嘗試較多。Aydin等用精氨酸、消炎痛、激肽釋放酶治療45例少精子症和弱精子症者，其中15例接受精氨酸治療，連續服用3個月。結果證實這些藥均可在一定程度上提高精子的數目和運動性。我們的實驗結果顯示，用魚精多肽灌胃大鼠(56天)，其組織和血清中的NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性比對照生理鹽水組都有明顯的提高。這都說明魚精多肽對性保健方面有一定的作用。精氨酸參與精子的形成，也是精子各種核蛋白的基本成分在精子形成階段伴隨著核的濃集和核蛋白類型的轉變，即從賴氨酸型的組蛋白轉變為精氨酸型的魚精蛋白。精氨酸與男性不育的關係主要是與魚精蛋白發生異常有關聯，當富含賴氨酸的組蛋白轉型變成富含精氨酸的魚精蛋白時，出現的轉換異常或缺陷均可引起男性不育。人體內精氨酸缺乏或體內含量不足時可以引起精子蛋白質的改變，使DNA不穩定，不易受精或造成早期胚胎發育終止。精氨酸可逆轉糖酵解抑制劑對細胞的影響，保持細胞ATP的正常水平，提高精子的發生和代謝。精氨酸延緩精子細胞膜的脂質氧化，維持胞膜結構的穩定性和通透性，使精子具有良好的活動力。NO是在NOS的作用下，由精氨酸和分子氧反應產生的，NO在體內生成後直接擴散進入鄰近細胞，與鳥苷酸環化酶中亞鐵血紅素分子的鐵離子結合併激活該酶，致使環磷酸鳥苷(cGMP)生成增加。cGMP作為體內重要的第二信使之一，激活多種cGMP特異依賴性蛋白激酶而發揮各種生理功能，包括對平滑肌舒張調節和前列腺分泌的調節，從而對男性的生殖系統具有重要作用。交配實驗和性激素都是性功能主要評價指標，實驗結果如表4和表5。結果顯示，雄性大鼠在交配過程中對照組和藥物組沒有表現顯著差異，而血清中睪酮含量略有下降，但也沒有顯著差異，這和行為實驗的結果基本一致。這說明魚精多肽在性功能方面沒有明顯作用。然而魚精蛋白以含大量精氨基的鹼性蛋白，其酶解產物中的大量精氨酸是精子形成的重要成分，大量研究結果也表明了精氨酸在性功能特別是在男性不育症和弱精症等方面有明顯作用；同時我們研究顯示魚精多肽在抗疲勞抗氧化方面表現出明顯的作用，而交配能力和抗疲勞能力緊密相關。因此，魚精多肽可能在性功能的某一些方面有一定作用，而不僅僅局限於交配能力方面。表4.血清中睪酮和雌二醇的含量組別睪酮(ng/ml)雌二醇(pg/ml)對照組2.28±1.518.37±2.4藥物組1.36±0.816.06±1.7與對照組相比，*(屍<0.05)表5.交配實驗數據組別捕捉潛伏期(S)捕捉次數(20min)對照組137.5±16.315.5±2.5藥物組166.5±24.513.6±2.4與對照組相比，*(屍<0.05)實施例3.涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能保健食品中的應用。應用機理同實施例l。實施例4還涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能化妝品中的應用。應用機理同實施例l。總之，通過體內、體外實驗研究表明，魚精多肽具有較強的抗氧化活性，也能明顯提高Wistar大鼠的抗疲勞能力。魚精多肽不僅是一種具有較強的抗氧化活性的物質，而且可加速體內胺基酸的吸收、提高機體對氮的利用率，提供肌體生長、發育所需要的營養物質。合成的新的二肽在體外不僅有明顯的清除羥自由基活性，而且明顯降低MRC-5胞內自由基的含量，從而保護細胞避免氧化損傷。因此我們正進一步從魚精多肽中分離具有較強活性的功效成分，系統地研究其作用機理，為魚精多肽的廣泛應用打下基礎。體內和體外研究都證明魚精多肽都具有明顯的抗氧化活性，因此我們基於抗氧化功能，進行進一步分離純化的研究。自由基的存在可以破壞有機體內細胞膜、DNA、酶和蛋白的結構，從而導致一些疾病。氧化應激反應在許多衰老疾病中具有重要作用，如動脈粥樣硬化等，造成這些疾病的因素包括脂質過氧化反應及氧化反應後期產生的一些小分子物質。從大豆、雞蛋清蛋白和魚蛋白酶解產物中得到的天然抗氧化劑不僅具有豐富的營養功能，而且能有效抑制和清除體內的自由棊。這些天然抗氧化劑目前正成為食品和醫學領域的研究熱點。，我們的研究表明，來源於魚業副產品的魚精蛋白酶解產物(Protaminehydrolysate)，在體內和體外都具有良好的抗氧化活性。這項研究為魚精多肽在食品和保健食品中應用提供了科學而詳細的證據，也為魚精的廣泛利用提供了支持。增殖細胞如人二倍體成纖維細胞(HDFs)，通常表現典型的複製衰老(replicativesenescence,RS)。自1961年Haylick提出人胚肺二倍體成纖維細胞體外培養有限增殖實驗，可以作為研究細胞衰老的模型以來，細胞衰老研究多採用人二倍體成纖維細胞。而且，人二倍體成纖維細胞(HDFs)如MRC-5，在遭遇各種不到致死量的脅迫如氧化脅迫等，表現出脅迫誘導的過早衰老特徵(stress-inducedprematuresenescence,SIPS)，SIPS通常和RS的表型一致。許多研究表明二倍體成纖維細胞在過氧化氫誘導的氧化脅迫下，顯示出衰老、RS的典型變化和氧化損傷。因此我們採用人二倍體成纖維細胞來研究藥物的抗衰老和抗氧化功能。魚精多肽對自由基的清除試驗結果如表6，多肽在試驗濃度(l-80mg/ml)範圍內對-OH均有較強的清除作用，並隨著濃度增加清除率增大。在l-20mg/ml濃度範圍內，隨著濃度增加，清除率增加很快，呈劑量線性關係；但魚精多肽在高濃度(20-80mg/mO的情況下，隨濃度的增大，清除率上升趨勢緩慢，這可能是魚精多肽已趨於飽和的原因。同時，不同濃度點的魚精多肽對OH的清除效果都明顯比對照甘露醇好，魚精多肽對'OH的半數抑制濃度(IC50)值為11.79mg/ml，而甘露醇的ICs。值為20.48mg/ml。而魚精多肽對DPPH自由基的清除活性在6mg/ml範圍內，其清除率具有明顯的劑量依賴性。超過6mg/ml後，清除率不隨劑量增加而升高，其lCso值為2.79mg/ml。但是，研究發現甘露醇在DPPH系統基本沒有清除率，即使在高濃度，也未表現任何清除率。因此，甘露醇不適合DPPH系統；而VitaminC作為對照，則表現出高清除活性，ICso值為0.0127mg/ml。在PMS-NADH體系中，魚精多肽對超氧陰離子的清除活性明顯比對照VitaminC高，在5mg/ml時其清除活性是VitaminC的2.11倍。因此，多肽在不同反應體系中活性表現並不完全一致，但總的說來魚精多肽表現出明顯清除自由基的能力。表6.魚精多肽和分離組分在反應體系中清除自由基的抗氧化活性^1羥自由DPPH自由超氧陰離子樣品(mg/ml)基的清除率基清除率的清除率(%)(%)(%)Protemins16.42±0.8225.41±2.3010.38±0.85hydrolysate211.32±1.8742.78±0.4423.59±1.9931.45±2.0566.61±1.7629.88±1.58Gl0.513.95±0.3718.31±1.8224.20±0.63124.47±1.8621.21±3.4328.10±2.80G20.51^.68±1.112.74±1.6117.83±1.40132.11±2.9812.77±1.8722.07±0.14G30.533.95±0.379.75±0.9320.99±1.54153.95±1.8638.47±4.2639.04±3.81Mamiitol11.12±0.3120.17±1.510.75±0.221039.84±1.111.36±0.49VitaminC198.12±0.779.10±0.4798.72±1.0214.11±0.311021.21±0.55注protaminehydrolysate,Gl,G2，G3組分和甘露醇清除羥自由基的IC5o值分別為11.79,2.3,3.47,0.86and20.48mg/ml，而PHP的IC5q值為91.35pg/ml。對合成二肽清除羥自由基的活性分析基於篩選的新的二肽具有較強的抗氧化性，根據其多肽序列合成了二肽，進一步研究其體外的抗氧化活性，結果如表7。在20ug/ml的低濃度下，合成二肽的羥自由基的清除活性達到37.29%，遠遠高於篩選二肽在20ug/ml時的清除活性21.04%，甚至在5ug/ml非常低的濃度時，也表現出較高的清除活性。這一結果不僅表明篩選和分離純化得到抗氧化性的活性多肽是成功的，所得到的組分在抗氧化活性組分中起著重要作用；而且預示篩選得到的新的二肽在抗氧化方面包括抗氧化機理、抗氧化疾病和抗氧化產品等研究，可能將發揮一定的作用。表7.合成二肽清除羥自由基的活性分析tableseeoriginaldocumentpage14對合成多肽清除胞內自由基的活性分析胞內氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)是有氧代謝過程中不可避免的副產物，在化學和生物系統中可以通過各種途徑而產生，一般來說是通過鍵的斷裂反應或是電子的轉移反應而產生，如果機體暴露於能量即UV和y射線下主要發生鍵的斷裂反應，正常情況下生物系統中還是以電子的轉移反應佔主導地位。《和NO是最早生成的自由基，接著它們在線粒體內生成穩定的非自由基形式的活性氧h202和ONOCT，最終又均裂為HO，再經過自由基傳遞反應，生成了ROO禾p102。ROS包括羥基自由基(HO)、超氧自由基陰離子(02:)、一氧化氮(NO)、過氧化物自由基(ROO)、過氧化氮自由基(ONOCT)、單氧(102)、次氯酸(HOCl)、過氧化氫(11202)。ROS不僅參與脂質過氧化、蛋白質修飾變性及影響細胞內信號轉導和基因表達，也可以直接損傷DNA分子的嘌呤、嘧啶鹼基及脫氧核糖的作用，造成DNA分子單鏈或雙鏈斷裂和鹼基缺失，從而改變抑制或觸發細胞凋亡的蛋白表達。近年來，抗氧化劑特別是食品來源的天然抗氧化劑越來越收到關注，L-肌肽(P-丙氨酸-L-組氨酸)不僅有強的抗氧化抗衰老的作用，而且有神經保護劑、抗癌等作用。McFarland和Holliday首次研究了L-肌肽對胎兒肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)和其它細胞系生長的影響，結果發現肌肽使細胞的實際群體倍增數(PD)顯著升高，細胞的壽命也顯著延長；肌肽培養的細胞即使進入老年，也未出現衰老表型，而且更換肌肽培養基培養衰老細胞能使其年輕化。在這個實驗中，我們利用DCFH-DA作為細胞內的氧化狀態的指示劑，進入細胞後經細胞內酶的作用，加水分解為非膜通透性的DCFH，該物質被氧化後變為DCF會發出螢光，從而檢測細胞內的自由基變化；同時建立MRC-5的過氧化氫(H202)氧化損傷模型，研究合成的新的二肽對胞內氧自由基清除作用。結果顯示，無論在100uMH2O2組或300uMH2O2組，隨著二肽濃度的增加，胞內ROS含量都明顯降低。當二肽濃度達到250ug/ml時和不加二肽組(Oug/ml二肽組)相比，胞內ROS含量明顯降低，並出現極顯著差異，其含量幾乎和不加11202的對照組相當。而不加H202的對照組和不加二肽組相比較，胞內ROS含量明顯降低，也說明實驗模型是成功的；同時300uM&02組比100uMH202組的ROS含量普遍高，也說明H202誘導產生胞內ROS，模型非常成功。合成多肽在細胞周期方面的作用流式細胞術(Flowcytometry,FCM)是20世紀70年代發展起來的一種對細胞的物理性質及化學性質，如細胞大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等進行快速測定並可分類收集的技術。我們通過PI標記DNA，由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態，計算出Go/Gi期^、S期%、G2/M期X，以判斷細胞周期狀態的指標，結果如表8。我們用300uMH202分別作用MRC-53h和6h，結果發現細胞8期％由28.07%變為33.49%和41.17%，相對的G2/M期細胞比例下降，說明H202作用後細胞周期被明顯阻斷在S期。通過二肽25ug/ml、125ug/ml作用24h後，細胞S期％由模型組41.17%下降為37.72%和30.57%，而G2/M期細胞則有所上升，並有明顯的劑量效應，這結果和空白對照組非常接近，說明二肽有明顯的氧化保護作用。從細胞周期的代謝過程看，細胞周期各時相的DNA含量不同，Gi期為DNA合成前期，此期為過渡至S期做準備，S期為DNA合成期，S期。/。可反映細胞的分裂活力，增值旺盛的細胞處於S期的比例較高；G2為DNA合成後期，M期為有絲分裂期，(S+G2M)。/。為增殖指數PI，代表了該細胞群體中增殖期細胞的數量，在一定程度上可反映細胞的增殖狀態，這個實驗中(S+G2M)。/。沒有明顯的變化，可能表示二肽沒有明顯的促進細胞增殖作用。表8:合成二肽對細胞周期的作用細胞周期中不同時期細胞比例(％)G。/G!SG2/MNon6H2O2(300uM)H202(300uM)+dipeptide(25ug/ml)45.79±1.0643.23±1.2544.49±1.4128.07±1.0741.17±0.8"37.72±0.77*'26.14±2.1417.79±1.04*H202(300uM)+dipeptide(125ug/ml)46.18±0.9230.57±0.38#23.25±0.57*'#與對照組(None)相比，*屍<0.05;與模型組H2O2(300uM)相比，#屍<0.05合成的新的二肽在體外不僅有明顯的清除羥自由基活性，而且明顯降低MRC-5胞內自由基的含量，從而保護細胞避免氧化損傷。上述參照實施例對該魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範圍之內。權利要求1.魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能藥物中的應用。2、魚精多肽中的抗氧化二肽在製備治療或預防性功能障礙藥物中的應用。3、魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能保健食品中的應用。4、魚精多肽中的抗氧化二肽在製備抗氧化、抗衰老和美白化妝品中的應用。全文摘要本發明涉及一種魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途，深入拓展其在製備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能等藥物、保健品或化妝品中的新用途，用以開發新品適應市場需求，充分利用天然資源造福於人類。通過凝膠色譜、離子交換色譜和反相HPLC等色譜分離方法，將獲得的一系列抗氧化性的多肽組分，根據液質聯用和NCBI資料庫搜尋，具有最高抗氧化活性的多肽被鑑定為Pro-Arg，處於魚精蛋白序列中1-2和16-17殘基部位。這個合成的新二肽不僅具有強的清除羥自由基活性，而且能明顯降低胞內氧自由基的產生，從而保護人二倍體成纖維細胞免受氧化損傷。這些結果為魚精多肽作為藥品、保健食品及化妝品原料提供理論基礎，同時也為廣泛利用魚白提供科學依據。文檔編號A61K8/64GK101371918SQ20071005927公開日2009年2月25日申請日期2007年8月24日優先權日2007年8月24日發明者吳巧玲,朱鋒榮,王勇剛,王賀瑤,韓福森申請人:天津天獅生物發展有限公司